CN114276264B - 一种芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用，本发明制备得到了两种半抗原，半抗原FB和半抗原FN，应用半抗原FB偶联载体蛋白LF得到人工抗原FB‑LF，并进一步制备得到用于检测芬氟拉明的特异性抗体，应用人工抗原FN‑OVA作为包被原，该抗体对芬氟拉明具有良好的灵敏度和特异性，半抑制浓度为10.22ng/mL，最低检测限为0.63ng/mL，定量检测范围为1.76～59.13ng/mL，对芬氟拉明类似物无交叉反应，可特异性检测芬氟拉明；本发明建立了芬氟拉明的免疫分析方法，实现了快速准确检测芬氟拉明的目的。

Description

一种芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，更具体地，涉及一种芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

芬氟拉明(fenfluramine)在治疗剂量下是抑制中枢的，具有镇静作用。它促进神经末梢释放5-羟色胺，抑制5-羟色胺在摄取和激动5-羟色胺受体，兴奋下丘脑饱食中枢，从而引起食欲减退。它还能增加葡萄糖的利用，降低血糖。在大剂量下(右旋)芬氟拉明具有兴奋中枢作用。常见的副作用及其中枢效应有口干、腹泻、昏睡、头痛、眩晕、肠胃功能紊乱、失眠、血压的改变(大多为低血压)、不安、心悸、出汗等。单独且长时间使用芬氟拉明减肥时会出现心脏瓣膜损伤的情况。为此，1997年9月FDA发出声明敦促生产商停止芬氟拉明与右旋的市场销售。随后这两种药物相继退出全球市场。我国也已禁止在减肥类保健品中使用芬氟拉明，但仍允许其作为治疗单纯性肥胖症的处方药使用。

目前，分析芬氟拉明等食欲抑制剂的方法以各种色谱技术为主，包括HPLC(APCL-MS)、LCMS/MS(李荫,等.LC-MS/MS检测减肥保健品中4种违禁药物研究[J].新技术新工艺,2017(01):66-69.)、及GC/MS等。然而，这些方法虽然具有检测效率高、准确度高、抗干扰能力强等特点；但是，检测所需的仪器设备昂贵、成本高、样品前处理繁杂、需专业人士操作，不符合大批量样品现场检测要求。

现有技术公开了一种保健食品中非法添加违禁药物芬氟拉明的快速检测方法，该方法是利用试剂A构造酸性反应环境，然后加入试剂B及试剂C，利用亚硝酸离子在酸性介质中与对硝基苯胺发生重氮化反应，再加入适量的碱性试剂C中和过量的酸，调节适宜的pH环境，然后在该环境中使重氮对硝基苯胺可与目标物质芬氟拉明偶联，生成红色偶氮化合物，根据是否出现红色判断是否非法添加了违禁药物芬氟拉明，该方法利用化学反应结合显色判断是否含有芬氟拉明，不能准确检测芬氟拉明的添加量，且化学反应的试剂也会对环境造成影响，不符合大批量样品现场检测要求。现有技术中也还未见有关于芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中芬氟拉明检测方法的缺陷和不足，提供一种芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

本发明的目的在于提供两种芬氟拉明半抗原。

本发明的目的还在于提供芬氟拉明半抗原在制备芬氟拉明人工抗原中的应用。

本发明的目的还在于提供芬氟拉明人工抗原。

本发明的目的还在于提供所述芬氟拉明半抗原和/或人工抗原在制备芬氟拉明人工抗体中的应用。

本发明的目的还在于提供一种芬氟拉明抗体。

本发明的目的还在于提供一种检测芬氟拉明的试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种检测芬氟拉明的免疫分析方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种芬氟拉明半抗原，为半抗原FB或半抗原FN，所述半抗原FB的结构式如式(I)所示，

所述半抗原FB采用系统命名法命名为：4-((1-(3-(三氟甲基)苯基)丙-2-基)氨基)丁酸；

所述半抗原FN的结构式如式(II)所示，

所述半抗原FN采用系统命名法命名为：6-((3-(三氟甲基)苯乙基)氨基)己酸。

本发明所述半抗原FB的制备方法，包括如下步骤：

将间三氟甲基苯丙酮与4-氨基丁酸甲酯溶于甲醇中，充分反应后；冷却至室温，然后硼氢化钾，充分反应；分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后充分水解，调节pH为6～7，即得半抗原FB。

