CN114397441A - 一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农药残留化学发光免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用。一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；所述A液包括3‑氨基‑苯二甲酰肼和Tris缓冲溶液；所述B液包括双氧水溶液。本发明得到的发光试剂盒可延长持续发光时间，避免天然酶催化过程中发光时间短等问题。化学发光试剂盒的发光强度可达7×104，发光时间持续可达60min，化学发光稳定平台期持续时间为可达35min。
Description
技术领域
本发明涉及农药残留化学发光免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
啶虫脒作为防治刺吸式口器害虫、小型鳞翅目和鞘翅目害虫最有效的一类杀虫剂，广泛用于蔬菜、果蔬、水稻等农产品中病虫害的防止。啶虫脒不规范使用，会对蜜蜂以及环境土壤等生态系统造成破坏。因此研发啶虫脒快速检测试剂盒具有重要意义。
啶虫脒常用的检测方法有高效液相、气相色谱技术等，传统的检测技术操作复杂，成本高，耗时长等弊端。化学发光免疫分析不仅结合了化学发光技术的高灵敏度和免疫分析的高特异性，还具备操作简单、成本低，耗时短等优势。
传统的化学发光免疫分析中，常用的催化酶是HRP天然酶等，天然酶催化活性因环境温度、湿度、酸碱度变化而变化，对环境的耐受性差，造成化学发光免疫分析技术的精密度和准确度差，其次，天然酶制备过程复杂、成本比较高，难以实现现场快速检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，以解决现有农药残留检测化学发光试剂盒的发光时间持续时间短、环境耐受性差等技术问题。
本发明的另一个目的在于提供一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，简单、高效。
本发明的另一个目的在于提供一种啶虫脒的化学发光免疫分析方法，具有高效、精确的特点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；
所述A液包括3-氨基-苯二甲酰肼和Tris缓冲溶液；
所述B液包括双氧水溶液。
优选地，所述A液中，3-氨基-苯二甲酰肼的浓度为0.005～0.03mol/L；所述B液中，双氧水的浓度为0.015～0.03mol/L；
优选地，所述A液和所述B液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；
优选地，所述Tris缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH为10.5～10.8；
优选地，所述啶虫脒标准品包括啶虫脒、甲醇和水；其中，啶虫脒的浓度为小于或等于200μg/L。
优选地，所述的纳米酶Au探针包括卵清蛋白偶联的啶虫脒半抗原标记到纳米酶Au颗粒上的所得物；
优选地，所述的抗体标记微孔板包括啶虫脒抗体标记到96白色微孔板的所得物。
所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
分别制备纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液。
优选地，所述纳米酶Au探针的制备方法，包括以下步骤：
将卵清蛋白偶联的啶虫脒半抗原和纳米酶Au溶液的混合物进行振荡处理，再进行离心和洗涤，收集所得固相并用水进行复溶；
优选地，所述纳米酶Au溶液的制备方法，包括：将氯金酸和水在加热条件下进行第一搅拌处理，再加入柠檬酸三钠溶液并进行第二搅拌处理，得到的混合体系冷却后进行离心处理，收集固相并用水进行复溶；
优选地，所述氯金酸和所述柠檬酸三钠的摩尔比为(0.8～1.2)：(3.5～4.2)；
优选地，所述第一搅拌处理的温度为99～100℃，第一搅拌处理的时间为30～60s；
优选地，第二搅拌处理的时间为18～25min。
优选地，所述纳米酶Au溶液经过0.22μm的滤膜进行过滤；
优选地，所述振荡处理在36.8～37.2℃的条件下进行，所述振荡处理的时间为25～35min；
优选地，所述离心的转速为9000～11000r/min，所述离心的时间为12～16min；
优选地，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液，洗涤的次数为3～4次。
优选地，所述抗体标记微孔板的制备方法，包括以下步骤：
将啶虫脒抗体和96孔板混合并进行孵育；
优选地，所述孵育的温度为3.5～4.5℃，所述孵育的时间为11～13h；
优选地，对所述孵育后的96孔板进行洗涤，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液，洗涤次数为3～4次。
采用如上所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒实施啶虫脒的化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：
将纳米酶Au探针、抗体标记微孔板和不同浓度的啶虫脒标准品分别进行第一混合，经过洗涤后得到不同的复合微孔板；将不同的所述复合微孔板分别与A液和B液进行第二混合，得到多个第二混合体系；
