KR100696615B1 - 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템 - Google Patents

이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템 Download PDF

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KR100696615B1 KR1020050093773A KR20050093773A KR100696615B1 KR 100696615 B1 KR100696615 B1 KR 100696615B1 KR 1020050093773 A KR1020050093773 A KR 1020050093773A KR 20050093773 A KR20050093773 A KR 20050093773A KR 100696615 B1 KR100696615 B1 KR 100696615B1
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반응조에서 코팅항원을 배양 후 1차 항체 및 시료를 주입하여 반응시키는 단계, 상기 반응조에 2차 항체 및 효소 표지된 희석액을 주입하여 반응시키는 단계, 상기 반응조에 기질 완충액 및 발색시료를 주입하여 발색 반응을 일으키는 단계, 상기 발색 반응을 분석하여 시료 내 이미다크로플리드의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하고, 상기 1차 항체 및 2차 항체의 배양을 15분 미만으로 수행하는 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템에 관한 것이다.
상기 분석방법을 이용한 농산물 내 잔류 이미다크로플리드의 존재 여부 및 농도 측정시, 1차 및 2차 항원의 배양 시간과 농도를 조절함으로써, 종래 2시간 이상의 검출 시간을 크게 줄일 수 있어, 각종 바이오센서 및 진단용 킷트로 제작되어 현장에서 신속한 측정을 수행할 수 있다.
바이오센서, 효소면역분석법, 항체, 항원, 이미다크로플리드, 잔류 농약, 진단용 킷트

Description

이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템{ANALYSING METHOD OF INSECTICIDE IMIDACLOPRID AND MEASUREMENT CONTROL SYSTEM FOR THE SAME}
도 1은 본 발명에 따른 분석 시스템을 보여주는 개략적인 블럭도이다
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용된 생물반응 시스템을 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 사용된 계측제어 시스템을 보여주는 모식도이다.
도 4는 1차 항체 및 2차 항체의 농도별 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 5는 1차 항체 및 2차 항체의 배양시간별 흡광도를 비교한 그래프이다.
본 발명은 효소면역법을 이용하여 농산물의 이미다크로플리드 잔류량을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 적용한 분석 시스템 또한 운반이 간편하고 비전문가도 사용 가능하도록 휴대형 바이오센서 또는 진단용 킷트로 바람직하게 적 용될 수 있는 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템에 관한 것이다.
최근 소비자 보호기관이나 시민단체를 비롯하여 국민 모두가 농산물 잔류농약에 대하여 높은 관심을 보이고 있는 가운데, 농산물, 식품 또는 환경 분야에서 잔류 농약의 검출에 대한 중요성은 점차 증가하고 있다. 또한 농산물 수입량이 날로 증가함에 따라 수입 농산물에 잔류하는 농약 성분의 정확하고 신속한 검출이 중요한 문제로 대두되고 있다.
특히 농약 성분 중 이미다크로플리드는 신니코틴(neonicotinoid)계 살충제로서 해충 등에 살포되어 전신마비, 이완, 활동성 저하 등을 일으켜 이를 박멸한다. 상기 이미다크로플리드는 국내에서 귤굴나방, 조팝나무 진딧물, 벼멸구, 굼벵이 류 등의 방제를 위해 감귤, 사과, 고추, 배, 장미, 복숭아 및 벼농사에 광범위하게 사용되고 있다(정영호 외, 농약학, 시그마프레스, 2000). 이때 국내에서 이미다크로플리드의 최대잔류허용한계는 쌀에서 0.05 ppm, 면실에서 6 ppm으로 작물별로 다르지만 0.05 내지 6 ppm 범위이다(이영순 외, 식품의농약 잔류허용기준. 식품의약품안전청, 2003).
