CN114621175B - 一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用，本发明制备得到了两种半抗原，半抗原B‑PH和半抗原B‑SG，应用半抗原B‑PH偶联载体蛋白BSA得到人工抗原B‑PH‑BSA，并进一步制备得到用于检测苯醚甲环唑的特异性抗体，以人工抗原B‑SG‑OVA作为包被原；该抗体对苯醚甲环唑具有良好的灵敏度和特异性，半抑制浓度为1.75ng/mL，最低检测限为0.022ng/mL，定量检测范围为0.11～27.57ng/mL，对苯醚甲环唑类似物无交叉反应，可特异性检测苯醚甲环唑；本发明提供了更优的苯醚甲环唑的免疫检测原料，为苯醚甲环唑的快速准确检测提供了更优选择。

Description

一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
苯醚甲环唑(difenoconazole)是一种毒性低，化学性质稳定，持效期长的广谱三唑类杀菌剂，属于14α-甾醇脱甲基化抑制剂，可以干扰菌丝生长，抑制病原体孢子萌发，最终抑制真菌生长。其广泛用于防治水稻、葡萄、梨、香蕉、甜菜等多种作物上的叶枯病、炭疽病、叶斑病、白粉病、黑星病等病害。但大量施用苯醚甲环唑会造成农药残留，残留的苯醚甲环唑会进入生态系统，对生态环境、动物和人类健康产生不利影响。按照我国农药的毒性分级标准，苯醚甲环唑的毒性经口大于500mg/kg，对人的每日容许摄入量为0.01mg/kg体重。
苯醚甲环唑常规检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等仪器方法，然而，这些方法虽然具有检测效率高、准确度高、抗干扰能力强等特点；但是，检测所需的仪器设备昂贵、成本高、样品前处理繁杂、需专业人士操作，不符合大批量样品现场检测要求。
基于抗原-抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。现有技术公开了一些用于苯醚甲环唑检测的半抗原、抗原、抗体等，但是存在着苯醚甲环唑半抗原合成步骤多、反应副产物多、抗体检测限相对较高等问题(冯久慧.苯醚甲环唑免疫检测方法的研究[D].天津科技大学,2016.)。
免疫分析方法的关键在于设计出合适的半抗原，从而制备出灵敏度高、特异性强的抗体，因此，有必要研究出全新的苯醚甲环唑半抗原，简化了半抗原的合成步骤，降低抗体的检测限，提高苯醚甲环唑抗体的特异性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中苯醚甲环唑免疫检测半抗原、抗体存在的缺陷和不足，提供一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
本发明的目的在于提供苯醚甲环唑半抗原。
本发明的目的还在于提供所述苯醚甲环唑半抗原在制备苯醚甲环唑人工抗原中的应用。
本发明的目的还在于提供苯醚甲环唑人工抗原。
本发明的目的还在于提供所述苯醚甲环唑人工抗原在制备苯醚甲环唑抗体中的应用。
本发明的目的还在于提供一种苯醚甲环唑多克隆抗体。
本发明的目的还在于提供一种苯醚甲环唑的检测方法。
本发明的目的还在于提供一种检测苯醚甲环唑的试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种苯醚甲环唑半抗原，为半抗原B-PH或半抗原B-SG，所述半抗原B-PH的结构式如式(I)所示，
Figure BDA0003545829490000021
所述半抗原B-PH采用系统命名法命名为：4-((2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲氧基)苯甲酸，即4-((2-(2-chloro-4-(4-chlorophenoxy)phenyl)-4-methyl-1,3-dioxolan-2-yl)methoxy)benzoic acid；
所述半抗原B-SG的结构式如式(II)所示，
Figure BDA0003545829490000022
Figure BDA0003545829490000031
所述半抗原B-SG采用系统命名法命名为：4-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)-4-氧代丁酸。
本发明式(I)所示化合物(半抗原B-PH)的制备方法，包括如下步骤：
将对羟基苯甲酸甲酯的无水(N,N)二甲基甲酰胺(DMF)溶液与氢化钠混合，常温反应，再与2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环反应，55～60℃充分反应；分离纯化，将分离纯化的反应物充分水解，调节pH为6～7，即得半抗原B-PH。
优选地，将对羟基苯甲酸甲酯的无水(N,N)二甲基甲酰胺(DMF)溶液与氢化钠混合，常温搅拌半个小时后加入2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环，60℃反应2h；分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物溶解于甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即得半抗原B-PH。
优选地，所述对羟基苯甲酸甲酯：氢化钠：2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环的摩尔比为1:4～8：0.8～1.2。
