CN110987843A - 基于双金属mof纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法 - Google Patents
基于双金属mof纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸根的检测方法，尤其涉及一种基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法。首先绘制紫外吸收光谱标准工作曲线，然后通过工作曲线来确定待测物的磷酸根含量。本发明还公开了双金属金属（Ce/Zr）有机框架结构（MOFs）纳米类氧化酶即Treated‑UiO‑66‑(Ce/Zr)的制备方法。本发明检测过程条件温和，不需要其他试剂，实现了磷酸根的方便、快速检测，检测成本低廉，操作简单；通过双模式校准TMB/ABTS+Treated‑UiO‑66‑(Ce/Zr)体系检测磷酸根，检测限低至14 nM，可检测范围宽至0.667～667μM；利用TMB/ABTS+Treated‑UiO‑66‑(Ce/Zr)体系检测磷酸根，对实际样品的测量结果准确，对磷酸根的响应灵敏，可实现对环境饮用水中磷酸根的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸根的检测方法，尤其涉及一种基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法。
背景技术
磷酸盐是人体所需的营养物质之一，人体内的磷酸盐正常含量一般为2.5-4.5mg/dL，摄入过多的磷酸盐会危害血管安全，诱发多种疾病，影响身体健康。环境中的磷酸盐广泛存在于生活饮用水中，主要来源于食品工业、洗涤剂制造业和农药生产等领域的污废水排放。另外，环境中过多的磷酸根还会导致水体富营养化，不利于水生生物的生长。因此，准确、快速地检测环境水体中磷酸根的含量成为监控水体质量和疾病预防的重要手段。
目前磷酸根的检测方法主要有色谱法、荧光法、电化学法、生物传感法及SERS等。中国专利CN107179301A《锆-卟啉金属有机骨架材料作为荧光探针在检测磷酸氢根离子中的应用》公开了一种利用磷酸氢根离子对锆-卟啉MOFs荧光增强效果来定量检测磷酸氢根的方法，该方法利用锆-卟啉MOFs中的Zr-O结点与磷酸氢根之间的特异性结合，以及在水相中较好的分散性，从而实现了对水溶液中磷酸氢根离子的检测。中国专利CN110132911A《基于复合物比率荧光探针的水样中总磷检测方法》公开了一种基于稀土离子聚合物与碳量子点构建的N,S-CQDs/EuCPs复合物比率荧光探针体系，除Fe3+略有轻微影响外，该荧光体系可实现对磷酸根的选择性检测。中国专利CN106093168A《基于MEMS技术的磷酸根电化学传感器及其在动态检测磷酸根中的应用》公开了一种电化学动态检测磷酸根的方法，该方法能够克服现有磷酸根离子选择电极传感器抗干扰能力不足的缺点，最大限度地减少其他离子对目标离子的干扰，准确度高，可用于现场对土壤等磷酸根离子的快速检测。中国专利CN1598539A《一种检测尿液中磷酸根的方法》公开了一种使用镱离子、邻苯二酚紫为显色剂的定量法直接检测未稀释的人体尿液中磷酸根含量，该测定方法简单方便，灵敏度高且不受尿液中其他成分的干扰，可用于临床检测。
然而在上述技术方案中，有些检测方法对环境要求苛刻，成本相对较高，操作相对复杂，试剂保存条件要求高。因此，开发一种操作简便、成本低廉、适用性强的磷酸根检测方法具有重要的意义。比色法具有操作简单、反应速度快、成本低等优点，而且检测结果无需借助复杂的仪器，比色信号便可通过裸眼观察或利用智能手机记录，使得比色法非常适合现场快速分析。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于公开一种基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法。
该方法以Treated-UiO-66-(Ce/Zr)为类氧化酶模拟物，在酸性条件下，催化氧气与显色剂(TMB或ABTS)之间的反应，产生显色物质(TMBox或ABTSox)。由于磷酸根的加入会显著地改变Treated-UiO-66-(Ce/Zr)的表面电荷状态，从而影响不同显色物质的颜色变化。本发明中，Pi可以促进TMB的显色而抑制ABTS的显色，因此本发明利用A’＝ATMB/AABTS对检测结果进行运算处理，从而得到更稳定可靠的检测数据，据此可测定环境中水体的磷酸根。
技术方案
基于双金属有机框架结构(MOFs)纳米类氧化酶的磷酸根比色检测方法，首先绘制紫外吸收光谱标准工作曲线，然后通过工作曲线来确定待测物的磷酸根含量。
一种基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，步骤如下：
1)分别于5mL离心管中加入不同浓度的磷酸根和0.267mL 1mg/mL Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶，反应1～30min，优选5min；所述磷酸根在体系内的最终浓度为0.67μM、1.33μM、2μM、2.67μM、3.33μM、6.67μM、13.33μM、20μM、26.67μM、33.33μM、66.67μM、133.33μM、200μM、266.67μM、333.33μM、400μM、466.67μM、533.33μM、600μM或666.67μM；
2)再向混合液中依次加入0.1mL 5mM的TMB和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min，优选5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
或者
