CN110887724A - 一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法 - Google Patents

一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法。包括如下步骤：将待检测的液体生物样品在低于溶剂沸点的温度条件下烘干成块状；或将待测的固体生物样品在101～105℃温度条件下烘干至微焦状态；然后加入65％硝酸，在80～82℃条件下密封消解40～50min；最后在同样温度条件下，再加入30％双氧水，密封消解5～10min，冷却后即可得到消解液。本发明所述方法通过先低温烘干，再加入硝酸低温消解，最后再加入双氧水；上述处理不仅减少了硝酸的用量，避免了酸污染，降低了处理成本；同时还充分发挥了硝酸和双氧水的消解能力；得到的消解液澄清透明，其中的酸浓度较低，无需赶酸，降低了分析物的损失，且消解液空白值低，还可同时处理大批量样品。

Description

一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法
技术领域
本发明涉及生物样品中微量元素的检测技术领域，更具体地，涉及一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法。
背景技术
目前生物样品的前处理方法主要包括灰化法和湿法消解法。灰化法是利用高温除去样品中的含碳有机物，剩余的灰分用稀酸溶解为样品待测溶液。由于灰化温度一般为500～600℃，故处理样品时，如汞、铅、镉、锡、砷、硒等易挥发元素损失严重。
湿法消解，又叫湿法消化，是用各种具有氧化性的浓酸或其混酸在加热或加压条件下破坏样品中的有机物。传统的湿法消解由于装置不同主要又分两种：1)微波消解法。微波消解通常是指利用微波加热封闭容器中的消解液(各种浓酸或混酸)和试样，从而在高温增压条件下使各种样品快速溶解。然而即使温度升到2000℃，生物样品中的物质仍然消解不够彻底，致使造成测定结果偏低。由于生物样品含有大量的有机质，微波消解时会产生大量的气体，使密闭容器内产生压力过大，以致超出正常的控制压力而失去微波自动控制加热的能力，造成压力过大甚至消解器产生爆炸的危险；而且所需要的设备价格昂贵，且不适用于大批量样本的同时处理。2)加热板消解法。此方法是将样品置于敞口的容器内加入浓酸液，通过加热到一定的温度使其消解。对于含大量有机物的生物样品，特别是脂肪和纤维素含量高的样品，加热消解时易产生大量泡沫，容易造成被测组分的损失。酸雾的挥发不但危害人的健康，还可能导致样品的污染和元素的丢失。传统的湿法消解法不能大批量同时处理样品，且耗酸量较大，仍需高温加热(大于200℃)，难使溶液澄清，易造成环境污染和元素损失(如：Ni)，对于部分元素(如：Zn)可能容易被污染。消解完后，由于采用的酸量较大，必须作赶酸处理，不仅增加了分析步骤，而且容易导致分析物损失，还会提高空白值；混酸中的高氯酸和硫酸会对石墨炉原子吸收带来光谱干扰，氯离子会对质谱测定砷带来分子质量干扰，以及硫酸根离子在质谱测定时会在锥上产生沉积，造成记忆效应。
因此，为了准确、简单的检测生物样品中的微量无机元素，有必要对上述样品前处理过程进行改进。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的检测生物样品中的微量无机元素时，生物样品前处理方法中存在的酸的用量较大、操作复杂(必须进行赶酸处理)、分析物元素损失较大、检测空白值高等缺陷和不足，提供一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法。