优选地，将间三氟甲基苯丙酮与4-氨基丁酸甲酯溶于甲醇中，60℃反应过夜；冷却至室温后加入硼氢化钾，待气泡消失后加热至60℃反应2h；分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后调节pH为6～7，即得半抗原FB。

优选地，所述间三氟甲基苯丙酮与4-氨基丁酸甲酯的摩尔比为1:2～5。

进一步优选地，所述间三氟甲基苯丙酮与4-氨基丁酸甲酯的摩尔比为1:4。

优选地，所述分离纯化后的反应物与甲醇的摩尔比为1～1.5:2～5。

进一步优选地，所述分离纯化后的反应物与甲醇的摩尔比为1:3。

优选地，所述间三氟甲基苯丙酮与硼氢化钾的摩尔比为1～2:1～3。

进一步优选地，所述间三氟甲基苯丙酮与硼氢化钾的摩尔比为1:1。

本发明所述半抗原FN的制备方法，包括如下步骤：

将2-(3-三氟甲基苯基)乙胺与6-溴己酸甲酯溶于乙腈中，加入碳酸钾和碘化钠充分反应，分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后充分水解，调节pH为6～7，即得半抗原FN。

优选地，将2-(3-三氟甲基苯基)乙胺与6-溴己酸甲酯溶于乙腈中，加入碳酸钾和碘化钠加热回流12h，分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后调节pH为6～7，即得半抗原FN。

优选地，所述2-(3-三氟甲基苯基)乙胺与6-溴己酸甲酯的摩尔比为1:3～6。

进一步优选地，所述2-(3-三氟甲基苯基)乙胺与6-溴己酸甲酯的摩尔比为1:5。

优选地，所述2-(3-三氟甲基苯基)乙胺、碘化钠与碳酸钾的摩尔比为1～1.5:0.1～1:3～8。

进一步优选地，所述2-(3-三氟甲基苯基)乙胺、碘化钠与碳酸钾的摩尔比为1:0.1:6。

优选地，所述分离纯化后的反应物与甲醇的摩尔比为1～2:2～5。

进一步优选地，所述分离纯化后的反应物与甲醇的摩尔比为1:3。

所述半抗原FB和/或半抗原FN在制备芬氟拉明人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种芬氟拉明人工抗原，由所述半抗原FB或半抗原FN偶联载体蛋白得到；由所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的人工抗原FB的结构式如式(III)所示，其中，P为载体蛋白，

由所述半抗原FN偶联载体蛋白得到的人工抗原FN的结构式如式(IV)所示，其中，P为载体蛋白，

优选地，所述载体蛋白(P)为牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)任意一种或几种。

本发明所述人工抗原FB或人工抗原FN的制备方法，利用所述半抗原FB或半抗原FN，通过活泼酯法偶联载体蛋白。

作为上述方法的一个具体实施方式，所述人工抗原FB的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述半抗原FB与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌2～4h，得到半抗原FB活化液；

(2)将载体蛋白加入到PBS缓冲液中；

(3)将步骤(1)的半抗原FB活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白溶液中，4℃反应12h；

(4)用PBS缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得人工抗原FB。

优选地，步骤(1)中所述半抗原FB、NHS与EDC的质量比为1:1～2:1.5～2.5。

更优选地，步骤(1)中所述半抗原FB、NHS与EDC的质量比为1:1.5:1.9。

优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为8mg:1mL。

优选地，步骤(1)中所述半抗原FB与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1～2:1～4。

更优选地，步骤(1)中所述半抗原FB与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1:3。

所述人工抗原FN的制备方法同人工抗原FB。

所述芬氟拉明人工抗原在制备芬氟拉明抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种芬氟拉明人工抗原组合，包括免疫原和包被原，免疫原由所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的，即人工抗原FB；包被原为所述芬氟拉明人工抗原。

优选地，所述包被原由所述半抗原FN偶联载体蛋白得到的，即人工抗原FN。

进一步优选地，所述免疫原由所述半抗原FB偶联载体蛋白乳铁蛋白(LF)得到，即人工抗原FB-LF；所述包被原由所述半抗原FN偶联载体蛋白鸡卵清白蛋白(OVA)得到的，即人工抗原FN-OVA。