进一步优选地，所述对羟基苯甲酸甲酯：氢化钠：2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环的摩尔比为1：6：1。
所述苯醚甲环唑结构式为：
Figure BDA0003545829490000032
本发明式(II)所示化合物(半抗原B-SG)的制备方法，包括如下步骤：
将4-(4-氯苯氧基)苯酚和丁二酸酐的吡啶混合溶液与4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合，回流充分反应，分离纯化，即得半抗原B-SG。
优选地，将4-(4-氯苯氧基)苯酚和丁二酸酐的吡啶溶液与4-二甲氨基吡啶(DMAP)106～110℃回流反应过夜，通过柱层析法分离纯化，即得半抗原B-SG。
优选地，所述4-(4-氯苯氧基)苯酚：丁二酸酐的摩尔比为1:1～2。
进一步优选地，所述4-(4-氯苯氧基)苯酚：丁二酸酐的摩尔比为1:1。
所述半抗原B-PH和/或半抗原B-SG在制备苯醚甲环唑人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种苯醚甲环唑人工抗原，由所述半抗原B-PH或半抗原B-SG偶联载体蛋白得到，由所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH的结构式如式(III)所示，其中，P为载体蛋白，
Figure BDA0003545829490000041
由所述半抗原B-SG偶联载体蛋白得到的人工抗原B-SG的结构式如式(IV)所示，其中，P为载体蛋白，
Figure BDA0003545829490000042
优选地，所述载体蛋白(P)为牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)或者鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)中的任意一种或几种。
本发明所述人工抗原B-PH或人工抗原B-SG的制备方法，利用半抗原B-PH或半抗原B-SG，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原B-PH的制备方法，包括如下步骤：
(1)将半抗原B-PH与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光充分反应，得到半抗原B-PH活化液；
(2)将载体蛋白与PBS缓冲液混合，制备载体蛋白溶液；
(3)将步骤(1)制备的半抗原B-PH活化液与步骤(2)制备的载体蛋白溶液混合，4℃下充分反应；
(4)用PBS缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得人工抗原B-PH。
优选地，步骤(1)所述充分反应是室温下避光搅拌2～4h。
优选地，步骤(1)所述半抗原B-PH、NHS与EDC的摩尔比为1:2～4:1～3。
更优选地，步骤(1)所述半抗原B-PH、NHS与EDC的摩尔比为1:2:1.5。
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为8～12mg:1～2mL。
更优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为10mg:1mL。
优选地，步骤(3)所述混合是将步骤(1)制备的半抗原B-PH活化液缓慢逐滴加入步骤(2)制备的载体蛋白溶液中；所述充分反应是4℃下反应12h。
所述人工抗原B-SG的制备方法同人工抗原B-PH。
所述苯醚甲环唑人工抗原在制备苯醚甲环唑抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种苯醚甲环唑人工抗原组合，包括免疫原和包被原，免疫原由所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到，即人工抗原B-PH；包被原为所述半抗原B-PH或半抗原B-SG偶联载体蛋白得到，即人工抗原B-PH或人工抗原B-SG。
优选地，所述包被原由所述半抗原B-SG偶联载体蛋白得到的，即人工抗原B-SG。
进一步优选地，所述免疫原由所述半抗原B-PH偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)得到，即人工抗原B-PH-BSA；所述包被原由所述B-SG偶联载体蛋白鸡卵清蛋白(OVA)得到，即人工抗原B-SG-OVA。
所述人工抗原组合在制备苯醚甲环唑抗体和/或检测苯醚甲环唑中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种苯醚甲环唑多克隆抗体，利用所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH免疫动物制备得到。
优选地，所述苯醚甲环唑多克隆抗体是利用所述半抗原B-PH偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)得到的人工抗原B-PH-BSA免疫动物制备得到。
一种苯醚甲环唑多克隆抗体的制备方法，利用所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH免疫实验动物制备得到。
优选地，利用所述半抗原B-PH偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)得到的人工抗原B-PH-BSA免疫实验动物制备得到。