本发明所述样品前处理方法通过先将待检测的生物样品(全血、血清、动物组织、细胞、毛发、指甲、胎粪、中草药、陆地植物及海洋生物等等)采用低温烘干，然后在低温条件下，加入少量硝酸进行消解，最后再加入少量双氧水消解，即可得到澄清透明的消解液，经稀释后即可进行检测。所述方法不仅可保证生物样品在较少硝酸用量的情况下消解完全，且无须进行赶酸处理、分析物元素的损失极少、样品空白值交底，可同时处理大批量样品。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，包括如下步骤：将待检测的液体生物样品在低于溶剂沸点的温度条件下烘干成块状；或将待测的固体生物样品在101～105℃温度条件下烘干至微焦状态；然后加入质量浓度65％硝酸，在80～82℃条件下密封消解40～50min；最后在同样温度条件下，再加入质量浓度30％双氧水，密封消解5～10min，冷却后即可得到澄清透明的消解液。
由于生物样品的基体分子主要为含碳有机物，因此用来消解生物样品的酸液主要为浓硝酸。目前硝酸湿法消解方法的缺陷在于：1)生物样品的含水量一般为70％～90％，传统的湿法消解是将酸液直接与未处理的生物样本接触，结果样本中的水分不但降低酸液的浓度，影响其氧化能力的发挥，并且附在生物样品内部的水分子能阻止酸分子与有机分子的有效接触，进一步降低样品的消化效率；2)浓硝酸的沸点为83℃，传统的湿法消解加热温度通常在200℃以上，硝酸挥发为气态，致使样品中的有机分子与硝酸分子接触几率大为减少，降低了消化效率。不但导致消解液空白值高，易挥发元素也有损失；3)传统的湿法消解通常用酸量很大，0.1g固体或0.5mL液体样品通常需要5～10mL浓硝酸，加热板敞口消化时，对环境污染很大，且影响人体健康。由于用酸量很大，消解完毕后需要长时间赶酸，不仅耗时，还很难得到无色澄清透明的溶液。4)传统处理样本效率低下，不能同时大批量处理样品；5)传统的加热消解时，由于大量水分的存在，消解过程中，易产生大量泡沫，容易造成被测组分含量的损失。
而本发明所述方法，通过先低温烘干生物样品，赶走了样品中的水分，然后加入硝酸低温密封消解，一方面由于样品不含水分，不会降低硝酸的浓度，即不会降低硝酸的氧化性，而保持低温密封环境进行消解，避免了硝酸的损耗，同样也减少了硝酸的用量；同时生物样品在无水的干燥状态下，其消解温度略低于硝酸的沸点(83℃)下，以保证硝酸分子与生物样品内部中的有机分子最大程度的接触，不仅大为提高消化效率，也大大降低生物样品消解时对硝酸的用量；最后当硝酸消解一定时间，再加入双氧水，可为减弱的硝酸氧化能力继续提供氧化，提高体系的氧化力，完全氧化有机物，且得到的分解物简单，对分析物的测定干扰影响极小，消解过程中，由于生物样品中没有水分存在，不会产生大量的泡沫，不会导致被测组分含量的损失；消解结束后，即可得到澄清透明的消解液。消解过程中，因为采用的硝酸的含量较少，最终得到的消解液中的酸浓度较低，无需赶酸，减少了操作过程，也降低了分析物的损失，所得消解液稀释定容后，即可直接上机用于各种光谱法或质谱法测定。
虽然硝酸和双氧水在生物样品消解中采用的较为普遍，但现有的消解方法中，通常将二者同时加入样品中进行消解，但是本发明是先加入硝酸消解一段时间之后，才加入双氧水的，这一顺序消解过程，既避免硝酸与双氧水之间互相反应降低总的氧化效率，又能保证低温下各自发挥最佳氧化效率。
此外，由于双氧水消解过程中，过氧化氢氧化分解时会在消化液中不断产生气体，使生物样品在消化时得到类似搅拌均匀的效果，最终能得到澄清透明的消解液。生物样品低温烘烤及密闭状态下低温消解，不但使生物样品处于均匀稳定的受热环境，还能保证易挥发元素的损失减少到最低程度。不但全过程无污染，消化后的样品空白值也低，便于准确检测。
优选地，所述生物样品为水溶液体类样品时，则烘干的温度为60～80℃；更优选地，烘干温度为60℃。当生物样品为水溶液体类样品时，测定的元素为铅、汞或砷等易挥发元素时，烘干的温度为60℃，被测组分的损失极少，可忽略不计。
