CN101949921A - 一种重金属酶标物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶标物及其应用。该重金属酶标物，是络合物与酶形成的交联物；所述络合物为螯合剂与载体蛋白的偶联物与重金属形成的络合物。本发明所提供的制备铜离子酶标物的制备方法简单，合成成本低，HRP活性损失小。用本发明方法制备的酶标物所建立的ELISA检测方法具有很高的灵敏度。本发明的制备铜离子ELISA检测用酶标物的方法对其他重金属ELISA检测用酶标物的成功制备具有重要的参考价值，由该方法建立的铜离子快速免疫检测方法将有广阔的应用前景。

Description

一种重金属酶标物及其应用

技术领域

本发明涉及一种重金属酶标物及其应用。

背景技术

重金属是环境与农产品中的重要污染物质，可以通过食物链在动物及人的体内尤其是肝脏内富集，对人类健康会带来严重的危害。铜是生命体生长所必须的微量元素之一，但是高浓度的铜会对生命体产生毒害作用。水生生物对铜离子的毒害作用尤为敏感。

目前，重金属铜的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光/质谱法、X-射线荧光光谱法、电位溶出分析法以及近几年发展的生物传感器检测法等。但是用这几种方法检测铜离子需要昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时，不能用于现场快速检测。与仪器分析法相比，直接酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。获得好的抗原酶标物是建立高灵敏度的直接ELISA检测方法的前提。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备重金属酶标物的方法。

本发明所提供的制备重金属酶标物的方法，包括如下步骤：

(1)将酶活化，得到活化后的酶；

(2)将所述活化后的酶与络合物进行交联反应，得到重金属酶标物；

所述络合物是按照包括如下步骤的方法制备的：

Ⅰ、将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；

Ⅱ、将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述重氮化的螯合剂的偶联物；

Ⅲ、将金属离子的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述络合物。

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法包括如下步骤：将酶的水溶液与NaIO₄水溶液混合，反应，得到活化的酶；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与络合物进行交联反应的方法包括如下步骤：将所述络合物溶于碳酸盐缓冲液中，再加入所述活化后的酶，反应，得到所述重金属酶标物；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅰ中，所述重氮化的方法包括如下步骤：将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括：温度为0-5℃、避光和时间为15min；所述温度优选为0℃或4℃；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比为4mg∶2×10^-3mol∶1.2×10^-4mol；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅱ中，所述偶联反应的条件包括：温度为4℃-10℃或4℃，pH值为8.5-9.0或8.5，反应时间为4h-24h或4h；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料摩尔比为10∶1；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅲ中，所述络合反应的条件包括：温度为25℃、pH值为7.5和时间为12h；所述偶联物与所述金属离子的投料摩尔比为1∶20。

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法中，所述反应的温度为25℃，反应的时间为20min；(酶与NaIO₄的投料配比为10mg酶∶0.02mol NaIO₄；)

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为2小时，所述反应的PH值为8.0；(所述活化后的酶与所述络合物的投料摩尔比为2∶1；)；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法中，在所述反应后，包括如下用乙二醇终止反应的步骤：向所述反应的体系中加入乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min；其中乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，在所述反应后，包括如下步骤：向所述反应的体系中加入NaBH₄，4℃搅拌反应2小时。

上述任一所述制备方法中，所述重金属为铜；所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述酶为辣根过氧化物酶。

所述对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式为：

由上述任一所述制备方法得到的重金属酶标物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种重金属酶标物。

本发明所提供的重金属酶标物，是络合物与酶通过共价键形成的交联物；所述络合物为螯合剂与载体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与重金属通过配位键连接形成的络合物。

所述络合物中，螯合剂与载体蛋白间的共价键是所述螯合剂上的氨基基团与所述载体蛋白中酪氨酸上的酚基基团形成的，所述配位键是所述重金属离子与所述偶联物中螯合剂上的EDTA形成的；所述络合物与酶间的共价键是所述络合物中载体蛋白上的氨基基团与所述酶上的糖基基团形成的。