관행적인 잔류농약 분석은 주로 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)나 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)에 의존하고 있다. 이 방법들은 잔류농약 측정의 정확도가 높다는 장점을 갖고 있지만, 추출과 정제의 전처리 과정이 필요하기 때문에 시간 및 비용이 많이 소요된다는 단점을 갖고 있으며 "숙달된 전문 기술이 필요하다(박선화, 살균제 페나리몰(Fenarimol) 잔류물 검출을 위한 효소면역분석법 개발, 충북대학교, 2003)."
국내특허공개 제2001-0073248는 분광 광도계를 이용한 잔류 농약 분석방법(속성 분석법)에 관한 것으로, 기존의 속성 분석법에 시간 개념(Kinetic Scan)을 도입하여 반응 정지액을 첨가하지 않고 시료가 반응하는 동안의 흡광도 값을 계속 측정하여 구해진 흡광도 변화량을 이용하여 기존의 속성 분석법에서 발생되는 흡광도 오차를 보정하여 시료의 잔류 농약을 정확하게 검출해주는 키네틱 타입의 속성 분석법을 제시하고 있다.
국내특허공개 제2005-0074178호는 아세틸콜린에스터라제(ACHE)를 이용한 살충제의 분석방법에 관한 것으로, 유기인계 또는 카바메이트계 살충제가 농도에 비례하여 ACHE를 저해하는 것을 이용한 농작물 잔류 살충제의 분석방법을 개시하고 있다. 그러나 이러한 방법은 시료의 처리가 거의 수작업으로 이루어지고 박막크로마토그래피에 의해 측정하게 되어 측정 데이터 또한 신뢰성이 매우 낮다.
최근에는 대형기기를 이용한 농약분석의 단점을 보완하기 위하여 효소면역분석법(ELISA)이 개발되고 있다(Lee et al., Development of an ELISA for the detection of the residues of the insecticide imidacloprid in agricultural and environmental samples. J. Agric. Food Chem. 49: 2159-2167).
또한, 효소면역분석법을 이용한 센서들이 식품원료나 가공 식품 및 공정에 잔류하는 농약, 항생제, 식품독소, 중금속 등의 고감도 검출에 많이 활용되고 있다(김남수, 식품중에 유해세균 신속검출을 위한 면역센서 개발동향. 보건산업기술동향: 34-42. 한국보건산업진흥원 편집부. 2002). 상기 분석법은 관행적인 방법에 비해 경비, 시간 및 노력 등을 많이 단축하였으나, 시료를 실험실까지 운반해야 하 며 최소 2시간 이상의 분석시간이 요구된다.
따라서, 기존의 효소면역분석법을 변형하여 감도(IC50)는 3.46 ng/mL로 실험실용 효소면역분석법에 비해 다소 낮게 나타났으나, 검출에 소요되는 시간은 15분으로 단축하여 신속한 측정이 가능하도록 하였다. 그러나 현장에서 사용 가능한 측정 장치의 개발은 아직 미흡한 실정이다.
상기한 문제를 해소하기 위한 본 발명의 목적은 효소면역분석법에 의해 이미다크로플리드의 존재 여부 및 농도를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 생물반응 시스템 및 계측제어 시스템을 포함하는 이미다크로플리드의 분석방법 및 이를 위한 시스템을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 농산물에 잔류하는 살균제인 이미다크로플리드의 존재 여부 및 농도를 측정하기 위하여,
(a) 반응조에서 코팅항원을 배양 후 1차 항체 및 시료를 주입하여 반응시키는 단계,
(b) 상기 반응조에 2차 항체 및 효소 표지된 희석액을 주입하여 반응시키는 단계,
(c) 상기 반응조에 기질 완충액 및 발색시료를 주입하여 발색 반응을 일으키는 단계, 및
(d) 상기 발색 반응을 분석하여 시료 내 이미다크로플리드의 농도를 확인하는 단계를 포함하고,
상기 1차 항체 및 2차 항체의 배양을 15분 미만으로 수행하는 생물반응 시스템을 포함하는 이미다크로플리드의 분석방법을 제공한다.