测定多个所述第二混合体系的化学发光强度；
根据啶虫脒标准品的浓度及各浓度所对应的发光强度抑制率建立标准曲线，根据所述标准曲线计算各样品中的啶虫脒的浓度。
优选地，所述第一混合的温度为36.8～37.2℃，第一混合的时间为55～65min；
优选地，所述第一混合的湿度为70％～80％；
优选地，所述第二混合的时间为20～30min；
优选地，所述洗涤的次数为3～4次。
优选地，所述标准曲线为：y＝31.793x+4.5925，其中，x为所述啶虫脒标准品的浓度，y为发光强度抑制率，相关系数R2＝0.9677。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中采用易制备、低成本、耐贮藏的纳米酶Au，作为天然酶的替代物，制备纳米酶Au的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，通过各组成的配合，可延长持续发光时间，避免天然酶催化过程中发光时间短等问题。化学发光试剂盒的发光强度可达7×104，发光时间持续可达60min,化学发光稳定平台期持续时间为可达35min。
(2)本发明啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，简单、高效。
(3)本发明啶虫脒的化学发光免疫分析方法，具有高效、精确的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中基于纳米酶Au的化学发光免疫分析试剂盒动力曲线；
图2为本发明中纳米酶Au颗粒的透射电镜图；
图3为本发明中啶虫脒标准品的浓度与抑制率的线性图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；
所述A液包括3-氨基-苯二甲酰肼和Tris缓冲溶液；
所述B液包括双氧水溶液。
本发明中采用易制备、低成本、耐贮藏的纳米酶Au，作为天然酶的替代物，制备纳米酶Au的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，通过各组成的配合，延长持续发光时间，避免天然酶催化过程中发光时间短等问题。
在一种实施方式中，所述A液中，3-氨基-苯二甲酰肼的浓度为0.005～0.03mol/L。3-氨基-苯二甲酰肼的浓度包括但不限于0.005mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.015mol/L、0.02mol/L、0.025mol/L或0.028mol/L。
在一种实施方式中，所述B液中，双氧水的浓度为0.015～0.03mol/L。双氧水的浓度包括但不限于0.018mol/L、0.02mol/L、0.022mol/L、0.25mol/L或0.028mol/L。
在一种实施方式中，所述A液和所述B液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。例如可以为1:1、0.8:1、1.2:1或1:1.2。
在一种实施方式中，所述Tris缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH为10.5～10.8。在一种实施方式中，所述Tris缓冲溶液的浓度包括但不限于0.09mol/L、0.1mol/L或0.11mol/L。
在一种实施方式中，所述啶虫脒标准品包括啶虫脒、甲醇和水；其中，啶虫脒的浓度为小于或等于200μg/L。啶虫脒的浓度包括但不限于0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、60μg/L、70μg/L、80μg/L、90μg/L、100μg/L、110μg/L、120μg/L、130μg/L、150μg/L、160μg/L、170μg/L、180μg/L或190μg/L。
在一种实施方式中，所述的纳米酶Au探针包括卵清蛋白(OVA)偶联的啶虫脒半抗原标记到纳米酶Au颗粒上的所得物。
在一种实施方式中，所述的抗体标记微孔板包括啶虫脒抗体标记到96白色微孔板的所得物。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
分别制备纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液。
在一种实施方式中，本Tris缓冲溶液是由1.2114g三羟甲基氨基甲烷溶于100mL超纯水中，配置成0.1mol/L的Tris缓冲溶液，其pH约10.5～10.8。
在一种实施方式中，A液(鲁米诺溶液)是由0.0354g 3-氨基-苯二甲酰肼溶于20mL、0.1mol/L的Tris缓冲溶液中，配置成0.01mol/L的鲁米诺溶液。
在一种实施方式中，H2O2溶液是由30％质量分数的H2O2溶液配置而成0.02mol/LH2O2溶液。
在一种实施方式中，所述纳米酶Au探针的制备方法，包括以下步骤：
将卵清蛋白偶联的啶虫脒半抗原和纳米酶Au溶液的混合物进行振荡处理，再进行离心洗涤，收集所得固相并用水进行复溶。
在一种实施方式中，所述纳米酶Au溶液的制备方法，包括：将氯金酸和水在加热条件下进行第一搅拌处理，再加入柠檬酸三钠溶液并进行第二搅拌处理，得到的混合体系冷却后进行离心处理，收集固相并用水进行复溶。
