EA005380B1 - Иммунологический анализ неоникотинильных инсектицидов - Google Patents
Иммунологический анализ неоникотинильных инсектицидов Download PDFInfo
- Publication number
- EA005380B1 EA005380B1 EA200200620A EA200200620A EA005380B1 EA 005380 B1 EA005380 B1 EA 005380B1 EA 200200620 A EA200200620 A EA 200200620A EA 200200620 A EA200200620 A EA 200200620A EA 005380 B1 EA005380 B1 EA 005380B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- neonicotinoid
- formula
- sample
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
- C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/61—Halogen atoms or nitro radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение раскрывает иммуногены для генерации антинеоникотиноидных антител, а также антитела, способы, реагенты и наборы для определения наличия одного или нескольких неоникотиноидных инсектицидов в образце с помощью иммунологического анализа. Настоящее изобретение имеет особое применение для определения концентрации неоникотиноидных инсектицидов, нанесенных на растительные воспроизводимые материалы, такие как семена, упомянутое антитело является селективным в отношении соединения формулы (I), где А означает 2-хлорпирид-5-ил или 2-хлортиазол-5-ил; R и Rозначают независимо друг от друга водород или (С-С)алкил; Rи Rозначают независимо друг от друга водород или (С-С)алкил или Rи Rвместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолиновое или оксадиазиновое кольцо; и Х означает -N-NOили -N-CN. Заявлено также соединение формулы (IA) и белковый конъюгат формулы (II), в котором PR означает остаток белка молекулы переносчика, выбранной из группы, состоящей из очищенного белкового производного (PPD, туберкулина) из вируса Diptheria, бычьего сывороточного альбумина, катионированного бычьего сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, овальбумина и гемоцианина из моллюска keyhole limpet (Megathura crenulata); или остатка фермента, выбранного из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, пероксидазы хрена и β-галактозидазы.
Description
Данное изобретение относится к иммунологическим анализам пестицидов и к антителам и реагентам для проведения таких анализов. Кроме того, изобретение относится к способам осуществления таких анализов и к наборам, содержащим реагенты для применения на практике таких способов. Изобретение имеет специфическое применение для определения и количественной оценки неоникотиноидных инсектицидов в образце.
Инсектициды
Применение инсектицидов для контроля насекомых-вредителей в сельскохозяйственных культурах является универсальной практикой. Данная практика достигла высокой степени коммерческого успеха, поскольку было показано, что такой контроль может повысить урожайность. Однако эффективное применение инсектицидов требует правильной организации с точки зрения устойчивости насекомых и затрагивает воздействие на окружающую среду и работника. Одним из решений, применимых к этой проблеме, было обеспечение новых, более активных инсектицидов, чтобы уменьшить необходимость в более старых, высокотоксичных инсектицидах и снизить нагрузки на окружающую среду.
Одним новым классом инсектицидов, получившим значительное признание на рынке, являются так называемые «неоникотиноидные» инсектициды. Соединения данного класса включают, например, имидаклоприд, ацетамиприд и тиаметоксам, которые описаны в патентах И8 № 4742060 и № 5304566 и в ЕР580553А2, соответственно.
Прямая обработка растительных воспроизводимых материалов (таких, как семена) инсектицидами является целевым применением, которое направлено на необходимость снижения воздействия на окружающую среду и работника и накопленной устойчивости насекомых при нанесении по отдельности или в сочетании с нанесением инсектицидов на листву и борозду. Однако необходимо обратить внимание, что аппарат для покрытия семян калиброван должным образом для того, чтобы инсектицид равномерно наносился на семенной материал с целью избежать, помимо других, проблему эффективности действия инсектицидов и фитотоксичности семян. Можно использовать аналитические измерения, чтобы определить, работает ли надлежащим образом оборудование для покрытия семян, если оно калибровано правильно, и может ли обработанная масса семян быть выпущена для поставки. Однако традиционные способы определения остатков инсектицидов на семенах чрезвычайно длительны и требуют больших затрат, поскольку они требуют высокоспециализированных и дорогих аналитических методик, таких как газожидкостная или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Обе хроматографические методики требуют дорогостоящего оборудования, которое дорого обслуживать и на котором должны работать специалисты высокой квалификации. Производственные объекты для обработки семян и производители сельскохозяйственной продукции обычно не имеют такого оборудования или кадрового состава, поэтому семена должны отправляться во внешние аналитические лаборатории. Если образцы анализируются такими лабораториями на основе быстрой оборачиваемости, производственный объект, обрабатывающий семена, может получать аналитические данные приблизительно через 24 ч после отправки. Замедленные анализы приводят к более длительным перерывам в работе. Эти перерывы приводят к незанятому машинному времени в обрабатывающих объектах. Задержки в отправлении обработанных семян также неизбежны.
В этой области существует настоятельная необходимость усовершенствовать существующие методики измерения, чтобы сделать их менее дорогими, более эффективными и более легко выполнимыми. Требуемые способы также должны быть применимы за пределами лаборатории, в полевых условиях, так чтобы они могли быстро и достоверно обеспечить персонал, обрабатывающий растение или семена, информацией о наличии и концентрациях данного инсектицида в образце семян. В этом отношении важно, чтобы способы позволяли дифференцировать пестицидный материал от других продуктов, делая возможным количественное определение нужного активного ингредиента, присутствующего в семенах. Однако все еще остается много серьезных ограничений, присущих классическим аналитическим методам. Некоторые из этих ограничений были бы преодолимы путем использования методики иммунологического анализа.
Иммунологические анализы и определение пестицидов
Созданные первоначально для использования в медицине и ветеринарии иммунологические анализы начали находить все большее применение в сельскохозяйственной области. Например, доступны иммунологические анализы для определения и количественной оценки болезней сельскохозяйственных культур, афлатоксинов и некоторых антибиотиков. Несмотря на то что иммунологические анализы для определения пестицидов описаны в научной литературе (смотри ниже), они стали доступны на коммерческой основе только в течение последнего десятилетия.
Иммунологические анализы основываются на высокоспецифичных антителах и относительно простых аналитических приборах для определения и/или количественной оценки большого разнообразия материалов-мишений. Антитело, а не прибор или условия работы, обеспечивает аналитическую специфичность. Следовательно, иммунологические анализы могут проводиться на относительно неочищенных образцах. Более того, иммунологические способы были оптимизированы для применения в удаленной, не лабораторной окружающей обстановке, допускающего их использование в поле так же, как и в специализированной лаборатории.
- 1 005380
Известны иммунологические способы для определения некоторых гербицидов, включая 2,4дихлорфеноксиуксусную кислоту (Р1еекег 1.. 1. Аккос. ОГГ. Апа1. Сйет. 70:874-878 (1986)), хлорсульфурон (Ке11еу М. и др., 1. Адпс. Рооб Сйет. 33:962-965 (1985)), галоацетамиды (ХУтхепйигдег Р.А. и др., Еигореап Ра1еп1 Риййсайоп ЕР 340198, 1989) и множество пестицидов, включая дифлубензурон (\У1е 8.1. и др., 1. Адпс. Рооб Сйет. 30:949-957 (1982), металаксил (Ые^коте ν.Η., 1. Адлс. Рооб Сйет. 33:528-530 (1985)) и паратион (Етсе1доуюй С.И. и др., 1. Адлс. Рооб Сйет. 29:559-563 (1981)). Описан также способ для иммунологического определения атразина (патент И8 № 4530786). Известны также иммунологические анализы для цианазина, диклофопметила, пентахлорфенола, 2,4,5-Т и тербутрина.
Во всех упомянутых выше иммунологических способах использовали поликлональные антисыворотки, которые получали от животных-хозяев (обычно от кроликов), иммунизированных соответствующим антигеном (иммуногеном). Совсем недавно раскрыты моноклональные антитела (тАйк), специфичные к атразину, его производным и продуктам распада, и использование таких тАйк в иммунологических анализах (8с1йаерр| и др., Еигореап Ра1еп1 Риййсайоп ЕР 365818 (1990)).
Из-за своей низкой молекулярной массы инсектициды не являются иммуногенными и не вызывают образование специфических антител у животного-хозяина. Следовательно, создание иммунологического анализа инсектицидов требует множества стадий, начиная с создания гаптенов, производных инсектицида, которые поддерживают структурную специфичность молекулы инсектицида и в то же время допускают конъюгацию с белком-«переносчиком», имеющим более высокую молекулярную массу. Кроме того, для скрининга антител при воплощении способа их продукции могут быть также получены дополнительные гаптены, которые по химической структуре отличаются от гаптена, используемого для иммунизации животных. Наконец, как только препарат антитела получен (или поликлонального, или моноклонального), должен быть создан достаточно чувствительный иммунологический анализ.
Основные концепции, используемые в современных иммунологических анализах, описаны в многочисленных ссылках (см., например, Уо11ет А. и др. (ред.), [ттипоаккаук Рог Тйе 80'к, Ишуегкйу Рагк, 1981; Уо11ет А., Тйе Епхуте Ьшкеб 1ттипо8огйеп1 Аккау (ЕЫ8А), О|адпокбс Нолхопк 2:1-7, 1978, М|сгойю1одюа1 Аккоаа1ек Оиаг1ег1у Риййсайоп, Vа1ке^кν^11е, Мб; Уо11ег А. и др., 1. С1ш. Ра1йо1. 31:507-520 (1978); Вибет 1.Е., Ме1й. Епгуток 73:482-523(1981); Маддю Е. (ред.). Епхуте 1ттипоаккау, СВС Ргекк, Воса Ра1оп, Р1а., 1980). При каждом подходе существенным является построение калибровочных кривых с использованием известных количеств требуемого анализируемого вещества.