바람직하기로, 상기 1차 항체의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 4000:1 내지 2000:1 로, 2차 항체의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 10000:1 내지 5000:1의 범위에서 수행하며, 이때 IC50이 2.0 내지 4.0 ng/ml으로 고감도로 분석된다.
또한 본 발명은,
(A) (ⅰ) 각종 시료 및 시약이 저장된 저장부,
(ⅱ) 상기 시료 및 시약이 이송되는 이송부, 및
(ⅲ) 시료의 효소 면역 반응이 수행되는 반응조를 포함하는 반응부를 구비하는 생물반응 시스템과;
(B) (ⅰ) 상기 반응조의 발색 반응에 따른 발광다이오드 빛의 광도에 비례하여 광전류를 발생시키기 위한 포토 다이오드를 포함하는 검출부,
(ⅱ) 상기 포토 다이오드의 광전류의 변화에 따른 전압 신호를 처리하는 신호처리부,
(ⅲ) 이를 외부로 표시하기 위한 표시부, 및
(ⅳ) 상기 저장부, 이송부, 반응부, 검출부, 신호처리부 및 표시부를 자동으로 제어하기 위한 제어회로가 구비된 제어부를 구비하는 계측 시스템;을 포함하는 이미다크로플리드의 분석 시스템을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 검출 방법은 각종 바이오센서 또는 진단용 킷트로 다양하게 적용하여 현장에서 사용 가능하며 20분 이내의 신속한 측정이 가능한 것을 특징으로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 분석 시스템을 보여주는 개략적인 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 분석 시스템은 효소면역반응이 수행되는 생물반응 시스템과, 이를 분석 및 제어하기 위한 계측 시스템으로 구성된다. 이때 생물반응 시스템은 각종 시료 및 시약이 저장된 저장부(10), 상기 시료 및 시약이 이송되는 이송부(20), 시료의 효소 면역 반응이 수행되는 반응조를 포함하는 반응부(30)를 포함하고, 상기 계측 시스템은 상기 반응조(10)의 발색 반응에 따른 빛(발광 다이오드)의 광도에 비례하여 광전류를 발생시키기 위한 포토 다이오드를 포함하는 검출부(40), 상기 포토 다이오드의 광전류의 변화에 따른 신호를 처리하기 위한 신호처리부(50), 이를 외부로 표시하기 위한 표시부(60) 및 마이크로컴퓨터에 의한 제반 작업을 제어하는 제어부(70)를 포함한다.
반응부(30)는 시료의 효소면역반응이 수행되는 곳으로, 이때 효소면역반응에 필요한 각종 시료 및 시약이 저장되어 있는 저장부(10)로부터 이송부(20)를 통해 직접적으로 연결된다. 이때 반응조는 큐벳이 사용되며, 바람직하기로는 흡착성이 좋은 표준수정 큐벳을 사용한다.
저장부(10)는 분석하고자 하는 시료, 표준시료, 염료 각각에 대한 저장용기를 포함한다. 이때 시료 저장용기는 본 발명에 의해 검출하고자 하는 이미다크로플리드를 포함하는 시료를 저장하며, 효소면역분석법에 의해 검출된다.
표준시료 저장용기에는 기지 농도의 검출된 이미다크로플리드에 대한 표준용액이 저장되며, 이러한 표준시료에 의하여 얻어진 표준농도곡선에 검출하고자 하는 이미다크로플리드의 농도를 계산해 낼 수 있게 된다.
또한 염료 저장용기에는 검출하고자 하는 이미다크로플리드와 특이적으로 결합하고 항체를 표지할 수 있는 염료가 저장된다. 본 발명에서 사용가능한 염료로는 항원-항체 반응에 의해 검출부(40)에서 검출이 가능한 신호를 낼 수 있는 것이라면, 제한이 없으며, 바람직하게 형광, 화학발광 또는 인광 등의 신호를 내는 염료가 사용된다.
