CN113583110A - 一种苯并三唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种苯并三唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苯并三唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。本发明以5‑氨基苯并三唑和5‑羧基苯并三唑作为半抗原，应用半抗原得到人工抗原2和人工抗原3；以人工抗原2作为包被原，应用人工抗原3作为免疫原制备得到特异性抗体，该抗体对亚硝酸盐衍生物苯并三唑具有良好的灵敏度和很高的特异性，最低检测限为8.05ng/mL，半抑制浓度为515.77ng/mL，对亚硝酸钠本身、邻苯二胺以及其他食品添加剂的亲和力很弱，交叉反应很低，均小于0.29％。苯并三唑为亚硝酸盐与邻苯二胺衍生反应的产物，本发明的抗体可用于间接检测食品中亚硝酸盐的含量；为亚硝酸盐快速、准确的检测建立了免疫检测方法。

Description

一种苯并三唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种苯并三唑半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。
背景技术
亚硝酸盐，广泛存在于土壤、水域及植物中，是一种常用的食品添加剂，乳制品、泡菜、腌腊肉等食物中含量较高。这类添加剂能赋予食品良好的外观色泽和独特风味，延缓其氧化酸败，延长货架期，抑制腐败菌的生长繁殖，阻止致病菌导致的食物中毒。
但是若从食物中摄取过量的亚硝酸盐，会严重威胁人类健康。首先，在亚硝酸盐作用下，人体亚铁血红蛋白氧化形成高铁血红蛋白，从而会丧失携带氧的能力，严重时会危及生命。其次，亚硝酸盐在胃内酸性环境中，会与人体内的伯胺及酰胺类物质发生亚硝化反应生成N-亚硝胺，亚硝胺类化合物是一种强致癌、致畸、致突变物质，会引起食管癌，胃癌，咽喉癌，肝癌和大肠癌等。亚硝酸盐作为N-亚硝胺的前体物质，具有很强的遗传毒性和致癌性，被WHO列入2A类致癌物，一般人体摄入0.3～0.5g亚硝酸盐便可引起中毒，超过3g则会致死，其中硝酸盐的每日可接受摄入量为人体重的3.7mg/kg，亚硝酸盐的每日可接受摄入量为人体重的0.06mg/kg。此外，亚硝酸盐还可能引发人类先天畸形，尤其是中枢神经系统先天畸形高发的重要原因之一。
我国对亚硝酸盐的使用有着严格的规定，明确规定了亚硝酸盐在各类食品中的限量值，GB 2760中指出不同类型食品的亚硝酸盐最大残留限量(以NaNO2计)在30～70mg/kg之间。
目前，亚硝酸盐的检测方法较多，主要有离子色谱法(程慰先.离子色谱法改进后检测肉制品中亚硝酸盐含量[J].河南预防医学杂志,2016(8):592-593.)、紫外分光光度法(高倩妮,邹小欠,喻惜珍,等.Dynamic Study on Physical and Chemical Indexes ofPickled Mustard During Storage[J].安徽科技学院学报,2018,032(006):88-95.)、电化学分析法(陈林林,韩可,李伟,等.亚硝酸盐检测方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2019(11):3430-3435.)、气相分子吸收光谱法(徐晓,郝桂娟,郭利攀,邢丽丽,宋婷.气相分子吸收光谱法测定酱腌菜中亚硝酸盐[J].食品安全质量检测学报,2020,11(15):5252-5257.)、液相色谱法(王小芳,樊继彩,任韧.高效液相色谱-荧光检测法测定婴幼儿奶粉中的亚硝酸盐[J].中国卫生检验杂志,2021,31(07):808-810+816.)等。这些方法的检出限主要在0.06～1.2mg/kg之间，但这些方法都有着各自的优缺点，电化学分析法重现性差且耗时，色谱法和光谱法仪器昂贵，分析复杂，紫外分光光度法易操作，但灵敏度较低。这些方法都不适宜进行大批量的快速筛选，因此，需发明一种针对亚硝酸盐的快速、简便的检测方法。基于抗原抗体特异性结合的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。国际权威学术刊物将其列为近年来首位优先发展的新分析技术。但是由于亚硝酸盐分子太小，抗原特征表位不明显，目前尚无可用于检测的亚硝酸盐的半抗原、抗原和抗体及免疫检测方法的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中亚硝酸盐检测技术的缺陷和不足，提供一种苯并三唑的半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。苯并三唑为亚硝酸盐与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将亚硝酸盐完全反应。通过检测苯并三唑可以间接检测亚硝酸盐的含量。