Способ с применением «меченого антитела» в обычном употреблении означает твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЙ18А). В данном случае белковый конъюгат пестицида (называемый антигеном «с покрытием» или «скрининговым» антигеном) получают, используя белок, который не является структурно родственным белку-переносчику, примененному в пестицидном иммуногене, против которого вырабатывались антипестицидные антитела. Конъюгат антигена с покрытием иммобилизуют на твердофазной подложке, такой как лунка микропланшета, что приводит к фиксированному на твердой фазе количеству пестицида на реакцию. Наряду с исследуемым образцом прибавляют известное количество антитела. Иммобилизованный пестицид конкурирует со свободным пестицидом в опытном образце за ограниченное количество участков связывания антител. Взаимодействие между антителом и определяемым при анализе веществом в жидкой фазе подавляет связывание антитела с иммобилизованным на твердой фазе пестицидом. Антитело, связанное с твердой фазой, определяют с помощью второго антитела, специфичного к неизменному участку тяжелой цепи антипестицидного антитела. Многие связанные с ферментом вторые антитела коммерчески доступны для такого применения. После отмывания несвязанного второго антитела иммобилизованное второе антитело обычно определяют добавлением хромогенного субстрата фермента, что приводит к окрашенному продукту реакции, образованному в прямой пропорции, к количеству второго связанного антитела. Таким образом, количество продукта реакции обратно пропорционально количеству анализируемого вещества в исследуемом образце.
Модификация способа «меченого антитела» исключает применение антигена с покрытием. При иммуноферментном анализе (Е1А) антипестицидное антитело иммобилизуют на твердой фазе. Пестицидный гаптен ковалентно связывают с ферментом и образующийся ферментный конъюгат инкубируют с образцами в микроячейках или пробирках культивирования, покрытых антипестицидным антителом. Пестицид в образце конкурирует с конъюгатом пестицидного гаптена и фермента за связывание с иммобилизованным антителом. Твердую фазу промывают для удаления несвязанных материалов и конъюгат антителосвязанный фермент определяют добавлением хромогенного субстрата.(см., например, Викйгау Κ.Ι, Ь.Р. Реткшк, 8.А. 8ауаде, 8.Ь. Ьекоикц В.8. Регдикоп. 1988. Ие1еттша1юп оГ а1га/ше гек1биек ш \та1ег апб коП йу епхуте ттшпоаккау. Ви11. Епуйоп. Соп1ат. Тохюо1. 40:647-654; Р1еекег ΙΚ., Πν. Соок. 1991. Пе11аЫ111у оГ сопипегс1а1 епхуте тпттоаккау т бе!ес!юп оГ айахте ш \та1ег. Р. 78-85 в М. Уапбейапп, Ь.Н. 81апкег, В.Е. ’№а1кшк, Ό.ν. Войейк (ред.), [птшпоаккаук Гог Тгасе Сйетюа1 Апа1умк. АС8 8утрокшт 8ейек 451. ’№акйшд1оп, И.С.: Ателсап Сйетюа1 8оае1у).
В сельскохозяйственной области существует необходимость в способе анализа семян, обработанных активными ингредиентами, такими как инсектицид, который можно проводить в поле или внутри производственного помещения для обработки семян.
- 2 005380
Настоящее изобретение обеспечивает нео-никотиноидные гаптены и иммуногены для выработки антинеоникотиноидных антител, а также способы, реагенты и наборы для определения наличия одного или нескольких неоникотиноидных инсектицидов в образце с помощью иммунологического анализа. Настоящее изобретение имеет особое применение для определения концентрации неоникотиноидных инсектицидов, нанесенных на растительные воспроизводимые материалы, такие как семена.
Способ иммунологического анализа по изобретению позволяет персоналу производственных помещений для обработки семян, где неоникотиноидные инсектициды наносят на семена, количественно измерять нанесенный активный ингредиент. Способ включает быструю экстракцию активных ингредиентов из семян и быстрое измерение экстракционного раствора, основанное на иммунологическом анализе. Данные измерения можно использовать, чтобы определить, работает ли надлежащим образом оборудование для покрытия семян, если оно калибровано правильно, и может ли обработанная масса семян быть выпущена для поставки. Создаваемый анализ должен быть простым в осуществлении, требующим только обычного лабораторного оборудования и реагентов. Поэтому персонал, лишенный опыта в проведении иммунологических анализов, сможет успешно проводить исследование после нескольких практических экспериментов.
Было найдено, что антигенные неоникотиноидные конъюгаты (иммуногены) могут быть получены конъюгацией неоникотиноидного пестицидного гаптена с молекулой-переносчиком, такой как очищенное белковое производное (ΡΡΌ. туберкулин) из вируса ΌίρίΗοΓία. бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин, овальбумин, или конъюгацией гемоцианина из моллюска Ксу1ю1с Ытрс1 (МедаБшга сгепи1а1а) с неоникотиноидным гаптеном. Могут быть получены конъюгаты превращенных в производные материалов, таких как производное бычьего сывороточного альбумина, катионированный бычий сывороточный альбумин и тому подобное (см. А. МисксгНабс, К. Арр1е, А. Рексе, к С. М1с1ае1 (1987). 1. 1ттипо1. 138:833-837). Данные иммуногены затем могут быть инъецированы животным-хозяевам, вырабатывающим антитела к неоникотиноидному гаптену, которые можно собрать. Затем эти антитела могут быть утилизированы в разнообразных методиках иммунологического анализа для определения соответствующих неоникотиноидных инсектицидов с использованием различных известных маркеров, чтобы пометить или инсектицид, или антитело. В некоторых вариантах воплощения иммунологических анализов иммобилизуют или производное неоникотиноидного инсектицида, или антитело. Как поликлональные, так и моноклональные антитела могут применяться в практике по настоящему изобретению. Антитела могут оказаться селективно связанными с требуемыми неоникотиноидными инсектицидами даже в присутствии других активных пестицидных ингредиентов, включая другие неоникотиноидные инсектициды, введенные в смесь для покрытия семян.
Способы определения, которые могут применяться на практике по настоящему изобретению для измерения неоникотиноидных инсектицидов в образце, включают биодатчики и ферментные, флуоресцентные, хемилюминесцентные и радиометрические системы. Для таких анализов можно использовать гетерогенный или гомогенный режимы и можно применять планшеты с микроячейками, пробирки для культивирования и латексные шарики или частицы в качестве твердых фаз.
Иммунологические анализы по настоящему изобретению применяют для определения концентрации неоникотиноидных инсектицидов, таких как имидаклоприд, нитенпирам, ацетамиприд, тиаметоксам, тиаклоприд и клотиадин, в образце, а также в растительном воспроизводимом материале.
Настоящее изобретение обеспечивает иммунологические анализы для исследования образца на присутствие неоникотиноидных инсектицидов. В таких иммунологических анализах реакция неоникотиоидного (антигена)/антитела может быть определена разнообразными способами, использующими различные маркеры для введения метки или в антиген, или в антитело, чтобы сделать возможным определение продукта реакции. Более того, во многих случаях иммобилизация или антигена, или антитела будет способствовать определению.
Анализы антигена/антитела можно разделить на две категории: гетерогенную и гомогенную. Гетерогенные анализы перед определением продукта реакции требуют отделения компонента со связанной меткой от компонента со свободной меткой. При гомогенном анализе такой этап отделения не требуется. Кроме того, анализы могут быть (1) конкурентными, например, если антиген конкурирует за меченое антитело с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, или если антиген конкурирует с меченым антигеном за антитело, иммобилизованное на твердой фазе, или (2) неконкурентными, если существует прямая взаимозависимость между меткой и антителом или антигеном.
Способы иммунологического анализа, которые могут применяться на практике по настоящему изобретению для определения неоникотиноидных инсектицидов в образце, включают ферментный, флуоресцентный, хемилюминесцентный и биосенсорный иммунологический анализ, а также радиоиммунологический анализ. В твердофазном ферментном иммунологическом анализе (БОБА) по настоящему изобретению гаптены, соответствующие представляющим интерес неоникотиноидным инсектицидам, можно метить непосредственно с ферментом или непрямым способом с использованием меченых по ферменту антител, которые при соответствующих условиях катализируют реакцию с субстратом. Ферментную активность обычно определяют с помощью образования окрашенного продукта реакции, т.е. окрашенной
- 3 005380 конечной точки, которая может быть легко обнаружена визуально или измерена спектроскопическими либо отражательными способами.
В методиках флуоресцентного иммунологического анализа для применения по настоящему изобретению гаптены, соответствующие представляющим интерес неоникотиноидным инсектицидам, можно метить непосредственно с флуорохромами или непрямым способом с использованием меченых по флуорохрому антител. Флуорохромы представляют собой красители, которые поглощают излучение (например, ультрафиолетовый свет), при этом возбуждаются и испускают свет (например, видимый свет).