以ABTS为显色底物，重复步骤1)～2)，用紫外-可见吸收分光光度计测定吸光度，记录波长为408nm处的吸光度并绘制以ABTS为显色剂的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
4)将上述测量值按照公式A’＝ATMB/AABTS进行计算，所得的A’与对应的磷酸根浓度绘制校准后的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
5)将待测磷酸根样品重复步骤1)～4)，用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB和ABTS为底物时的吸光度，通过计算再与标准工作曲线比对，即可获得磷酸浓度。
本发明较优公开例中，步骤2)中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2M。
本发明较优公开例中，步骤5)中所述待测磷酸根样品的可检测浓度范围为0.667～667μM，检测限低至14nM。
在本说明书中，术语“类氧化酶”是指具有氧化酶催化活性的材料。具体地，本发明的类氧化酶以氧气作为电子受体，通过氧化相应底物生成有色物质，用于比色检测。
在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“ABTS”是化合物“2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸”的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“UiO-66-(Ce/Zr)”是指原始的双金属金属有机框架纳米类氧化酶，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“Treated-UiO-66-(Ce/Zr)”是指氧化处理后的双金属金属有机框架纳米类氧化酶，二者可互换使用。
本发明的另外一个目的，在于公开了上述双金属金属(Ce/Zr)有机框架结构(MOFs)纳米类氧化酶即Treated-UiO-66-(Ce/Zr)的制备方法，包括如下步骤：
A)将合成所需的锆盐与铈盐均匀混合，依次加入锆盐与铈盐摩尔量之和的对苯二甲酸，一定体积的调节剂，以DMF为溶剂溶解，充分混匀，其中，所述锆盐：铈盐的摩尔比为1mmol：0.1～10mmol，优选1mmol：5mmol；所述调节剂的体积为1～8mL，优选5mL；所用DMF体积为10～50mL，优选20mL；
B)将混合溶液置于水热反应器中80～150℃反应2～48h，优选120℃反应24h，取出产物，用丙酮、乙醇分别淋洗干净，离心干燥，制得双金属有机框架UiO-66-(Ce/Zr)；
C)配制体积比为10：1～25：1的NaOH(2.5M)和H2O2(30wt％)预备液，混合均匀备用；
D)称取20mg步骤B)得到的UiO-66-(Ce/Zr)于4.0mL去离子水中，超声20min使其分散均匀，加入50μL步骤C)中新鲜配制的预备液，氧化5～60min，优选20min，得复合物；
E)用去离子水将复合物反复淋洗直至pH呈中性，60℃烘干，收集即可得到Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶。
本发明较优公开例中，步骤A)所述锆盐为ZrCl4、ZrOCl2或Zr(NO3)4，优选Zr(NO3)4；所述铈盐为Ce(NO3)3、Ce(NH4)2(NO3)6或Ce(SO4)2，优选Ce(NH4)2(NO3)6。
本发明较优公开例中，步骤A)中所述调节剂为乙酸、甲酸或苯甲酸，优选乙酸。所用的调剂通常是单配位的配体，可以影响配体去质子化状态，或可逆地与桥连配体竞争金属位点，影响晶体生长的动力学过程。
有益效果
本发明公开了TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系用于磷酸根的比色检测；利用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系比色检测磷酸根，检测过程条件温和，不需要其他试剂，实现了磷酸根的方便、快速检测，检测成本低廉，操作简单；通过双模式校准TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根，检测限低至14nM，可检测范围宽至0.667～667μM；利用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根，对实际样品的测量结果准确，对磷酸根的响应灵敏，可实现对环境饮用水中磷酸根的检测。
附图说明
图1.不同反应体系反应5min时的紫外-可见吸收光谱；
图2.磷酸根影响催化体系图(A：以TMB为底物；B：以ABTS为底物)；
图3.用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根原理探讨一；
图4.用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根原理探讨二；
图5.用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根条件优化图(其中，A：材料组分优化；B：纳米酶浓度优化；C：吸附时间优化)；
图6.用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根的检测效果(其中，A：以TMB为底物的光谱图；B：以ABTS为底物的光谱图；C：校准后的标准曲线)；
图7为用TMB+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系检测磷酸根的选择性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
双金属金属有机框架作为类氧化酶模拟物的制备方法，包括如下步骤：