이송부(20)는 반응부(10)의 반응조 내로 각종 시료 및 시약을 이송하기 위한 이송부(20)는 주입량 및 주입 속도를 조절하기 위한 밸브 및 펌프를 구비하며, 상기 반응부(10)와 이송관을 통해 연결된다.
상기 밸브는 여러 가지 방향으로 설계될 수 있으나, 바람직하기로 선택된 시료 및 시약 각각을 주입하기 위해 양 방향 밸브를, 시료의 급격한 주입을 방지하기 위해 세 방향 밸브를 사용한다.
또한 펌프의 속도는 지나치게 큰 경우 각종 시료 및 시약의 운반을 정량적으로 수행할 수 없고, 반대로 지나치게 작은 경우 전체적인 검출시간을 단축시킬 수 없으므로, 적절히 조절한다.
이때 이송관의 길이가 길수록 각종 시료 및 시약의 운반을 위한 펌프의 스트로크 횟수가 많아지므로, 시료이송 시간이 길어질 수 있는 문제가 발생하므로 가능하면 이송관의 길이가 최소가 될 수 있도록 펌프, 밸브 및 반응조의 위치를 결정한다.
상기 반응조에서 효소면역반응은 발색 반응을 통한 흡광도를 측정함으로써 이루어지며, 이때 흡광도 측정 및 분석을 검출부(40)에서 이루어진다.
이러한 검출부(40)는 시료에 광을 주입하기 위한 발광 다이오드와, 상기 발광 다이오드에 의해 투과된 광의 광도에 비례하여 전류를 발생시키는 포토 다이오드로 구성된다.
이때 발광 다이오드는 반응조를 담은 블럭 외벽의 아주 작은 구멍을 통하여 큐벳에 광을 투과시켜 반대편에 위치한 포토 다이오드 면과 수직으로 정렬한다. 이때 포토다이오드는 투과된 빛의 광도에 비례하여 광전류를 발생시키며, 이는 신호처리부(50)의 106 V/A의 이득을 갖는 광전압 증폭기에 입력되고, 상기 광전압 증폭기에서 출력된 전압 신호는 차단 주파수가 10 Hz인 4차 버터워스(4th-Butterworth) 저역통과 필터로 고주파 성분이 제거된다. 이어서 이득이 10이며 출력 옵셋(offset) 조절이 가능한 연산증폭기를 사용하여 출력전압을 읽고, 센서 출력은 제어부(70)인 마이크로컴퓨터에 내장된 10 비트의 분해능을 갖는 A/D 변환 기능을 통해 디지털 신호로 바뀌어 육안으로 확인할 수 있는 표시부(60)로 출력된다.
상기 표시부(60)는 액정 표시장치(LCD)와 같은 모니터, 프린터 포트, 통신포 트 및 경보 또는 알람장치 등이 가능하다.
이때 발색 반응에 따른 흡광도의 측정 및 계산의 알고리즘은 하나의 소프트웨어 프로그램으로서 시스템 설계자에 의해 미리 작성되어 제어부(70) 내부의 메모리에 저장된다.
이러한 분석 시스템을 이용한 농약 내 잔류 이미다크로플리드의 분석은
(a) 반응조에서 코팅항원을 배양 후 1차 항체 및 시료를 주입하여 반응시키는 단계,
(b) 상기 반응조에 2차 항체 및 효소 표지된 희석액을 주입하여 반응시키는 단계,
(c) 상기 반응조에 기질 완충액 및 발색시료를 주입하여 발색 반응을 일으키는 단계, 및
(d) 상기 발색 반응을 분석하여 시료 내 이미다크로플리드의 존재 여부를 확인하는 단계를 거쳐 이루어진다.
구체적으로, 제어 시스템(70)에 의해 저장부에 연결된 마이크로 펌프를 작동시켜 저장용기의 솔레노이드 밸브를 개방하여 큐벳에 코팅 항원을 주입 후 세척한 다음, 이를 배양하고, 여기에 다른 밸브를 개방하여 이미다크로플리드 표준시료 및 항체를 주입하여 항원-항체 반응을 수행한다.