В одном варианте воплощения по настоящему изобретению способ определения концентрации неоникотиноидного инсектицида в образце состоит из следующих этапов:
(а) обеспечение твердой фазы с иммобилизованным антителом, селективным к упомянутому неоникотиноидному инсектициду;
(б) контакт упомянутого образца с иммобилизованным антителом в присутствии известного количества конъюгата неоникотиноидный инсектицидный гаптен-фермент;
(в) промывание твердой фазы этапа (б) для удаления любого несвязанного гаптен-ферментного конъюгата или образца;
(г) взаимодействие хромогенного субстрата, специфичного к упомянутому гаптен-ферментному конъюгату, с промытой твердой фазой этапа (в) для того, чтобы генерировать хромоген; и (д) измерение количества хромогена, полученного на этапе (г), для определения количества конъюгата антителосвязанный гаптен-фермент и, следовательно, количества неоникотиноидного инсектицида в упомянутом образце.
В одном варианте воплощения изобретения иммунологический анализ обеспечивается в виде набора, включающего покрытые антителом пробирки, конъюгат неоникотиноидный гаптен-фермент, субстрат фермента и раствор для прекращения образования колориметрического сигнала.
Несмотря на то что в описании изобретения часто упоминается применение поликлональных антител, специалисты в этой области поймут, что моноклональные антитела могли быть использованы в качестве альтернативы применению поликлональных антител. Термин «антитела», используемый в контексте, по происхождению относится к поликлональным или моноклональным антителам.
Моноклональные антитела к неоникотиноидным инсектицидам для применения в практике по настоящему изобретению получают, используя методики иммунизации и культивирования гибридом, хорошо известные специалистам. Соответствующие линии клеток гибридомы получают слиянием клетки, продуцирующей антитело, и миеломной клетки, полученной из мышиных видов. Клетками, продуцирующими антитела, предпочтительно являются клетки селезенки. Может быть использована любая соответствующая миеломная клеточная линия, однако желательно применять хорошо охарактеризованные линии клеток, некоторые из которых обычно употребляются.
Подобным образом поликлональные антитела к неоникотиноидным инсектицидам для применения в практике по настоящему изобретению также получают, используя методики, хорошо известные специалистам.
Настоящее изобретение обеспечивает также препарат поликлонального антитела к 1дС (иммуноглобулину С), который связывает по меньшей мере один неоникотиноидный инсектицид, препарат антитела получают способом, который состоит из следующих этапов: (а) введение хозяину предварительно определенного количества композиции, включающей неоникотиноидный инсектицид или иммунологический эквивалент, соединенный с биологически приемлемым белком-переносчиком, (б) сбор сыворотки хозяина и (в) очистка антитела к 1дС от сыворотки. Иммунологический эквивалент антигена обладает способностью при введении хозяину вызывать выработку антител к антигену.
Как отмечено выше, иммунологический анализ по настоящему изобретению имеет особое применение для определения количества неоникотиноидного инсектицида, который нанесен на растительный воспроизводимый материал. Подразумевается, что термин «растительный воспроизводимый материал» означает все генеративные части растения, такие как семена, которые можно использовать для размножения последнего, и вегетативный растительный материал, такой как обрезки и клубни (например, картофеля). Можно упомянуть, например, семена (в строгом смысле слова), корни, плоды, клубни, луковицы, корневища и части растений. Можно также упомянуть проросшие растения и молодые растения, которые должны быть пересажены после прорастания или после появления над почвой. Эти молодые растения можно защитить перед пересадкой с помощью полной или частичной обработки путем погружения.
В одном варианте воплощения неоникотиноидный инсектицид, определяемый анализом по настоящему изобретению, представлен формулой
I I
О) где А означает 2-хлорпирид-5-ил или 2-хлоротиазол-5-ил;
В и В3 независимо друг от друга означают водород или (С1-С4)алкил;
- 4 005380
К1 и К2 независимо друг от друга означают водород или (С1 -С4)алкил, или К1 и К2 вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолидиновое или оксадиазиновое кольцо; и
Х означает -Ν-ΝΟ2 или -Ν-ΟΝ.
В другом варианте воплощения неоникотиноидный инсектицид, определяемый анализом по настоящему изобретению, представлен формулой
где А, К3 и Х имеют приведенные выше значения для формулы (I).
В предпочтительном варианте воплощения иммунологический анализ по настоящему изобретению использует поликлональные антитела для неоникотиноидного инсектицида. Эти антитела могут быть получены из сыворотки иммунизированного животного. Иммунизация может быть осуществлена путем инъекции иммуногена (антигенный конъюгат гаптен-ΡΡΌ) видам животных, продуцирующих антитела, обычно млекопитающему и предпочтительно кролику или овце. Как правило, начальная инъекция сопровождается серией последовательных бустерных инъекций, чтобы вызвать максимальное образование антител. Оптимально режим введения состоит из многократных доз, вводимых белым кроликам породы Ζοαίαηά. Количество вводимого инъекцией иммуногена меняется, но должно быть адекватным выработке определяемого количества антител. Получение антител может быть подтверждено анализом сыворотки, полученной в опытных пробах, с применением ΕΙΑ, ЕЫ8А или непрямого флуоресцентного иммунологического анализа.
Те же самые метки, которые используют в известных иммунометрических анализах, могут применяться для мечения гаптена по настоящему изобретению. Среди них можно упомянуть репортерные молекулы (КМ), включающие ферменты, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и β-галактозидаза. Кроме того, могут быть использованы флуоресцентные, люминесцентные или радиоактивные метки, такие как флуоресцеин, родамин, люминол, акридий и радиоактивные изотопы 125Ι и т.д., или коллоидные частицы, такие как золото и селен и т.д. Наконец, образующие хелаты флуорофоры лантанидов, таких как европий и тербий, можно использовать для генерирования разрешенных по времени флуоресцентных сигналов. Наиболее распространенными ферментными маркерами являются пероксидаза хрена (НКР) и щелочная фосфатаза.
В одном варианте воплощения для определения количества неоникотиноида в образце используют спектрофотометр. Однако способы по настоящему изобретению могут быть адаптированы специалистами в этой области к другим типам хромогенных детекторов. Подобным образом определяемый продукт реакции не ограничен наличием хромофора, а может содержать другие метки, как описано выше.
Было найдено, что гаптены следующих формул (ΙΑ), (ΙΒ) и (ПА) применимы для образования антигенных неоникотиноидных конъюгатов (иммуногенов) и анализируемых конъюгатов.
Гаптен ДА).
где А означает 2-хлорпирид-5-ил или 2-хлоротиазол-5-ил;
К3 означает водород или (С1-С4)алкил;
К1 и К2 независимо друг от друга означают водород или (С1 -С4)алкил, или К1 и К2 вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолидиновое или оксадиазиновое кольцо;
η означает целое число 1-5 (предпочтительно целое число 3-5); и
Х означает О, -Ν-ΝΟ2 или -Ν-ΟΝ.
Гаптен (ΙΒ).
где А, К1, К2, К3 и Х имеют значения, как в формуле (1А); и
Е означает одинарную ковалентную связь или остаток связывающей группы формулы -(СН2)т-, в которой т означает целое число 1-3.
Пример 1. Гаптен (ΙΙΙΑ).
- 5 005380 где А, К3, Х и η имеют значения, как в формуле (ΙΑ). Гаптен (ΙΙΙΒ).
где А, К3 и Х имеют значения, как в формуле (ΙΑ), и Е имеет значение, как в формуле (ΙΒ). (ΙΙΙΒ) могут быть
Гаптены формул (ΙΙΙΑ) и лучены по аналогии со следующими методиками:
со2н | ОМе .ОМе
Υ поНВс1сНзМН2
Производное
2-аминоэтантиола
или (ΙΙΙΒ) получают, см ^5у\/со«н \|___/ (ШС)
Замещенный 2-(1Ч-цианоимино)тиазолидин
Требуемый гаптен (ΙΙΙΑ) аминоэтантиола, выбранное из соединений формул
Н5СНСН2ЫН2 (ИЮ) или [СИЛ СО,А используя соответствующее производное 2Ηδ-ΟΗΟΗ„ΝΗ2 (ШЕ)
где К имеет значение, приведенное выше, для формулы (Ι).
Было найдено, что следующие гаптены особенно полезны в практике по настоящему изобретению:
где η в каждом случае означает целое число 1-5; предпочтительно η означает целое число 3-5.
Антигенные неоникотиноидные конъюгаты (иммуногены) и анализируемые конъюгаты могут быть получены соединением неоникотиноидного пестицидного гаптена с молекулой-переносчиком или репортерной молекулой в зависимости от обстоятельства, с использованием методик, известных специалистам в этой области. Два основных подхода могут быть выбраны. Первый использует линкеры, которые становятся частью конъюгата. Данные линкеры являются гомобифункциональными или гетеробифункциональными и включают те, которые способны образовать, например, дисульфидные связи с тиольными группами остатков цистеина в белковых субстратах или образовать амидные связи между Ν-концевой аминогруппой или аминогруппами в боковых цепях либо в остатках лизина, и активированные ацильные остатки, такие как сукцинимидные сложные эфиры. В общем, данный подход включает наличие у линкера функциональных групп с высокой реакционной способностью и является довольно легким в отношении субстратов для конъюгации. Однако во многих случаях выгодно использовать функциональные группы, которые могут быть менее реакционноспособными, такие как те, которые способны образовать гидразоны.