所述人工抗原组合在制备芬氟拉明抗体和/或检测芬氟拉明中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种芬氟拉明抗体，利用所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的人工抗原FB免疫动物制备得到。

优选地，所述芬氟拉明抗体是利用所述半抗原FB偶联载体蛋白乳铁蛋白(LF)得到的人工抗原FB-LF免疫动物制备得到。

优选地，所述芬氟拉明抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

一种芬氟拉明多克隆抗体的制备方法，利用所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的人工抗原FB免疫实验动物制备得到。

作为上述方法的一个具体实施方式，芬氟拉明多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)利用所述人工抗原FB配合免疫佐剂免疫实验动物；

(2)首次免疫时，人工抗原FB与等体积的完全弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔；

(3)4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。

(4)加强免疫四次后，心脏取血分离获得血清即得多克隆抗体。

优选地，所述人工抗原FB是所述半抗原FB偶联载体蛋白乳铁蛋白(LF)得到的人工抗原FB-LF。

所述芬氟拉明抗体在检测芬氟拉明和/或制备检测芬氟拉明试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测芬氟拉明的试剂盒，包括所述芬氟拉明人工抗原和所述芬氟拉明抗体。

优选地，所述试剂盒包括所述半抗原FN偶联载体蛋白得到的人工抗原FN和所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的人工抗原FB免疫动物制备得到的抗体。

进一步优选地，所述人工抗原FN是所述半抗原FN偶联载体蛋白鸡卵清白蛋白(OVA)得到的人工抗原FN-OVA，所述人工抗原FB是所述半抗原FB偶联载体蛋白乳铁蛋白(LF)得到的人工抗原FB-LF免疫动物制备得到的抗体。

优选地，所述试剂盒还包括酶标板、芬氟拉明标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中一种或多种。

进一步优选地，所述试剂盒还包括所述芬氟拉明人工抗原包被的酶标板、芬氟拉明标准品、酶结合物、显色液、终止液和浓缩洗涤液。

一种检测芬氟拉明的免疫分析方法，以所述芬氟拉明人工抗原为抗原，以所述半抗原FB偶联载体蛋白得到的人工抗原FB免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法为非诊断治疗目的方法。

优选地，所述免疫分析方法，以所述半抗原FN偶联载体蛋白得到的人工抗原FB为抗原。

优选地，所述免疫分析方法，以偶联载体蛋白鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原FN-OVA为抗原，以偶联载体蛋白乳铁蛋白(LF)的人工抗原FB-LF为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。

所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了两种芬氟拉明半抗原，半抗原FB和半抗原FN，应用半抗原FB和半抗原FN偶联载体蛋白得到人工抗原FB-LF和人工抗原FN-OVA；以半抗原FB与待测物芬氟拉明的骨架结构重叠度高，有效的提高了芬氟拉明人工抗原FB-LF的免疫原性，且人工抗原FB-LF与半抗原FB结构差异较大，形成了较大空间位阻，进一步提高抗体亲和力；

(2)利用所述芬氟拉明人工抗原FB-LF作为免疫原免疫新西兰大白兔，采用辛酸-硫酸铵法纯化后为抗体。所得到的抗体效价高、特异性强、亲和力高，利用所述抗体对芬氟拉明的最低检测限LOD为0.63ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为10.22ng/mL，定量检测范围为1.76～59.13ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广；对芬氟拉明的交叉反应率为100％，对芬氟拉明类似物苯丁胺、氯苯丁胺、苯甲吗啡、安非泼拉酮的均无交叉反应。

(3)本发明的抗体具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在芬氟拉明的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。利用本发明的芬氟拉明半抗原、人工抗原、抗体可实现快速准确检测芬氟拉明的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1半抗原FB的合成路线图。

图2为本发明实施例1半抗原FN的合成路线图。

图3为本申请实施例2半抗原FB、LF、FB-LF紫外扫描图。

图4为本申请实施例2半抗原FN、OVA、FN-OVA紫外扫描图。

图5为本申请实施例5芬氟拉明的抗体间接竞争ELISA标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1芬氟拉明半抗原的合成与鉴定