苯醚甲环唑多克隆抗体在检测苯醚甲环唑和/或制备检测苯醚甲环唑试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种苯醚甲环唑的检测方法，以所述苯醚甲环唑人工抗原为抗原，以所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；所述检测方法为非诊断检测目的方法。
优选地，以半抗原B-SG偶联载体蛋白得到的人工抗原B-SG为抗原。
进一步优选地，以载体蛋白为鸡卵清蛋白(OVA)人工抗原B-SG-OVA为抗原；以载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的人工抗原B-PH-BSA为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，所述抗体为所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH免疫动物制备得到的多克隆抗体。
所述检测方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
一种检测苯醚甲环唑的试剂盒，包括所述苯醚甲环唑人工抗原和所述苯醚甲环唑多克隆抗体。
优选地，所述试剂盒包括所述半抗原B-SG偶联载体蛋白得到的人工抗原B-SG和所述半抗原B-PH偶联载体蛋白的人工抗原B-PH免疫动物制备得到的抗体。
进一步优选地，所述试剂盒包括所述半抗原B-SG偶联载体蛋白鸡卵清蛋白(OVA)得到的人工抗原B-SG-OVA和所述半抗原B-PH偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)的人工抗原B-PH-BSA免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述抗体为所述半抗原B-PH偶联载体蛋白得到的人工抗原B-PH免疫动物制备得到的多克隆抗体。
优选地，所述试剂盒还包括酶标板、苯醚甲环唑标准品、酶标记的抗体、显色液、终止液或洗涤液中一种或多种。
优选地，所述试剂盒还包括所述苯醚甲环唑人工抗原包被的酶标板、苯醚甲环唑标准品、辣根过氧化物酶标记的苯醚甲环唑多克隆抗体、显色液、终止液和洗涤液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了两种苯醚甲环唑半抗原，半抗原B-PH和半抗原B-SG，应用半抗原B-PH偶联牛血清白蛋白(BSA)制备得到的人工抗原B-PH作为免疫原，进而制备得到苯醚甲环唑特异性抗体，应用半抗原B-SG偶联鸡卵清蛋白(OVA)制备得到的人工抗原B-SG-OVA作为包被原；所得到的抗体效价高、特异性强、亲和力高，对苯醚甲环唑的最低检测限LOD为0.022ng/mL，半抑制浓度IC50为1.75ng/mL，定量检测范围为0.11～27.57ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广，检测限更低；本发明的抗体具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点；利用本发明的苯醚甲环唑人工抗原、抗体可更准确的检测样品中的苯醚甲环唑。
附图说明
图1为本发明实施例1半抗原B-PH的合成路线图。
图2为本发明实施例1半抗原B-SG的合成路线图。
图3为本申请实施例2半抗原B-PH、BSA、B-PH-BSA紫外扫描图。
图4为本申请实施例2半抗原B-SG、OVA、B-SG-OVA紫外扫描图。
图5为本申请实施例5苯醚甲环唑的抗体间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1苯醚甲环唑半抗原的合成与鉴定
1.苯醚甲环唑半抗原B-PH的合成与鉴定
(1)苯醚甲环唑半抗原B-PH的合成
将对羟基苯甲酸甲酯(1mol)溶于无水(N,N)二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入氢化钠(6mol)，常温搅拌半个小时后加入2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环(1mol)，60℃反应2h，将反应后的溶液通过柱层析法分离纯化，然后将分离纯化的反应物溶解于甲醇，分离纯化的反应物与甲醇摩尔比为1:5，然后加入1mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后用浓度为1mol/L的盐酸调节pH为6～7，所得沉淀即得半抗原B-PH。半抗原B-PH的合成路线图如图1所示。
(2)苯醚甲环唑半抗原B-PH的鉴定
半抗原B-PH的核磁鉴定结果：1HNMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.90–7.77(m,2H),7.63(d,J＝8.7Hz,1H),7.31–7.25(m,2H),6.93–6.84(m,5H),6.81(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),4.44–4.34(m,2H),4.06(dt,J＝7.4,6.0Hz,1H),3.94(dd,J＝7.7,6.0Hz,1H),3.57–3.47(m,2H),1.22(dd,J＝6.1,3.6Hz,3H).
