CN109959781A - 基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括如下物质：96孔聚苯乙烯微孔板、二氧化锰纳米片溶液、样品稀释液、TMB显色液和HCl终止溶液。取3μl二氧化锰纳米片溶液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入100μl样品稀释溶液，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。本发明利用二氧化锰纳米片对草酸特异性检测，通过加入显色液对草酸进行定量检测。本发明试剂盒的检测下限低，检测时间短。

Description

基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于纳米生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前，已经开发了多种方法来测量食物、尿液或血浆中的草酸盐，例如分光光度法，离子色谱法，电流型生物传感器，毛细管电泳，高效液相色谱法，和气相色谱法。然而，上述分析技术需要昂贵且复杂的设备，大量样品，有毒且昂贵的试剂或专业技术人员，因此，需要寻找一种能快速简单且经济实用的检测试剂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于二氧化锰纳米片草酸试剂盒，它包括如下物质：96孔聚苯乙烯微孔板、二氧化锰纳米片溶液、样品稀释液、TMB显色液和HCl终止溶液。
所述二氧化锰纳米片溶液是：10ml 0.3M MnCl2·4H2O溶液中加入20ml含有0.6MTMA·OH和3wt％H2O2的混合溶液。混合后将溶液放在摇床上室温摇晃过夜。取反应后的溶液在10000rpm转速下离心10分钟。将沉淀用乙醇和超纯水润洗，并放在烘箱中30℃条件下干燥后得到合成的块状二氧化锰。取合成的块状二氧化锰10mg溶于10ml 1mg/mL BSA溶液中，室温下超声8小时。将溶液在1000rpm转速下离心20min。去除离心后的沉淀所得。
所述样品稀释液是：将草酸溶液用纯水稀释后，再用pH＝3的硫酸稀释成浓度7.8μM-250μM。
一种基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒的应用，具体为：取3μl二氧化锰纳米片溶液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入100μl样品稀释溶液，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。
本发明的有益效果是，本发明利用二氧化锰纳米片对草酸特异性检测，通过加入显色液对草酸进行定量检测。本发明试剂盒的检测下限低，检测时间只需11min。
附图说明
图1是本发明方法原理图；
图2是本发明二氧化锰纳米片检测草酸前的透射电子显微镜(TEM)表征图；
图3是本发明不同体积的二氧化锰纳米片显色结果吸光度谱；
图4是本发明草酸与二氧化锰纳米片反应时间结果图；
图5是本发明二氧化锰纳米片与TMB显色时间结果图；
图6是本发明检测不同浓度草酸结果图；
图7是试剂盒在不同物质干扰下的吸光度变化结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。
本发明提出的基于二氧化锰纳米片草酸试剂盒，它包括如下物质：96孔聚苯乙烯微孔板、二氧化锰纳米片溶液、样品稀释液、TMB显色液和HCl终止溶液。
具体的，所述二氧化锰纳米片溶液是：10ml 0.3M MnCl2·4H2O溶液中加入20ml含有0.6M TMA·OH和3wt％H2O2的混合溶液。混合后将溶液放在摇床上室温摇晃过夜。取反应后的溶液在10000rpm转速下离心10分钟。将沉淀用乙醇和超纯水润洗，并放在烘箱中30℃条件下干燥后得到合成的块状二氧化锰。取合成的块状二氧化锰10mg溶于10ml 1mg/mLBSA溶液中，室温下超声8小时。将溶液在1000rpm转速下离心20min。去除离心后的沉淀所得。
具体的，所述样品稀释液是：将草酸溶液用纯水稀释后，再用pH＝3的硫酸稀释成浓度7.8μM-250μM。
上述基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒的应用，具体为：
取3μl二氧化锰纳米片溶液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入100μl样品稀释溶液，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。
实施例1：
