CN103351433A

CN103351433A - 一种苯甲酸人工抗原和抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103351433A
Application number: CN2013101975288A
Authority: CN
Inventors: 孙远明; 沈玉栋; 王弘; 罗林; 徐振林; 杨金易; 雷红涛; 肖治理
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种苯甲酸人工抗原和抗体及其制备方法与应用。所述苯甲酸人工抗原具有式（Ⅰ）所示分子结构：

。所述苯甲酸人工抗原是将对氨基苯甲酸作为半抗原与载体蛋白通过重氮化法偶联制备得到的。采用本发明人工抗原得到的抗血清的效价可达到1:32000，最低检测限为0.71ng/mL，半抑制浓度为3.34ng/mL，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高，为建立快速、准确、灵敏的苯甲酸免疫检测方法奠定了基础。

Description

一种苯甲酸人工抗原和抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种苯甲酸人工抗原和抗体及其制备方法与应用。

背景技术

苯甲酸又名安息酸，是我国允许使用而且历史比较悠久的食品防腐剂，常用于碳酸饮料、低盐酱菜、酱类、蜜饯、果酒、软糖、酱油、食醋、果味饮料的防腐。苯甲酸及其钠盐安全性较高，进入机体后，苯甲酸与体内的甘氨酸或葡萄糖醛酸结合生成马尿酸，全部从尿中排出，而不在体内积蓄。但近年来报道，苯甲酸及其钠盐可引起过敏反应，肠道不适等中毒症状。动物实验证明，含8%的苯甲酸饲料喂大白鼠，十三天后约50%的大白鼠四亡；用含苯甲酸5%的饲料喂大白鼠，所以大白鼠出现过敏反应、尿失禁、痉挛，然后四五；同时，有报道指在出维生素C、过渡金属离子如Cu（Ⅱ）、Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）存在的条件下，苯甲酸易受羟基自由基进攻而发生脱羧反应生成高毒性强致癌物苯。因此，各国虽允许使用苯甲酸，但其应用范围逐渐变窄。我国将其列为A级绿色食品不得使用的防腐剂，同时规定在一般食品中，苯甲酸的最大使用量不得超过1 g/kg，在浓缩果汁中不得超过2 g/kg。日本规定鱼子酱中苯甲酸最大使用量为2.5 g/kg，清凉饮料、酱油中为0.6 g/kg，而苯甲酸对一般微生物完全抑制的最低质量分数为0.5～1 g/kg。

鉴于苯甲酸可引起食品安全问题的可能性，目前对防腐剂苯甲酸的监测主要有比色法，气相色谱、液相色谱等色谱技术，但是上述方法各有不足。比色法特异性不强、操作繁琐、精确性差，测量结果易受其他因素影响。色谱法仪器、耗材贵成本高。而免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，可以满足快速、简便、灵敏、大批量检测防腐剂苯甲酸的要求。《中国卫生检疫杂志》1998年8卷第三期吴定的文章“食品中苯甲酸含量竞争ELISA测定”通过将对氨基苯甲酸用戊二醛方法与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫原，得到多了针对苯甲酸的多克隆抗体，抗血清的效价为1:1000，对苯甲酸的半抑制浓度为20 ng/mL并建立的间接竞争ELISA方法。《食品科学》2009年30卷第三期赵伟的文章“苯甲酸人工抗原的合成与免疫效价的测定”用邻苯二甲酸酐直接与BSA偶联作为免疫Bablc小鼠，得到抗血清效价为1:32000，但是并没有提供对苯甲酸半抑制浓度，该抗体对苯甲酸特异性，是否适合建立免疫分析方法不得而知。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统苯甲酸检测技术中抗体制备效价低、重复性差的缺陷，提供一种苯甲酸人工抗原和特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供所述苯甲酸人工抗原和特异性抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述苯甲酸人工抗原和特异性抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种苯甲酸人工抗原和特异性抗体，所述苯甲酸人工抗原具有式（Ⅰ）所示分子结构：

Figure 2013101975288100002DEST_PATH_IMAGE001

。

优选地，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或卵清蛋白；更为优选地，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。

如上所述苯甲酸人工抗原的制备方法，将对氨基苯甲酸作为半抗原与载体蛋白通过重氮化法偶联制备得到的。

具体的包括如下步骤：

S1.将对氨基苯甲酸溶于盐酸溶液中，加入亚硝酸钠溶液，反应X时间得A液；

S2.将载体蛋白溶于碳酸缓冲液中得B液；

S3.将A液和NaOH溶液加入B液中，混匀后取上清溶液透析即得式（Ⅰ）结构的人工抗原；

所述对氨基苯甲酸与载体蛋白的质量比为0.3～1:1

更具体的包括如下步骤：

S1.将10～20mg的对氨基苯甲酸溶于3～5 mL 1 mol/L 的盐酸溶液中，加入500～10000 μL 1mol/L 的亚硝酸钠溶液，4℃反应0.5～1 h；得A液