半抗原B-PH的质谱结果为：MS：C24H20Cl2O6：475.32，ESI-[M-H]-：474.3。
半抗原B-PH的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003545829490000081
半抗原B-PH采用系统命名法命名为：4-((2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲氧基)苯甲酸，即
4-((2-(2-chloro-4-(4-chlorophenoxy)phenyl)-4-methyl-1,3-dioxolan-2-yl)methoxy)benzoic acid。
2.苯醚甲环唑半抗原B-SG的合成与鉴定
(1)苯醚甲环唑半抗原B-SG的合成
将4-(4-氯苯氧基)苯酚(1mol)与丁二酸酐(1mol)溶于吡啶，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2mol)，回流反应过夜，通过柱层析法分离出未反应的原料和副产物，即得半抗原B-SG。半抗原B-SG的合成路线图如图2所示。
(2)苯醚甲环唑半抗原B-SG的鉴定
半抗原B-SG的核磁鉴定结果：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.33(d,J＝8.9Hz,1H),7.11(d,J＝9.0Hz,1H),6.99(dd,J＝26.9,8.9Hz,2H),2.84(dd,J＝7.5,5.5Hz,1H),2.70(dd,J＝7.5,5.6Hz,1H).
半抗原B-SG的质谱结果为：MS：C16H13ClO5：320.73，ESI-[M-H]-：319.7。
半抗原B-SG的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0003545829490000091
半抗原B-SG采用系统命名法命名为：4-(4-(4-氯苯氧基)苯氧基)-4-氧代丁酸，即4-(4-(4-chlorophenoxy)phenoxy)-4-oxobutanoic acid。
实施例2苯醚甲环唑人工抗原的合成和鉴定
1.苯醚甲环唑人工抗原的合成
将实施例1制备的半抗原B-PH和半抗原B-SG，通过活泼酯法偶联牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)。
称取1mmoL实施例1制备的半抗原B-PH，与2mmoL N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.5mmoL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于50～200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌2～4h，得到半抗原B-PH活化液；将10mg BSA加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；将半抗原B-PH活化液缓慢逐滴加入BSA的PBS缓冲溶液中，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得苯醚甲环唑人工抗原B-PH-BSA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，PBS缓冲液的配方：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
人工抗原B-SG的制备同人工抗原B-PH-BSA，区别在于载体蛋白为鸡卵清蛋白(OVA)，制备得到人工抗原B-SG-OVA。
2.苯醚甲环唑人工抗原的鉴定
(1)对载体蛋白BSA、半抗原B-PH和上述合成的人工抗原B-PH-BSA，进行紫外扫描。紫外扫描结果如图3。
BSA、B-PH、B-PH-BSA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现B-PH-BSA的吸收曲线与载体蛋白BSA明显不同，半抗原B-PH在240nm和270nm处各有一个特征峰，而偶联BSA后，B-PH-BSA的吸收峰在240nm至300nm处明显比BSA高，且相对半抗原B-PH的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，说明反应产物是载体蛋白BSA与半抗原B-PH的复合物，说明B-PH-BSA偶联成功。
(2)对载体蛋白OVA、半抗原B-SG和上述合成的人工抗原B-SG-OVA，进行紫外扫描。紫外扫描结果如图4。
OVA、B-SG和B-SG-OVA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现B-SG-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，半抗原B-SG在240nm处有一个特征峰，而偶联OVA后，B-SG-OVA的吸收峰在240nm至300nm处明显比OVA高，且相对半抗原B-SG的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，说明反应产物是载体蛋白OVA与半抗原B-SG的复合物，说明B-SG-OVA偶联成功。
实施例3抗体的制备
1.多克隆抗体的制备
将实施例2制备的B-PH-BSA作为免疫原与免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫体重为2.5～3kg新西兰大白兔。采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心10min，取上清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2.单克隆抗体制备
