HU229490B1 - Immunoassay for determining the concentration of a neonicotinoid insecticide - Google Patents
Immunoassay for determining the concentration of a neonicotinoid insecticide Download PDFInfo
- Publication number
- HU229490B1 HU229490B1 HU0203499A HUP0203499A HU229490B1 HU 229490 B1 HU229490 B1 HU 229490B1 HU 0203499 A HU0203499 A HU 0203499A HU P0203499 A HUP0203499 A HU P0203499A HU 229490 B1 HU229490 B1 HU 229490B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- neonicotinoid
- sample
- enzyme
- formula
- Prior art date
Links
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title claims description 45
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 21
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 21
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- -1 2-chloro-5-thiazolyl Chemical group 0.000 claims description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 13
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000005941 Thiamethoxam Substances 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- NWWZPOKUUAIXIW-FLIBITNWSA-N thiamethoxam Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C/1N(C)COCN\1CC1=CN=C(Cl)S1 NWWZPOKUUAIXIW-FLIBITNWSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- QMEQBOSUJUOXMX-UHFFFAOYSA-N 2h-oxadiazine Chemical group N1OC=CC=N1 QMEQBOSUJUOXMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N Imidazolidine Chemical compound C1CNCN1 WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 claims description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- HOKKPVIRMVDYPB-UVTDQMKNSA-N (Z)-thiacloprid Chemical compound C1=NC(Cl)=CC=C1CN1C(=N/C#N)/SCC1 HOKKPVIRMVDYPB-UVTDQMKNSA-N 0.000 claims description 4
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 4
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 4
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005940 Thiacloprid Substances 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 claims description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CFRPSFYHXJZSBI-DHZHZOJOSA-N (E)-nitenpyram Chemical compound [O-][N+](=O)/C=C(\NC)N(CC)CC1=CC=C(Cl)N=C1 CFRPSFYHXJZSBI-DHZHZOJOSA-N 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 229940079888 nitenpyram Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims 2
- 241000748228 Porophyllum gracile Species 0.000 claims 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims 2
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 1-Heptene Chemical compound CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000534477 Diodora Species 0.000 claims 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims 1
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 claims 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethanethiol Chemical compound CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002621 immunoprecipitating effect Effects 0.000 claims 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- FESBVLZDDCQLFY-UHFFFAOYSA-N sete Chemical compound [Te]=[Se] FESBVLZDDCQLFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000005906 Imidacloprid Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N imidacloprid Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C1/NCCN1CC1=CC=C(Cl)N=C1 YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940056881 imidacloprid Drugs 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 3
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- WPGPRLVPWACBHW-UHFFFAOYSA-N (4-methoxy-4-oxobutyl)azanium;chloride Chemical compound Cl.COC(=O)CCCN WPGPRLVPWACBHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N (E)-acetamiprid Chemical compound N#C/N=C(\C)N(C)CC1=CC=C(Cl)N=C1 WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005875 Acetamiprid Substances 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- MZZBPDKVEFVLFF-UHFFFAOYSA-N cyanazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)(C)C#N)=N1 MZZBPDKVEFVLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000188595 Brassica sinapistrum Species 0.000 description 1
- 244000191482 Cantharellus cibarius Species 0.000 description 1
- 235000015722 Cantharellus cibarius Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005893 Diflubenzuron Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical class SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- QQQYTWIFVNKMRW-UHFFFAOYSA-N diflubenzuron Chemical compound FC1=CC=CC(F)=C1C(=O)NC(=O)NC1=CC=C(Cl)C=C1 QQQYTWIFVNKMRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940019503 diflubenzuron Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- RYPKRALMXUUNKS-UHFFFAOYSA-N hex-2-ene Chemical group CCCC=CC RYPKRALMXUUNKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N potassium methoxide Chemical compound [K+].[O-]C BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
- C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/61—Halogen atoms or nitro radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
A találmány peszticidek immunoesszéire {immnoassay-ire), valamint az ilyen vizsgálatok vl.grahajtására szolgáló antitestekre és reagensekre vonatkozik. A találmány kiterjed az ilyen vizsgálatok végrehajtási eljárásaira, továbbá az eljárások gyakorlati megvalósítására szolgáló reagenseket tartalmazó készletekre (kitekre) is. A találmány a vizsgálati mintákban lévő neon!kotinoid inszekticidek detektálására és mennyiségi meghatáro zására alka Imazható.
Ins ze kt ic ide k
A rovar kártevők irtására a növénytermesztésben általános gyakorlat a. szintetikus inszekticidek alkalmazása. Ez a gyakorlat igen nagy gazdasági eredményt biztosit, mivel bizonyított tény, hogy az ilyen típusú növényvédelem fokozza a termesztett növények hozamát. Ugyanakkor azonban az inszekticidek hatékony alkalmazása igen nagy körültekintést igényei, különösen tekintettel a rovar rezisztenciára, valamint a környezetet és az ínszekticidekkel dolgozókat ért hatásokra. A probléma egyik megoldását. olyan, új, sokkal nagyobb aktivitású inszekticidek jelenthetik, amelyek csökkentik a régi, akut módon toxikus inszekticidek iránti igényt és mérsékelik a környezeti terhelést .
A kereskedelemben jelentős elismerést nyert inszekticidek egyik osztályát az úgynevezett neonikotínoid. inszekticidek. alkotják. Az ebbe az osztályba tartozó vegyületek példái közé «ίβ φφ φ « Φ * X tartoznak — egyebek síel lett — a 4 742 060. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett ímidaeloprid, az 5 304 556« számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett acetamíprid, valamint az 580 553. számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett thiamethoxant.