其中，所述重金属为铜；所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述酶为辣根过氧化物酶。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测样品中是否含有重金属的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的用于检测样品中是否含有重金属的酶联免疫试剂盒，包括包被原和上述任一所述重金属酶标物；所述包被原为抗待检重金属的抗体；所述重金属酶标物中的重金属与所述待检重金属相同。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述酶联免疫试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、样品稀释液和标准品溶液；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述标准品为EDTA与所述待检重金属的螯合物；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述标准品是按照如下方法制备得到的：

(1)将每29.3mg EDTA溶解于去离子水中，调节pH至8.0，得到溶液Ⅰ；

(2)将13.5mg待检重金属的可溶性盐溶解于去离子水中，并逐滴加入到所述溶液Ⅰ中，磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至6.4mL，得到EDTA与所述待检重金属的螯合物；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述标准品溶液中所述待检重金属离子浓度为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.31ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL和0.039ng/mL；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述包被缓冲液为0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，每1升洗涤液按照如下方法配制：将8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96g Na₂HPO₄·12H₂O、1mlTween-20溶于水中，并用水补足至1L；

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，样品稀释液按照如下方法配制：将1mL吐温20和1g明胶溶于1L PBS缓冲液中，得到样品稀释液；

每1升PBS缓冲液由NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O和水组成；NaCl在磷酸盐缓冲液中的浓度为8.0g/L，KH₂PO₄在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O在磷酸盐缓冲液中的浓度为2.96g/L，pH值为7.5。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述抗待检重金属的抗体为抗待检重金属的单克隆抗体或多克隆抗体。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述待检重金属为铜；所述抗待检重金属的抗体是由保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9产生。

保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9产生的抗金属铜的单克隆抗体也属于本发明的保护范围；

保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9也属于本发明的保护范围；

上述任一所述重金属酶标物在检测样品中是否含有重金属中的应用也属于本发明的保护范围；

上述任一所述酶联免疫试剂盒在检测样品中是否含有重金属中的应用也属于本发明的保护范围。

在小分子物质的直接ELISA检测方法中，其酶标物的制备一般是通过活化小分子上的活性集团然后与HRP分子上的游离氨基、巯基或羧基连接，此方法经常容易导致所制备的酶标物酶活性的很大损失。本发明所提供的方法避开了小分子经活化后直接与HRP相连的常规方法，而是小分子先与载体蛋白连接后，再通过载体蛋白与HRP连接，这样可以极大地避免HRP在交联反应中的酶活性损失。

本发明所提供的制备铜离子酶标物的制备方法简单，合成成本低，HRP活性损失小。用本发明方法制备的酶标物所建立的ELISA检测方法具有很高的灵敏度。本发明的制备铜离子ELISA检测用酶标物的方法对其他重金属ELISA检测用酶标物的成功制备具有重要的参考价值，由该方法建立的铜离子快速免疫检测方法将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为铜离子直接ELISA检测用酶标物的合成路线图。

图2为以EDTA-Cu为标准样品建立的铜离子直接竞争ELISA法标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

对氨基苄基乙二胺四乙酸{1-(4-Aminobenzyl)-EDTA}购于日本同仁化学研究所(Dojindo Laboratories)，产品号：M029-10。乙二胺四乙酸(EDTA)，牛血清白蛋白，卵清白蛋白和原子吸收级金属铜离子均购于Sigma-Aldrich公司。其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。辣根过氧化物酶(HRP)购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为P6782。

所述对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式为：

实施例1、检测样品中是否含有重金属铜的试剂盒

一、试剂盒的组成

(一)本发明试剂盒的组成

1、包被原：抗铜的单克隆抗体，为由保藏号CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9分泌得到的单抗；

2、酶标物：酶标重金属铜，是络合物与辣根过氧化物酶通过共价键形成的交联物；所述络合物为对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA通过共价键连接形成的偶联物再与重金属铜通过配位键连接形成的络合物。

3、包被缓冲液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；

4、洗涤液：每1升洗涤液按照如下方法配制：将8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96gNa₂HPO₄·12H₂O、1mLTween-20溶于水中，并用水补足至1L。

5、样品稀释液：样品稀释液按照如下方法配制：将1mL吐温20和1g明胶溶于1L PBS缓冲液中，得到样品稀释液；

每1升PBS缓冲液由NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O和水组成；NaCl在磷酸盐缓冲液中的浓度为8.0g/L，KH₂PO₄在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O在磷酸盐缓冲液中的浓度为2.96g/L，pH值为7.5；