本发明的目的在于提供5-氨基苯并三唑和/或5-羧基苯并三唑作为半抗原在制备苯并三唑人工抗原和/或制备苯并三唑抗体中的应用。
本发明的目的还在于提供苯并三唑人工抗原1、人工抗原2和人工抗原3及其制备方法。
本发明的目的还在于提供所述人工抗原1、人工抗原2和/或人工抗原3在制备苯并三唑人工抗体中的应用。
本发明的目的还在于提供苯并三唑人工抗原组合。
本发明的目的还在于提供苯并三唑抗体及其制备方法。
本发明的目的还在于提供苯并三唑人工抗原或苯并三唑人工抗体在检测苯并三唑及间接检测亚硝酸盐中的应用。
本发明的目的还在于提供一种检测苯并三唑的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种检测亚硝酸盐的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种检测苯并三唑的免疫分析方法。
本发明的目的还在于提供一种检测亚硝酸盐的免疫分析方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
5-氨基苯并三唑和/或5-羧基苯并三唑作为半抗原在制备苯并三唑人工抗原和/或苯并三唑抗体中的应用。已知，5-氨基苯并三唑和5-羧基苯并三唑结构式分别如式(II)和式(III)所示，本发明研究表明可利用5-氨基苯并三唑和/或5-羧基苯并三唑作为苯并三唑半抗原制备苯并三唑的人工抗原和/或苯并三唑抗体，并间接检测亚硝酸盐；
Figure BDA0003220792970000031
一种苯并三唑人工抗原，为人工抗原1、人工抗原2或人工抗原3，人工抗原1结构式如式(IV)所示，
Figure BDA0003220792970000032
人工抗原2结构式如式(V)所示，
Figure BDA0003220792970000033
人工抗原3结构式如式(VI)所示，
Figure BDA0003220792970000041
优选地，所述苯并三唑人工抗原偶联的载体蛋白(protein)为乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
所述苯并三唑人工抗原在制备苯并三唑抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述人工抗原1的制备方法，以5-氨基苯并三唑为半抗原，通过重氮化法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
先将半抗原5-氨基苯并三唑溶解于冰盐酸中，然后加入NaNO2溶液冰浴避光搅拌反应，反应结束后将反应液在冰浴搅拌下缓慢加入载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；偶联混合物在低温下透析数天，得到所述人工抗原1。
优选地，所述人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS缓冲液中；
(2)将5-氨基苯并三唑半抗原溶解于1M冰盐酸溶液中；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1。
(3)将NaNO2加入到步骤(2)的半抗原溶解液中，4℃避光反应形成重氮盐；所述NaNO2与半抗原的摩尔比为1～2：1。
(4)将重氮盐滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原1。
进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白的摩尔比为100：1；
进一步优选地，所述半抗原与鸡卵清蛋白的摩尔比为300：1；
进一步优选地，所述NaNO2与半抗原的摩尔比为1.2：1。
所述人工抗原2的制备方法，以5-氨基苯并三唑为半抗原，通过戊二醛法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
先将载体蛋白溶解，然后加入戊二醛溶液室温搅拌反应4h，反应液经透析形成蛋白-戊二醛交联液；将5-氨基苯并三唑半抗原溶于甲醇中，然后加入到蛋白-戊二醛交联液中，4℃搅拌反应过夜，反应结束后加入硼氢化钠水溶液，室温还原反应2h；偶联混合物低温下透析数天，得到所述人工抗原2。
优选地，所述人工抗原2的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于的pH＝7.4的PBS缓冲液中；