A környezetet és a dolgozókat ért hatásoknak, valamint a kártevő rezisztencia kialakulásának a csökkentését szolgálja a növényi szaporítóanyagok (például a vetőmagvak) inszekticidekkel végzett közvetlen kezelése, ami elvégezhető önmagában vagy pedig ínszekticfdekkel történő levél- vagy barázdakezeléssei együtt. Azonban igen nagy gondosságot igényei a magcsáváző berendezés helyes beállítása, hogy az inszekticíd- egyenletesen kerüljön fel a s zápor.í tőanyagra, ami elengedhetetlen ahhoz, hogy elkerülhetők legyenek — egyebek mellett — például a inszekticíd hatásával és mag-fitotozicitásával kapcsolatos problémák. Analitikai méréséseket alkalmazhatunk annak eldöntésére, hogy a magcsávázó berendezés megfelelően lett-e kalibrálva, megfelelően működik-e, illetve nagy mennyiségek kezelése után a magvak elszállíthatők-e. A magvakon lévő inszektíeldmaradék detektálására szolgáló hagyományos eljárások azonban nagyon időigényesek és rendkívül költségesek, mivel egészen speciális analitikai módszerek, például gáz-folyadék- vagy nagyteljesítményű folyadékfcromatográf ia alkalmazását teszik szükségessé. Mindkét kromatográfiás eljárás drága berendezéseket igényei, amelyeknek a fenntartása, illetve üzemeltetése is sokba kerül, valamint működtetésükhöz magasan képzett .szál emberekre van «φ * # ♦ Αφφ φ«χ **· Λ φ ♦ · * * * ♦** szükség. A magosávázó üzemeknek és a termesztőknek általában nincs ilyen berendezése, illetve személyzete, ezért külső analitikai laboratóriumokba kell mintákat küldeniük. Amennyiben a laboratóriumok azonnal elvégzik a minták vizsgálatát, a kezelést végző üzem a minta elküldését követően hozzávetőleg 24 óraelteltével kaphatja meg az analitikai eredményeket. Emiatt a csávázóüzemben érákkal megnő a berendezés üzemideje, valamint a bevont magvak elszállítása is késedelmet szenved.
A szakterületen égető szükség van a jelenlegi mérési módszerek javítására., annak érdekében, hogy az analitikai eljárások olcsóbbak, hatékonyabbak és egyszerűbbek, legyenek. A kívánt eljárásoknak olyanoknak, kell lenniük, amelyek nem igényeinek laboratóriumi körülményeket, azaz szántóföldi környezetben is elvégezhetők, valamint gyors és megbízható információkat nyújtanak a termesztést vagy a magkezelést végző személyzet számára arról, hogy egy adott magmintán jelen van-e, illetve milyen koncentrációban van jelen egy konkrét ínszektlcid. Ebből a szempontból igen fontos, hogy az eljárások .megkülönböztessék az aktív peszticid anyagot az egyéb termékektől, lehetővé téve ezáltal a magon lévő kívánt hatóanyag mennyiségi meghatározását. A klasszikus analitikai eljárások alkalmazhatósága azonban erősen korlátozott. Az immunoesszé technika alkalmazásával igen sok megszüntethető az említett korlátozó ténvezők közül.
Peszticidek immunoesszé vizsgálata és detektálás a
Noha elsősorban gyógyászati és állatgyógyászati alkalmazás céljából kerültek .kifejlesztésre, az immunoesszéfc a mezőgazda4 *φφ * ί «φ»» ság területén is mind több felhasználást nyernek. Például az Immunoesszék alkalmasak növényi betegségek, aflatoxinok és bizonyos antibiotikumok detektálására és mennyiségi meghatározására, Sár peszticidek detektálásra szolgáló immunoésszéket a tudományos szakirodalomban már korábban is leírtak {lás alább)f nagyüzemi alkalmazásuk csak az elmúlt tíz évben vált lehetővé.
Az igen változatos target anyagok detektálására és/vagy mennyiségi meghatározására szolgáló ímmnnoesszék nagyon specifikus antitest reagenseket és viszonylag egyszerű analitikai berendezéseket igényelnek. Az analitikai specifitást elsősorban az antitest biztosítja, a berendezés vagy a műveleti körülmények ilyen szempontból kevéssé lényegesek. Ezért az immunoesszék viszonylag durva mintákkal is elvégezhetők. Ezenkívül, az immunoesszé eljárások távoli, nem laboratóriumi körülmények. közötti felhasználásra optimalizáltak, azaz lehetőség van az immunoesszék akár szántóföldi, akár laborétóriumban történő végrehajtására. is.
Ismertek bizonyos herbicídek detektálására alkalmas immunológiai eljárások, amilyenek — egyebek mellett — például a következők: (2,4-d'íklőr-fenoxi)-eeetsav [Fleeker, J., J. Assoe.
Off. Amsl. Chem. , 70, 874-878 (1986)1, ohlorsulfuron (Keiley, M.
et al., J. Ashic. Food· Chem. , 33, 962-965 (1985) ], haloacetamidök [Winzenfourger, P. A. et al., 340 198. számú európai szabadalmi bejelentés (1989)}, valamint különféle peszticidek, köztük, diflubenzuron [Wíe, S. I. et al., J. Agrio. Food Chem. , 30, 949-957 {1982)], metsXaxyl [hewsome, W. H., J, Agric. Food Chem., 33,
528-530 (1985)] és parathion [Srcegovieh, C. D. et al., J. Asric. Food Chem-. , 29, 559-563 (1981)1. Leírtak egy eljárást az atrasine immunológiás detektálására is <4 530 786. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ismertek a cyanasíné, a dieXofop-methyi, a phentaehlorphenol, a 2,4,5-T és a terbnt.ryn immunoiógiás vizsgálatai is.