6、标准品溶液：标准品为EDTA-Cu螯合物；

标准品溶液中Cu离子浓度分别为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.31ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL和0.039ng/mL。

7、底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺(OPD)溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30％的H₂O₂水溶液得到；

柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液：由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；柠檬酸三钠在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.01M，Na₂HPO₄在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03M；柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的pH值为5.5；

8、终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液。

9、封闭液：溶解于样品稀释液中的3％的脱脂牛奶。

二、试剂盒的制备

(一)酶标重金属铜的制备(铜离子-对氨基苄基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白-HRP)

制备的流程图如图1所示。

1、铜-对氨基苄基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(Cu-对氨基苄基EDTA-BSA)的制备

(1)重氮化：对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)4mg，溶解于2mL 1M的HCL水溶液中，得到溶液1；在0℃避光条件下，向溶液1中滴加60ul 2M的NaNO₂水溶液，搅拌反应15min，得到重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液。该反应体系中对氨基苄基乙二胺四乙酸、HCL和NaNO₂的投料配比为4mg∶2×10^-3mol∶1.2×10^-4mol；

重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式如式I所示。

(2)偶联：将步骤1得到的重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液在10min内加入到4mL含有67.5mg BSA的硼酸盐缓冲液(0.05M，PH9.6)中，调节pH值到8.5，4℃避光搅拌反应4小时，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA通过共价键连接而成的偶联物。该反应体系中所述重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸与所述载体蛋白BSA的投料摩尔比为10∶1。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物的结构式如式II所示。

(3)络合：将步骤(2)得到的反应产物溶液用1M的HCL将pH值调节到7.5，然后向其中滴加40ul 0.5M的氯化铜水溶液，室温(25℃)反应过夜(12h)，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物与铜离子通过配位键形成的络合物。偶联物与所述铜离子的摩尔比为1∶20；(螯合剂与BSA的摩尔比为10∶1，而铜离子与螯合剂的投料摩尔比应该为2∶1，所以偶联物与所述铜离子的摩尔比为1∶20)。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物与铜离子形成的络合物的结构式如式Ⅲ所示。

(4)透析：将步骤(3)得到的反应产物溶液在PBS溶液(pH7.5)中透析完全，冷冻干燥后置于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未螯合的铜离子或未反应的其他小分子。

2、对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物与铜离子形成的络合物与HRP的交联

(1)HRP的活化：将10mg HRP溶于1mL水中，加入0.2mL 100mM NaIO₄水溶液，25℃搅拌反应20min，将得到的溶液记作溶液Ⅰ；HRP与NaIO₄的投料配比为10mgHRP∶0.02mol NaIO₄；此步骤的目的是使HRP糖基上的邻二羟基被氧化成活性醛基，生成的醛基与络合物上BSA的氨基共价键结合，避免了因酶分子上的氨基或羧基参与偶联反应而使酶的活性产生较大损失。

(2)向所述溶液Ⅰ中加入20μL的1M的乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min，将反应溶液置于透析袋中与PH7.5的PBS溶液中4℃透析4小时。将得到的溶液记作溶液Ⅱ；乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1。加入乙二醇的目的是使其与过量的NaIO₄反应，终止NaIO₄氧化反应并去除其对后续实验的干扰。

(3)将7mg式Ⅲ所示络合物(以BSA计)溶于1mL PH值为9.5的碳酸盐缓冲液中，再加入所述溶液Ⅱ，调节PH值至8.0，25℃反应2小时，将得到的溶液记作溶液Ⅲ；HRP与络合物的投料摩尔比为2∶1。

(4)向所述溶液Ⅲ中加入0.1mL浓度为0.1M的NaBH₄水溶液，4℃搅拌反应2小时；目的是还原过碘酸钠氧化法产生的不稳定的醛基与氨基形成的C＝N双键。(C＝N双键指酶与络合物中的BSA之间的连接键)