二氧化锰纳米片制备：制备过程如图1所示。10ml 0.3M MnCl2·4H2O溶液中加入20ml 0.6M TMA·OH和3wt％H2O2混合溶液。混合后溶液变成暗棕色，将溶液放在要床上室温摇晃过夜。取反应后的溶液在10000rpm转速下离心10分钟。将沉淀用乙醇和超纯水润洗3次，并放在烘箱中30℃条件下干燥，得到合成的块状二氧化锰。取合成的块状二氧化锰10mg溶于10ml 1mg/mL BSA溶液中，室温下超声8小时。然后将溶液离心20min，转速1000rpm。去除离心后的沉淀，得到二氧化锰纳米片溶液。制备好的二氧化锰纳米片用TEM进行表征，如图2所示。在剥离后的二氧化锰纳米片中可以观察到具有褶皱的大平面和超薄片。
实施例2：
取1μl至7ul体积不等的二氧化锰纳米片溶液，加入100μl H2SO4和100μl TMB显色液。放入酶标仪中，设置扫谱范围为300nm-650nm，选择要扫谱的区域，进行吸光度谱扫描，如图3所示。扫谱结果表明，出峰位置在波长460nm处，溶液显色一定梯度，因此选择吸光度为1.5所对应的二氧化锰纳米片溶液的体积作为最佳体积。
实施例3：
二氧化锰纳米片检测草酸所需时间的表征如图4、图5所示。首先，为了研究二氧化锰纳米片和草酸的反应时间，用硫酸调100μM草酸至pH为3，取草酸溶液100μl加入3μl二氧化锰纳米片，每反应5分钟后加入TMB显色液，检测吸光度。图4可以看出，反应10分钟过后，曲线趋于平缓，吸光度基本不变，可以确定草酸和二氧化锰的反应时间为10分钟。接下来，为了研究显色时间，取3μl二氧化锰纳米片溶液，加入100μl H2SO4和100μl TMB显色液。每隔一段时间检测吸光度。从图5可以看到从加入显色液后吸光度基本保持不变，因此将显色时间确定为1分钟。综上所述，本发明方法检测草酸所用时间为11分钟。
实施例4：
在上述反应条件下，取3μl二氧化锰纳米片加入到96孔板中，加入100μl样品稀释溶液，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。吸光度值如图6所示。当草酸盐浓度低于7.8μM或高于250μM时，吸光度显示非常轻微的变化。传感器在7.8μM至250μM的浓度范围内表现出良好的线性。线性关系式为A＝-0.8248lgC+2.372，线性度为0.99。同时如图7所示，显示出了非常好的特异性。
实施例5：
用于人工尿中草酸的检测。将0.45g肌酐,2.25g KCl,0.50g MgSO4·7H2O,1.48g柠檬酸,3.17g NaCl,0.17g NaHCO3,0.05g Na2HPO4·12H2O,0.05g NaH2PO4·2H2O,1.29g ofNa2SO4,0.80g NH4Cl,12.13g尿素和0.17g尿酸定容至1000ml。用人工尿配出100μM，50μM，25μM，10μM的草酸实际样品。取3μl二氧化锰纳米片溶液加入到96孔板中，加入100μl草酸实际样品，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。通过实验测得结果如表1：
需要声明的是，本发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于二氧化锰纳米片草酸试剂盒，其特征在于，它包括如下物质：96孔聚苯乙烯微孔板、二氧化锰纳米片溶液、样品稀释液、TMB显色液和HCl终止溶液。
所述二氧化锰纳米片溶液是：10ml 0.3M MnCl2·4H2O溶液中加入20ml含有0.6M TMA·OH和3wt％H2O2的混合溶液。混合后将溶液放在摇床上室温摇晃过夜。取反应后的溶液在10000rpm转速下离心10分钟。将沉淀用乙醇和超纯水润洗，并放在烘箱中30℃条件下干燥后得到合成的块状二氧化锰。取合成的块状二氧化锰10mg溶于10ml 1mg/mL BSA溶液中，室温下超声8小时。将溶液在1000rpm转速下离心20min。去除离心后的沉淀所得。
所述样品稀释液是：将草酸溶液用纯水稀释后，再用pH＝3的硫酸稀释成浓度7.8μM-250μM。
2.一种权利要求1所述基于二氧化锰纳米片草酸检测试剂盒的应用，其特征在于，所述应用具体为：取3μl二氧化锰纳米片溶液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入100μl样品稀释溶液，反应10分钟。在反应后的溶液中加入100μl TMB显色液，接着加入100μl HCl终止溶液终止反应。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，定点扫描波长460nm处的吸光度。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述草酸优选为尿液草酸。
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