Az előbbi immunológiás eljárások mindegyike poliklonális antiszérumokat alkalmazott, amelyeket megfelelő antigénnel (immunogénnel) immunizált hazdaállatokból (jellemzően nyálakból) nyertek. A közelmúltban atrazine-ra és származékaira, valamint lebomlási termékeire specifikus monoklonális antitesteket (mAbs) ismertettek (Schlaeppi et ai., 365 818. számú európai szabadalmi bejelentés (1990)], valamint leírták az említett monoklonális antitestek immunoesszékben történő felhasználását is.
Kis molekulatömegük, miatt az ínszekticídek nem irfimunogének és nem váltanak ki specifikus antitesteket a gazdaállatokbői. Ezért egy inszekticid ÍMiunoesszé kifejlesztéséhez számos lépésre van szükség, kezdve a haptének, az inszekticid olyan származékainak a megtervezésével, amelyek megtartják az inszektícid molekula struktúrálís specífltását, ugyanakkor lehetőséget adnak egy nagyobb molekulatömegé immunogén hordozó” proteinhez történő hozzákapcsolásra. Ezenkívül a képződési folyamat ideje alatti antitest szkríneléshez további olyan haptének is előállíthatők, amelyek kémiai szerkezete eltér az állatok immunizálására alkalmazott haptén struktúrájától. Végűi miután si~ (poliklonális vagy monoklonális) antikerült előállítani, egy »·ΧΧ «Χ« 9 φ * * »· ♦ * *·» ΦΦ ♦* φ test-preparátumot, egy elegendően szenzitív ímmunoes-szét kell kifejleszteni.
A modern immnnoesszékben, alkalmazott alapvető stratégiákat már számos helyen leírták (lásd például: Voltét, A. et al·.,· eds., ZsBaunoasssya För The 80‘'s, táti versi ty Park (1981) ; Voller, A., The Fnzyme linked immunosorbent Assay CFiJFAj, Dimnostic Horizors, 2, 1-7 (1978), Mic.rofoiologic.al Associates
Q-uarterly Publication, Walkersville, Md..; Voller, A. et al., J.
Clin. Pavhol., 31, 507-520 (1978); Butler, J. E., Mesh. Ενζυμοι. , 73, 482-52:3 (1981); Maggio, E. (ed.), lismunaessey, CRC
Press, Bocs Haton, Fia. (I98Ö)]. Valamennyi megközelítés lényegét a kívánt minta ismert mennyiségeinek az alkalmazásával felvett kalibrációs görbék előállítása jelenti,
Az egyik gyakorta alkalmazott jelzett antitest” módszer az úgynevezett enzimkötött ímmunoszorbens vizsgálat (enzymé~linked ítsaunosorbent as.say ™ ELISA) . Ennek során egy olyan protein felhasználásával előállítják a pesztieidnek egy protein konjugátumát (az úgynevezett bevonó” vagy szkrínelő antigén^), amely protein szerkezetileg eltér attól, a peszticid immunogénben alkalmazott hordozó proteintől, amellyel szemben 32 anti-peszticid antitestek létrejöttek. A bevonó antigén konjugátúrnőt egy szilárd fázisú hordozón, például egy mikrolémez vájatának a felületén ímmofoíiizál jak, .amelynek eredményeként reakciónként rögzített mennyiségű szilárd fázisú pesztleidet nyernek. A tesztmintákhoz ismert mennyiségű, antitestet adnak. Az immobiiizált peszticid verseng az ismeretlen mintában lévő szabad nesztieiddel a korlátozott számú antitest kötő helyekért.
» « * φ « φ * *** *«Φ φφφ Φ * 9 * » * * Φ X Φ φ· ** «φ χΧ
Az antitest és a foiyadékfázisban lévő minta közötti kölcsönhatás gátolja az antitestnek a szilárd fázisú peszticidhez történő kötődését. A szilárd fázishoz között antitestet egy, az antí-pesztleid antitest nehéz láncának konstans régiójára specifikus enzim-konjugált második antitesttel detektálják. Erre a célra a kereskedelemben számos enzimkötött' második antitest kapható-. A kötetlen második antitest kimosása után az immobiLizáit második antitestet általában úgy detektálják, hogy az enzimnek egy kromogén szubsztrátját adják a rendszerhez, amelynek eredményeként a kötött második antitest Mennyiségével közvetlenül arányos mennyiségben egy színes reakcíótermék képződik. Azaz a reakciőtermék mennyisége fordítottan arányos az ismeretien mintában lévő vizsgált anyag mennyiségével.
A ”jelzett antitest eljárás egyik változata elíminálja a bevonó antigén alkalmazását. Az enzim immunoesszé (ETA) egy szilárd fázison immobilizálja az anti-peszticid antitestet. Egy pesztlcid naptárt kovalens kötéssel kapcsolódik egy enzimhez, és az így nyert, enzim konjugát.umot mikrováj átokban vagy tenyésztőcsövekben .anti-peszticid antitesttel inkubálják. A mintában lévő pesztlcid verseng a peszticíd haptén-enzim konjugátuwmai az immobilizéit antitesthez kötődésért. A kötetlen anyagok eltávolítása érdekében a szilárd fázist mossák, majd az antitest-kötött enzim konjugátumot kromogén szubsztrát hozzáadásával detektálják [lásd például: Bushway, R. J. , L, P.. Perkin.s, S. A. Savage, S. L. Lekousi, and 3. S. Ferguson, Deierminetion of atrasfne residues in water and so.il fey enzyme immunoassay..
Bull. Botirok. Cöhtak, Toxjcot., 40, 647-654 (1988); Fleeker, J. R.
ΦΦ * « Φ Φ X φ
Φ ΦΦΦ Φ** *»<* φ « * * ♦ Φ Φ X Φφφ φ «X φφ ΦΦ φ and L. W. Cook, Aeiiabiíity of co^crcíai enzyme ímmunoassay ín detecfeion of atraríne in vater. P. 73-85 ín M. Vanderíann, L.