(5)将步骤(4)的反应液置于PBS中透析完全，得到络合物与HRP的偶联物，偶联物结构见式Ⅳ。

所述络合物与HRP形成的交联物其结构简式如式Ⅳ所示：

其中，对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA间的共价键是对氨基苄基乙二胺四乙酸上的氨基基团与BSA上的酚基基团形成的，所述配位键是铜离子与对氨基苄基乙二胺四乙酸上的乙二胺四乙酸形成的；所述络合物与酶间的共价键是所述络合物中BSA上的氨基基团与HRP上的糖基基团形成的。

(二)包被原：抗铜的单克隆抗体的制备

铜离子单克隆抗体为以铜-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白为免疫原免疫小鼠经过细胞融合、筛选、亚克隆、腹水制备及抗体纯化步骤得到。

铜-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白的制备方法：与实验(一)中Cu-对氨基苄基EDTA-BSA的制备方法相同，不同的是所用的蛋白为卵清白蛋白。

免疫方法：

(1)取8-10周龄的Bal b/C小白鼠作为实验动物。

(2)基础免疫：铜-对氨基苄基EDTA-OVA完全抗原(1mg/mL)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为0.1mg抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL上述稀释好的铜-对氨基苄基EDTA-OVA抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg。

加强免疫每隔10天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第6-7天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，待效价大于1∶8000后，选择血清效价和抑制率俱佳的小鼠进行细胞融合筛选单克隆抗体。有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采取间接竞争ELISA方法筛选分泌抗体效价高的单克隆细胞株。

细胞融合和克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌抗铜的单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株。将此细胞株命名为Cu-EDTA 6A9，该细胞株已于2010年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3987。

间接竞争ELISA方法步骤如下：

包被：在96孔酶标板中每孔加入100mL步骤1制备得到的Cu-对氨基苄基EDTA-BSA的溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

封闭：封闭液150μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。

竞争：零孔每孔加50μL样品稀释液，抑制孔每孔加入50μlEDTA-Cu螯合物标准品溶液。分别从96孔细胞培养板中取出100μL培养液分别于酶标板零孔和抑制孔中加入50μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(0.1mg/mL)稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

显色：取20mgOPD溶于10mL底物稀释液中，加4μL 30％H₂O₂，将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。避光显色15min。

终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪490nm处测定各孔的OD值。

效价的定义为零孔OD值为1时的血清稀释倍数。

单克隆抗体的制备与纯化：

增量培养法：将杂交瘤细胞CGMCC No.3987置于细胞培养基中，在37℃条件下于二氧化碳培养箱中进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

(三)标准品是按照如下方法制备得到的：

(1)称取29.3mg EDTA，充分溶解于10mL去离子水中，用1M NaOH调节pH至8.0，得到溶液Ⅰ；

(2)称取13.5mg CuCl₂，溶解于去离子水中，并逐滴加入到上述步骤(1)配制的溶液Ⅰ中，磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至6.4mL，得到螯合产物溶液，其中含有EDTA与Cu的螯合物(EDTA-Cu)，EDTA-Cu在溶液中的浓度为2.11mg/mL，螯合物中Cu离子在螯合产物溶液中的浓度为1mg/mL；

(3)用样品稀释液将上述步骤(2)的螯合产物溶液配成螯合物中Cu离子浓度为2000ngCu离子/mL的EDTA-Cu螯合物标准品溶液。

实施例2、试剂盒的应用

将上述制备的EDTA-Cu螯合物标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的Cu离子浓度：10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.31ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL和0.039ng/mL。

(1)抗体的包被：将1mg/mL的单抗按照1∶2000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的EDTA-Cu螯合物标准品溶液(实验孔)，每孔50μL，对照孔中不添加EDTA-Cu螯合物标准品溶液而加入50μL样品稀释液；

(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入0.5μg/mL的酶标物，每孔50μL；37℃温育30min；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(4)向实验孔和对照孔中分别加入100μL底物缓冲液，室温反应15min后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；

(5)在492nm下测定吸光值；

(6)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的EDTA-Cu螯合物标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为EDTA-Cu螯合物标准品溶液的平均吸光度值，B₀为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，运用Origin7.0绘制标准曲线。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。结果表明，其灵敏度(IC₅₀)约为1.02ng/mL，检测范围是0.1-7ng/mL(以10％-90％抑制率计算)。