- 6 005380
Второй подход, особенно удобный при конъюгации двух белковых частей, использует дегидратирующий агент, такой как карбодиимид, чтобы оказать воздействие на образование, например, пептидных связей при взаимодействии карбоксильной группы одного компонента конъюгата со свободной аминогруппой другого. В этом случае реагент не становится частью конъюгата. Эта реакция не является особенно удобной, поскольку карбоксильная группа не активирована; карбодиимид образует активное промежуточное соединение и сдвигает равновесие путем удаления элементов воды для образования пептидной связи.
Оба подхода к конъюгации, как правило, осуществляют в водных растворителях, поскольку белковый материал, образующий конъюгат, легко денатурирует. Белки, рассчитанные на то, чтобы быть устойчивыми в водной окружающей среде, как известно, денатурируют даже в таких растворителях, как этанол, который, казалось бы, является достаточно схожим с водной средой. Кроме того, компоненты белкового конъюгата имеют тенденцию быть относительно нерастворимыми в неводных растворителях.
Было найдено, что гаптеновые конъюгаты следующей формулы применимы в практике по изобретению:
1& Р
I Iо А\ // Υ Υсо к3 х где А, К1, К2, К3, η и X имеют значения, приведенные выше для формулы (ΙΑ), и РК означает остаток белка (1) молекулы-переносчика, такой как очищенное производное белка (РРЭ, туберкулин) из вируса Э1рЛепа, бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин, овальбумин или гемоцианин из моллюска КеуЕо1е Б1шре1 в случае иммуногена, или (2) репортерной молекулы (КМ), такой как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и β-галактозидаза.
Кроме того, гаптеновые конъюгаты следующей формулы также являются приемлемыми:
где А, К1, К2, К3, Е и Х имеют значения, приведенные выше для формулы (ΙΒ).
Было показано, что следующие конъюгаты особенно полезны в практике по настоящему изобретению:
где η в каждом случае означает целое число 1-5; предпочтительно η означает целое число 3-5.
Немеченое поликлональное антитело, применяемое в способе по настоящему изобретению для связывания антигенного неоникотиноидного конъюгата или конъюгата гаптен-КМ в тестируемом образце, может быть иммобилизовано на любой из подложек, обычно применяемых в иммунометрических анализах. Среди тех, которые могут применяться, фильтровальная бумага, латексные или полистирольные шарики и полиэтиленовый, полистирольный, полипропиленовый или другой подходящий планшет с микроячейками либо пробирка. Эта подложка может быть сделана из любого полимера природного или синтетического происхождения или из аморфного материала, такого как стекло. Выгодно использовать мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона для реакционных полос и поливинильные, полипропиленовые, полистирольные или другие пластмассы для шариков или микропланшетов. Могут также использоваться гели или частицы, в основе которых агароза, акриламид или латекс. Кроме того, любые из иммунохроматографических устройств, полос для тестирования и устройств с горизонтальным растеканием, известные специалистам, могут быть адаптированы к способу по настоящему изобретению. Среди соответствующих устройств с горизонтальным растеканием можно упомянуть, например, тип такого устройства, раскрытый в патенте И8 № 4366241. Методики для привязки антител к таким материалам хорошо из
- 7 005380 вестны специалистам. Соответствующим источником получения антител, связанных с подложкой, является, например, Веасоп Лиа1уйса1 ЗуМспъ. 1пс. (РогИаиб, Маше).
Чтобы приготовить образец семян для использования в анализе, выборку из обработанной неоникотиноидом серии (например, 5-100 г семян рапса; 10-200 г семян сорго, пшеницы, хлопка, полевой кукурузы или сахарной кукурузы) диспергируют в соответствующем растворителе, таком как ацетон, ацетонитрил, этанол, изопропанол, метанол или смеси этих растворителей с различным процентным содержанием воды. Приемлемые смеси воды и растворителей включают, например, 1-50% метанола/воды и 120% ацетонитрила/воды. Диспергированные семена смешивают с помощью вращения и затем помещают в облучаемую ультразвуком баню примерно на 20 мин с последующим дополнительным вращением. Содержимому дают отстаиваться. Определенную часть жидкого экстракта удаляют и прибавляют известное количество раствора, например 1% ацетонитрил/вода. Экстракт разбавляют дополнительно, чтобы довести концентрацию экстрагированного неоникотиноида до диапазона калибровочной кривой. Было найдено, что разведения от 1000- до 60000-кратного являются удобными. Иммунологический анализ занимает приблизительно 35 мин для своего выполнения. Экстракция и приготовление экстракта для анализа занимают приблизительно 30 мин. Следовательно, образец семян может быть экстрагирован и анализирован примерно за 1 ч и 5 мин. В одном варианте воплощения изобретения до двух образцов семян (вместе с выборками - до пяти проб на образец семян) могут анализироваться одновременно.
Концентрации неоникотиноидных инсектицидов от примерно 10 тыс. частей на миллион до 1/2 части на миллиард могут быть определены в иммунологических анализах по настоящему изобретению. Однако способ пригоден для любого количества присутствующего неоникотиноидного инсектицида при условии, что неоникотиноидный инсектицид в образце или в экстракте образца выпадает в осадок или может быть соответствующим образом разбавлен, чтобы выпасть в осадок в пределах калибровочной кривой.
Получение антигена, выработка поликлональных антител и иммунологический анализ иллюстрируются более подробно следующими не ограничивающими изобретение примерами.
Примеры
Пример 1. Синтетическая методика для тиаметоксамового гаптена.
О ОМе
1.1
ОМе •Η,δΟ,
ОМе
1.3
СНЭ8ОЭН нсоон
О
О
ОМе
1.2
1.5
1.1. 2-Метил-1-нитрозомочевина.
Растворяли сульфат О-метилизомочевины (38,5 г) в смеси азотной кислоты (120 мл)/серной кислоты (280 мл) при 0°С и перемешивали в течение 2 ч при 0°С. Осторожно выливали смесь на колотый лед при перемешивании и затем удаляли колотый лед фильтрованием. Растворяли игольчатые кристаллы в этилацетате и подщелачивали раствор добавлением карбоната калия. Сушили раствор над сульфатом магния и фильтровали. Концентрировали фильтрат, получая белое порошкообразное вещество (5 г).
1.2. Готовили раствор из 3 г гидрохлорида метилового эфира 4-аминомасляной кислоты (1.1а) и 15 мл воды. Доводили рН до 11, прибавляя по каплям 2 н. ЫаОН при охлаждении раствора в бане со льдом. Реакционную колбу снабжали электродом для измерения рН и термометром, полученный прозрачный основной раствор быстро перемешивали по мере прибавления небольшими порциями 2-метил-1нитрозомочевины (2,38 г), чтобы поддерживать температуру раствора ниже 2°С. Когда прибавление завершилось, реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при 0°С; отметить, что значение рН стабилизировалось при 9,6. Прибавляли ТГФ (1 мл) и перемешивали в течение дополнительных 2 ч. Реакционную смесь разбавляли водой и выливали в этилацетат. После отделения органической фазы ее сушили над сульфатом магния, раствор фильтровали. Концентрация фильтрата дала прозрачное масло. Флешхроматография неочищенного масла на силикагеле при элюировании смесью дихлорметан/ацетонитрил (3:1) привела к 750 мг требуемого продукта в виде белого твердого вещества.
- 8 005380
1.3. Объединяли продукт из опыта 1.2 (1,44 г) с параформальдегидом (422 мг), метансульфоновой кислотой (0,023 мл) и муравьиной кислотой (10 мл) и нагревали при 55°С в течение 15 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Полученное коричневое масло суспендировали в толуоле и с помощью азеотропа упаривали раствор досуха. Образующееся масло растворяли в смеси ТГФ/диоксан/ацетонитрил (1:1:1) и обрабатывали его избытком диазометана. Данный раствор перемешивали в течение 30 мин и реакционную смесь обрабатывали уксусной кислотой. Концентрировали реакционную смесь до образования масла. Вновь растворяли масло в этилацетате, промывали разбавленным раствором бикарбоната натрия, сушили над сульфатом магния и вновь концентрировали до образования масла. Очищали это масло флеш-хроматографией в смеси дихлорметан/ацетонитрил (3:1), получая 658 мг требуемого сложного эфира оксадиазинаминомасляной кислоты (1.3) в виде прозрачного масла.
1.4. Растворяли продукт из опыта 1.3 (1,1 г) в ацетонитриле (50 мл) и прибавляли 3 г карбоната калия. Добавляли (хлорметил)хлоротиазол одной порцией и реакционную смесь нагревали при 55°С в течение 20 ч. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и фильтровали для удаления твердых веществ. Полученный коричневый фильтрат концентрировали до образования масла. Очищали масло флеш-хроматографией в смеси дихлорметан/ацетонитрил (3:1), получая 894 мг требуемого соединения в виде желтого/коричневого масла.