H. Stanker, 3, E. Watkins, and D. W. Roberts., eds. Jteunoassays fór Trace Chemical Anaiysís, ÁCS Symeosiom Series 451. Washington, D, C., American Chemical Society (1991).
A mezőgazdaságban szükség van a hatóanyagokkal, például inszekticidekkel kezelt magvak/szaporitőanyagok olyan analitikai eljárásaira, amelyek a szántófölden vagy a magcsávázó üzemekben is végrehajthatók,
A jelen találmány anti-neonikotinoid antitestek előállítására szolgáló neonikotinoid hapténekre és immunogénekre, valamint olyan antitestekre, eljárásokra, reagensekre és készletekre (kitekre) vonatkozik, amelyek arra szolgáinak, hogy egy mintában immunoesszévei meg lehessen határozni egy vagy több aeonikotinoid inszektícid jelenlétét, A találmány különösen jól alkalmazható növényi szaporítóanyagokra, például magvakra felvitt neonikotinoid inszekticidek koncentrációjának a meghatározására .
A találmány szerinti ímmunoesszé eljárás segítségével a neonikotinoid inszekticidek magvakra történő felvitelével foglalkozó magkezelő üzemek személyzete maga is meg tudja határozni a felvitt hatóanyag mennyiségét. Az eljárás során a magvakból egy gyors ext rakó lóval, kivonjuk a hatóanyagot, majd egy gyors ímmunoesszé-alapú vizsgálattal mérjük az extrakciós oldatot, Ezeket a méréseket felhasználhatjuk annak eldöntésére., hogy a magcsávázó berendezés megfelelően lett-e kalibrálva, megfelelően működik-e, illetve nagy mennyiségek kezelése után a * * ·♦ » « * » » ίφ« ♦»9 9 « * * Φ * X & 9
ΧΊφ «φ $ magvak elszállíthatők-e. A vizsgálat ügy került megtervezésre, hogy a mérésekhez csak egyszerű laboratóriumi eszközökre és reagensekre legyen szükség, Néhány gyakorlati próba után az íb®inoesszék területén tapasztalatlan, személyzet is eredményesen végre tudja hajtani a vizsgálatot.
Azt találtuk, hogy antigén neonikotinoid kongugátumokát (immun-ogéneket) készíthetünk oly módon, hogy egy neonikotinoid peszticid haptént egy bordozómolekulához, például Diptherla vírusból származó tisztított proteinszármazékhoz {purífied protein derivative, P.PD), bovin-ssérumalbwainboz, humán széruma.lbuminhoz, ovalbuminhoz kapcsolunk, vagy K'HL (Keyhole Limpet, Diódéra aspera) bemocíanint egy neonikotinoid hapténhez kapcsolunk. Derivatizált anyagok, például derívatizált bovin-szérum-albumin, kationositott bovin-szérumalbumin stb. konjugátumait is előállíthatjuk (lásd például: A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce and J. G. Michael, J. ImunoL., 138, 833-837 (1987) }. Ezeket az immunogéneket ezt követően gazdaállatokba injekciózhatjuk, majd az. állatok által a neonikotinoid hapténre termelt antitesteket kinyerhetjük. Az antitesteket ezt követően felhasználhatjuk különféle immunoesszé eljárásokban a megfelelő neonikotinoid inszektleidék detektálására, ahol az inszektieid vagy az antitest jelzésére különféle ismert markereket alkaimazhatunk.Az immunoesszék néhány megoldásában egy neonikotinoid inszekticid származékot vagy egy antitestet ímmobilizálunk. A találmány gyakorlati megvalósításához poiikionális és monoklonálís antitesteket egyaránt felhasználhatunk. Az antitestek esetén látható, hogy szelektíven az egy vagy több kívánt neonikolö
*.* ** φ·* « * V fc Ji « fc
X *»* «*«. «*.« φ * * 9 fc * fc fc X-fcfc.fc
X «♦ Φ-fc fcjfc <fc tinóid inszekticidhez kötődnek, még a magosávázó készítménybe beépített más peszticid hatóanyagok, köztük egyéb neonikotinoid inszekticidék jelenlétében is,
A mintákban lévő neonikotinoid inszékticidek mérésére szolgáló találmány szerinti eljárások gyakorlati megvalósítására felhasználható detektálási módszerek bioszenzorokon, valamint enzimes, fluoreszcens, kemilumineszcens és radiometríás rendszereken alapulnak. Az ilyen vizsgálatok során heterogén és homogén formákat alkalmazhatunk, valamint szilárd fázisokként mi .krovájat lemezeket, tenyésztőcsöveket és lat ex gyöngyöket vagy szemcséket használhatunk.
A találmány szerinti inounoesszéket mintákban, .például növényi szaporítóanyagokban lévő neonikotinoid inszekticid vegyületek, például imidacloprid., nitenpyram, acetamiprid, thiamethoxam, thiacioprid és clothiadin koncentrációjának a meghatározására. alkalmazzuk.
A találmány szerinti immunoesszékkel neonikotinoid inszekticidek jelenlétére nézve is tesztelhetünk mintákat. Ezekben az immunoesszékben különféle módszerekkel detektálhatjuk a neonikotinoid (antigén)/antitest reakciót, amelyek során a reafccíótermék detektáihatósága érdekében különféle markereket alkalmazhatunk az antigénnek vagy az antitestnek a Jelzésére. Ezenkívül számos esetben elősegíti a detektálást az antigénnek vagy az antitestnek az ímmobilizálása.