(2)将25％戊二醛溶液加入步骤(1)的载体蛋白溶液中；室温下搅拌反应4h并用PBS缓冲液透析3次，每次3h，得到蛋白-戊二醛交联液；所述戊二醛溶液与载体蛋白溶液的体积比为2～10：1000；
(3)将5-氨基苯并三唑半抗原溶于甲醇，然后加入到步骤(2)的蛋白-戊二醛交联液中，4℃搅拌反应过夜；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1；
(4)将1mg/mL硼氢化钠水溶液滴加到步骤(3)反应液中，室温下还原反应2h；反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原2；所述硼氢化钠与载体蛋白的质量比为1：100。
进一步优选地，戊二醛溶液与载体蛋白溶液的体积比为3.75：1000；
进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白的摩尔比为100：1；
进一步优选地，所述半抗原与鸡卵清蛋白的摩尔比为300：1；
进一步优选地，所述硼氢化钠与载体蛋白的质量比为1：100。
所述人工抗原3的制备方法，以5-羧基苯并三唑为半抗原，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原3的制备方法，包括如下步骤：
将5-羧基苯并三唑溶于0.1MMES水溶液中，加入EDC和NHS室温避光搅拌，反应结束后转移至冰浴，将载体蛋白溶解后加入，搅拌均匀，室温偶联过夜；偶联混合物低温下PBS透析数天，得到所述人工抗原3。
优选地，所述的人工抗原3的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS缓冲液中；
(2)将5-羧基苯并三唑半抗原溶解于0.1M MES溶液中；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1。
(3)将EDC和NHS加入步骤(2)的半抗原溶解液中，室温避光反应4h形成活泼酯；EDC：NHS：5-羧基苯并三唑摩尔比＝1～2：1～2：1；
(4)将活泼酯滴加入步骤(1)的载体蛋白溶液中，室温避光偶联过夜；
(5)反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS透析3天，得到人工抗原3。
进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白的摩尔比为100：1；
进一步优选地，所述半抗原与鸡卵清蛋白的摩尔比为300：1；
进一步优选地，EDC：NHS：5-羧基苯并三唑摩尔比＝1.5：1.5：1。
一种苯并三唑人工抗原组合，包括苯并三唑人工抗原中的两种或三种。
优选地，所述苯并三唑人工抗原组合包括人工抗原2和人工抗原3。
优选地，所述苯并三唑人工抗原组合包括以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原3和以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2。
进一步优选地，所述苯并三唑人工抗原组合包括作为免疫原的以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原3和作为包被原的以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2。
所述苯并三唑人工抗原组合在制备苯并三唑抗体和/或检测苯并三唑中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种苯并三唑抗体，利用苯并三唑人工抗原免疫动物制备得到。
优选地，所述苯并三唑抗体是利用人工抗原3免疫动物制备得到。
进一步优选地，所述苯并三唑抗体是利用以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原3免疫动物制备得到。
优选地，所述抗体为多克隆抗体。
一种苯并三唑抗体的制备方法，利用苯并三唑人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对苯并三唑的抗体，所述抗体是能与苯并三唑发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。
优选地，利用人工抗原3免疫实验动物。
进一步优选地，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原3免疫实验动物。
作为上述方法的一个具体实施方式，苯并三唑多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)利用人工抗原配合弗式佐剂免疫实验动物；
(2)首次免疫时，人工抗原用等体积的弗式完全佐剂乳化后免疫6-7周龄的Balb/c小鼠，乳化后每只小鼠的免疫剂量为0.1mL/只；
(3)加强免疫时，用相同剂量的人工抗原与等体积的弗式不完全佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠；
(4)加强免疫四次后，心脏取血分离获得血清即鼠源多克隆抗体。
苯并三唑抗体在检测苯并三唑或亚硝酸盐中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用是在检测苯并三唑或亚硝酸盐的试剂盒或检测苯并三唑或亚硝酸盐的免疫分析方法中的应用。
一种检测苯并三唑和/或亚硝酸盐的试剂盒，包含作为包被原的苯并三唑人工抗原和以苯并三唑人工抗原免疫动物制备得到的苯并三唑抗体。
优选地，所述检测亚硝酸盐的试剂盒还含有邻苯二胺；所述亚硝酸盐的含量根据苯并三唑的含量换算得到，苯并三唑与亚硝酸盐的摩尔比为1：1，即所述亚硝酸盐的摩尔数即为与苯并三唑的摩尔数。
优选地，所述试剂盒包括作为包被原的人工抗原2和以人工抗原3免疫动物制备得到的苯并三唑抗体。
进一步优选地，所述试剂盒包括作为包被原的以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2和以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原3免疫动物制备得到的苯并三唑抗体。
优选地，所述试剂盒包括包被有作为包被原苯并三唑人工抗原的酶标板、苯并三唑标准品、苯并三唑抗体工作液、酶标二抗工作液、显色液、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
进一步优选地，试剂盒的包被原为以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2；抗体为以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原3免疫动物制备得到的苯并三唑抗体。
作为上述试剂盒的一个具体实施方式，用于检测亚硝酸盐时通过以下步骤实施：
(1)样品预处理，对样品中的亚硝酸盐进行提取、浓缩，并加入过量邻苯二胺使其衍生。
(2)然后将样品衍生液、苯并三唑标准品和苯并三唑抗体分别加入已包被好以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2的包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应。利用酶标仪测试吸光值，通过对比样品衍生液及苯并三唑标准品的吸光值大小，定量分析样品衍生液中的苯并三唑含量。
(3)通过换算得到样品中的亚硝酸盐含量，苯并三唑与亚硝酸盐的摩尔比为1：1。
一种检测苯并三唑的免疫分析方法，以苯并三唑人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，所述免疫分析方法以人工抗原2为包被原，以人工抗原3为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原3为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
一种检测亚硝酸盐的免疫分析方法，将亚硝酸盐与邻苯二胺充分反应生成苯并三唑，以苯并三唑人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；所述亚硝酸盐的含量根据免疫分析方法检测的苯并三唑的含量换算得到，苯并三唑与亚硝酸盐的摩尔比为1：1，即所述亚硝酸盐的摩尔数即为与苯并三唑的摩尔数。
优选地，以人工抗原2为包被原，以人工抗原3为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原3为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
作为上述方法的具体实施方式，包括如下步骤：
(1)利用人工抗原3免疫动物制备多克隆抗体；
(2)将人工抗原2作为包被原包被在微孔板上，然后将步骤(1)制备得到多克隆抗体加入微孔板中；
(3)加入亚硝酸盐充分衍生后的苯并三唑待测样品，采用竞争ELISA测定苯并三唑的含量，从而间接测定亚硝酸盐的含量，苯并三唑与亚硝酸盐的摩尔比为1：1。
优选地，所述人工抗原3的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)。
优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。