1)将9.1mmol Zr(NO3)4、0.9mmol Ce(NH4)2(NO3)6、10mmol对苯二甲酸和2mL乙酸充分混合，溶解于15mL DMF中；
2)将混合溶液置于水热反应器中在80℃温度下反应2h，取出产物，用丙酮、乙醇分别淋洗3次，离心干燥，制得双金属金属有机框架UiO-66-(Ce/Zr)；
3)配制体积比为10：1的NaOH(2.5M)和H2O2(30wt％)预备液，混合均匀备用；
4)称取20mg上一步得到的UiO-66-(Ce/Zr)于4.0mL去离子水中，超声20min使其分散均匀，向混合液中加入50μL步骤3)中新鲜配制预备液，氧化5min；
5)用去离子水将上述复合物反复淋洗直至pH呈中性，60℃烘干，收集即可得到Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶。
Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶催化氧气氧化底物反应的应用实验：
1)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在652nm处的吸光度；
2)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的ABTS和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在408nm处的吸光度。
实施例2
双金属金属有机框架作为类氧化酶模拟物的制备方法，包括如下步骤：
1)将1.67mmol Zr(NO3)4、8.33mmol Ce(NH4)2(NO3)6、10mmol对苯二甲酸和5mL乙酸充分混合，溶解于20mL DMF中；
2)将混合溶液置于水热反应器中在120℃温度下反应24h，取出产物，用丙酮、乙醇分别淋洗3次，离心干燥，制得双金属金属有机框架UiO-66-(Ce/Zr)；
3)配制体积比为15：1的NaOH(2.5M)和H2O2(30wt％)预备液，混合均匀备用；
4)称取20mg上一步得到的UiO-66-(Ce/Zr)于4.0mL去离子水中，超声20min使其分散均匀，向混合液中加入50μL步骤3)中新鲜配制预备液，氧化20min；
5)用去离子水将上述复合物反复淋洗直至pH呈中性，60℃烘干，收集即可得到Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶。
Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶催化氧气氧化底物反应的应用实验：
1)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在652nm处的吸光度；
2)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的ABTS和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在408nm处的吸光度。
实施例3
双金属金属有机框架作为类氧化酶模拟物的制备方法，包括如下步骤：
1)将0.9mmol Zr(NO3)4、9.1mmol Ce(NH4)2(NO3)6、10mmol对苯二甲酸和8mL乙酸充分混合，溶解于20mL DMF中；
2)将混合溶液置于水热反应器中在150℃温度下反应48h，取出产物，用丙酮、乙醇分别淋洗3次，离心干燥，制得双金属金属有机框架UiO-66-(Ce/Zr)；
3)配制体积比为20：1的NaOH(2.5M)和H2O2(30wt％)预备液，混合均匀备用；
4)称取20mg上一步得到的UiO-66-(Ce/Zr)于4.0mL去离子水中，超声20min使其分散均匀，向混合液中加入50μL步骤3)中新鲜配制预备液，氧化60min；
5)用去离子水将上述复合物反复淋洗直至pH呈中性，60℃烘干，收集即可得到Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶。
Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶催化氧气氧化底物反应的应用实验：
1)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在652nm处的吸光度；
2)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的ABTS和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应5min之内在408nm处的吸光度。
实施例4
Treated-UiO-66-(Ce/Zr)催化氧气氧化其底物反应的实验
1)体系一：取2.9mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，向其中加入0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；
体系二：取2.8mL0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL的UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；
体系三：取2.8mL0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；
2)将步骤1)中各体系所得混合液分别在室温下反应5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