在一种实施方式中，所述氯金酸和所述柠檬酸三钠的摩尔比为(0.8～1.2)：(3.5～4.2)。例如，可以为1:4。
在一种实施方式中，所述第一搅拌处理的温度为99～100℃，第一搅拌处理的时间为30～60s。例如可以为35s、40s、45s、50s、55s或60s。
在一种实施方式中，第二搅拌处理的时间为18～25min。例如可以为10min、20min、21min、22min、23min或24min。
在一种实施方式中，离心处理的转速为9500～10500r/min，离心处理的的时间为10～20min。
复溶后的纳米酶Au放在3.8～4.3℃的环境中避光保存。
在一种实施方式中，纳米酶Au的制备方法，具体包括以下步骤：
(a)实验过程所用的转子、三孔圆底烧瓶、烧杯、量筒、玻璃小瓶等玻璃仪器均需用王水(VHNO3:VHCl＝1:3)浸泡4h，并用超纯水淋洗5-6遍，并烘干备用；实验过程所用超纯水均为蒸馏水；
(b)搭建好铁架台、电加热套、回流冷凝管，将三孔圆底烧瓶置于电加热套上，加入100mL超纯水，放入2cm梭形磁子，转速360r/min，打开加热套，设置温度100℃，功率500W；
(c)待超纯水加热至微微沸腾时，向烧瓶内加10％的HAuCl4溶液，搅拌30～60s，迅速加入10mL、38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌加热20min后关闭加热套；
(d)在回流的条件下冷却至常温，制备的纳米酶Au在10000r/min的条件下离心15min，去除上清液，将纳米酶Au用超纯水复溶，复溶的纳米酶Au放在4℃环境中避光保存。
在一种实施方式中，所述纳米酶Au溶液经过0.22μm的滤膜进行过滤。
在一种实施方式中，所述振荡处理在36.8～37.2℃的条件下进行，所述振荡处理的时间为25～35min。在以一种实施方式中，振荡处理的温度包括但不限于36.9℃、37℃或37.1℃。所述振荡处理的时间包括但限于26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min或34min。
在一种实施方式中，所述离心的转速为9000～11000r/min，所述离心的时间为12～16min。所述离心的转速包括但不限于9100r/min、9200r/min、9300r/min、9400r/min、9500r/min、9600r/min、9700r/min、9800r/min、9900r/min、10000r/min、10500r/min或10700r/min。
在一种实施方式中，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液(PBST)，洗涤的次数为3～4次。PBST的浓度为0.04～0.06mol/L。
在一种实施方式中，所述抗体标记微孔板的制备方法，包括以下步骤：
将啶虫脒抗体和96孔板混合并进行孵育。
在一种实施方式中，所述孵育的温度为3.5～4.5℃，时间为11～13h。所述孵育的温度包括但不限于3.6℃、3.7℃、3.8℃、3.9℃、4℃、4.1℃、4.2℃、4.3℃或4.4℃。孵育的时间为11.5h、12h、12.5h或12.7h。
在一种实施方式中，对所述孵育后的96孔板进行洗涤，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液，洗涤次数为3～4次。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及采用所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒实施啶虫脒的化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：
将纳米酶Au探针、抗体标记微孔板和不同浓度的啶虫脒标准品分别进行第一混合，经过洗涤后得到不同的复合微孔板；将不同的所述复合微孔板分别与A液和B液进行第二混合，得到多个第二混合体系；
测定多个所述第二混合体系的化学发光强度；
根据啶虫脒标准品的浓度及各浓度所对应的发光强度抑制率建立标准曲线，根据所述标准曲线计算各样品中的啶虫脒的浓度。
该方法高效，精确。
在一种实施方式中，所述第一混合的温度为36.8～37.2℃，时间为55～65min，所述第一混合的温度包括但不限于36.9℃、37℃或37.1℃。第一混合的时间为56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min或64min。
在一种实施方式中，所述第一混合的湿度为70％～80％。所述第一混合的湿度包括但不限于71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％。
在一种实施方式中，所述第二混合的时间为20～30min。所述第二混合的时间包括但不限于22min、25min、26min、27min或29min。
在一种实施方式中，所述洗涤的次数为3～4次。
在一种实施方式中，所述标准曲线为：y＝31.793x+4.5925，其中，x为所述啶虫脒标准品的浓度，y为所述所述啶虫脒标准品的各个浓度所对应的发光强度抑制率，相关系数R2＝0.9677。
下面将结合具体的实施例对本发明作进一步的解释说明。
图1为本发明中基于纳米酶Au的化学发光免疫分析试剂盒动力曲线。图2为本发明中纳米酶Au颗粒的透射电镜图。图3为本发明中啶虫脒标准品的浓度与抑制率的线性图。