이때 1차 항체 및 2차 항체의 배양은 15분 미만, 바람직하게는 3 내지 5분 동안 수행한다. 이는 각 항체를 높은 농도로 희석시킴으로써 가능하며, 바람직하기로 1차 항체의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 4000:1 내지 2000:1로, 2차 항체 의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 10000:1 내지 5000:1의 범위에서 수행한다.
만약 배양 시간이 상기 범위 미만이면 정확한 측정 결과를 얻을 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하게 되면 측정 시간이 과도하게 길어져 바이오센서 또는 진단용 킷트로서 현장에서 용이하게 적용하기가 어렵다. 또한 각 항체의 농도가 상기 범위 미만이면 불완전한 생물반응에 따른 분석의 부정확을 초래할 우려가 있고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 항체의 과다사용 등에 따른 비용손실의 문제와 함께 부정확한 분석를 초래할 우려가 있어, 상기 범위 내에서 적절히 조절하여 사용한다.
이어서, 다른 밸브를 개방하여 큐벳 내로 2차 항체 및 효소 표지된 희석액을 주입하여 반응시킨 후, 또 다른 밸브를 개방하여 상기 큐벳에 기질 완충액 및 발색 시료를 주입하여 발생 반응을 수행한다.
다음으로, 발색 반응을 종료시키기 위해 한 시료를 주입하고, 이때 색 변화 데이터를 광 검출기를 측정하여 시료 중의 이미다크로플리드의 농도를 측정한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 분석방법은 농산물에 잔류하는 살충제 성분인 이미다크로플리드의 검출을 위해 실험실에서 시행되어 오던 효소면역분석법을 기본으로 하여, 특히 1차 및 2차 항원의 배양 시간과 농도를 조절함으로써, 종래 2시간 이상의 검출 시간을 크게 줄일 수 있어, 각종 바이오센서 및 진단용 킷트로 제작되어 현장에서 신속한 측정을 수행할 수 있게 된다.
더욱이 감도 또한 2.0 내지 4.0 ng/ml으로, 국내 작물별 이미다크로플리드의 허용 잔류량의 최소한계인 0.05 내지 6.0 μg/mL 이하인 것을 기준으로 볼 때, 충 분히 적용 가능함을 알 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1) 시료 준비
이미다크로플리드의 잔류량 검출을 위한 코팅 항원으로 hapten-3-BSA을 사용했으며 항체로는hapten-5-KLH를 면역원으로 하여 생산한 항혈청을 사용하였다. 이들 항원과 항체는 충북대학교 농화학과 농약학 실험실에서 제조하였다. 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG와 기질인3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine(TMB)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
이미다크로플리드의 농도별 용액에 대하여 수작업을 통해 큐벳에 항원을 코팅시켰으며, 코팅된 큐벳은 냉동고(-20℃)에 보관하여 사용하였다.
이때 1차 항체의 농도는 1:2000으로 하고 2차 항체의 농도는 1:5000으로 하였으며, 배양시간은 5분과 3분으로 하여 실험하였다. 희석된 항체는 변질을 최소화하기위해 냉장고(4℃)에 보관하여 사용하였다. 이때 이미다크로플리드는 200 ng/mL 내지 0.32 ng/mL 범위로 희석하여 사용하였다.
마이크로 플레이트는 Maxisorp 96-well microtiter plate(Nunc-Immuno Plate, Maxisorp surface, Roskilde, Denmark)를 사용하였고, 마이크로 플레이트 판독기(reader)는Bio-Rad Laboratories 사의 Model 550(Hercules, CA, USA)를 사용하였다
2) 효소 면역 반응
96-웰 미세적정 플레이트(microtiter plate, Nunc-Immuno plate, Maxisorp surface, Nalge Nunc International, Roskilde, Denmark)의 각 반응조(well)에 pH 9.6의 코팅 버퍼(buffer)로 희석한 코팅항원(단백질 농도: 0.1 μg/mL)을 100μL씩 주입하였다. 이어서 4℃에서 24시간 경과 이후 세척 완충액(1×PBS + 0.05% Tween20)으로 5회 세척하여 플레이트에 코팅이 되지 않은 항원을 제거하였다. 이때 반응조의 코팅되지 않은 부위를 블로킹(blocking)하기 위해 각 반응조에 탈지유(3% skim milk in 1×PBS)를 200μL씩 추가하였다.