S2.将10～44mg的载体蛋白溶于0.5～2 mL 0.15 mol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液中得到B液；

S3.取0.5～1.5 mL A液、1～2 mL 1 mol/L的NaOH溶液滴加到上述B液中，搅拌反应1～3 h，取上清液装入截留分子量10000 Da的透析袋，4 ℃下，用0.1 mol/L, pH7.4的PBS溶液透析3天，每12 小时更换一次透析液，即得式（Ⅰ）结构的人工抗原。

本发明同时提供所述苯甲酸特异性单克隆抗体和多克隆抗体，以及所述苯甲酸人工抗原和特异性抗体在苯甲酸免疫检测方面的应用。

本发明的有益效果是：

目前对防腐剂苯甲酸的监测主要有比色法，气相色谱、液相色谱等色谱技术，但是上述方法各有不足。比色法特异性不强、操作繁琐、精确性差，测量结果易受其他因素影响。色谱法仪器、耗材贵成本高。而免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，可以满足快速、简便、灵敏、大批量检测防腐剂苯甲酸的要求。本发明提供了一种苯甲酸人工抗原及抗体的制备方法与应用。其思路是将对氨基苯甲酸，这种含苯甲酸结构，同时带有芳香氨基可与载体蛋白偶联的常见有机化合物，与载体蛋白通过重氮化法偶联制备完全抗原，免疫动物得到针对苯甲酸的特异性抗体。该思路有益效果体现在：（1）在苯甲酸羧基的对位引入官能团，偶联载体蛋白后可使苯甲酸的特征结构羧基间隔载体蛋白更远、更好的暴露在蛋白表面，从而更容易得到高特异性抗体；（2）使用重氮化法偶联，在苯甲酸结构与载体蛋白之间形成了具有刚性的重氮键，该共价键稳定性强，是苯甲酸的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答，产生特异性更强，灵敏度更高的抗体；（3）本发明提供的苯甲酸快速检测方法最低检测限可达0.71 ng/mL。

附图说明

图1 人工抗原、KLH、OVA、对氨基苯甲酸紫外扫描（200~400 nm）吸收曲线。

图2 直接竞争酶联免疫吸附法测苯甲酸的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本技术领域常规的试剂、方法和仪器。

实施例1：免疫原的合成与鉴定

S1.称取13.7 mg的对氨基苯甲酸溶于3 mL 1 mol/L 的盐酸溶液中，加入750 μL 1mol/L 的亚硝酸钠溶液，4℃反应30 min，得到A 液。

S2.将10 mg的KLH溶于0.15 mol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液中得到B液。

S3.取1.2 mL A液、1.5 mL 1 mol/L的NaOH溶液滴加到上述B液中，室温搅拌反应1 h。反应结束后取上清液装入透析袋（截留分子量10000 Da），4 ℃下，用0.1 mol/L, pH7.4的PBS透析三天，每12 h更换一次透析液，1 mg/mL分装成小管，-20 ℃保存，即得式1结构的人工抗原（免疫原）。

免疫原的鉴定

分别将对氨基苯甲酸、KLH、式1结构的人工抗原，在紫外（200-400 nm）下扫描，发现人工抗原与KLH对氨基苯甲酸相比，吸收曲线（见图1）有明显变化，可以确定免疫原制备成功。

实施例2：包被原的合成及鉴定

S2.将44mg的OVA溶于0.15 mol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液中得到B液。

包被原的鉴定

分别将对氨基苯甲酸、OVA、式1结构的人工抗原，在紫外（200-400 nm）下扫描，发现人工抗原与OVA对氨基苯甲酸相比，吸收曲线（见图1）有明显变化，可以确定包被原制备成功。

实施例3 苯甲酸多克隆抗体的制备及鉴定

S1.免疫动物制备抗血清

用实施例1制备得到的人工抗原作为免疫原免疫雄性新西兰大白兔。首次免疫，取0.5 mg的人工抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化，采用背部多点免疫。以后取0.5 mg的人工抗原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，间隔四周加强免疫。每次加强免疫一周后，取耳缘静脉血，采用ELISA方法测定抗血清效价。待效价稳定后，再加强一次免疫。最后一次免疫后10天进行心脏采血，离心保留血清。