利用实施例2制备的B-PH-BSA免疫雌性Bal b/c小鼠。取人工抗原B-PH-BSA与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀后，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，尾部取血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次免疫，3天后取脾脏细胞进行融合，制备单克隆抗体。
实施例4苯醚甲环唑免疫原和包被原组合优化
本发明还按照实施例2的B-PH-BSA的制备方法制备了以乳铁蛋白(LF)为载体蛋白的人工抗原B-PH-LF和以鸡卵清蛋白(OVA)作为载体蛋白的人工抗原B-PH-OVA，且均偶联成功。
将制备的B-PH-LF和实施例2制备的B-PH-BSA作为免疫原，按照实施例3的方法免疫新西兰大白兔制得的苯醚甲环唑多克隆抗体进行包被原筛选，以制备的B-PH-OVA和实施例2制备的B-SG-OVA作为包被原，经ELISA检测免疫新西兰大白兔所获得抗血清的效价和抑制率。
具体操作步骤如下：
(1)将苯醚甲环唑人工抗原B-PH-OVA和B-SG-OVA分别用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至250ng/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；
(2)每孔加入120μL封闭液(1wt％的鱼胶蛋白)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
(3)将苯醚甲环唑多克隆抗体用PBST稀释为1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；用PBST将1mg/mL苯醚甲环唑药物稀释1000倍，为1μg/mL；
效价列：先每孔加50μL的PBST，然后将倍比稀释得到苯醚甲环唑多克隆抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；
抑制列：先每孔加50μL的药物，然后将倍比稀释得到苯醚甲环唑多克隆抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；在37℃下温育40min，洗涤5次，拍板；
(4)加入羊抗兔二抗Ig-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；
(5)加入显色液，在37℃下温育显色10min；
(6)加入10％H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值；
效价是OD450为1.0左右所对应的抗血清稀释倍数。
抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％
4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率如表1所示。
表1 4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率
Figure BDA0003545829490000121
从表1中可以看出，不同的苯醚甲环唑人工抗原作为免疫的新西兰大白兔产生的抗血清均有一定的效价，所得抗血清对目标分析物苯醚甲环唑均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的免疫原和包被原结构组合所示的抗血清效价1:256000和抑制率92.64％为最佳组合；在该组合下，苯醚甲环唑多克隆抗体不仅能特异性识别目标分析物苯醚甲环唑，而且抗体灵敏度好；抗血清效价和抑制率均高于编号2、3、4的免疫原和包被原组合，故编号1的免疫原和包被原结构组合为最佳组合。即将B-PH-BSA作为免疫原、B-SG-OVA作为包被原。
实施例5苯醚甲环唑的间接竞争ELISA检测方法的建立
1.苯醚甲环唑的间接竞争ELISA检测
一种检测苯醚甲环唑的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)将实施例2制备的人工抗原B-SG-OVA作为包被原，用包被液稀释至62.5ng/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃孵育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤两次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
(5)用实施例4的PBST 1：4000倍稀释实施例3制备的多克隆抗体，并将苯醚甲环唑药物稀释至10000ng/mL、1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL；
(6)每行加入50μL待检测苯醚甲环唑药物稀释液(三组平行)，再加入50μL/孔实施例3制备的多克隆抗体稀释液，37℃孵育40min，洗涤五次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 10％的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
2.检测结果
用于检测苯醚甲环唑的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，从图5可知用于检测苯醚甲环唑的抗体半抑制浓度(IC50)为1.75ng/mL，定量检测范围为0.11～27.57ng/mL，最低检测限(LOD)为0.022ng/mL；说明本发明制备得到的用于检测苯醚甲环唑的抗体灵敏度高，可以满足检测要求。
实施例6用于检测苯醚甲环唑的抗体的特异性评价
1.实验方法