다음으로, 37℃에서 1시간 배양하고, 다시 상기 방법으로 반응조 플레이트를 세척하였다.
이어 코팅된 플레이트에 1×PBS에 일정 비율로 희석한 1차 항체인 다클론 항체와 분석 대상 시료인 이미다크로플리드의 농도별 표준용액을 50μL씩 첨가하고 잘 혼합하여 실온(24℃)에서 1시간 반응시켰다.
다음으로, 상기 방법으로 세척하고, 2차 항체에 효소가 표지된 goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase 희석액 (1:20,000 diluted with 1×PBST)을 100μL씩 추가하였다. 이어 실온에서 1시간 반응 후 세척하고 기질 완충액 100μL씩을 각 반응조에 추가해 파란색으로 발색시켰다.
약 15분 후에 4N-H2SO4을 50μL씩 추가하여 각 반응조에서의 발색반응을 정지시켰다. 황색으로 변한 플레이트를 450-655 nm 범위의 듀얼 파장 모드(dual wavelength mode)에서 마이크로플레이트 판독기(Model 550, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다.
3) 시스템 구성
상기 효소 면역 반응은 하기 도 2에 도시된 바의 생물반응 시스템을 구성하여 측정하였다. 이때 반응조는 흡착성이 좋은 표준 수정 큐벳을 사용하였다.
또한, 시료의 운반과 혼합을 위해 행정당 50μL의 이송용량을 가진 4개의 솔레노이드펌프(LPLA1220050L, The Lee Co., Westbrook, CT, USA)가 사용되었다. 펌프, 이송관 및 밸브의 오염을 최소화하기 위해 별도의 펌프와 이송관을 두었으며, 양방향 밸브(LFAA1201710H, The Lee Co.)는 선택된 시약을 주입하기 위해 사용하였고, 세 방향 밸브(LFAA1201410H, The Lee Co.)는 시료의 급격한 주입을 예방하기 위해 사용하였다.
이때 반응조 안에 공급되는 배관은 스테인레스강 튜브(1.47 mm OD, 1.07 mm ID)를 사용했고, 다른 이송관은 내경이 1.6 mm인 바이톤 튜브를 사용하였다.
생물반응 시스템의 펌프와 밸브의 작동, 반응조의 발광다이오드 제어. 반응결과의 검출, 검출 신호처리, 계산 및 농도값 표시 등의 제반 과정을 제어하는 계측제어 시스템을 도 3에 도시한 바와 같이 구성하였다.
4) 흡광도 측정
기질의 흡광도를 측정하기 위해 645 nm 발광다이오드(HLMP-4101, Hewlett Packard, San Jose, CA, USA)와 포토다이오드(BPX61, Sienmens Components, Inc., Cupertino, CA, USA)를 사용하여 농도에 대한 발색 정도에 따라 출력전압을 측정하였다.
이때 제어용 프로그램은 C 언어로 작성되어 실행 프로그램으로 변환된 후 AVR에 다운로딩 되었으며, 제어 알고리즘은하기 표 1에 나타내었다.