1.5. Растворяли соединение 1.4 (372 мг) в 8 мл концентрированной соляной кислоты и 1 мл воды и перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Разбавляли реакционную смесь водой и осторожно подщелачивали, добавляя 1 н. ИаОН до тех пор, пока значение рН не достигло 4,5. Экстрагировали этилацетатом, органическую фракцию сушили над сульфатом магния. Концентрировали высушенную органическую фракцию до образования масла, которое очищали флеш-хроматографией в смеси дихлорметан/ацетонитрил (1:1), получая требуемый продукт 1.5 (100 мг).
Примеры 2-5. Тиаметоксамовые гаптены.
Использовали синтетические методики примера 1 для получения следующих тиаметоксамовых гаптенов, показанных в табл. 1, путем замены промежуточного соединения 1.1а соответствующим аналогом формулы КН2(СН2)ПСО2К (1.1Ь), где η означает целое число 1-5 и К означает Н или (С1-С4)алкил.
Таблица 1
Примеры 6-9. Тиаметоксамовые гаптены
Использовали синтетические методики примера 1 для получения следующих гаптенов тиаметоксама, показанных в табл. 2, путем замены промежуточного соединения 1.1а соответствующим аналогом формулы 1.1с
где Е означает ковалентную одинарную связь или линкер -(СН2)т-, в котором т означает целое число 13; К означает Н или (С1-С4)алкил.
Таблица 2
I О
- 9 005380
Пример 10. Синтетическая методика для дезнитроиминотиаметоксамового гаптена.
Методика
Объединяли гаптен тиаметоксаммасляной кислоты (100 мг, 0,275 ммоля) и анизол (6,5 мл) в круглодонной колбе на 10 мл, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником. Колбу помещали в масляную баню и нагревали при 165°С в течение 2 ч. Анизол удаляли при пониженном давлении при 50°С в течение 5 ч. Полученный маслянистый продукт имел чистоту 93% по анализу методом ВЭЖХ.
Спектроскопические данные для характеристики
ВЭЖХ: сорбент Кеу81опе 8с1епййс Адиаы1 С-18, 5 мкм (колонка 25*0,46 см); ацетонитрил-20 мМ фосфорная кислота (40:60); 1,0 мл/мин; ΐ 40°С; УФ-детектор при 240 нм (ширина полосы 100 нм); время пробега 13 мин; время удерживания 4,6 мин.
ТСХ: (диольный гель) дихлорметан/ацетонитрил (2:1), К{=0,25.
1Н-ЯМР (ΟΏ3ΟΝ, 300 МГц), δ: 7,43 (т, 1Н), 4,78 (с, 4Н), 4,75 (с, 4Н), 4,48 (д, 2Н), 3,29 (т, 2Н), 2,27 (т, 2Н), 1,73 (кв, 2Н).
Масс-спектр [электронная ионизация (Е1)/устройство прямого ввода (ΏΕΡ)]: т/ζ 319 (М+).
Элементный анализ: вычислено, %: С 41,32; Н 4,41; Ν 13,14; найдено, %: С 40,13; Н 4,43; Ν 12,99. Примеры 11-18. Дезнитроиминотиаметоксамовые гаптены.
Использовали синтетические методики примера 10 для получения следующих дезнитроиминотиаметоксамовых гаптенов, приведенных в табл. 3, заменяя соединение, полученное в примере 1, соответствующим аналогом из примеров 2-9.
Таблица 3
О
- 10 005380
Примеры 19-27. Имидаклопридные гаптены.
Использовали синтетические методики примера 1 для получения следующих гаптенов имидаклоприда, представленных в табл. 4, используя нитрогуанидильное производное, полученное в опыте 1.2, или его аналог, полученный заменой промежуточного соединения 1.1а на соответствующий аналог формулы 1.1Ь или 1.1с, как показано в примерах 2-9.
Таблица 4
-СН2СН2СО2Н
-СН2СН2СН2СО2Н
-СН2СН2СН2СН2СО2Н
-СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н
согн
Примеры 28-36. Гаптены дезнитроиминоимидаклоприда.
Использовали синтетические методики примера 10 для получения следующих гаптенов дезнитроиминоимидаклоприда, приведенных в табл. 5, заменяя соединение, полученное в примере 1, соответствующим аналогом из примеров 19-27.
Таблица 5
- 11 005380
| Пример | К. |
| 28 | -сн2со2н |
| 29 | -сн2сн2со2н |
| 30 | -сн2сн2сн2со2н |
| 31 | -СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 32 | -СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 33 | |
| 34 | ЧУ |
| 35 | Ч/ \_-СО2Н |
| 36 | Ч^У |
Примеры 37-45. Гаптены клотиадина.
Использовали синтетические методики примера 1 для получения следующих гаптенов клотиадина, приведенных в табл. 6, с использованием нитрогуанидильного производного, полученного в опыте 1.2, или его аналога, полученного заменой промежуточного соединения 1.1а соответствующим аналогом формулы 1.1Ь или 1.1с, как показано в примерах 2-9.
Таблица 6
С1
Ν ι
О
| Пример | τ*----------------- |
| 37 | -СН2СО2Н |
| 38 | -СН2СН2СО2Н |
| 39 | -СН2СН2СН2СО2Н |
| 40 | -СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 41 | -СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 42 | X со,н |
| 43 | ЧУ |
| 44 | ЧУ |
| 45 | о- |
Примеры 46-54. Гаптены дезнитроиминоклотиадина.
Использовали синтетические методики примера 10 для получения следующих дезнитроиминоклотиадиновых гаптенов, приведенных в табл. 7, заменяя соединение, полученное в примере 1, соответствующим аналогом из примеров 37-45.
Таблица 7
С1
^)-^=8
Ν^'Λ^ΝΗ^ΝΗ-Κ9
О
- 12 005380
| Пример | к9 |
| 46 | -СН2СО2Н |
| 47 | -СН2СН2СО2Н |
| 48 | -СН2СНгСН2СО2Н |
| 49 | -СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 50 | -СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н |
| 51 | |
| 52 | |
| 53 | \_-со2н |
| 54 | Ό· |
Примеры 55-63. Гаптены тиаклоприда.
Использовали синтетические методики, описанные для гаптенов формул (ΙΙΙΑ) и (ΙΙΙΒ), для получения следующих гаптенов клотиадина, приведенных в табл. 8.
Таблица 8
Пример *55
-сн2со2н
-сн2сн2со2н
-СН2СН2СН2СО2Н
-СН2СН2СН2СН2СО2Н
-СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н
Пример 64. Получение тиаметоксамового иммуногена
64.1. Готовили раствор очищенного белкового производного (туберкулина, ΡΡΌ) в 0,01 ЗФР, рН 7,4 до концентрации 1 мг/мл. Доводили рН 0,5 мл аликвотной пробы данного раствора до 4,5-5,0 с 0,1 М соляной кислотой.
64.2. Растворяли гаптен тиаметоксама из примера 1 (1 мг) в 250 мкл 0,1 М раствора 2-(Νморфолино)этансульфоновой кислоты, рН 4,5. Объединяли растворы гаптена и ΡΡΌ.
64.3. Растворяли 1 мг гидрохлорида 1-(диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (ЕЭС) в 100 мкл дистиллированной деионизированной воды. Немедленно прибавляли раствор БОС к раствору гаптенΡΡΌ из опыта 3.2. Смешивали раствор гаптен-ЕЕО-ЕОС путем вращения в течение 2 ч при комнатной температуре. Переносили реакционную смесь в диализный мешок с отсечением молекулярной массы 1000-2000 Да. Подвергали диализу экстенсивно против 2 л ЗФР при 4°С при трех переменах/день в течение 48 ч.
- 13 005380
Пример 65. Получение имидаклопридного иммуногена.
Использовали методики примера 64 для получения имидаклопридного иммуногена с применением гаптена из примера 21.
Пример 66. Получение клотиадинового иммуногена.
Использовали методики примера 64 для получения клотиадинового иммуногена с применением гаптена из примера 39.
Пример 67. Получение тиаклопридного иммуногена.
Использовали методики примера 64 для получения клотиадинового иммуногена с применением гаптена из примера 57.
Пример 68. Схема иммунизации и сбор антител.
Для начальной иммунизации растворяли иммуноген из примера 64 в полном адъюванте Фрейнда. Делали прививки белым кроликам-самкам породы Νο^ Ζοαίαηά. вводя приблизительно 25 мкг иммуногена в каждый участок. Подобным образом иммунизировали овец, за исключением того, что в каждый участок вводили приблизительно 38 мкг иммуногена.
При последующих иммунизациях растворяли иммуноген в неполном адъюванте Фрейнда. Животные отдыхали в течение 4 недель между иммунизациями и подвергались отбору крови через 10 дней после иммунизации.
Применяли активаторные инъекции и отбирали кровь у животных в течение 9 месяцев, в конце которых они были обескровлены.
Поликлональные антитела собирали, используя методики, известные специалистам в этой области. Пример 69. Получение конъюгатов гаптен-фермент.
69.1. Гаптен тиаметоксама из примера 1 (3,1 мг), Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗ8) (4,0 мг) и БИС (4,6 мг) объединяли в небольшом флаконе. Данные материалы сушили под слабым током азота в течение 15 мин при комнатной температуре.