优选地，所述生物样品为其它有机溶剂溶液体类样品时，则烘干的温度低于溶剂沸点，比如测定正丁醇(沸点117)提取物中金属离子时，烘干温度为105～110℃。
当生物样品为固体生物样品时，其内部含有的溶剂基本上都是水分，因此固体生物样品的烘干温度为略高于水的沸点温度，控制在101～105℃范围内，可以保证烘干的速度，减少烘干的时间，同时还保证了被测组分不会挥发和损失。
优选地，所述生物样品为固体类样品时，所述固体类样品烘干前的重量与65％硝酸的体积比为0.1～0.5:0.2～0.35(g/mL)；所述生物样品为液体类样品时，所述液体类样品与65％硝酸的用量体积比为0.1～0.5:0.2～0.35。
优选地，所述65％硝酸和30％双氧水的用量体积比为1:0.5～1:1.5；更优选地，体积比为1:1。
优选地，所述生物样品的量较少时，即液体生物样品的体积＜200μL；固体生物样品的湿重＜0.1g，消解时65％硝酸和30％双氧水的用量体积比为1:0.5；当生物样品的量较多时，即液体生物样品的体积＞200μL；固体生物样品的湿重＞0.1g消解时65％硝酸和30％双氧水的用量体积比为1:1.5。
优选地，所述65％硝酸消解的温度为80℃。
优选地，所述生物样品包括全血、血清、动物组织、细胞、毛发、指甲、胎粪、中草药、陆地植物或海洋生物。
优选地，所述生物样品为动物组织时，得到的消解液还需经过滤膜过滤。
当生物样品为动物组织时，得到的消解液的液层上可能浮有油滴，可通过0.45μm的滤膜过滤，然后上机进行检测。
优选地，当所述生物样品为细胞液时，因细胞无法称重，也无法定量体积，故须在样品处理前测定样品的蛋白浓度，以蛋白含量定量金属离子的质量。
优选地，所述烘干过程，采用敞口容器放置生物样品，并设有透气防尘罩。设有透气防尘罩，不仅起防尘作用，可避免样品受到污染，还可避免冷凝水重回到敞口容器中。
更优选地，所述烘干过程中，采用敞口的PFA消解管放置生物样品。
优选地，所述烘干、密封消解可采用GS消解仪。所述GS消解仪可同时多批次样品进行加热处理，样品处理效率高，且能保证样品加热均匀。
优选地，所述消解液可适用于原子吸收光谱法、冷原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法或电感耦合等离子体质谱法进行测定微量元素。
优选地，所述消解液经稀硝酸稀释后，即可直接用于检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，通过先低温烘干生物样品，赶走样品中的水分，然后再加入硝酸低温消解，一方面由于不含水分，可保证硝酸的强氧化性，且水分挥发后，酸分子才能钻到样品的内部，以此提高两者反应物的接触面积来提高氧化效率；另一方面，保持低温密闭环境进行消解，避免了硝酸的损耗，同样也减少了硝酸的用量，降低了处理成本，避免了酸污染；再者，保证在低温下进行消解，其消解温度略低于硝酸的沸点(83℃)，以保证硝酸分子与生物样品中的有机分子最大程度的接触，不仅大为提高消化效率，也大大降低生物样品消解时对硝酸的用量；最后再加入双氧水，可为减弱的硝酸氧化能力继续提供氧化，提高体系的氧化力，完全氧化有机物，且这一顺序消解过程，既避免硝酸与双氧水之间互相反应降低总的氧化效率，又能保证低温下各自发挥最佳氧化效率。最终得到的消解液澄清透明，其中的酸浓度较低，无需赶酸，全程无酸污染，减少了操作过程，也降低了分析物的损失，易挥发元素如砷、铅、汞、硒等回收率均在90～110％范围之内，且消解液空白值低，利于准确检测。
所述方法不仅可保证生物样品在较少硝酸用量的情况下消解完全，且无须进行赶酸处理、分析物元素的损失极少、样品空白值交底，可同时处理大批量样品。
附图说明
图1为实施例1中采用GS消解仪面板加热消解的参考图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