优选地，偶联鸡卵清白蛋白的人工抗原2包被浓度为1μg/mL，苯并三唑抗体稀释倍数为4000倍。
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明并以5-氨基苯并三唑和5-羧基苯并三唑作为苯并三唑半抗原，应用苯并三唑半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原1、人工抗原2和人工抗原3，应用人工抗原3(5-羧基苯并三唑-LF)制备得到用于间接检测亚硝酸盐的特异性抗体，应用人工抗原2(5-氨基苯并三唑-OVA)作为人工包被原，该抗体对亚硝酸盐的衍生物苯并三唑具有良好的灵敏度和很高的特异性，最低检测限为8.05ng/mL，半抑制浓度为515.77ng/mL，对亚硝酸钠本身、衍生剂邻苯二胺以及其他食品添加剂的亲和力很弱，交叉反应很低，均小于0.29％，可有效的排除其类似物的干扰，该方法具有检测灵敏度高(检测限可达ppb水平)，特异性高、检测通量高等优势，具有广阔的应用前景。苯并三唑为亚硝酸盐与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将亚硝酸盐完全反应；本发明的抗体可用于间接检测食品中亚硝酸盐的含量；为亚硝酸盐快速、准确的检测建立了免疫检测方法。
(2)本发明以5-氨基苯并三唑和5-羧基苯并三唑为半抗原，该结构中引入氨基或羧基结构同时保留了亚硝酸盐衍生物苯并三唑的特征结构，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；5-氨基苯并三唑中的氨基为芳香族氨基具强的反应活性，可在亚硝酸钠和盐酸存在条件下转变为交稳定的重氮盐，能直接偶联到载体蛋白酪氨酸羟基的邻位上制备人工抗原；该氨基基团还能通过戊二醛与载体蛋白进行交联，运用戊二醛的两个醛基分别半抗原和载体蛋白的氨基形成Schiff键，从而使半抗原偶联到载体蛋白上得到另一种人工抗原。这两种半抗原载体蛋白偶联物可以互为异源包被抗原，提升免疫检测灵敏度；5-羧基苯并三唑中的羧基基团能够与载体蛋白的氨基缩合形成稳定酰胺键，使半抗原高效偶联到载体蛋白，从而得到另一种半抗原。
附图说明
图1为亚硝酸盐衍生物苯并三唑的质谱鉴定图。
图2为苯并三唑半抗原1(5-氨基苯并三唑)的质谱鉴定图。
图3为苯并三唑半抗原1(5-氨基苯并三唑)的核磁鉴定图。
图4为苯并三唑半抗原2(5-羧基苯并三唑)的质谱鉴定图。
图5为苯并三唑人工抗原1及其半抗原、鸡卵清蛋白、乳铁蛋白紫外扫描图。
图6为苯并三唑人工抗原2及其半抗原、鸡卵清蛋白、乳铁蛋白紫外扫描图。
图7为苯并三唑人工抗原3及其半抗原、鸡卵清蛋白、乳铁蛋白紫外扫描图。
图8为以苯并三唑人工抗原3所制备的抗体对苯并三唑衍生物的抑制曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例只用于解释本发明，并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1亚硝酸盐的衍生与鉴定
1、亚硝酸盐的衍生与鉴定
取5mg亚硝酸钠溶于5mL 0.1M盐酸中，将20mg邻苯二胺溶于5mL 0.1M盐酸中并将其加入到亚硝酸盐溶液中，混匀后室温反应10min，即得到亚硝酸盐衍生溶液，其衍生物为苯并三唑。苯并三唑的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003220792970000101
ESI-MS鉴定结果如图1所示，与苯并三唑分子量相符。
实施例2 5-氨基苯并三唑的合成与鉴定
1、5-氨基苯并三唑的合成与鉴定
将2g 4-硝基邻苯二胺溶于5mL冰醋酸中，经磁搅拌制成悬浮液。将1g亚硝酸钠用5mL一级水溶解并将其加入到4-硝基邻苯二胺冰醋酸的悬浮液中。室温搅拌反应30min。过滤除去溶剂，并用冷水洗涤滤渣以除去过量的醋酸，干燥后得到5-硝基苯并三唑浅棕色固体粉末；将164mg 5-硝基苯并三唑溶于1mL浓盐酸中，569mg二氯化锡用2mL浓盐酸溶解并将其加入5-硝基苯并三唑溶液中，室温搅拌反应1h，过滤除去溶剂，并用乙酸乙酯洗涤后干燥得到淡蓝色粉末即为5-氨基苯并三唑。
5-氨基苯并三唑的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0003220792970000111
ESI-MS鉴定结果如图2所示，与5-氨基苯并三唑分子量相符。
核磁氢谱如图3：1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.65(d,J＝8.5Hz,1H),6.90(d,J＝7.9Hz,1H),6.81(s,1H).