69.2. Прибавляли сухой диметилформамид (2,0 мл) и смесь облучали ультразвуком в течение 1 мин. Полученный раствор инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
69.3. В небольшом флаконе растворяли пероксидазу хрена (8,5 мг) в карбонатном буфере (2,0 мл, 0,05 М, рН 9,6). Флакон помещали в баню со льдом.
69.4. Все 100 мкл раствора гаптен-ΝΗδ-ΕΌδ из опыта 6.2 медленно прибавляли в течение 1 ч и смесь инкубировали при перемешивании в течение 2 ч. Реакционную смесь пропускали через колонку с сефадексом С-25М, уравновешенную с ЗФР (0,01 М, рН 7,2). Ферментный конъюгат собирали в первых 3,0 мл элюата и прибавляли равный объем глицерина; хранили при -20°С.
Пример 70. Иммунологический анализ семян рапса, обработанных тиаметоксамом.
Часть экстракта семян разбавляли смесью 1% метанол/вода до тех пор, пока ожидаемая концентрация тиаметоксама не была доведена до диапазона калибровочной кривой, 0,5-120 част./млрд. Пробирки с нанесенными антителами метили и помещали в штатив таким образом, чтобы первая и последняя пробирки были стандартами, а остальные стандарты и образцы смешивали. Каждую пробирку закрепляли в штативе так, чтобы его можно было перевернуть без потери пробирок. Во все соответствующие пробирки прибавляли аликвоту стандарта или образца (0,5 мл). Раствор ферментного конъюгата (0,5 мл) прибавляли во все пробирки. Штатив осторожно встряхивали, чтобы смешать содержимое всех пробирок. Пробирки инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Штатив переворачивали, чтобы декантировать содержимое всех пробирок. Во все пробирки прибавляли дистиллированную воду до переполнения, используя промывную склянку с дозирующим колпачком, и промывную воду декантировали. Пробирки промывали дополнительно трижды. После последней промывки штатив переворачивали и осторожно постукивали пробирками по чистому бумажному полотенцу, чтобы удалить избыток промывки. Прибавляли субстрат фермента (0,5 мл) во все пробирки, которые инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. В ходе инкубации штатив осторожно встряхивали каждые 2,5 мин. Останавливающий реакцию кислый раствор (1 М соляная кислота, 0,5 мл) прибавляли во все пробирки, чтобы прекратить генерацию сигнала. Как показано в табл. 10, поглощение продукта реакции измеряли при 450 нм. Поглощение стандартов использовали для построения калибровочной кривой, функция регрессии в виде У=ш Бп(Х)+В. Поглощение каждого образца подставляли в функцию, чтобы определить концентрацию неоникотиноидного пестицида в разбавленном образце. Полученную концентрацию умножали на фактор разведения, чтобы рассчитать количество неоникотиноидного пестицида в исходном образце.
Таблица 10 Типичная стандартная кривая иммунологического анализа тиаметоксама
| Концентрация1 тиаметоксама | Поглощение при 450 нм (аналитический ответ) |
| 120 | 0,3145 |
| 20 | 0,6636 |
| 3 | 1,0283 |
| 0,5 | 1,3618 |
1 Единица измерения част./млрд
- 14 005380
Функцию, описывающую ответ тиаметоксамовых стандартов, вырабатывали с помощью регрессионного анализа. Этот набор данных давал стандартную кривую по уравнению Υ=-.191 Ьп(Х)+1,23, г=.999, где Υ означает аналитический ответ и Х означает концентрацию тиаметоксамовых стандартов.
Пример 71. Тест перекрестной реактивности семян сельскохозяйственных культур, обработанных тиаметоксамом.
71.1. Экстракция семян.
Образцы обработанных семян подвергали выборке путем произвольного прибавления в широкогорлый сосуд на 8 унций 50 г семян хлопка, полевой кукурузы, сорго, сахарной кукурузы и пшеницы или рапса. Семена рапса подвергали выборке 4 раза, использовали семена с пятикратной выборкой и семена других видов. Прибавляли растворитель (150 мл) и плотно закрывали крышку. Семена хлопка экстрагировали смесью 5% ацетонитрил/вода, тогда как для других семян использовали смесь растворителей 20% метанол/вода. Сосуд энергично встряхивали вручную в течение 30 с и помещали в облучаемую ультразвуком водяную баню при комнатной температуре на 20 мин. Образцы встряхивали второй раз, как ранее описано. Содержимому сосуда давали отстояться в течение приблизительно 5 мин и отбирали аликвоту (0,10 мл) для анализа. Аликвоту разводили в смеси 1% метанол/вода для доведения концентрации осадка до диапазона стандартной кривой.
71.2. Иммунологический анализ.
Покрытые антителом полистирольные пробирки для культивирования метили и помещали в штатив для пробирок таким образом, что первая и последняя пробирки служили стандартами, а оставшиеся стандарты и образцы смешивали. Образец и стандартный раствор (по 0,50 мл) прибавляли в соответствующие пробирки. Добавляли такой же объем раствора ферментного конъюгата. Штатив осторожно встряхивали, чтобы перемешать растворы, и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Содержимое всех пробирок удаляли, переворачивая штатив над лотком из нержавеющей стали. Каждую пробирку промывали, наполняя до краев дистиллированной водой. Штатив переворачивали над мойкой, чтобы слить промывную воду. Промывание повторяли 4 раза. Затем штатив переворачивали и легко постукивали по бумажному полотенцу, чтобы удалить большую часть остающейся воды. (Некоторое количество жидкости, остающееся в пробирках, не влияло на результаты анализа.) Раствор субстрата фермента (0,50 мл) прибавляли в пробирки, которые инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Штатив осторожно встряхивали с интервалами в 2,5 мин, чтобы обеспечить сохранение достаточного снабжения фермента субстратом. Генерацию синего сигнала прекращали добавлением останавливающего реакцию кислого раствора (0,50 мл). Поглощение раствора в каждой пробирке измеряли спектрофотометрически при 450 нм. Концентрацию анализируемого вещества в образцах определяли по функции регрессии в виде у=т 1п(х)+Ь.
71.3. Определение перекрестной реакционной способности.
Оценивали перекрестную реакционную способность или специфичность иммунологического анализа, чтобы определить, будут ли другие исследуемые вещества, найденные в семенных покрытиях, мешать измерению тиаметоксама. Исследуемые вещества растворяли в смеси 1% метанол/вода до концентрации, изменяющейся от 1000 до 0,01 нг/мл. Аликвоты каждой концентрации анализировали, как описано выше. Реакционную способность каждого исследуемого вещества выше данного диапазона определяли, как описано ранее Вгайу ГР.. Тите 1.. Зкшпег Ό.Η. Аррйсайоп оГ а (паыйГигоп епхуте 1ттипоа88ау Ю 1йе апа1у818 оГ тсиггей геыйиек ίη κοΐί апй \\'а1ег 8атр1е8, 1. Адпс. Гоой. Сйет. 1995, 43:2542-2547.
71.4. Результаты.
Найдено, что среди исследуемых анализированных веществ только тиаметоксам обладает значительной реакционной способностью в иммунологическом анализе (табл. 9 ниже). Следовательно, данный иммунологический анализ специфичен к тиаметоксаму.
Выборки обработанных серий семян анализировали с помощью иммунологического анализа и ВЭЖХ. Результаты данных анализов приведены в табл. 11. Табл. 11 иллюстрирует корреляцию средних результатов иммунологического анализа, использующего поликлональное антитело, и анализа методом ВЭЖХ 40 образцов семян для тиаметоксама. Самое лучшее соответствие линии регрессии указывает на то, что подобные результаты были получены каждым способом.
Таблица 9
Перекрестная реакционная способность в иммунологическом анализе тиаметоксама
| Исследуемое вещество | Реакционная способность относительно тиаметоксама, процент1 |
| Тиаметоксам | 100 |
| Клотиадин | <1,0 |
| Имидаклоприд | НР2 |
| Хлорпирифос | НР |
| Дифеноконазол | НР |
| Флудиоксонил | НР |
| Пентахлорнитробензол | НР |
| Метал аксил | НР |
| Мефеноксам (Я-Металаксил) | НР |
- 15 005380
| Флуксофеним | НР |
| Карбоксин | НР |
| Каптан | НР |
| Систан (Миклобутанил) | НР |
| ТСМТВ | НР |
| Примифос-метил | НР |
| Тиофанат-метил | НР |
1 Реакционная способность исследуемых веществ по отношению к реакционной способности тиаметоксама, выраженная в процентах.
2 НР - нереакционноспособен.
Специалисты в данной области поймут, что можно сделать многочисленные вариации и модификации по изобретению, как описано выше, не отходя от сущности и объема изобретения, широко представленных.
Таблица 11 Сравнение аналитических результатов, полученных иммунологическим анализом и ВЭЖХ
1 Анализ реплик (пять) каждого образца сопровождался иммунологическим анализом. Среднее значение иммунологических анализов для каждого образца сопоставляли с результатом ВЭЖХ для каждого образца путем регрессионного анализа. Это давало функцию регрессии Υ=1,00 Х+10,9, г=.976, N=40, где Υ означает определенный иммунологическим анализом тиаметоксам в част./млн и Х означает определенный ВЭЖХ тиаметоксам в част./млн.