결합 사이클(Binding cycle)
이미다크로플리드 밸브(600 μL), 반응물 펌프 작동 (20 strokes) 1차 항체 밸브개방 (600 μL), 반응물 펌프 작동 (15 strokes) 혼합 펌프 작동 (33 strokes) 배양 5, 3 분 (24℃)
세척 사이클 (Washing cycle ×5)
큐벳 배수 밸브 세척 (1.2 mL), 반응물 펌프작동 (30 strokes) 혼합 펌프 작동 (36 strokes)
항체 라벨링 사이클(Antibody Labeling cycle)
2차 항체 주입 (1 mL), 펌프 작동 (20 strokes) 배양 5, 3 분 (24℃)
세척 사이클 (Washing cycle ×5)
배양 사이클 (Development cycle)
기질 밸브 개방 (1 mL), 반응물 펌프 작동 (32 strokes) 5 분간 배양(24℃) A/D 콘버터 OD (광학밀도) 계산 (10 s)
세척 사이클 (Cleaning cycle)
이미다크로플리드 시료 밸브 세척 기질 시료 세척 세척액 추가
실험예 1: 효소 면역분석법의 분석시간 단축
효소면역분석법을 기초로 하여 이미다크로플리드의 실시간 측정이 가능하도록 측정감도와 정확도를 저하시키지 않는 범위에서 측정에 소요되는 시간을 최소화하였다.
소요시간을 단축하기 위해서 배양시간과 발현시간을 최소화하는 기초실험을 실시하였다. 이때 표준방법에서 1시간 소요되는 배양 시간을 단축하기 위하여 1차 항체의 희석비를 1:16000에서 1:8000, 1:4000, 1:2000으로, 2차 항체의 희석비를 1:20000에서 1:10000, 1:5000으로 변화하면서 실험하였다. 또한 항체 희석비 증가에 따라 배양시간을 1 시간에서 30분, 15분, 5분으로 축소하면서 흡광도를 측정하였다.
1) 항체 농도 변화
도 4는 1차 항체의 농도를 1:4000(diluted with 1×PBS), 2차 항체 농도를 1:10000(diluted with 1×PBST)으로 하였을 때 농도별 흡광도를 측정한 결과와 1차 항체의 농도를 1:2000으로 하고 2차 항체의 농도를 1:5000으로 하였을 때 흡광도를 비교한 그래프이다.
이때 종래 배양 조건에 따른 IC50을 하기 표 2에 나타내었다.
코팅 항원 (㎍/mL) = 0.1 1차 항원 농도(Rabbit D antiserum, dilution) = 1:16000 2차 항원 농도(Goat anti-rabbit IgG-HRP, dilution) = 1:20000
AMax(A) Slope (B) IC50 (ng/mL) (C) AMin (D) A/D 측정 범위 (ng/mL, IC20-IC80)
0.386 0.460 0.78 -0.007 55.1 0.038-15.926
상기 표 2 및 도 4를 참조하면, 1차 항체의 농도를 4배, 2차 항체의 농도를 2배로 증가시켰을 때 표 2의 최적화 조건에서의 결과와 비교하여 IC50 값이 0.78 ng/mL에서 10 ng/mL로 높아졌고 최대흡광도 값은 0.386에서 0.04로 매우 낮아졌다. 이에 1차 항체를 8배, 2차 항체를 4배의 농도로 높인 결과 IC50 값은 2.2 ng/mL로 낮아졌고 최대 흡광도 값도 1.5272로 급격히 증가함을 확인하였다. 또한 최소 검출한계도 0.831 ng/mL에서0.176 ng/mL로 낮게 측정되었다.
따라서 1차 항체의 농도가 1:2000, 2차 항체의 농도가 1:5000이고 배양시간이 15분인 경우 흡광도의 값도 높아지고, 최소 검출한계도 낮아지는 것을 알 수 있었다.
2) 배양시간 변화
도 5는 1차 항체의 농도가 1:2000, 2차 항체의 농도가 1:5000일 때 배양시간을 5분과 3분으로 수행한 경우 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 5를 참조하면, 배양시간을 5분으로 하였을 때 최대흡광도 값이 0.1901로 측정되었으며 3분으로 하였을 때 최대흡광도 값이 0.1318로 낮게 측정되었다. 상기 측정감도 IC50 값은 2.5 ng/mL에서 3.8 ng/mL로 다소 높아졌지만 잔류 이미다크로플리드의 검출 및 분석이 충분히 가능한 범위이다.