Az antigéo/antltest vizsgálatokat általában két kategóriára, heterogén vizsgálatokra és homogén vizsgálatokra osztjuk. Heterogén vizsgálatok esetén a reakciótermék detektálása előtt «« φ4ί φ * « ♦ β * φ «Χϊ 9fcx »· « * * * * * fc · «X fcfc »* fcfc -fc-fc «fc ;
a kötött-jelzett komponenst el kell választani a szabad™jelzett komponenstől. A homogén vizsgálatok nem igényelnek, ilyen elválasztást. A vizsgálatok ezenkívül (15 kompétitív jellegűek lehetnek, ahol az antigén egy szilárd fázisú antigénnel verseng a jelzett antitestért, illetve ahol az antigén egy jelzett antigénnel verseng egy szilárd fázisú antitestért, vagy (2) nem-kompetitív jellegűek lehetnek, ahol a jelzés és az antitest vagy antigén között közvetlen kapcsolat áll fenn.
A találmány gyakorlati megvalósítása során a mintákban lévő neonikotinoid ínszektieidek detektálására alkalmazható iramúnoesszé eljárások körébe tartozik az enzim, fluoreszcens, kemiiaffiineszcens és bioszenzor ímmunoesszé, valamint a radíoimmuno-esszé. A találmány szerinti enzímkőtött immanoesszékben (ELISA) a kérdéses egy vagy több neonikotinoid inszekticidnek megfelelő hapténeket egy enzimmel közvetlenül jelölhetjük, vagy olyan enzim-jelzett antitestek alkalmazásával közvetett módon jelölhetjük, amelyek megfelelő körülmények között katalizálnak egy szubsztráttal lejátszódó reakciót. Az enzlmakfivítást általában egy színes reakciőtermék képződése révén detektáljuk, azaz egy olyan színes végponttal, amely szemmel, illetve spektrószkópiás vagy reflexiós eszközökkel könnyen detektálható.
A találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra alkalmas fluoreszcens immunoesszé eljárásokban a kérdéses egy vagy több neonikotinoid inszektleidnek megfelelő hapténeket fluorokrómokkal közvetlenül, vagy fiuorokrőmmai jelzett antitestekkel közvetett módon jelölhetjük. A fluorokróraok olyan színezékek, amelyek elnyelik a sugárzást (például az ultraibo»*** «ί» ** X y « 5» φ $ * »**. *.«*. φ φ * * * X * * » **«* *” 0$ «> »Λί § lya fényt), az elnyelt fény által gerjesztett állapotba kerülnek és fényt (például látható fényt) amittálnak.
Az egyik találmány szerinti megoldás értelmében a mintákban lévő neonikotinoid inszektlcidek koncentrációjának a meghatározására szolgáló· eljárás a következő lépéseket foglalja magában :
(a.) kialakítunk egy szilárd fázist a neonifcotinoid inszektícidre szelektív ímmobílizált antitesttel;
(b) a mintát egy neonikotinoid inszekticid heptán-enzím konjugátum ismert mennyiségének a jelenlétében érintkezésbe hozzuk az immobíLizáit antitesttel;
(c) a nem kötött heptán-enzím konjugatom vagy a minta eltávolítása érdekében a (b) lépés szerinti szilárd fázist mossuk;
(d) egy kromogén létrehozása érdekében a (ej lépés szerinti mosott szilárd fázist egy, a hapf én-enzim konjugátumra specifikus kromogén szubsztráttál reagáitatjuk; és (e) az antitest-kötött haptén-enzím konjugatura mennyiségének és ezen keresztül a mintában lévő neonikotinoid inszekticid mennyiségének a meghatározása érdekében mérjük a (d) lépésben képződött kromogén mennyiségét.
Az egyik megoldás értelmében az immunoesszét egy olyan kit (készlet) formájában prezentáljuk, amely a következőket tartalmazza: antitest-bevonatú csövek, a neonikotinoid haptén-enzím konj ugatom., enzim szubsztrát és egy, a kolorímetriás szignál termelését leállító oldat.
Bár a találmány ismertetése során gyakran hivatkozunk poΛ» *, * $ * » φ φ φ « « * * * * κ Φ Φ *»ΦΦ χ „ ν» Φ V φ : >
liklonális antitestek alkalmazására, az ezen a területen jártas szakember számára könnyen felIsmerhető, hogy az polikionális antitestek alkalmazásának alternatívájaként monoklonálls antitesteket is felhasználhatunk. A jelen leírásban alkalmazott ”antitest” kifejezés kiterjed mind a polikionális# mind pedig a monokionális antiteatekre.
A neonikotinoid inszektícidikkel szembeni, a találmány gyakorlati megvalósításában történő felhasználásra szolgáló mo~ noklonális antitesteket a szakterületen jól ismert immunizációs és hibdiroma tenyésztési módszerekkel állítjuk elő. Az alkalmas hibrldoma seútvonalakat előnyösen egy antitesttermelő' sejt és egy rágcsáló (murine) speciesből származó myeloma sejt fúziójával állítjuk elő. Az antitesttermelő sejtek előnyösen .lépse jtek. Bármilyen alkalmas myeloma sejtvonalat felhasználhatunk# előnyösen azonban a szokásosan használt nagyszámú jól karakté.rizált sejt vonalak egyikét alkalmazzuk...
A neonikotinoid inszektícidikkel szembeni.# a találmány gyakorlati megvalósításában történő felhasználásra szolgáló- polikionális antitesteket ugyancsak a szakterületen jól ismert módszerekkel, állítjuk elő.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy polikionális IgG antitest készítmény, amely legalább egy neonikotinoid .inszekticídet képes megkötni. Az antitest készítményt a következő lépésekből álló eljárással állítjuk elő:
(a) egy gazdaszervezetbe bejuttatjuk egy .biológiailag elfogadható hordozó proteinhez kapcsolt neonikotinoid inszekticidet vagy immunológiai ekvivalenst tartalmazó készítmény **** «« «♦ ¢, φ * X Φ « ♦ φ
-> *βί * X X Χ*« Λ φ * Λ * * * · * * »*«< ♦ ♦ «4ί »ψ φ* Λ előre meghatározott mennyiségét;
(b) a gazdaszervezetből szérumot nyerünk; és (c) a szérumból tisztítással IgG antitestet nyerünk ki.