Claims (4)
1. Антитело, применимое в иммунологическом анализе образца, для определения количества неоникотиноидного инсектицида, где упомянутое антитело (I) является поликлональным антителом, полученным иммунизацией животного неоникотиноидным гаптеном, конъюгированным с иммуногенным белком-переносчиком, и (II) специфически связывается с неоникотиноидным инсектицидом, который выбирается из соединения формулы (I) и (III) где А означает 2-хлоропирид-5-ил или 2-хлоротиазол-5-ил;
К и К3 означают независимо друг от друга водород или (С1-С4)алкил;
К1 и К2 означают независимо друг от друга водород или (С1-С4)алкил или К1 и К2 вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолиновое или оксадиазиновое кольцо и
Х означает -Ν-ΝΟ2 или -Ν-ΟΝ.
2. Антитело по п.1, где упомянутое антитело селективно в отношении соединения, выбранного из группы, состоящей из имидаклоприда, нитенпирама, ацетамиприда, тиаметоксама, тиаклоприда и клотиадина.
3. Соединение формулы где А означает 2-хлоропирид-5-ил или 2-хлоротиазол-5-ил;
- 16 005380
К3 означает водород или (С1-С4)алкил;
К1 и К2 означают независимо друг от друга водород или (С1-С4)алкил или К1 и К2 вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолиновое или оксадиазиновое кольцо;
η означает целое число 1-4; и
Х означает -Ν-ΝΟ2 или -Ν-0Ν.
4. Соединение по п.3 формулы
5. Соединение по п.4 формулы
7. Соединение по п.6 формулы
8. Белковый конъюгат формулы где А означает 2-хлоропирид-5-ил или 2-хлоротиазол-5-ил;
К3 означает водород или (С1-С4)алкил;
К1 и К2 независимо друг от друга означают водород или (С1-С4)алкил или К1 и К2 вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют имидазолиновое или оксадиазиновое кольцо;
η означает целое число 1-4;
Х означает -Ν-ΝΟ2 или -Ν-0Ν и
РК означает остаток белка молекулы-переносчика, выбранный из группы, состоящей из очищенного белкового производного (РРЭ, туберкулина) из вируса ЭхрФепа, бычьего сывороточного альбумина, катионированного бычьего сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, овальбумина и гемоцианина из моллюска кеуйо1е Нтре! (МедаФига сгепи1а!а);
или остаток фермента, выбранный из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, пероксидазы хрена и β-галактозидазы.
9. Белковый конъюгат по п.8 формулы
Νχ «О ΝΗ—РК.
N
I _
О
10. Белковый конъюгат по п.8 формулы
Ν, +£) ΝΗ---РК
N
I _
О
- 17 005380
11. Способ определения концентрации неоникотиноидного инсектицида в образце, включающий следующие этапы:
(а) обеспечение твердой фазы с иммобилизованным антителом, селективным по отношению к упомянутому неоникотиноидному инсектициду согласно пп.1-2;
(б) контакт упомянутого образца с иммобилизованным антителом в присутствии известного количества конъюгата неоникотиноидный инсектицидный гаптен-фермент согласно пп.8-10;
(в) промывание твердой фазы этапа (б) для удаления любого несвязанного конъюгата гаптенфермент или образца;
(г) взаимодействие хромогенного субстрата, специфичного к упомянутому конъюгату гаптенфермент, с промытой твердой фазой этапа (в) для того, чтобы генерировать хромоген; и (д) измерение количества хромогена, образованного на этапе (г), чтобы определить количество конъюгата антителосвязанный гаптен-фермент и отсюда количество неоникотиноидного инсектицида в упомянутом образце.
12. Способ по п.11, где упомянутый образец получают экстракцией растительного воспроизводимого материала в соответствующий растворитель.
13. Способ по п.12, где упомянутым растительным воспроизводимым материалом являются семена.
14. Способ по п.13, где упомянутые семена выбирают из группы, состоящей из рапса, сорго, пшеницы, хлопка, полевой кукурузы или сахарной кукурузы.
15. Способ по п.11, где упомянутым антителом является поликлональное антитело, полученное иммунизацией животного с неоникотиноидным инсектицидом, конъюгированным с иммуногенным белком-переносчиком.
16. Способ по п.15, где упомянутым белком-переносчиком является молекула-переносчик, выбранная из группы, состоящей из очищенного производного белка (ΡΡΌ, туберкулина) из вируса 01р(11епа, бычьего сывороточного альбумина, катионированного бычьего сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, овальбумина и гемоцианина из моллюска 1<су1ю1с 1ипрс1 (МедаШига сгеии1а!а).
17. Набор, применимый для иммунологического анализа образца, с целью определения количества неоникотиноидного инсектицида, где набор включает в сочетании в одном или нескольких контейнерах (а) твердую фазу с иммобилизованным антителом, селективным в отношении упомянутого неоникотиноидного инсектицида, по пп.1-2;
(б) ферментный конъюгат, содержащий фермент, конъюгированный с неоникотиноидным гаптеном, по пп.8-10.
18. Набор по п.17, где антителом является поликлональное антитело, полученное иммунизацией животного с неоникотиноидом, конъюгированным с иммуногенным белком-переносчиком.
19. Набор по п.18, где ферментом является пероксидаза хрена.
20. Набор по п.17, где антитело специфически связывается с неоникотиноидным инсектицидом, выбранным из группы, состоящей из имидаклоприда, нитенпирама, ацетамиприда, тиаметоксама, тиаклоприда и клотиадина.
4^) Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45678299A | 1999-12-08 | 1999-12-08 | |
| PCT/EP2000/012310 WO2001042787A2 (en) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Immunoassay for neonicotinyl insecticides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200200620A1 EA200200620A1 (ru) | 2002-10-31 |
| EA005380B1 true EA005380B1 (ru) | 2005-02-24 |
Family
ID=23814141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200200620A EA005380B1 (ru) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Иммунологический анализ неоникотинильных инсектицидов |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7148029B2 (ru) |
| EP (1) | EP1235805B1 (ru) |
| JP (1) | JP4980536B2 (ru) |
| KR (1) | KR100752536B1 (ru) |
| CN (1) | CN100379725C (ru) |
| AR (2) | AR026735A1 (ru) |
| AT (1) | ATE343564T1 (ru) |
| AU (1) | AU778677B2 (ru) |
| BR (1) | BR0016265B1 (ru) |
| CA (1) | CA2393084C (ru) |
| CZ (1) | CZ303174B6 (ru) |
| DE (1) | DE60031570T2 (ru) |
| DK (1) | DK1235805T3 (ru) |
| EA (1) | EA005380B1 (ru) |
| ES (1) | ES2272357T3 (ru) |
| HU (1) | HU229490B1 (ru) |
| IL (2) | IL150009A0 (ru) |
| MA (1) | MA25635A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA02005514A (ru) |
| NO (1) | NO331464B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ519152A (ru) |
| PL (1) | PL205061B1 (ru) |
| PT (1) | PT1235805E (ru) |
| UA (1) | UA76708C2 (ru) |
| WO (1) | WO2001042787A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200204582B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634381C2 (ru) * | 2005-05-18 | 2017-10-26 | Аблинкс Н.В. | Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7763433B2 (en) | 2004-07-01 | 2010-07-27 | Forsite Diagnostics Limited | Analyte detection system |
| JP2006282547A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Horiba Ltd | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 |
| JP4841856B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2011-12-21 | 株式会社堀場製作所 | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 |
| KR100696615B1 (ko) | 2005-10-06 | 2007-03-19 | 충북대학교 산학협력단 | 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템 |
| US8323904B2 (en) * | 2005-12-16 | 2012-12-04 | Bayer Cropscience Ag | Kit for measurement of termite insecticide active ingredient by immunoassay method |
| JP2007187650A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Horiba Ltd | 免疫測定法を用いたフィプロニルの測定キット |
| WO2007091392A1 (ja) * | 2006-02-10 | 2007-08-16 | Mitsui Chemicals, Inc. | Ｏ－メチル－ｎ－ニトロイソ尿素の製造方法 |
| CN100402522C (zh) * | 2006-02-13 | 2008-07-16 | 中国农业大学 | 一种净化常山酮的方法及其专用免疫亲和色谱柱 |
| KR100879222B1 (ko) | 2006-05-09 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 제초제 메타미포프 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| KR100879223B1 (ko) | 2007-05-22 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| KR100876435B1 (ko) | 2007-05-22 | 2008-12-31 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체 |
| US9207240B2 (en) * | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
| CN101880325A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-11-10 | 南京农业大学 | 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 |
| EP2705366B1 (en) | 2011-05-04 | 2017-07-12 | Pop Test LLC | Diagnostic device |
| CN102636643A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-15 | 上海交通大学 | 用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法 |
| TR201910347T4 (tr) | 2012-08-21 | 2019-07-22 | Janssen Pharmaceutica Nv | Olanzapin haptenlerine yönelik antikorlar ve bunların kullanımı. |
| US9504682B2 (en) | 2012-08-21 | 2016-11-29 | Janssen Pharmaceutica Nv | Haptens of aripiprazole |
| PL2888373T3 (pl) | 2012-08-21 | 2018-08-31 | Janssen Pharmaceutica Nv | Przeciwciała dla arypiprazolu i ich zastosowanie |
| TR201816378T4 (tr) * | 2012-08-21 | 2018-11-21 | Janssen Pharmaceutica Nv | Olanzapin haptenleri. |
| ES2807902T3 (es) | 2012-08-21 | 2021-02-24 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos para olanzapina y uso de los mismos |
| CN110054694B (zh) | 2012-08-21 | 2024-02-20 | 詹森药业有限公司 | 阿立哌唑半抗原的抗体及其用途 |
| CN102942519B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-08-13 | 天津科技大学 | 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 |