이때 최소 검출한계는0.237 ng/mL과 0.326 ng/mL로 확인되었고, 잔류 이미다크로플리드의 국내허용기준인 0.05 내지 6μg/mL 보다 낮은 검출한계를 갖는다.
따라서, 본 발명에 의해 효소면역분석법을 이용한 잔류 농약 내 이미다크로플리드의 존재 여부 및 농도 측정시, 1차 및 2차 항원의 배양 시간과 농도를 조절함으로써, 종래 2시간 이상의 검출 시간을 크게 줄일 수 있어, 각종 바이오센서 및 진단용 킷트로 제작되어 현장에서 신속한 측정을 수행할 수 있게 된다.

Claims (9)

  1. 농산물에 잔류하는 살균제인 이미다크로플리드의 존재 여부 및 농도를 측정하기 위하여,
    (a) 반응조에서 코팅항원을 배양 후 1차 항체 및 시료를 주입하여 반응시키는 단계,
    (b) 상기 반응조에 2차 항체 및 효소 표지된 희석액을 주입하여 반응시키는 단계,
    (c) 상기 반응조에 기질 완충액 및 발색시료를 주입하여 발색 반응을 일으키는 단계, 및
    (d) 상기 발색 반응을 분석하여 시료 내 이미다크로플리드의 농도를 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 1차 항체 및 2차 항체의 배양을 15분 미만으로 수행하는 생물반응 시스템을 포함하는 이미다크로플리드의 분석방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 1차 항체 및 2차 항체의 배양은 3 내지 5분 동안 수행하는 것인 이미다크로플리드의 분석방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 1차 항체의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 4000:1 내지 2000:1 인 것인 이미다크로플리드의 분석방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 2차 항체의 농도는 희석용액에 대한 함량비로 10000:1 내지 5000:1인 것인 이미다크로플리드의 분석방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 분석방법은 IC50가 2.0 내지 4.0 ng/ml범위의 고감도로 분석되는 것인 이미다크로플리드의 분석방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계 a) 내지 d)의 단계는 제어회로에 의해 자동으로 조절 및 제어되는 것인 이미다크로플리드의 분석방법.
  7. (A) (ⅰ) 각종 시료 및 시약이 저장된 저장부,
    (ⅱ) 상기 시료 및 시약이 이송되는 이송부, 및
    (ⅲ) 시료의 효소 면역 반응이 수행되는 반응조를 포함하는 반응부를 구비하는 생물반응 시스템과;
    (B) (ⅰ) 상기 반응조의 발색 반응에 따른 발광다이오드 빛의 광도에 비례하여 광전류를 발생시키기 위한 포토 다이오드를 포함하는 검출부,
    (ⅱ) 상기 포토 다이오드의 광전류의 변화에 따른 전압 신호를 처리하는 신호처리부,
    (ⅲ) 이를 외부로 표시하기 위한 표시부, 및
    (ⅳ) 상기 저장부, 이송부, 반응부, 검출부, 신호처리부 및 표시부를 자동으로 제어하기 위한 제어회로가 구비된 제어부를 구비하는 계측 시스템;
    을 포함하는 이미다크로플리드의 분석 시스템.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 표시부는 액정 표시장치(LCD)를 포함하는 모니터, 프린터 포트, 통신포트 및 경보 및 알람장치로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 장치인 것인 이미다크로플리드의 분석 시스템.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 제어부는 흡광도의 측정 및 계산의 알고리즘을 가지는 소프트웨어 프로그램이 내장된 마이크로 컴퓨터인 것인 이미다크로플리드의 분석 시스템.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030108970A1 (en) 1999-12-08 2003-06-12 Brady James Francis Immunoassay for neonicotinyl insecticides

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