实施例3 5-羧基苯并三唑的合成与鉴定
1、5-羧基苯并三唑的合成与鉴定
将2g 4-羧基邻苯二胺溶于5mL冰醋酸中，经磁搅拌制成悬浮液。将1g亚硝酸钠用5mL一级水溶解并将其加入到4-羧基邻苯二胺冰醋酸的悬浮液中。室温搅拌反应30min。过滤除去溶剂，并用冷水洗涤滤渣以除去过量的醋酸，干燥后得到浅棕色固体粉末即为5-羧基苯并三唑。
5-羧基苯并三唑的结构式如式(III)所示：
Figure BDA0003220792970000112
ESI-MS鉴定结果如图4所示，与5-羧基苯并三唑分子量相符。
实施例4人工抗原1的合成和鉴定
1、人工抗原1的合成
人工抗原1的合成方法，包括以下步骤：
将实施例2制备的5-氨基苯并三唑作为半抗原，通过重氮化法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清蛋白(OVA)；所述乳铁蛋白为免疫抗原的载体蛋白，鸡卵清蛋白为包被抗原的载体蛋白。
取28mg的半抗原5-氨基苯并三唑溶解于625μL冰的1M盐酸溶液中，冰浴下避光滴加1725μL 1％NaNO2，4℃避光搅拌反应；反应过程中用淀粉碘化钾试纸监测，当试纸呈现蓝黑色后继续反应15min形成重氮盐；取20mg乳铁蛋白(LF)和20mg鸡卵清蛋白(OVA)分别溶解于4mL的pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液(CBS；Na2CO31.69g、NaHCO32.95g用一级水定容至1L)中后，冰浴中搅拌加入重氮盐(LF中加入825μL，OVA中加入1525μL)，搅拌均匀后，4℃避光偶联2h；偶联混合物于4℃下用0.01MPBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得人工抗原1(人工抗原1(LF)、人工抗原1(OVA))。人工抗原1以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、人工抗原1的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、5-氨基苯并三唑以及人工抗原1(LF)、人工抗原1(OVA)进行紫外扫描测定(190～400nm)，结果如图5所示，人工抗原1(5-氨基苯并三唑-LF、5-氨基苯并三唑-OVA)的紫外吸收峰与5-氨基苯并三唑的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原1同时具备5-氨基苯并三唑和LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原1偶联成功。
实施例5人工抗原2的合成和鉴定
1、人工抗原2的合成
人工抗原2的合成方法，包括以下步骤：
将实施例2制备的5-氨基苯并三唑作为半抗原，通过戊二醛法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清白蛋白(OVA)。
取20mg鸡卵清白蛋白(OVA)和20mg乳铁蛋白(LF)分别溶解于4mL0.01MPBS缓冲溶液中，搅拌后各加入15μL25％戊二醛溶液，室温搅拌反应4h，反应液透析后得蛋白-戊二醛交联液，反应液于4℃下用PBS缓冲溶液透析3次，3h更换一次透析液；将30mg 5-氨基苯并三唑溶解于900μL 0.1M 2-(N-玛琳)乙磺酸(MES)水溶液中后滴加到蛋白-戊二醛交联液中(LF中加入300μL，OVA中加入600μL)，搅拌均匀后，4℃偶联过夜；各取200μL 1mg/mL硼氢化钠水溶液滴加到偶联液中，室温搅拌还原2h；反应结束后，偶联混合物于4℃下用0.01M PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得人工抗原2(人工抗原2(LF)、人工抗原2(OVA))。人工抗原2以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为300：1。
2、人工抗原2的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、5-氨基苯并三唑以及人工抗原2(LF)、人工抗原2(OVA)进行紫外扫描测定(190～400nm)，结果如图6所示，人工抗原2的紫外吸收峰与5-氨基苯并三唑的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原2同时具备5-氨基苯并三唑和LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原2偶联成功。
实施例6人工抗原3的合成和鉴定
1、人工抗原3的合成
人工抗原3的合成方法，包括以下步骤：
将实施例3制备的5-羧基苯并三唑作为半抗原，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清蛋白(OVA)；所述乳铁蛋白为免疫抗原的载体蛋白，鸡卵清蛋白为包被抗原的载体蛋白。
取26mg的半抗原5-羧基苯并三唑溶解于900μL0.1M MES溶液中，搅拌加入470μL100mg/mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和280μL100mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光搅拌反应4h；取20mg鸡卵清白蛋白(OVA)和20mg乳铁蛋白(LF)分别溶解于5mL PH9.6的CBS缓冲溶液(Na2CO31.69g、NaHCO32.95g用一级水定容至1L)中后，冰浴中搅拌加入半抗原活化液(LF中加入255μL，OVA中加入1395μL)，搅拌均匀后，4℃避光偶联2h；偶联混合物于4℃下用0.01M PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得人工抗原3(人工抗原3(LF)、人工抗原3(OVA))。人工抗原3以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、人工抗原3的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、5-羧基苯并三唑以及人工抗原3(LF)、人工抗原3(OVA)进行紫外扫描测定(190～400nm)，结果如图7所示，人工抗原3的紫外吸收峰与5-羧基苯并三唑的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原3同时具备5-羧基苯并三唑和LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原3偶联成功。