实施例1
基于纳米酶Au的化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；所述A液包括0.01mol/L的3-氨基-苯二甲酰肼和0.1mol/L的Tris缓冲溶液，pH为10.5；所述B液包括双氧水溶液，双氧水的浓度为0.02mol/L。
其中，抗体标记微孔板的制备方法，包括：取啶虫脒抗体(10μg/L)，加入到96孔板中，在4℃条件下孵育12h；孵育12h后的96孔板，需要用0.05mol/L的PBST洗液洗涤3遍，弃去洗液，放在4℃冰箱备用。
纳米酶Au探针的的制备方法，包括：首先取1mL经过0.22μm滤膜过滤的纳米酶Au溶液，再取OVA偶联的啶虫脒半抗原加入到纳米酶Au溶液中，在37℃条件下，振荡30min；振荡30min后，在10000r/min条件下，离心15min。用0.05mol/L的PBST洗液离心洗涤3次，弃去洗液，再用超纯水复溶；所述纳米酶Au的溶液的制备方法，具体包括：
(a)实验过程所用的转子、三孔圆底烧瓶、烧杯、量筒、玻璃小瓶等玻璃仪器均需用王水(VHNO3:VHCl＝1:3)浸泡4h，并用超纯水淋洗5-6遍，并烘干备用；实验过程所用超纯水均为蒸馏水；(b)搭建好铁架台、电加热套、回流冷凝管，将三孔圆底烧瓶置于电加热套上，加入100mL超纯水，放入2cm梭形磁子，转速360r/min，打开加热套，设置温度100℃，功率500W；(c)待超纯水加热至微微沸腾时，向烧瓶内加10％的HAuCl4溶液，搅拌40s，迅速加入10mL、38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌加热20min后关闭加热套；(d)在回流的条件下冷却至常温，制备的纳米酶Au在10000r/min的条件下离心15min，去除上清液，将纳米酶Au用超纯水复溶，复溶的纳米酶Au放在4℃环境中避光保存。
采用上述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒实施啶虫脒的化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：
啶虫脒标准品制备：用10％甲醇溶液，配置一系列农药梯度的啶虫脒标准品(浓度梯度包括：0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L)，以备竞争反应；
将20μL啶虫脒标准品和20μL啶虫脒纳米酶Au探针加入到抗体标记的微孔板中，发生竞争反应，在温度37℃，75％湿度条件下孵育1h；竞争反应后的复合物，用超纯水洗涤3次；洗涤后的竞争反应复合物微孔板，加入A液和B液，按体积比为1:1的比例混合使用，加入A液和B液在室温条件下反应25min后，再用多功能酶标仪测量化学发光强度；
以啶虫脒标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的发光强度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的啶虫脒浓度，所述标准曲线为：y＝31.793x+4.5925，其中，x为所述啶虫脒标准品的浓度，y为所述所述啶虫脒标准品的各个浓度所对应的发光强度抑制率，相关系数R2＝0.9677。
实施例2
基于纳米酶Au的化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；所述A液包括0.03mol/L的3-氨基-苯二甲酰肼和0.15mol/L的Tris缓冲溶液，pH为10.8；所述B液包括双氧水溶液，双氧水的浓度为0.015mol/L。
其中，纳米酶Au探针的制备方法，包括：首先取1mL经过0.22μm滤膜过滤的纳米酶Au溶液，再取OVA偶联的啶虫脒半抗原加入到纳米酶Au溶液中，在36.8℃条件下，振荡35min；振荡35min后，在11000r/min条件下，离心12min。用0.05mol/L的PBST洗液离心洗涤4次，弃去洗液，再用超纯水复溶；所述纳米酶Au的溶液的制备方法同实施例1。
抗体标记微孔板的制备方法，包括：取啶虫脒抗体(20μg/L)，加入到96孔板中，在4.5℃条件下孵育11h；孵育11h后的96孔板，需要用0.05mol/L的PBST洗液洗涤4遍，弃去洗液，放在4℃冰箱备用。
啶虫脒的化学发光免疫分析方法同实施例1。
实施例3
基于纳米酶Au的化学发光免疫分析试剂盒，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；所述A液包括0.008mol/L的3-氨基-苯二甲酰肼和0.08mol/L的Tris缓冲溶液，pH为10.6；所述B液包括双氧水溶液，双氧水的浓度为0.025mol/L。
其中，纳米酶Au探针的制备方法，包括：首先取1mL经过0.22μm滤膜过滤的纳米酶Au溶液，再取OVA偶联的啶虫脒半抗原加入到纳米酶Au溶液中，在37.2℃条件下，振荡25min；振荡25min后，在9000r/min条件下，离心16min。用0.05mol/L的PBST洗液离心洗涤3次，弃去洗液，再用超纯水复溶。所述纳米酶Au的溶液的制备方法同实施例1。
抗体标记微孔板的制备方法，包括：取啶虫脒抗体(10μg/L)，加入到96孔板中，在4℃条件下孵育13h；孵育13h后的96孔板，需要用0.05mol/L的PBST洗液洗涤4遍，弃去洗液，放在4℃冰箱备用。