对照酶标物为对氨基苄基-EDTA与HRP通过共价键形成的偶联物与铜离子螯合形成的络合物。按照上述同样的方法检测对照酶标物的效果。结果显示对照酶标物在ELISA反应中基本不显色或显色很弱，以至于无法计算其ELISA检测灵敏度和检测范围，说明HRP酶活性在偶联反应过程中损失很大。

Claims (10)

1.一种制备重金属酶标物的方法，包括如下步骤：

(1)将酶活化，得到活化后的酶；

(2)将所述活化后的酶与络合物进行交联反应，得到重金属酶标物；

所述络合物是按照包括如下步骤的方法制备的：

Ⅰ、将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；

Ⅱ、将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述重氮化的螯合剂的偶联物；

Ⅲ、将金属离子的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述络合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述活化的方法包括如下步骤：将酶的水溶液与NaIO₄水溶液混合，反应，得到活化的酶；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与络合物进行交联反应的方法包括如下步骤：将所述络合物溶于碳酸盐缓冲液中，再加入所述活化后的酶，反应，得到所述重金属酶标物；

所述步骤Ⅰ中，所述重氮化的方法包括如下步骤：将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括：温度为0-5℃、避光和时间为15min；所述温度优选为0℃或4℃；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的投料配比为4mg∶2×10^-3mol∶1.2×10^-4mol；

所述步骤Ⅱ中，所述偶联反应的条件包括：温度为4℃-10℃或4℃，pH值为8.5-9.0或8.5，反应时间为4h-24h或4h；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料摩尔比为10∶1；

所述步骤Ⅲ中，所述络合反应的条件包括：温度为25℃、pH值为7.5和时间为12h；所述偶联物与所述金属离子的投料摩尔比为1∶20。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述活化的方法中，所述反应的温度为25℃，反应的时间为20min；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为2小时，所述反应的PH值为8.0；

所述步骤(1)中，所述活化的方法中，在所述反应后，包括如下用乙二醇终止反应的步骤：向所述反应的体系中加入乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min；其中乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1；

所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，在所述反应后，包括如下步骤：向所述反应的体系中加入NaBH₄，4℃搅拌反应2小时。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述重金属为铜；所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述酶为辣根过氧化物酶。

5.由权利要求1-4中任一所述方法得到的重金属酶标物。

6.一种重金属酶标物，是络合物与酶通过共价键形成的交联物；所述络合物为螯合剂与载体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与重金属通过配位键连接形成的络合物。

7.一种用于检测样品中是否含有重金属的酶联免疫试剂盒，包括包被原和权利要求5或6所述重金属酶标物；所述包被原为抗待检重金属的抗体；所述重金属酶标物中的重金属与所述待检重金属相同。

8.根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、样品稀释液和标准品溶液；

所述标准品为EDTA与所述待检重金属的螯合物；

所述标准品是按照如下方法制备得到的：

(1)将每29.3mg EDTA溶解于去离子水中，调节pH至8.0，得到溶液Ⅰ；

(2)将13.5mg待检重金属的可溶性盐溶解于去离子水中，并逐滴加入到所述溶液Ⅰ中，磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至6.4mL，得到EDTA与所述待检重金属的螯合物；

所述标准品溶液中所述待检重金属离子浓度为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.31ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL和0.039ng/mL；

所述包被缓冲液为0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；

每1升洗涤液按照如下方法配制：将8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96g Na₂HPO₄·12H₂O、1mlTween-20溶于水中，并用水补足至1L；

样品稀释液按照如下方法配制：将1mL吐温20和1g明胶溶于1L PBS缓冲液中，得到样品稀释液；

所述抗待检重金属的抗体为抗待检重金属的单克隆抗体或多克隆抗体。

9.根据权利要求7或8所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述待检重金属为铜；所述抗待检重金属的抗体是由保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA6A9产生。

10.保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9产生的抗金属铜的单克隆抗体；

保藏号为CGMCC No.3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9；

权利要求6或7所述重金属酶标物在检测样品中是否含有重金属中的应用；

权利要求6或7所述酶联免疫试剂盒在检测样品中是否含有重金属中的应用。

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