实验结果如图1所示，图1的三条光谱是三个反应体系对应的紫外可见吸收光谱图，由图可见单独的TMB体系几乎没有吸收峰，TMB+UiO-66-(Ce/Zr)和TMB+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系有明显吸收峰且在氧化处理后的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)类氧化酶活性显著增强。
实施例5
Pi影响Treated-UiO-66-(Ce/Zr)催化氧气氧化其底物反应的实验
实施例5A
1)体系一：取2.9mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，向其中加入0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；
体系二：取2.633mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；
体系三：取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL 10mM的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入2.533mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；
2)将步骤1)中各体系所得混合液分别在室温下反应5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
实验结果如图2A所示。图2A中单独的TMB体系几乎没有吸收峰,当加入催化剂Treated-UiO-66-(Ce/Zr)后，有较浅的颜色产生，当Pi加入后，由于Pi与纳米酶相互作用，改变了纳米酶表面的电荷分布状态，电负性增加，从而使带正电性的TMB显色反应加快，吸收峰增强。
实施例5B
1)体系一：取2.9mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，向其中加入0.1mL 5mM的ABTS，然后将上述溶液混合均匀；
体系二：取2.633mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的ABTS和0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；
体系三：取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL 10mM的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入2.533mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的ABTS，然后将上述溶液混合均匀；
2)将步骤1)中各体系所得混合液分别在室温下反应5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
实验结果如图2A所示。图2A中单独的ABTS体系几乎没有吸收峰,当加入催化剂Treated-UiO-66-(Ce/Zr)后，有较明显的颜色产生，当Pi加入后，由于Pi与纳米酶相互作用，改变了纳米酶表面的电荷分布状态，电负性增加，从而使带负电性的ABTS显色反应变慢，吸收峰减弱。
上述反应原理也利用红外光谱仪进行验证，如图3。与Pi反应之后的纳米酶出现了P-O键，证明Pi通过键合作用吸附在纳米酶的表面。其催化原理如图4所示，吸附了Pi的纳米酶表面电负性增加，从而改变了其与电负性不同底物反应的反应速率。
实施例6
Treated-UiO-66-(Ce/Zr)检测磷酸根的条件优化试验
实施例6A纳米酶组分对利用Treated-UiO-66-(Ce/Zr)检测磷酸根的影响
1)取2.633mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.267mL 1mg/mL不同组分的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
2)取0.267mL 1mg/mL不同组分的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL10mM的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入2.533mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
结果如图5A所示，从图5A可以看出磷酸根对反应体系的影响受组分含量高低的影响。在本实验中，Zr：Ce为1：5时磷酸根促进TMB显色效果最明显，故选用组分为1：5的纳米酶为最优条件。
实施例6B纳米酶浓度对利用Treated-UiO-66-(Ce/Zr)检测磷酸根的影响
1)取2.8mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.1mL 1mg/mL不同浓度的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
2)取不同体积1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL 10mM的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入一定体积0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀，保证总溶液体积为3mL；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
结果如图5B所示，从图5B可以看出磷酸根对反应体系的影响受纳米酶浓度高低的影响。在本实验中，体系中纳米酶浓度为89μg/mL时磷酸根促进TMB显色效果最明显，故选用体系中纳米酶浓度为89μg/mL为最优条件。