通过苯醚甲环唑多克隆抗体与苯醚甲环唑药物及其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测苯醚甲环唑的抗体的特异性，抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将苯醚甲环唑及其类似物己唑醇(Hexaconazole)、三唑醇(Triadimenol)、多效醇(Paclobutrazol)、戊唑醇(Tebuconazole)、氟环唑(Epoxiconazole)、氟硅唑(Flusilazole)、联苯三唑醇(Bitertanol Standard)、丙环唑(Propiconazole)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例5，得到各类似物的IC50值，按照以下公式计算苯醚甲环唑交叉反应率(CR)，
CR(％)＝IC50(苯醚甲环唑)/IC50(类似物)×100％。
2.实验结果
实施例3制备的苯醚甲环唑多克隆抗体与苯醚甲环唑药物及其类似物的交叉反应结果如表2所示，
表2苯醚甲环唑多克隆抗体与苯醚甲环唑及其类似物的交叉反应结果
Figure BDA0003545829490000141
注：NR表示无反应，无反应即抗体不识别该类似物。
从表2可知，用于检测苯醚甲环唑的多克隆抗体对苯醚甲环唑的交叉反应率为100％，IC50为1.75ng/mL，对苯醚甲环唑类似物己唑醇、三唑醇、多效醇、戊唑醇、氟环唑、氟硅唑、联苯三唑醇、丙环唑均无交叉；说明用于检测苯醚甲环唑的抗体对苯醚甲环唑的识别能力高、特异性强，可以有效地排除苯醚甲环唑类似物己唑醇、三唑醇、多效醇、戊唑醇、氟环唑、氟硅唑、联苯三唑醇、丙环唑对苯醚甲环唑检测的干扰，能够专门用于对苯醚甲环唑的检测。
实施例7检测苯醚甲环唑的试剂盒的开发
1.试剂盒的组成
检测苯醚甲环唑的试剂盒，包含下述各部分：
(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例2制备的苯醚甲环唑人工抗原B-SG-OVA作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1wt％～3wt％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；
(2)苯醚甲环唑标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/L，200μg/L，40μg/L，8μg/L，1.6μg/L，0.32μg/L，0.064μg/L，0.0128μg/L；
(3)实施例3制备的苯醚甲环唑多克隆抗体；
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的苯醚甲环唑多克隆抗体；
(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L H2SO4；
(7)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
2.样品检测
将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔；充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔OD值。
3.检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0μg/L)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以苯醚甲环唑标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中苯醚甲环唑的实际浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种苯醚甲环唑半抗原，其特征在于，所述苯醚甲环唑半抗原的结构式如式(I)所示，
Figure FDA0004242817670000011
2.一种苯醚甲环唑半抗原，其特征在于，所述苯醚甲环唑半抗原的结构式如式(II)所示，
Figure FDA0004242817670000012
3.式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，将对羟基苯甲酸甲酯的无水(N,N)二甲基甲酰胺溶液与氢化钠混合，常温反应，再与2-(溴甲基)-2-(2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基)-4-甲基-1,3-二氧戊环反应，55～60℃充分反应；分离纯化，将分离纯化的反应物充分水解，调节pH为6～7，即得；
Figure FDA0004242817670000013
4.式(II)所示化合物的制备方法，其特征在于，将4-(4-氯苯氧基)苯酚和丁二酸酐的吡啶混合溶液与4-二甲氨基吡啶混合，回流充分反应，分离纯化，即得；
Figure FDA0004242817670000021
5.权利要求1或2所述苯醚甲环唑半抗原在制备苯醚甲环唑人工抗原中的应用。
6.一种苯醚甲环唑人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述苯醚甲环唑半抗原偶联牛血清白蛋白得到，或由权利要求2所述苯醚甲环唑半抗原偶联鸡卵清蛋白得到。
7.一种苯醚甲环唑人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求1所述苯醚甲环唑半抗原偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由权利要求2所述苯醚甲环唑半抗原偶联鸡卵清蛋白得到。
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