Egy antigén .immunológiai ekvivalense képes a gazdaszervezetbe történő belépés esetén megindítani az antigénre adott antiteste k k ép z ódé sé t.
Amint azt a fentiekben már említettük, a találmány szerinti ímmunoesszé különösen jói alkalmazható a növényi szaporítóanyagokra felvitt neoni kot.inoíd ínszekticídek mennyiségének a meghatározására. A növényi szaporitóanyag” kifejezés úgy értendő, hogy az magában foglalja a növény valamennyi generatív részét, például a magvakat, amelyeket az utóbbiak megtöbbszörözésére alkalmazhatunk, valamint a vegetatív növényi anyagokat, például a dugványokat és a gumókat {például burgonya esetén). Megemlíthetők továbbá a szigorú értelemben vett magvak, a gyökerek, a gyümölcsök, a gumók, a gumós gyökerek, illetve hagymák, a rizómák és az egyéb növényi részek, ögyancsak megemlíthetők a csírázás után vagy a talajból történő kikelés után átültetendő csírázott növények és fiatal növények. Az átültetés előtt a fiatal növényeket teljes vagy részleges merítéses (immerziős) kezeléssel védhet jük..
Az egyik megoldás szerint a találmány szerinti vizsgáintdetektálható neonikotinoíd inszekticid az (1) iánc képletü szerkezettel rendelkezik.
- - -- »χ « * X Φ φ φ φ
X *Χ« XX* «ΦΦ Φ φ * % * * * * » * Χ*ΦΦ »« φ* φφ ΦΧ χ.
ahol a képletben
A jelentése 2-klór~5~p.iridil~ vagy 2~fclór~5~tiazolil-csoport ;
R és R jelentése egymástól .függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;
R és R 'jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy
R~ és R azzal a nítrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik, egy imidazolídin- vagy egy oxadiazingyű.rüt képez; és X jelentése -N-NO2 vagy =n~CN képietü csoport.
Egy másik megoldás szerint a találmány szerinti vizsgálattal. detektálható neont kot inoid ins-zektlcld a (III) általános képletú szerkezettel írható le,
ahol a képletben A, R~ és X jelentése az (1} általános képletnél meghatározott.
Az egyik előnyös megoldás értelmében a találmány szerinti immunoésszében egy neonikotinóid Ínszektieidhez ooliklonáüs *·♦· «» φφ φ ♦ X » » χ χ * *ΧΧ φχ* « ’».· ♦.,* %»* ·* antitesteket alkalmazunk. Ezeket az antitesteket egy immunizált állat, szérumából nyerhetjük, Az immunizálást úgy hajthatjuk végre, hogy az immunogént {haptén-PPD antigén konjugátumot) egy antitesttermelő speciesekbe, általában egy emlősbe, előnyösen nyálba vagy juhba injekciózzuk. Az antitest-válasz maximalizálása érdékében a kezdeti injekciót általában egy sorozat erősítő ífoooster) injekció követi. Optimális esetben az injekciókkal többszörös dózist adunk be nőstény New Zéaland fehér nyálaknak. Az injektált immunogén mennyisége, változó lehet, de ahhoz elegendőnek. kell lennie, hogy detektálható mennyiségű antitestet hozzon létre. Az: antitesttermelést a vérmintákból nyert szérum El A, ELISA vagy índirekt fluoreszcens immunoesszé vizsgálat alkalmazásával végzett analízisével ellenőrizhetjük..
A jelen találmányban alkalmazott haptén jelzésére az ismert immunometriás vizsgálatokban szokásos jelzéseket használhatjuk. Ezek között megemlíthetők a riporter molekulák (RM.)., ezen belül az enzimek, például az alkálikus fos-zfatáz, a torma pe.roxidáz és a β-gslaktozidáz. Ezenkívül fluoreszcens, lumineszcens vagy radioaktív jelzéseket, például fluoreszceint, rodamínt, luminolt, akridiumot és radioaktív izotópokat, például 12oI izotópot stb., illetve kolloid részecskéket, például aranyat, szelént stb. ís felhasználhatunk. Végül időben meghatározott (time-resolced) fluoreszcens szignálok létrehozásához lantanida kelét fiuorofőrokat is alkalmazhatunk. A leggyakoribb enzimes marke-r a torma peroxidáz (horseradí-sh peroxíöase, HRP) és az alkálikus toszfatáz.
Az egyik megoldás értelmében, a mintákban levő neonikotínoφφ * * « φ » « * φφφ φ»« «φ« « φ * * ♦ * ♦ * « φφφφ ** *» «* φφ · id mennyiségének a detektálására spektrofotométereket alkalmazunk. Azonban az ezen a területen jártas szakember képes a. találmány szerinti eljárásokat más típusú kromogén detektorok alkalmazására is adaptálni. Hasonló módon a detektálható reakció termék nem korlátozódik a krcmofórokra, hanem magéban foglal más, fentiekben ismertetett jelzett anyagokat. is.
Az alábbi (ΙΑ), (IB) és (HA) általános képietű haptének alkalmasnak bizonyultak az antigén neonikotinoíd konjugátumok (immunogének) és vizsgálati konjogátum előállítására történő felhasználásra.
(IA) haptén
A..