| CN104974256B (zh) * | 2015-04-10 | 2018-06-05 | 南京农业大学 | 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途 |
| CN105037344A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-11-11 | 环境保护部南京环境科学研究所 | 一种噻虫啉半抗原的合成方法 |
| CN105087498B (zh) * | 2015-09-07 | 2018-01-09 | 江南大学 | 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN105572376B (zh) * | 2016-03-07 | 2017-07-11 | 中国烟草总公司贵州省公司 | 一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法 |
| KR102225307B1 (ko) | 2017-10-19 | 2021-03-11 | 경북대학교 산학협력단 | 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 |
| CN109813894A (zh) * | 2017-11-18 | 2019-05-28 | 镇江亿特生物科技发展有限公司 | 一种检测大米中乙虫腈的化学发光免疫检测试剂盒 |
| CN108998422A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 江南大学 | 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN109061158B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109111394B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种啶虫脒半抗原与抗原的制备方法及应用 |
| CN109917126A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-21 | 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) | 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法 |
| CN111646959B (zh) * | 2020-05-14 | 2022-07-15 | 广州海关技术中心 | 一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置 |
| CN112111011B (zh) * | 2020-07-28 | 2022-04-19 | 浙江大学 | 一种特异性抗噻虫嗪抗体的可变区序列及其重组全长抗体 |
| CN113009057B (zh) * | 2020-10-22 | 2023-11-07 | 重庆医科大学 | 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法 |
| CN112595850A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-04-02 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种噻虫胺人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113281501B (zh) * | 2021-05-12 | 2023-07-07 | 北京勤邦科技股份有限公司 | 一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113979994A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-01-28 | 信达安检测技术(天津)有限公司 | 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及其合成与应用 |
| CN114397441A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-26 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN114636768B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-11-07 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0580553A2 (de) * | 1992-07-22 | 1994-01-26 | Ciba-Geigy Ag | Oxadiazinderivate |
| JP2000191698A (ja) * | 1998-12-24 | 2000-07-11 | Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho:Kk | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5334528A (en) * | 1989-10-30 | 1994-08-02 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same |
| JPH0580553A (ja) | 1991-09-24 | 1993-04-02 | Mita Ind Co Ltd | 電子写真感光体 |
| GB9304191D0 (en) * | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Process for the preparation of aqueous nicotinaldehyde |
| DE4329952C1 (de) * | 1993-09-04 | 1994-08-04 | Draegerwerk Ag | Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung |
| US5553209A (en) | 1994-01-28 | 1996-09-03 | Hughes Aircraft Company | Method for automatically displaying map symbols |
| US5849758A (en) * | 1995-05-30 | 1998-12-15 | American Cyanamid Company | Herbicidal 2, 6-disubstituted pyridines and 2, 4-disubstituted pyrimidines |
| EP0854721B1 (en) * | 1995-08-02 | 2001-10-24 | Smithkline Beecham Corporation | Endothelin receptor antagonists |
| US5972842A (en) * | 1996-12-12 | 1999-10-26 | American Cyanamid Company | Herbicidal cyanopyridines |
| ES2251747T3 (es) * | 1996-12-19 | 2006-05-01 | Syngenta Participations Ag | Procedimiento para la preparacion de derivados de tiazol. |
| JP2993902B2 (ja) * | 1997-02-26 | 1999-12-27 | 株式会社環境免疫技術研究所 | トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188641B2 (ja) * | 1997-03-18 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188642B2 (ja) * | 1997-03-19 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| AU749237B2 (en) * | 1997-10-27 | 2002-06-20 | Isk Americas Incorporated | Substituted benzene compounds, process for their preparation, and herbicidal and defolient compositions containing them |
| US6121202A (en) * | 1997-11-07 | 2000-09-19 | American Cyanamid Company | Thienyloxypyridines and-pyrimidines useful as herbicidal agents |
| DE19831246A1 (de) * | 1998-07-11 | 2000-01-13 | Clariant Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arylpyridinen |
| US6960595B2 (en) * | 2001-03-23 | 2005-11-01 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | 5-6 to 5-7 Heterobicycles as factor Xa inhibitors |
-
2000
- 2000-06-12 UA UA2002075564A patent/UA76708C2/ru unknown
- 2000-12-06 CZ CZ20021969A patent/CZ303174B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 BR BRPI0016265-5A patent/BR0016265B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 IL IL15000900A patent/IL150009A0/xx active IP Right Grant
- 2000-12-06 DE DE60031570T patent/DE60031570T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012310 patent/WO2001042787A2/en active IP Right Grant
- 2000-12-06 CA CA2393084A patent/CA2393084C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 AR ARP000106458A patent/AR026735A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-12-06 CN CNB008177716A patent/CN100379725C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 EP EP00989956A patent/EP1235805B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 HU HU0203499A patent/HU229490B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 ES ES00989956T patent/ES2272357T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 KR KR1020027007294A patent/KR100752536B1/ko active IP Right Grant
- 2000-12-06 PT PT00989956T patent/PT1235805E/pt unknown
- 2000-12-06 AT AT00989956T patent/ATE343564T1/de active
- 2000-12-06 NZ NZ519152A patent/NZ519152A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 AU AU26721/01A patent/AU778677B2/en not_active Ceased
- 2000-12-06 EA EA200200620A patent/EA005380B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 JP JP2001544026A patent/JP4980536B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 MX MXPA02005514A patent/MXPA02005514A/es active IP Right Grant
- 2000-12-06 DK DK00989956T patent/DK1235805T3/da active
- 2000-12-06 US US10/149,512 patent/US7148029B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 PL PL355630A patent/PL205061B1/pl unknown
-
2002
- 2002-06-03 IL IL150009A patent/IL150009A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-06 NO NO20022684A patent/NO331464B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-06-07 MA MA26676A patent/MA25635A1/fr unknown
- 2002-06-07 ZA ZA200204582A patent/ZA200204582B/xx unknown
-
2008
- 2008-01-11 AR ARP080100138A patent/AR064873A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0580553A2 (de) * | 1992-07-22 | 1994-01-26 | Ciba-Geigy Ag | Oxadiazinderivate |
| JP2000191698A (ja) * | 1998-12-24 | 2000-07-11 | Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho:Kk | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DATABASE WPI, Section Ch, Week 200053, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class B03, AN 2000-567792, XP002166141 & JP 2000 191698 A (KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSHO KK), 11 July 2000 (2000-07-11), abstract * |
| LI, KAI ET AL.: "Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Insecticide Imidacloprid", J. AGRIC. FOOD CHEM. (2000), 48(8), 3378-3382, XP002166140, the whole document * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634381C2 (ru) * | 2005-05-18 | 2017-10-26 | Аблинкс Н.В. | Улучшенные нанотела против сывороточного альбумина человека |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA005380B1 (ru) | Иммунологический анализ неоникотинильных инсектицидов | |
| US5654178A (en) | Immunoassay for tetrachloroisophthalonitrile (chlorothalonil), its derivatives and breakdown products | |
| CN109111394B (zh) | 一种啶虫脒半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| CN109061169B (zh) | 一种检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JP4841856B2 (ja) | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 | |
| JPH088874B2 (ja) | フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルを測定するためのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びに検査方法 | |
| CN106380520B (zh) | 一种抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体及其应用 | |
| Schütz et al. | Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for azadirachtins | |
| Kolár et al. | Production and characterization of generic antibodies against s-triazine and sulfonylurea herbicides | |
| CN109265395B (zh) | 一种二氯喹啉酸半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| WO1993003365A1 (fr) | Dosage immunologique, anticorps monoclonal et hybridome | |
| CN114317450B (zh) | 一株分泌氟苯虫酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN108997161A (zh) | 一种甲霜灵半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| CN109265364A (zh) | 一种二甲戊灵半抗原与抗原的制备及应用 | |
| JPH10101615A (ja) | フェノキシ酢酸類のハプテン化合物、抗体および測定方法 | |
| CN118702647A (zh) | 一种灭草松半抗原、抗体、杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN109336779A (zh) | 一种甲霜灵半抗原与抗原的制备及应用 | |
| CN118325845A (zh) | 一株分泌抗环酯草醚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN116535515A (zh) | 一种抗吡蚜酮的单克隆抗体及其应用 | |
| JPH07167861A (ja) | 抗体を用いたカーバメート系除草剤の簡易測定法 | |
| KR19980026589A (ko) | 메탐페타민(methamphetamine)에 대한 특이항체 분비세포주 | |
| JPH09278800A (ja) | メトプレンに特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、及びメトプレンの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |