CN111537463A - 一种定量检测血清中尿酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测血清中尿酸的方法，属于血清中尿酸检测技术领域，包括以下步骤：向待检测的血清中加入尿酸酶且混合均匀，得到混合液A，向混合液A中加入三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物得到混合液B；向混合液B中加入2，2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐得到混合液C；S4：将混合液C置于37℃的恒温环境中15～25min进行育温，然后室温环境内静置8～12min，得到混合液D；测定混合液D在420nm处的吸光度值，将测定得到的吸光度值带入标准曲线得到的计算公式，计算出尿酸的浓度；对血清中尿酸的浓度进行定量检测，使检测体系简单化同时减少影响因素，降低试剂成本。
Description
技术领域
本发明属于血清中尿酸检测技术领域，具体涉及一种定量检测血清中尿酸的方法。
背景技术
目前临床上常用于血清尿酸检测的方法主要是尿酸酶-过氧化物酶偶联法，其实验原理为：尿酸可被尿酸酶氧化，生成尿囊素和过氧化氢，在过氧化物酶催化下，过氧化氢使3，5-二氯-2-羟苯磺酸(DHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)缩合成红色醌类化合物，在520nm波长处有最大吸光度，其吸光度值与尿酸含量成正比；该方法中采用的过氧化物酶为天然的蛋白酶，如辣根过氧化物酶等，被广泛应用于各种临床检测方法中，但是由于天然的蛋白酶具有性质不稳定、在生物体内的含量较低、提纯以及储存较困难等等缺点，如在过酸、过碱以及高温条件下容易失活，这也使得天然酶的使用条件变得苛刻，窄范围的使用条件限制了它的实际应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种定量检测血清中尿酸的方法。
本发明所采用的技术方案为：一种定量检测血清中尿酸的方法，包括以下步骤：
S1：向待检测的血清中加入尿酸酶且混合均匀，得到混合液A；
S2：向混合液A中加入三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物且混合均匀，得到混合液B；
S3：向混合液B中加入2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐且混合均匀，得到混合液C；
S4：将混合液C置于37℃的恒温环境中15～25min进行育温，然后室温环境内静置8～12min，得到混合液D；
S5：测定混合液D在420nm处的吸光度值；
S6：将测定得到的吸光度值带入标准曲线得到的计算公式，计算出尿酸的浓度。
三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物简写为：MCA-Pd NPs；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐简写为：ABTS2-；
本发明的有益效果为：采用三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物，在三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物加入之后，就只需要加入2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，代替原有的3，5-二氯-2-羟苯磺酸和4-氨基安替比林，对血清中尿酸的浓度进行定量检测，使检测体系简单化同时减少影响因素，降低试剂成本和使用范围扩大，具有实际意义，为临床检测应用奠定坚实的基础，为临床血清尿酸检测方法研究寻找到一个新的方向。
本发明的工作原理为：尿酸被尿酸酶氧化，生成尿囊素和H2O2，H2O2在MCA-Pd NPs的作用下产生O2，O2将底物ABTS2-氧化成为显绿色的自由基ABTS·-，因此液体由无色转变成绿色，在420nm波长处有最大吸光度，其吸光度值与尿酸含量成正比。
进一步限定，步骤S6中计算公式由以下步骤得到：
A1：参考尿酸浓度的临床检测范围，设定6个的工作标准液，每个工作标准液的浓度均不相同；
A2：向每一个工作标准液中均依次加入相同量的尿酸酶、相同量的钯纳米粒子、相同量的2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐；
A3：将步骤S2中得到的混合液均在420nm处进行吸光度值的测定；且将吸光度值和工作标准液的浓度得到标准曲线；
A4：根据标准曲线得到所述计算公式。
进一步限定，步骤S4中的恒温环境为水浴。
进一步限定，6个所述工作标准液中尿酸的摩尔浓度分别为：100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1200μmol/L、1600μmol/L。
进一步限定，所述三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物由以下方法制备得到：
B1：向不断被搅拌的三聚氰胺溶液中加入H2PdCl4溶液，得到混合物E；
B2：向混合物E中加入三聚氰酸，得到混合液F；
B3：向混合物F中加入柠檬酸，室温搅拌至少12h，过滤得到黄色固体物即为三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物。
附图说明
图1是检测流程图；
图2是标准曲线图；
图3是MCA-Pd NPs催化性能的验证中不同实验组的吸光度值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本发明的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有能实现的结构或器件。
本发明为了解决现有血清中尿酸浓度的检测过程中所使用的过氧化物酶为天然的蛋白酶，而天然的蛋白酶具有性质不稳定、在生物体内的含量较低、提纯以及储存较困难等等缺点，如在过酸、过碱以及高温条件下容易失活，这也使得天然酶的使用条件变得苛刻，窄范围的使用条件限制了它的实际应用的问题，本发明提供一种定量检测血清中尿酸的方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤1：取10μL血清加入EP管中，再取50μL 1.6mg/mL尿酸酶加入并用加样枪上下吸取5次，充分混匀，使尿酸酶与血清中的尿酸充分接触，保证在后面的温育过程中尿酸酶将血清中的全部尿酸转变成尿囊素和过氧化氢做准备；
步骤2：取100μL 0.105mg/mL MCA-Pd NPs液体加入混合液中并用加样枪上下吸取5次，充分混匀，保证MCA-Pd NPs与混合液中其他成分充分接触；
步骤3：取50μL 90mmol/L ABTS2-加入混合液中并用加样枪上下吸取5次，充分混匀，使ABTS2-与混合液中其他成分充分接触，保证在后面的温育过程中反应产生的全部O2将底物ABTS2-氧化成ABTS·-；
步骤4：将装有混合液的EP管置于水浴锅中37℃反应20min，计时器计时；
步骤5：温育结束后，取出EP管室温放置10min，可肉眼观察到液体已经由无色转变成绿色；
步骤6：比色分析：先用空白管调零，将全部绿色液体转移到微量比色皿中，液面不能超过比色皿2/3处，在420nm处测定液体的吸光度值，记录数据；
步骤7：换算：从绘制好的标准曲线上经过公式换算，即可计算出尿酸的浓度；
其中，MCA-Pd NPs的制备如下：
在洗净烘干的150mL的烧杯中加入10mL的三聚氰胺溶液，在不断地搅拌下，再将0.4mL的50mmol/L H2PdCl4加入到上述三聚氰胺溶液中；然后，再将10mL的10mmol/L三聚氰酸加入到上述混合液中；最后，再在混合液中加入0.8mL的50mmol/L的柠檬酸。可以观察到混合液中开始出现黄色沉淀物，在室温下持续搅拌12个小时之后，即可合成具有氢键超分子结构的MCA-Pd NPs溶液。
实施例1
一、实验器材准备：EP管、加样枪、加样枪头、标记笔、温育标本架、水浴锅、比色皿、全波长扫描仪、装有蒸馏水的洗液瓶；
二、标准曲线的建立
取6个工作标准液且体积均为10μL，6个工作标准液中的尿酸的摩尔浓度分别为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1200μmol/L、1600μmol/L且分别命名为标准品1、标准品2、标准品3、标准品4、标准品5、标准品6，6个工作标准液分别依次进行如下操作：
EP管2：10μL标准品1(100μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL:0.105mg/MlMCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管3：10μL标准品2(200μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mLMCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管4：10μL标准品3(400μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105 mg/mLMCA-Pd NPs+50μL10mmol/Lol/L ABTS2-；
EP管5：10μL标准品4(800μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105 mg/mLMCA-Pd NPs+50μL10mmol/Lol/L ABTS2-；
EP管6：10μL标准品5(1200μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mLMCA-Pd NPs+50μL10mmol/Lol/L ABTS2-；
EP管7：10μL标准品6(1600μmol/L尿酸)+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105 mg/mLMCA-Pd NPs+50μL10mmol/Lol/L ABTS2-；
将EP管2-7的液体倒入其余的比色皿中，并将比色皿置于测试孔位置，依次对2-7管的液体进行比色检测，记录各样本的吸光度值，检测结束后，先将标准品1-6的数据绘制好标准曲线并生成公式，见图2；由图2得到标准曲线公式为：y＝0.0001x+0.0633，R2＝0.9943，这个R值越高说明X和Y值线性关系越好，R值>0.99说明标准曲线科学有效，该公式可用于换算。
三、血清样本检测
取5个临床血清样本，分别命名为血清样本1、血清样本2、血清样本3、血清样本4、血清样本5，将上述五个血清样本分别依次进行以下的处理：
EP管8：10μL血清样本1+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管9：10μL血清样本2+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管10：10μL血清样本3+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管11：10μL血清样本4+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管12：10μL血清样本5+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
EP管1：空白管，10μL蒸馏水+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-，该组为空白对照；
先将EP管1倒入2个比色皿中分别置于紫外可见分光光度计的参比孔和测试孔进行空白测试，后将测试孔的空白管取出；然后将EP管8-12的液体倒入其余的比色皿中，并将比色皿置于测试孔位置，依次对8-12管的液体进行比色检测，记录各样本的吸光度值，检测结束后，将各自的吸光值带入标准曲线公式即得到相应的尿酸浓度，结果如表1所示；且同时将10μL血清样本1-5采用临床常用的日立7600生化分析仪进行尿酸的测定，结果如表1所示。
表1两种检测方法检测血清中尿酸的浓度(μmol/L)
由表1可知，对于同一种血清样本，两种检测方法检测出的尿酸浓度大体相同，因此说明本发明公开的定量检测血清中尿酸的方法准确性高且可靠。
四、MCA-Pd NPs催化性能的验证
应用辣根过氧化物酶(HRP)作为参照设计了如下验证实验：
a管：10μL蒸馏水+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL2000U/L HRP+50μL10mmol/LABTS2-；
b管：10μL血清+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL2000U/L HRP+50μL10mmol/L ABTS2-；
c管：10μL血清+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-；
d管：10μL蒸馏水+50μL1.6mg/mL尿酸酶+100μL0.105mg/mL MCA-Pd NPs+50μL10mmol/L ABTS2-。
肉眼可见b和c两管液体由无色转变为绿色，而a和d两管液体仍表现为无色；使用全波长扫描仪器分别对4组混合液进行300nm-600nm波段扫描，b和c两管液体在420nm处均有明显的特征吸收峰，而a和d两管液体在420nm处几乎没有吸收，如图3所示，由图3可知，MCA-Pd NPs具有与HRP相似的过氧化物酶活性，基于MCA-Pd NPs和底物ABTS2-建立的比色法尿酸检测体系能成功应用于血清尿酸的检测。
注：上述每组实验均采用如图1所示的检测流程图。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种定量检测血清中尿酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向待检测的血清中加入尿酸酶且混合均匀，得到混合液A；
S2：向混合液A中加入三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物且混合均匀，得到混合液B；
S3：向混合液B中加入2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐且混合均匀，得到混合液C；
S4：将混合液C置于37℃的恒温环境中15～25min进行育温，然后室温环境内静置8～12min，得到混合液D；
S5：测定混合液D在420nm处的吸光度值；
S6：将测定得到的吸光度值带入标准曲线得到的计算公式，计算出尿酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中计算公式由以下步骤得到：
A1：参考尿酸浓度的临床检测范围，设定6个的工作标准液，每个工作标准液的浓度均不相同；
A2：向每一个工作标准液中均依次加入相同量的尿酸酶、相同量的钯纳米粒子、相同量的2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐；
A3：将步骤S2中得到的混合液均在420nm处进行吸光度值的测定；且将吸光度值和工作标准液的浓度得到标准曲线；
A4：根据标准曲线得到所述计算公式。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中的恒温环境为水浴。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，6个所述工作标准液中尿酸的摩尔浓度分别为：100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1200μmol/L、1600μmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物由以下方法制备得到：
B1：向不断被搅拌的三聚氰胺溶液中加入H2PdCl4溶液，得到混合物E；
B2：向混合物E中加入三聚氰酸，得到混合液F；
B3：向混合物F中加入柠檬酸，出现黄色沉淀，该黄色沉淀即为三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物，室温搅拌至少12h，即可得到含有三聚氰胺氰尿酸盐和钯纳米粒子形成的复合物的溶液。
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