以小鼠全血样品为测试对象，测试其中微量元素的含量，具体测试过程如下：
1、样品前处理过程：
(1)用移液枪取100μL全血置于7mL PFA消解管，敞口置于GS消解仪面板中的孔内，面板上盖好锥形防尘罩，调节温度到80℃，均匀受热至完全干燥为止(5～6小时)；
(2)然后，用移液枪取200μL优级纯65％硝酸置于PFA消解管，盖紧盖子使消化管密封，继续保持80℃使样品均匀受热55分钟，打开盖子再加入200μL优级纯30％双氧水，盖紧盖子使消化管密封，继续保持80℃使样品均匀受热5分钟。关闭电源，使消化管冷至室温，即可得到消化液。
2、检测过程：
用移液枪取2％(V/V)硝酸4600μL加入消化管，混匀后上机，采用电感耦合等离子体质谱法测定锌、铜、砷、铬、锰、镉、硒、铅、汞等元素，以样本液体体积定量元素浓度。
①如果上述全血前处理过程采用的是3mL的PFA消解管，则检测过程中，消解液冷却后用移液枪取2％(V/V)硝酸600μL加入，混匀后上机，可用石墨炉原子吸收光谱法测定铜或铅等元素。
②样品前处理过程中，若全血样品的取样体积为500μL，经(1)和(2)处理后的样本，则最终得到的消解液可用原子荧光法光谱法测定砷、汞、硒、镉等元素，冷原子吸收法测定汞元素，也可用火焰原子吸收法测定或电感耦合等离子体发射光谱法测定一些待测元素。
测定同一份全血中微量元素浓度所采用的各仪器数据如下(单位μg/L，n＝5)：
电感耦合等离子体质谱法：锌1254±112，铜986±25，铬15.5±7.3，锰6.55±0.23，镉5.85±0.38，砷1.98±0.07；铅21.2±3.5，汞1.87±0.33，硒0.88±0.05。
石墨炉原子吸光谱法：镉5.19±0.98，铅25.1±6.8。
原子荧光光法：镉5.73±0.33，砷1.85±0.05；铅20.1±3.3，汞1.66±0.29，硒0.79±0.04。
冷原子吸收法：汞1.78±0.30。
火焰原子吸收法：锌1315±133，铜1002±36。
电感耦合等离子体发射光谱法：锌1298±145，铜1012±36。
以上同一样品中同一种元素的含量，由于采用的检测仪器不同，存在一定的偏差，但上述偏差在合理范围之类，可见经前处理过程消解后的样品，可同时适用于多种仪器进行检测。
当待分析的元素为易挥发元素时，在烘干的过程中，由于温度的升高，容易造成易挥发元素的损失。
例如，按照上述生物样品前处理和检测过程，以胎粪为样品，采用石墨炉原子吸收测定胎粪样品中的铅的含量时，烘干温度为80℃时，回收率仅为20～50％，严重偏低，表明样品中铅的含量有明显的损失；当烘干温度设为60℃，烘干过夜处理时，回收率为90～110％，表明样品中铅的含量无损失或仅有轻微的损失，对其含量检测无明显影响。
例如，按照上述生物样品前处理和检测过程，以人血为样品，采用冷炉原子吸收测定人血样品中的汞的含量时，烘干温度为80℃时，回收率约70％左右，表明样品中汞的含量有明显的损失；但当温度设为60℃烘干时，则回收率上升到90～110％，表明样品中汞的含量无损失或仅有轻微的损失，对其含量检测无明显影响。
实施例2用电感耦合等离子体质谱法测定小鼠肝样品中微量元素的含量
1、样品前处理过程：
(1)用精密天平称取约50mg小鼠肝组织等置于7mL PFA消解管，敞口置于GS消解仪面板中的孔内，面板上盖好锥形防尘罩，调节温度到104℃，均匀受热至完全干燥为止(1～2小时)；
(2)用移液枪取200μL优级纯65％硝酸置于PFA消解管，盖紧盖子使消化管密封，继续保持80℃使样品均匀受热55分钟(如图1所示)，打开盖子再加入200μL优级纯30％双氧水，盖紧盖子使消化管密封，继续保持80℃使样品均匀受热5分钟。关闭电源，使消化管冷至室温。
图1所示的GS消解仪为南京瑞尼克公司提供，温度可在0～200℃范围内调节。PFA消解管可置放在消解仪中的管孔内，样品的烘烤及消解均处在均匀受热的环境中，并可一次处理120个样品(选120孔装置)；不但样本处理成本极低，处理样品效率也极高。
2、检测过程：
用移液枪取2％(V/V)硝酸4600μL至PFA消解管内混匀，然后过0.45μm的滤膜，再上机，采用电感耦合等离子体质谱法测定锌、铜、砷、铬、锰、镉、硒、铅、汞等元素，以样本质量定量元素浓度。
如果用到原子荧光法、火焰原子吸收光谱法、石墨炉原子吸法光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法，则可根据不同仪器的特点调节称样量和最终的稀释体积。
测定同一份小鼠全血中微量元素浓度所采用的各仪器数据如下(单位ng/g，n＝5)：
电感耦合等离子体质谱法：锌2355±413，铜1728±265，铬45.3±8.5，锰55.7±9.3，镉2.84±0.46，砷7.78±0.07；铅150±13.5，汞3.87±0.34，硒312±23。
石墨炉原子吸光谱法：镉未检出，铅157±36。
原子荧光光法：镉2.73±0.33，砷8.85±0.55；铅168±15，汞3.66±0.29，硒312±43。
冷原子吸收法：汞3.78±0.38。
火焰原子吸收法：锌2433±511，铜1678±306。
电感耦合等离子体发射光谱法：锌2228±476，铜1801±387。
实施例3
参照实施例1的过程检测细胞匀浆液，应另取部分体积测定蛋白浓度，按S1和S2处理样本，得到的消解液上机测定时，以样本处理前的蛋白含量定量金属离子浓度。
培养数天后的细胞收集，超声或冰冻破碎后，分离得到上清即细胞液；沉淀下来的细胞膜用适量表面活性剂溶解成为细胞膜液。从细胞液和细胞膜液各取少量体积测定蛋白质浓度；剩余样品按实施例1进行样品消解。因样品量少，适合石墨炉原子吸收法测定方法。故用石墨炉原子吸收法测定铜浓度。以蛋白浓度定量元素浓度，测定结果如下：
细胞液：34.9μg/gPro.；细胞膜液：25.2μg/gPro。
注：Pro表示蛋白质
其他的生物样本，参照实施例1至3中的任一过程，均可准确的检测其微量元素的含量，且检测结果准确。
对比例1
以传统的湿法消解为对比例，例如：1)2014年9月，34(9)：2533-2537，光谱学与光谱分析一文“微波消解-ICPMS测定动物血清和组织中的微量元素”，其中样品处理方法为1g血清或0.5～1g组织需要5mL纯硝酸和2mL 30％双氧水；2)2007年5月17(5)：925-926，中国卫生检验杂志一文“微波消解-原子荧光光谱法同时测定全血中砷和硒”提到样品消解方法为：1mL全血需5mL纯硝酸和2mL l30％双氧水。
将实施例1与对比例1中上述两篇文献中记载的方法相比较，实施例1中硝酸的用量明显少于对比例1，在硝酸的使用成本上，实施例1的处理方法，成本明显降低；以质谱法检测为例，目前购买德国默克ppb级硝酸250mL 1245元，即每1mL硝酸价约5元，传统湿法消解每处理一个样本约需5～10mL硝酸，即花费约25～50元，而本法处理一个样本只需0.2mL硝酸，花费仅1元。如果需要测痕量元素，则需要用到ppt级硝酸。一瓶250mL德国默克ppb级硝酸费用高达5877元。处理一个样本仅硝酸一项就要花费118～236元，而本法处理一个样本用到ppt级硝酸仅花费硝酸4.7元。
对比例2
2015年10月第33卷第10期：784-786，中华劳动卫生职业病杂质一文“人全血中54种元素同时测定的电感耦合等离子体质谱法”中记载的，以0.5mL全血为检测样品，加入0.5mL硝酸和0.5mL双氧水，与90℃条件下消解1h，然后经ICPMS进行检测。虽然此文中记载的硝酸的用量和双氧水的用量都较少，但是因为采用的检测仪是ICPMS，而采用ICPMS进行检测时，即使生物样品不经过消解，也同样可以进行检测。如2018年3月第3期：381-389，中国职业医学一文“电感耦合等离子体-质谱法没定生物样本中的12种元素”中记载的，以0.25mL全血用0.5％硝酸稀释20位直接测定目标元素。这种含有大量水分的样品用少量稀酸根本不能完全消化样品，但不影响测定。第一篇文献介绍的全血样品仅添加少量的硝酸和双氧水消解法，由于样品中含大量水，水分可冲淡浓硝酸的浓度而降低氧化性，也可阻碍硝酸分子与样品本中基体分子的良好接触也会降低其氧化性，因此为不完全消解。不完全消解与第二篇文献介绍的直接稀释法一样，虽然也可以用ICP-MS法检测血液样品中微量元素的含量，但这样进入仪器的样品会含有较多有机物，并导致等离子体稳定性欠佳而影响内标的稳定度，还会因与水溶液标准的基体产生差异而引起对待测元素的基体干扰。
对于未消化完全的样品，如果样品中含有与有机物结合的待测元素，当检测仪器为除ICPMS外的其他仪器时，检测的结果会出现严重偏差(ICPMS通常加有内标，这个基体影响就可以忽略计，但有些仪器方法不用内标就影响致大)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：将待检测的液体生物样品在低于溶剂沸点的温度条件下烘干成块状；或将待测的固体生物样品在101～105℃温度条件下烘干至微焦状态；然后加入质量浓度65％硝酸，在80～82℃条件下密封消解40～50min；最后在同样温度条件下，再加入质量浓度30％双氧水，密封消解5～10min，冷却后即可得到澄清透明的消解液。
2.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述生物样品为水溶液体类样品时，则烘干的温度为60～80℃；所述生物样品为有机溶剂溶液体类样品时，则烘干的温度低于有机溶剂沸点。
3.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述生物样品为固体类样品时，所述固体类样品烘干前的重量与65％硝酸的体积比为0.1～0.5:0.2～0.35；所述生物样品为液体类样品时，所述液体类样品与65％硝酸的用量体积比为0.1～0.5:0.2～0.35。
4.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述65％硝酸和30％双氧水的用量体积比为1:0.5～1.5。
5.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述65％硝酸消解的温度为80℃。
6.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述生物样品包括全血、血清、动物组织、细胞、毛发、指甲、胎粪、中草药、陆地植物或海洋生物。
7.根据权利要求6所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述生物样品为动物组织时，得到的消解液还需经过滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述烘干过程，采用敞口容器放置生物样品，并设有透气防尘罩。
9.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述消解液可适用于原子吸收光谱法、冷原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法或电感耦合等离子体质谱法进行测定微量元素。
10.根据权利要求1所述检测生物样品中微量无机元素的样品前处理方法，其特征在于，所述消解液经稀硝酸稀释后，即可直接用于检测。
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