实施例7抗体的制备及鉴定
1、抗体的制备
将实施例4、5、6制备好的载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原分别与等量的免疫佐剂(第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫小鼠。将6～7周大的Balb/C小鼠分别采用背部皮下、各部位皮下、腹腔和脚部多种注射方式免疫，2周后第二次免疫，以后每间隔2周加强免疫一次。第四次加强免疫后1周小鼠尾部取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用腹腔注射加强免疫。3天后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000离心15min，取上清即为抗血清，即为多克隆抗体。
2、抗体的鉴定
分别用实施例4、5、6制备的人工抗原1(OVA)、人工抗原2(OVA)和人工抗原3(OVA)作为人工包被原，经ELISA检测人工抗原免疫Balb/C小鼠所获得的抗血清效价和抑制率。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为抗血清和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将包被原稀释成1μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将抗血清分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，苯并三唑标准品配制成浓度为1μg/mL的溶液。将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，在酶标仪上读取数据。间接竞争ELISA测定结果如表1所示。
选择在450nm波长处，吸光值(OD)为1～1.5的抗血清稀释倍数为抗血清的效价，抑制率通过公式1进行计算。
抑制率＝100-(OD抑制/OD效价)*100(公式1)
表1间接竞争ELISA测定结果
Figure BDA0003220792970000141
Figure BDA0003220792970000151
综合抗血清的效价及抑制率选择效果最优的人工抗原组合，由表1结果可知，抑制率最高为67.32％，其对应的抗体效价仅为2000，效价较低，影响抗体的性能；因此，选择抑制率为57.98％，效价为16000的组合，即以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原3作为免疫原，以载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2作为包被原进行免疫检测。
实施例8包被浓度与抗体稀释倍数
使用棋盘检测法检测实施例5载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2(人工抗原2(OVA))包被浓度与实施例6以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原3(人工抗原3(LF))为免疫原得到的苯并三唑多克隆抗体浓度对苯并三唑检测的影响。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为多克隆抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原2分别稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将苯并三唑多克隆抗体分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，苯并三唑标准品配制成浓度为1μg/mL的溶液；将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
选择在450nm波长处，吸光值为1～1.5时的包被浓度及抗体稀释倍数计算抑制率，检测结果如表2所示。
表2棋盘检测法测定结果
OD值 包被浓度 抗体稀释倍数 抑制率
1.051 2μg/mL 1：8000 47.11％
1.320 1μg/mL 1：4000 53.13％
由表2可知，最优的偶联鸡卵清白蛋白的人工抗原2包被浓度为1μg/mL，苯并三唑多克隆抗体稀释倍数为4000倍。
实施例9抗体的灵敏度