Ff X ahol a képletben
A jelentése 2~k.10r-5-piri.dil- vagy 2-klór~5-tiazolÍl~ceoport;
R' jelentése hidrogénatom vagy 1~4 szénatomos alkilcsoport;
R.~ és PÓ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy γ
R~ és R“ azzal a nitrogénatommai együtt, amelyhez kapcsolódik, egy írnidazolidin- vagy egy oxadiazingyűrnt képez; n értéke 1, 2, 3, 4 vagy 5 (előnyösen 3, 4 vagy 5); és
X jelentése -N-NG? vagy -N-CH képletü csoport.
ΧΧ« #«» « φ
A X 4 4 4444
4 «* V ίΙΒ) haptén
ahol a képletben 1 2 3
A, R' , R', R' és X jelentése az (1A) általános képletnél meghatározott.; és
E jelentése egyes kötés vagy -~CCH2)m- általános képleté hírcsoport , ame1yben m értéke 1, 2 vagy 3.
1. péiOS (TIIA) haptén
ahol a képletben A, p/., X jelentése és n nos képletnél meghatározott..
teke az (XA) áltálé19 ** *.<· « ♦ * » χ * * * * * * *φ»>
χ* »* »» ».
(ΙΙΙΒ) hantén
ahol a képletben A, Ff és X jelentése az (IA) általános kéj nél, valamint S jelentése az (IB) általános képletnél meghatározott .
A CIHA) és (,IiIB) általános képletű hapténeket a követ kí zö metodológiával analóg módon állíthatjuk elő:
oöjH
HSCéCHgfíHg {Z-Sffnirío-ejBí-fítei-kapíáf?^-C!sno-iiT!S<í>terfeonáí
K2CO3
-ssármszék cm© pr
X
A' Ό
A kívánt CIHA) vagy (IIXB) általános képletű haptént a CIIID) vagy (111E) általános képletű vegyületek közül kiválasztott megfelelő í2-amino-etil)-merkaptán-származék alkalmazásával állítjuk elő, fc fcfc
X* «« fcfc «fcfcfc ♦ fc '*· fcfcfc fcfcfc fcfcfc fc fc • * fcfc fc X fcfcfcfc *♦ fcfc fcfc fc.X fc
HSCHCHML « w HS-CHCHJMH, («se.) r s z? s * z pu com
ahol az általános képletekben R. jelentése a fentiekben az (I) általános képletnél meghatározott.
Az alábbi haptének különösen alkalmasnak bizonyultak a találmány szerinti megoldásokban történő felhasználásra:
általános képletü vegyület, ahol az általános képletekben n értéke valamennyi esetben· 1, 2f 3, 4 vagy 5, előnyösen n értéke /1 .-ίΛΖΧΧ* C vi· < vriQy *
Antigén neon! kot inoid konjugátum.okat (immuno-géneket, és vizsgálati kong uc/átumo kát úgy állíthatunk elő, hogy az ezen a területen jártas szakember számára ismert módszerek alkalmazásával egy neonikotinoid pesztieid haptént az adott esettel függően egy hordozó molekulához vagy riporter molekulához kapcsolunk. Két alapvető megoldás ismert. Az első olyan linketeket ♦ * X «« « X »χ
:«φ «« » (kapcsolókat) alkalmaz, amelyek a konjugátum részévé válnak. A linketek homobífunkcionállsek vagy heterobifunckionáli-sak. Ebbe a körbe tartoznak azok a llnkerek, amelyek képesek például a szubsztrát proteinekben lévő cisztein egységek merkaptocsoportfáin keresztül disznlfi-dkötések kialakítására, illetve ^-terminális aminoesoport vagy amíno-oldailáneofc vagy lízincsoportok és aktivált acilcsoportok, például szukcinimídíl-észterek közötti amídkötesek kialakítására. Általában ez a megoldás a konjugációhoz a linkeren nagyon reaktív funkciós csoportokat és megfeleld szubsztrafókat feltételez. Gyakran azonban kevésbé reaktív funkciós csoportok is felhasználhatók, például amelyek hidrazonképzésre alkalmasak.
A második, különösen két protein egység összekapcsolására alkalmas megoldás például a konjugátum egyik tagján lévő karboxicsoport és a másikon lévő aminocsoport közötti új peptidkötések kialakításához áehidratálószereket, például egy karbodiímidet alkalmaz. Ebben az esetben a reagens nem lesz a konjugá.tum része. Ez a reakció nem tűi egyszerű, mivel a karboxicsoport nincs aktiválva; a karbodiimid biztosítja az aktív intermediert, illetve a peptídkötés kialakulásához, a víz eltávolításával a karbodiimid a kívánt termék, irányába tolja el az egyensúlyt.
Mindkét kapcsolási megoldást általában vizes oldószerekben hajtják végre, mivel a konjugátumot alkotó protein, anyag könynyen denaturálódik. A proteineket úgy választják meg, hogy vizes közegben stabilak legyenek és meg az olyan oldószerekben is denaturálódjanak, mint amilyen az etanol, ami egyébként egy vizes közeg analógjának volna tekinthető. Tehát a protein konjuφφφφ
Λ ζ, φ» ♦» φ * « Φ « » χ * ♦ ♦♦ ♦ ** Φ Φ * * * * * * ΦΦΦ* ** ΦΦ Φβ *Φ φ gátum komponenseinek nemvizes oldószerekben viszonylag oldhat katlannak kell lenniük.
A (IX) általános képíetű haptén konjugátumok alkalmasnak bizonyultak a találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra,
Ff R3
<IX)
A, R~, R2, R3 és X jelentése, valami ?R ahol a képletben n értéke a fenti (A) általános képletnél meghatározott.? és jelentése egy olyan proteincsoport, amely a kővetkező molekulákból származik: íl) egy feordo-zó molekula, például öíptheris vírusból származó tisztított proteinszármazék (PPD, Tnberkulin), bovin-szérumalbnmin, humán szérumalbumin, óvalbusán kapcsolunk, vagy KRL (Keyhole Limpet, biodóra sspera) hemocíanin egy immunogén esetében, vagy (2) egy riporter molekula (RM), például al káli kus· íoszfatáz,· torma peroxidáz és 'β-galaktozidáz.