实验例
实施例1中啶虫脒标准品的浓度与发光强度抑制率的测定数据如表1所示。啶虫脒标准品的浓度与发光强度抑制率的曲线图如图3所示。
表1不同啶虫脒标准品的浓度对应的发光强度抑制率
| 啶虫脒标准品的浓度(μg/L) | 发光强度抑制率(％) |
| 10 | 31.16 |
| 20 | 44.28 |
| 50 | 63.89 |
| 100 | 72.76 |
| 200 | 74.32 |
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液；
所述A液包括3-氨基-苯二甲酰肼和Tris缓冲溶液；
所述B液包括双氧水溶液。
2.根据权利要求1所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述A液中，3-氨基-苯二甲酰肼的浓度为0.005～0.03mol/L；所述B液中，双氧水的浓度为0.015～0.03mol/L；
优选地，所述A液和所述B液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；
优选地，所述Tris缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH为10.5～10.8；
优选地，所述啶虫脒标准品包括啶虫脒、甲醇和水；其中，啶虫脒的浓度为小于或等于200μg/L。
3.根据权利要求1所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的纳米酶Au探针包括卵清蛋白偶联的啶虫脒半抗原标记到纳米酶Au颗粒上的所得物；
优选地，所述的抗体标记微孔板包括啶虫脒抗体标记到96白色微孔板的所得物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别制备纳米酶Au探针、抗体标记微孔板、啶虫脒标准品、A液和B液。
5.根据权利要求4所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述纳米酶Au探针的制备方法，包括以下步骤：
将卵清蛋白偶联的啶虫脒半抗原和纳米酶Au溶液的混合物进行振荡处理，再进行离心和洗涤，收集所得固相并用水进行复溶；
优选地，所述纳米酶Au溶液的制备方法，包括：将氯金酸和水在加热条件下进行第一搅拌处理，再加入柠檬酸三钠溶液并进行第二搅拌处理，得到的混合体系冷却后进行离心处理，收集固相并用水进行复溶；
优选地，所述氯金酸和所述柠檬酸三钠的摩尔比为(0.8～1.2)：(3.5～4.2)；
优选地，所述第一搅拌处理的温度为99～100℃，第一搅拌处理的时间为30～60s；
优选地，第二搅拌处理的时间为18～25min。
6.根据权利要求5所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述纳米酶Au溶液经过0.22μm的滤膜进行过滤；
优选地，所述振荡处理在36.8～37.2℃的条件下进行，所述振荡处理的时间为25～35min；
优选地，所述离心的转速为9000～11000r/min，所述离心的时间为12～16min；
优选地，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液，洗涤的次数为3～4次。
7.根据权利要求4所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗体标记微孔板的制备方法，包括以下步骤：
将啶虫脒抗体和96孔板混合并进行孵育；
优选地，所述孵育的温度为3.5～4.5℃，所述孵育的时间为11～13h；
优选地，对所述孵育后的96孔板进行洗涤，所述洗涤采用的洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液，洗涤次数为3～4次。
8.采用权利要求1～3中任一项所述的啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒实施啶虫脒的化学发光免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
将纳米酶Au探针、抗体标记微孔板和不同浓度的啶虫脒标准品分别进行第一混合，经过洗涤后得到不同的复合微孔板；将不同的所述复合微孔板分别与A液和B液进行第二混合，得到多个第二混合体系；
测定多个所述第二混合体系的化学发光强度；
根据啶虫脒标准品的浓度及各浓度所对应的发光强度抑制率建立标准曲线，根据所述标准曲线计算各样品中的啶虫脒的浓度。
9.根据权利要求8所述的啶虫脒的化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述第一混合的温度为36.8～37.2℃，第一混合的时间为55～65min；
优选地，所述第一混合的湿度为70％～80％；
优选地，所述第二混合的时间为20～30min；
优选地，所述洗涤的次数为3～4次。
10.根据权利要求8所述的啶虫脒的化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述标准曲线为：y＝31.793x+4.5925，其中，x为所述啶虫脒标准品的浓度，y为发光强度抑制率，相关系数R2＝0.9677。
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