S2.抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵盐析法对上述所获得的抗血清进行纯化：取抗血清用pH 4.0、60 mmol/L醋酸盐缓冲液按1/2(V/V)稀释，并用0.1 mol/L NaOH调pH至4.5。在振荡下滴加正辛酸(33 μL/mL)，室温搅拌30 min，4 ℃静置1 h，然后在4 ℃ 10000 r离心30 min。弃沉淀，取上清液，用定性滤纸过滤，加入0.l mol/L PBS，用1 mol/L NaOH调pH至7.4，在4 ℃条件下预冷15 min。每毫升混合液加入0.277 g硫酸铵，搅拌30 min后在4 ℃冰箱内静置2-3 h，l0000 r离心30 min，弃上清。沉淀用少量0.01 mol/L PBS溶解，并在4 ℃下使用pH 7.4、0.01 mol/L PBS中透析，每天换液3-5次，透析至SO4^2－或NH⁴⁺被去除为止（使用BaCl₂进行判断）。

S3.酶标抗体的制备：HRP标记抗体的制备主要采用过碘酸盐法：

S31.溶解15 mg HRP于1 mL超纯水中，加入新配制的0.1 mol/L过碘酸钠100 μL，置室温或4 ℃冰箱反应20 min或30 min。

S32.向上述溶液中加2.5%的乙二醇1.5mL，室温反应30 min，然后在2000mL的0.05M的碳酸缓冲液中透析过夜。

S33.上述透析液加0.3mL新配的5mg/mL的硼氢化钠溶液，混匀，置4℃下2 h，然后加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30 min，4000rpm 离心20 min，弃上清，沥干。

S34.将沉淀溶于少量PBS（0.02M，pH7.4），装入透析袋中，用0.02M pH7.4的PBS透析，4℃过夜（中途换一次透析液）。透析后分装成小管，-20℃保存。

实施例5：抗血清最低检测限（LOD值）和半数抑制（IC₅₀）的检测。

用方正滴定确定上述所得酶标抗体及实施例1中所得人工抗原的工作浓度。用不同浓度的苯甲酸标准品溶液为实验溶液，浓度为1000、250、62.5、15.625、3.90625、0.9765625、0.244140625、0.061035156 ng/mL。采用4组平行试验。

直接竞争酶联免疫吸附法：用上述工作浓度的式1结构的人工抗原包被酶标板，将苯甲酸标准溶液与酶标抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置设置零标准孔（将添加的苯甲酸标准溶液用实验的高纯水替代，其他一致）。37 ℃下温育30 min，洗板五次，加底物显色液到酶标板小孔中，37℃下温育10 min，用酶标仪在450 nm处测定吸光值（OD）。以吸光值纵坐标，以标准品溶液浓度的对数值（Log）为横坐标，绘制半对数标准曲线（见图2）。

根据标准曲线得出20%的抑制量（LOD）和半数抑制量（IC₅₀）

抑制率按下式计算：

其中零标准孔的吸光值为B0，各标准品浓度孔的吸光值为B。

结果表明，上述抗体对苯甲酸的半数抑制量（IC₅₀）为3.34 ng/mL

(LOD）为0.71 ng/mL，在0.71～15.56 ng/mL的范围内，抑制率与苯甲酸浓度的对数值成显著的线性关系，相关系数为 0.9996。

抗体特异性检测

抗血清的特异性是指它同特异性抗原的结合能力与该抗原类似物的结合能力的比较。常用交叉反应率来作为评价的重要标准。交叉反应率越小，抗体特异性越好。

将苯甲酸几种类似物进行系列稀释，然后与上述所得抗体进行反应，制作标准曲线。通过曲线分别计算出各类似物的IC₅₀，计算抗体与苯甲酸类似物的交叉反应率。

实验设置三次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明，上述步骤所获得的抗体对苯甲钠的特异性很好，可以用来建立苯甲钠免疫分析方法。

表1 苯甲酸类似物对抗体的交叉反应率

Claims

1.一种苯甲酸人工抗原，其特征在于，具有式（Ⅰ）所示分子结构：

。

2.根据权利要求1所述苯甲酸人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或卵清蛋白。

3.根据权利要求2所述苯甲酸人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。

4.一种权利要求1所述苯甲酸人工抗原的制备方法，其特征在于，将对氨基苯甲酸作为半抗原与载体蛋白通过重氮化法偶联制备得到的。

5.根据权利要求4所述苯甲酸人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将对氨基苯甲酸溶于盐酸溶液中，加入亚硝酸钠溶液，反应0.5～1h得A液；

S2.将载体蛋白溶于碳酸缓冲液中得B液；

所述对氨基苯甲酸与载体蛋白的质量比为0.3～1 :1。

6.根据权利要求4所述苯甲酸人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将10～20mg的对氨基苯甲酸溶于3～5 mL 1 mol/L 的盐酸溶液中，加入500～10000 μL 1mol/L 的亚硝酸钠溶液，4℃反应0.5～1 h；得A液；

7.一种权利要求1~3任一项所述所述人工抗原在制备苯甲酸抗体或在检测苯甲酸中的应用。

8. 一种采用权利要求1~3任一项所述人工抗原制备得到的苯甲酸单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

9.一种权利要求8 所述抗体在检测苯甲酸中的应用。