1.芬氟拉明半抗原FB的合成与鉴定

1.1芬氟拉明半抗原FB的合成

以甲醇作为溶剂，将间三氟甲基苯丙酮(1moL)与4-氨基丁酸甲酯(4moL)常温搅拌至固体溶解，60℃反应过夜。第二天待反应冷却至室温后，投入硼氢化钾(1moL)，待气泡消失后加热至60℃反应2h。分离纯化反应物，然后将分离纯化的反应物溶解于甲醇，分离纯化的反应物与甲醇摩尔比为1:3，加入1mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后用浓度为1mol/L的盐酸调节pH为6～7，即得半抗原FB。半抗原FB的合成路线图如图1所示。

1.2芬氟拉明半抗原FB的鉴定

半抗原FB的核磁鉴定结果：¹H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.53(s,1H),7.51–7.35(m,3H),3.19–3.12(m,3H),3.01(dd,J＝10.0,6.4Hz,2H),2.94(dd,J＝8.9,6.7Hz,2H),2.15(t,J＝7.3Hz,2H),1.42(d,J＝6.5Hz,4H),1.11(s,J＝7.0Hz,3H).

半抗原FB的质谱结果为：MS：C₁₅H₂₀F₃NO₂：289.13，ESI-[M-H]^-：288.1。

半抗原FB的结构式如式(I)所示：

半抗原FB采用系统命名法命名为：4-((1-(3-(三氟甲基)苯基)丙-2-基)氨基)丁酸。

2.芬氟拉明半抗原FN的合成与鉴定

2.1芬氟拉明半抗原FN的合成

以乙腈作为溶剂，将2-(3-三氟甲基苯基)乙胺(1moL)与6-溴己酸甲酯(5moL)，加入碳酸钾(6moL)和碘化钠(0.1moL)加热回流12h，分离纯化反应物。然后将分离纯化的反应物溶解于甲醇，分离纯化的反应物与甲醇的摩尔比为1:3。再加入1mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后用浓度为1mol/L的盐酸调节pH为6～7，即得半抗原FN。半抗原FN的合成路线图如图2所示。

2.2芬氟拉明半抗原FN的鉴定

半抗原FN的核磁鉴定结果：¹H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.41(dd,J＝5.1,3.4Hz,1H),7.38(s,2H),7.35(dd,J＝5.0,1.3Hz,2H),3.46(dd,J＝8.2,6.8Hz,2H),3.19(t,J＝7.0Hz,2H),2.89–2.80(m,2H),2.27(t,J＝8.1Hz,2H),1.94–1.85(m,3H).

半抗原FN的质谱结果为：MSC₁₃H₁₆F₃NO₂：303.14，ESI-[M-H]^-：302.1。

半抗原FN的结构式如式(II)所示：

半抗原FN采用系统命名法命名为：6-((3-(三氟甲基)苯乙基)氨基)己酸。

实施例2芬氟拉明人工抗原的合成和鉴定

1.芬氟拉明人工抗原的合成

将实施例1制备的半抗原FB或半抗原FN，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(LF)或鸡卵清蛋白(OVA)。

称取1moL实施例1制备的半抗原FB，与1.4moL NHS和1.6moL EDC溶解于50～200μLDMF中，室温下避光搅拌2～4h，得到半抗原活化液；将10mg LF加入到1mL的PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)中；将半抗原活化液缓慢逐滴加入LF的PBS缓冲溶液中，4℃反应12h；然后用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得人工抗原FB，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。

其中，PBS缓冲液的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH₂PO₄0.20g，加蒸馏水定容至1000mL。

人工抗原FN的制备同人工抗原FB，区别仅在于载体蛋白为鸡卵清蛋白。

2.芬氟拉明人工抗原的鉴定

对LF、半抗原FB和上述合成的人工抗原FB-LF，进行紫外扫描。紫外扫描结果如图3。

LF、半抗原FB、FB-LF分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现FB-LF的吸收曲线与载体蛋白LF明显不同，半抗原FB在240nm和300nm处各有一个特征峰，而偶联LF后，FB-LF的吸收峰在240nm和300nm处明显比LF高，且相对半抗原FB的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白LF与半抗原FB的复合物，说明FB-LF偶联成功。

对OVA、半抗原FN和上述合成的人工抗原FN-OVA，进行紫外扫描。紫外扫描结果如图4。

OVA、半抗原FN和FN-OVA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现FN-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，半抗原FN在240nm和260nm处各有一个特征峰，而偶联OVA后，FN-OVA的吸收峰在240nm和260nm处明显比OVA高，且相对半抗原FN的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白OVA与半抗原FN的复合物，说明FN-OVA偶联成功。

实施例3抗体的制备

将实施例2制备的FB-LF作为免疫原与免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫新西兰大白兔。所述新西兰大白兔体重为2.5～3kg，采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心10min，取上清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。

实施例4芬氟拉明免疫原和包被原组合优化

本发明还按照实施例2的FB-LF的制备方法制备了以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白的人工抗原FB-BSA和以鸡卵清蛋白(OVA)作为载体蛋白的人工抗原FB-OVA，且均偶联成功。

分别将制备的FB-BSA和实施例2制备的FB-LF作为免疫原，按照实施例3的方法免疫新西兰大白兔制得的芬氟拉明抗体进行包被原筛选，以制备的FB-OVA和实施例2制备的FN-OVA作为包被原，经ELISA检测免疫新西兰大白兔所获得抗血清的效价和抑制率。

具体操作步骤如下：

(1)将芬氟拉明人工抗原FB-OVA、FN-OVA分别用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH9.6)稀释至250ng/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；

(2)每孔加入120μL封闭液(1wt％的鱼胶蛋白)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；

(3)将芬氟拉明抗体用PBST稀释为1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；用PBST将1mg/mL芬氟拉明药物稀释1000倍，为1μg/mL；

效价列：先每孔加50μL的PBST，然后将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；

抑制列：先每孔加50μL的药物，然后将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；在37℃下温育40min，洗涤5次，拍板；

(4)加入羊抗兔二抗Ig-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

(5)加入显色液，在37℃下温育显色10min；

(6)加入10％H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值；

效价是OD₄₅₀为1.0左右所对应的抗血清稀释倍数。

抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％

4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率如表1所示。

表1 4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率

从表1中可以看出，不同的芬氟拉明人工抗原作为免疫的新西兰大白兔产生的抗血清均有一定的效价，所得抗血清对目标分析物芬氟拉明均有不同程度的抑制效果。其中，编号3的免疫原和包被原结构组合所示的抗血清效价1:128000和抑制率88.36％为最佳组合；在该组合下，芬氟拉明抗体不仅能特异性识别目标分析物芬氟拉明，而且抗体灵敏度好；抗血清效价和抑制率均高于编号1、2、4的免疫原和包被原组合，故编号3的免疫原和包被原结构组合为最佳组合。即将FB-LF作为免疫原、FN-OVA作为包被原。

实施例5芬氟拉明的间接竞争ELISA检测方法的建立

1、实验方法

一种检测芬氟拉明的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：

(1)将实施例2制备的人工抗原FN-OVA作为包被原，用包被液稀释至62.5ng/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃孵育过夜(12h)；

(2)弃去包被液，洗涤两次，拍干；

(3)每孔加入120μL封闭液(即质量比1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；

(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；

(5)用实施例4的PBST 1：4000倍稀释实施例3制备的多克隆抗体，并将待检测芬氟拉明药物稀释至1000ng/mL、250ng/mL、62.5ng/mL、15.63ng/mL、3.9ng/mL、0.98ng/mL、0.244ng/mL、0.06ng/mL、0.015ng/mL；

(6)每行加入50μL待检测芬氟拉明药物稀释液(三组平行)，再加入50μL/孔实施例3制备的多克隆抗体稀释液，37℃孵育40min，洗涤五次，拍干；

(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；

(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；

(9)加入50μL 10％的H₂SO₄溶液终止反应，并在450nm处读取OD值

2、实验结果

用于检测芬氟拉明药物的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，从图5可知用于检测芬氟拉明药物的抗体半抑制浓度(IC₅₀)为10.22ng/mL，定量检测范围为1.76～59.13ng/mL，最低检测限(LOD)为0.63ng/mL；说明本发明制备得到的用于检测芬氟拉明的抗体灵敏度高，可以满足检测要求。

实施例6用于检测芬氟拉明的抗体的特异性评价

1、实验方法

通过芬氟拉明抗体与芬氟拉明药物及其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测芬氟拉明的抗体的特异性，抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将芬氟拉明及其类似物苯丁胺(phentermine，PHE)、氯苯丁胺(chlorphentermine，CPT)、苯甲吗啡(phenmetrazine，PHM)和安非泼拉酮(anfepramone，AFP)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例5，得到各类似物的IC₅₀值，按照以下公式计算芬氟拉明交叉反应率(CR)

CR(％)＝IC₅₀(芬氟拉明)/IC₅₀(类似物)×100％

2、实验结果

实施例3制备的芬氟拉明多克隆抗体与芬氟拉明药物及其类似物的交叉反应结果如表2所示，

表2芬氟拉明多克隆抗体与芬氟拉明及其类似物的交叉反应结果

注：NR表示无反应

从表2可知，用于检测芬氟拉明的抗体对芬氟拉明的交叉反应率为100％，IC₅₀为10.22ng/mL，对芬氟拉明类似物苯丁胺、氯苯丁胺、苯甲吗啡、安非泼拉酮的均无交叉；说明用于检测芬氟拉明的抗体对芬氟拉明的识别能力高、特异性强，可以有效地排除芬氟拉明类似物苯丁胺、氯苯丁胺、苯甲吗啡、安非泼拉酮对芬氟拉明检测的干扰，能够专门用于对芬氟拉明的检测。

实施例7检测芬氟拉明的试剂盒的开发

1.试剂盒的组成

检测芬氟拉明的试剂盒，包含下述各部分：

(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例2制备的芬氟拉明人工抗原FN-OVA作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有质量比1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；

(2)芬氟拉明标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/L，200μg/L，40μg/L，8μg/L，1.6μg/L，0.32μg/L，0.064μg/L，0.0128μg/L；

(3)实施例3制备的芬氟拉明多克隆抗体；

(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的芬氟拉明多克隆抗体；

(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L H₂SO₄；

(7)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

2.样品检测

将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔；充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔OD值。

3.检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0μg/L)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以芬氟拉明标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中芬氟拉明的实际浓度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种芬氟拉明半抗原在制备芬氟拉明人工抗原中的应用，其特征在于，所述半抗原的结构式如式（I）所示，

式（I）。

2.一种芬氟拉明半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式(II)所示，

式(II)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芬氟拉明半抗原的制备方法包括以下步骤：将间三氟甲基苯丙酮与4-氨基丁酸甲酯溶于甲醇中，充分反应后；冷却至室温，然后硼氢化钾，充分反应；分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后充分水解，调节pH为6～7，即得。

4.权利要求2所述芬氟拉明半抗原的制备方法，其特征在于，将2-(3-三氟甲基苯基)乙胺与6-溴己酸甲酯溶于乙腈中，加入碳酸钾和碘化钠充分反应，分离纯化，将分离纯化后的反应物溶解于甲醇，然后充分水解，调节pH为6～7，即得。

5.权利要求2所述芬氟拉明半抗原在制备芬氟拉明人工抗原中的应用。

6.一种芬氟拉明人工抗原，其特征在于，由权利要求1中的结构式如式（I）所示的芬氟拉明半抗原偶联乳铁蛋白得到；或由权利要求2中的结构式如式(II)所示的芬氟拉明半抗原偶联鸡卵清白蛋白得到。

7.一种芬氟拉明人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求1中的结构式如式（I）所示的芬氟拉明半抗原偶联乳铁蛋白得到；所述包被原由权利要求2中的结构式如式(II)所示的芬氟拉明半抗原偶联鸡卵清白蛋白得到。

8.一种检测芬氟拉明的试剂盒，其特征在于，包含芬氟拉明抗体和/或权利要求7中所述的包被原；所述芬氟拉明抗体为由权利要求7中所述的免疫原免疫动物制备得到的抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、芬氟拉明标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中一种或多种。

10.一种检测芬氟拉明的免疫分析方法，其特征在于，用权利要求8中所述的芬氟拉明抗体和/或权利要求7中所述的包被原进行检测；所述免疫分析方法为非疾病诊断治疗目的方法。

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