依据实施例8最优的包被浓度和抗体稀释浓度，使用实施例7人工抗原3(LF)制备的多克隆抗体(Ab-人工抗原3(LF))绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线。以实施例5载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2(人工抗原2(OVA))为包被原；以实施例7载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原3(人工抗原3(LF))制备多克隆抗体(Ab-人工抗原3(LF))。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为多克隆抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原2分别稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将苯并三唑标准品分别配制成浓度为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL的溶液，将苯并三唑多克隆抗体(Ab-人工抗原3(LF))稀释4000倍；将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin8.5软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。以苯并三唑为标准品建立ELISA的标准曲线，结果如图8，相关标准曲线参数见表3。
表3抗血清(Ab-人工抗原3(LF))对苯并三唑的检测参数
免疫原 IC<sub>50</sub>(ng/mL) 线性范围(ng/mL) 最低检测限(ng/mL) 相关系数
人工抗原3(LF) 515.77 34.24～7769.23 8.05 0.99248
结合图8和表3可知，以苯并三唑为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好，IC50为515.77ng/mL，最低检测限为8.05ng/mL。
实施例10抗体的特异性
使用实施例7人工抗原3(LF)制备的抗血清(Ab-人工抗原3(LF)，抗血清即为多克隆抗体)对苯并三唑及其衍生剂和常见添加剂进行酶联免疫分析(ELISA)，通过拟合得到其相应的IC50并计算交叉反应率，结果如表4。
表4抗血清对苯并三唑及其衍生物和常见添加剂的交叉反应率
竞争药物 IC<sub>50</sub>(μg/mL) 交叉反应率
苯并三唑 0.51577 100％
邻苯二胺 180.74 0.29％
山梨酸钾 无 ＜0.01％
亚硝酸钠 无 ＜0.01％
亚硫酸钠 无 ＜0.01％
苯甲酸钠 无 ＜0.01％
阿斯巴甜 无 ＜0.01％
糖精钠 无 ＜0.01％
从表4可知，苯并三唑抗体对衍生物苯并三唑的交叉反应率为100％，IC50值为0.51577μg/mL，对邻苯二胺的交叉反应率为0.29％，对其衍生剂和常见添加剂交叉反应率小于0.01％；说明本发明制备得到的苯并三唑抗体对苯并三唑具有很强的检测特异性；本发明的抗体可特异性识别亚硝酸盐的衍生物苯并三唑，对亚硝酸钠本身、衍生剂邻苯二胺以及其他食品添加剂的亲和力很弱，交叉反应很低，可专门用于苯并三唑的检测；由于样品中的亚硝酸盐与邻苯二胺可以快速、高效发生衍生反应生产苯并三唑，因此该方法可以间接检测食品中的亚硝酸盐的含量。
实施例11检测亚硝酸盐的试剂盒
一种检测亚硝酸盐的试剂盒，包括包被有实施例5载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板、苯并三唑标准品、实施例7人工抗原3(LF)制备的多克隆抗体(Ab-人工抗原3(LF))、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液、10％浓硫酸终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
提取、浓缩样品中的亚硝酸盐，加入过量邻苯二胺使亚硝酸盐充分衍生成苯并三唑，然后将样品衍生液、苯并三唑标准品和苯并三唑抗体加入已包被好包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应。利用酶标仪测试吸光值。通过对比样品待测液及苯并三唑标准品的吸光值大小，定量分析样品中的苯并三唑含量，并通过换算得出亚硝酸盐含量，苯并三唑与亚硝酸盐的摩尔比为1：1。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.5-氨基苯并三唑和/或5-羧基苯并三唑作为半抗原在制备苯并三唑人工抗原和/或苯并三唑抗体中的应用。
2.一种苯并三唑人工抗原，其特征在于，为人工抗原1、人工抗原2或人工抗原3，其中，人工抗原1结构式如式(IV)所示，
Figure FDA0003220792960000011
人工抗原2结构式如式(V)所示，
Figure FDA0003220792960000012
人工抗原3，结构式如式(VI)所示，
Figure FDA0003220792960000013
3.权利要求2所述苯并三唑人工抗原在制备苯并三唑抗体中的应用。
4.一种苯并三唑人工抗原组合，其特征在于，包括权利要求2所述苯并三唑人工抗原中的两种或三种。
5.权利要求4所述苯并三唑人工抗原组合在制备苯并三唑抗体和/或检测苯并三唑中的应用。
6.一种苯并三唑抗体，其特征在于，利用权利要求2所述苯并三唑人工抗原免疫动物制备得到。
7.一种检测苯并三唑和/或亚硝酸盐的试剂盒，其特征在于，包含作为包被原的权利要求2所述苯并三唑人工抗原和权利要求6所述苯并三唑抗体。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，检测亚硝酸盐的试剂盒还含有邻苯二胺。
9.一种检测苯并三唑的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求2所述苯并三唑人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
10.一种检测亚硝酸盐的免疫分析方法，其特征在于，将亚硝酸盐与邻苯二胺充分反应生成苯并三唑，以权利要求9所述免疫分析方法检测。
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