实施例6C Pi与纳米酶吸附时间对利用Treated-UiO-66-(Ce/Zr)检测磷酸根的影响
1)取2.633mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.267mL 1mg/mL不同浓度的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
2)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL 10mM的Pi混匀，反应一段时间，再依次向其中加入2.533mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度。
结果如图5C所示，从图5C可以看出磷酸根对反应体系的影响受吸附时间长短的影响。在本实验中，吸附时间为5min时磷酸根促进TMB显色效果最明显，故选用吸附时间为5min为最优条件。
实施例7
实施例7A利用TMB+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根
1)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和不同浓度的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入一定体积0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀，保证总溶液体积为3mL；所述混合溶液中只改变加入磷酸根溶液的浓度，其在体系内最终浓度为0.67μM、1.33μM、2μM、2.67μM、3.33μM、6.67μM、13.33μM、20μM、26.67μM、33.33μM、66.67μM、133.33μM、200μM、266.67μM、333.33μM、400μM、466.67μM、533.33μM、600μM或666.67μM；
2)将步骤1)中所得混合液在室温下反应5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
利用本发明的比色方法对于磷酸根检测的结果如图6A所示。其中,图6A说明随着磷酸根浓度的增加，溶液的吸光度逐渐增大。
实施例7B利用ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根
1)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和不同浓度的Pi混匀，反应5min，再依次向其中加入一定体积0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的ABTS，然后将上述溶液混合均匀，保证总溶液体积为3mL；所述混合溶液中只改变加入磷酸根溶液的浓度，其在体系内最终浓度为0.67μM、1.33μM、2μM、2.67μM、3.33μM、6.67μM、13.33μM、20μM、26.67μM、33.33μM、66.67μM、133.33μM、200μM、266.67μM、333.33μM、400μM、466.67μM、533.33μM、600μM或666.67μM；
2)将步骤1)中所得混合液在室温下反应5min；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实施例7C利用TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根
1)将上述测量值按照公式A’＝ATMB/AABTS进行计算，将所得的A’与对应的磷酸根浓度绘制校准后的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线。
利用双模式校准的比色方法对于磷酸根检测的结果如图6C所示。由图6C可以看出,该方法对于磷酸根的可检测范围为0.67～666.67μM，有优良的检测效果。
实施例8
利用TMB+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根的选择性和抗干扰性
1)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和0.1mL 10mM的不同种类的离子混匀，反应5min，再依次向其中加入2.533mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度；
2)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液、0.1mL 10mM Pi溶液和0.1mL 10mM的其他种类离子混匀，反应5min，再依次向其中加入2.433mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在室温下反应5min之内在652nm处的吸光度；
结果如图7所示。图7是用TMB+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根的选择性和抗干扰性的柱状图，柱状图从左到右依次为空白、Al3+、Co2+、Cu2+、Eu3+、Fe3+/EDTA、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Cl-、CO3 2-、HCO3 -、NO3 -、SO4 2-、SO3 2-、Br-、Ac-、AlO2 2-和H2PO4 -。从图7中可以看出只有磷酸根可以显著促进TMB的显色反应，而其他离子共存时不会对Pi的促进效果产生影响，说明该传感器可以高选择性、稳定地完成磷酸根的比色定量检测。
实施例9
TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)比色检测磷酸根的回收率实验
1)取0.267mL 1mg/mL的Treated-UiO-66-(Ce/Zr)分散溶液和一定量的Pi溶液混匀，反应5min，再依次向其中加入一定量的醋酸盐缓冲液(pH为4)，0.1mL 5mM的TMB，保证溶液总体积为3mL，然后将上述溶液混合均匀；
3)将步骤1)中所得混合液在室温下中反应5min；
4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
其测定结果如下表1所示：
表1本发明及国家标准方法对自来水和雨水检测结果的对比
由上表可知，TMB/ABTS+Treated-UiO-66-(Ce/Zr)体系对实际样品中磷酸根含量的变化响应灵敏，与国家标准方法相比，结果相近。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，其特征在于，步骤如下：
1）分别于5 mL离心管中加入不同浓度的磷酸根和0.267 mL 1 mg/mL Treated-UiO-66-(Ce/Zr) 纳米类氧化酶，反应1～30 min；所述磷酸根在体系内的最终浓度为0.67 μM、1.33 μM、2 μM、2.67 μM、3.33 μM、6.67 μM、13.33 μM、20 μM、26.67 μM、33.33 μM、66.67 μM、133.33 μM、200 μM、266.67 μM、333.33 μM、400 μM、466.67 μM、533.33 μM、600 μM或666.67 μM；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应1～30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652 nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
或者
以ABTS为显色底物，重复步骤1）～2），用紫外-可见吸收分光光度计测定吸光度，记录波长为408 nm处的吸光度并绘制以ABTS为显色剂的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
4）将上述测量值按照公式A’=A TMB /A ABTS 进行计算，所得的A’与对应的磷酸根浓度绘制校准后的磷酸浓度-吸光度标准工作曲线；
5）将待测磷酸根样品重复步骤1）～4），用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB和ABTS为底物时的吸光度，通过计算再与标准工作曲线比对，即可获得磷酸浓度。
2.根据权利要求1所述基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，其特征在于：步骤1）所述分别于5 mL离心管中加入不同浓度的磷酸根和0.267 mL 1 mg/mLTreated-UiO-66-(Ce/Zr)，反应5 min。
3.根据权利要求1所述基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，其特征在于：步骤2）所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
4.根据权利要求1所述基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，其特征在于：步骤2）所述混匀体系后反应5 min。
5.根据权利要求1所述基于双金属MOF纳米类氧化酶的磷酸根比色检测法，其特征在于：步骤5）中所述待测磷酸根样品的可检测浓度范围为0.667～667 μM，检测限低至14 nM。
6.如权利要求1所述Treated-UiO-66-(Ce/Zr) 纳米类氧化酶，其制备方法，包括如下步骤：
A）将合成所需的锆盐与铈盐均匀混合，依次加入锆盐与铈盐摩尔量之和的对苯二甲酸，一定体积的调节剂，以DMF为溶剂溶解，充分混匀，其中，所述锆盐：铈盐的摩尔比为1mmol：0.1～10 mmol，优选1 mmol：5 mmol；所述调节剂的体积为1～8 mL，优选5 mL；所用DMF体积为10～50 mL，优选20 mL；
B）将混合溶液置于水热反应器中80～150℃反应2～48 h，优选120℃反应24 h，取出产物，用丙酮、乙醇分别淋洗干净，离心干燥，制得双金属有机框架UiO-66-(Ce/Zr)；
C）配制体积比为10：1～25：1的NaOH（2.5 M）和H2O2（30 wt%）预备液，混合均匀备用；
D）称取20 mg步骤B）得到的UiO-66-(Ce/Zr)于4.0 mL去离子水中，超声20 min使其分散均匀，加入50 μL 步骤C）中新鲜配制的预备液，氧化5～60 min，优选20 min，得复合物；
E）用去离子水将复合物反复淋洗直至pH呈中性，60℃烘干，收集即可得到Treated-UiO-66-(Ce/Zr)纳米类氧化酶。
7.根据权利要求6所述Treated-UiO-66-(Ce/Zr) 纳米类氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤A）所述锆盐为ZrCl4、ZrOCl2或Zr(NO3)4，优选Zr(NO3)4；所述铈盐为Ce(NO3)3、Ce(NH4)2(NO3)6或Ce(SO4)2，优选Ce(NH4)2(NO3)6。
8.根据权利要求6所述Treated-UiO-66-(Ce/Zr) 纳米类氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤A）中所述调节剂为乙酸、甲酸或苯甲酸，优选乙酸。
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