Ezenkívül hasonlóan jól alkalmazhatók a képletü haptén konjugátnmok, (1IA 5 a 11 a j. a no s
m—fr
Zs5 **«» »* * *βψ « χ * * * β ♦ Φ 4ι Φ4>«:« *·* ** X* *4 Φ ahol a ké
Ί 2 3
A, R~, RT R , E és X yelentese a fenti (IB) általános képletnél, és PR jelentése a fenti (II) általános képletnél meghatározott.
Az alábbi napkén konjugátumefc különösen alkalmasnak .bizonyultak a találmány szerinti megoldásokban történő felhasználásra :
Ö
általános képletö vegyölet, ahol az általános képletekben n értéke valamennyi esetben 1, 2, 3, 4 vagy 5, előnyösen n értéke 3, 4 vagy 5,
A vizsgálandó mintában lévő antigén neonikotinoid vagy haptén-RM konjugatom kötésére a találmány szerinti eljárásban alkalmazott jelzetlen. políklonális antitestet az ímmunometriás vizsgálatokban szokásosan .alkalmazott hordozók bármelyikén ♦ ΧΦΦ φφ __ φ
Φ X Φ A φ φ
Φ φφί « X « y φ φ * φ * Φ * Φ Φ Φ X φ φ ** ΦΦ φφ Φ.4 $ immobilizáihatjuk. Egyebek mellett felhasználhatunk szűrőpapírt, latex vagy polisztirol gyöngyöket, valamint polietilén, polisz tiroi, proii.propiién vagy más alkalmas mikrová gat lemezeket vagy tesztcsöveket. A hordozó természetes vagy szintetikus eredetű polimerekből, illetve amorf anyagokból, például tőzegből készülhet. Előnyösen nxtro-eellulóz vagy nylon membránokat alkalmazunk a reaktív csíkokhoz, és poiivinil, polipropilén, polisztiroi vagy más műanyagokat a gyöngyökhöz vagy a mikrolemezekhez. Agaróz, akrilamid vagy la tex alapú géleket, vagy szemcséket is felhasználhatunk. A szakterületen ismert valamennyi immunokromatográfiás eszköz, tesztcsík és oldaláramlási eszköz (latéra! flow devíce) adaptálható a találmány szerinti eljáráshoz. Az oldaiáramlasi eszközök közül megemlíthetők például a 4 36β 241. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eszközök. Az antitesteknek az ilyen anyagokhoz kötésére alkalmas módszerek az ezen a területen jártas szakember számára jói ismertek. Hordozóhoz kötött antitesteket például a következő forrásból szerezhetünk be: üeacon Anaiytical Systems, Inc. (Fortland, Maine, Amerikai Egyesült Államok).
A vizsgálatban történő felhasználáshoz a magmíntát úgy állítjuk elő, hogy egy neonikotinoíddal kezelt tételből [például
5-100 g repcemagból (canola seed); 10-200 g cirok-, búza-, gyapot-, takarmánykukorica- és csemegekukorica-magból) vett reprezentatív almintákat egy alkalmas oldószerben, például különböző mennyiségű vizet tartalmazó acetonban, acetonitrilben, etanoiban, ízopropíl-alkoholban, metanolban vagy az említett oldószerek keverékeiben díszpergáljuk. Az alkalmas oldószer/víz ke25 *4 <9 4 * » » χ « 4 * »»« «9« 94x χ x * * * * * 4 * 44*x »* *4 4 4 M JÍ verékek közé tartoznak — egyebek mellett — például az 1-50 % MeOK/HjO és az 1-20 % acetoní tr.il/H^O oldöszereiegyek. A diszpergált magot vertexszel összekeverjük, ezt követően körülbelül 20 percre egy ultrhangos fürdőbe helyezzük, majd tovább vortexáljuk. Ezt követően a keverékeket hagyjuk leülepedni. A folyadék exfcrektumnak egy ismert részét eltávolítjuk és hozzáadjuk például egy 1 % acetonitril/víz oldat ismert mennyiségéhez. Az extraktumot tovább hígítjuk, amíg a kíextrahált neonikotinoid koncentrációja a kalibrációs görbe tartományába esik. Az ezerszerestől hatezerszeresíg terjedő hígítások bizonyultak alkalmazhatónak. Az immunoesszé körülbelül 35 percet igényei.
Az extrakció és az az extraktum analitikai előkészítése hozzávetőleg 30 percig tart. Tehát egy magminta körülbelül 65 perc alatt extraháihatő és analizálható. Az egyik megoldás szerint akár két magminta ímagmíntánként legfeljebb őt alminta) egyidejűleg is analizálható.
A találmány szerinti immunoesszékkel a neonikotinoíd inszektícidek körülbelül lö 000 ppm (parts per millión) és 0,5 ppb (parte per billión) közötti koncentrációi detektálhatok. Azonban az eljárás· alkalmas bármilyen mennyiségű neonikotinoíd inszekticid mérésére, mindaddig, amíg a mintában vagy a minta extraktuntban lévő neonikotinoíd inszekticid mennyisége, illetve ennek a mennyiségnek a megfelelő hígítása a kalibrációs görbe tartományába esik.
Az alábbiakban példákon előállításának, a poliklonáii ímmunoesszének. a részleteit.
keresztül mutatjuk be az antigén antitestek előállításának és egy
A példák a találmány oltalmi kö~ χφ -φ , φ * ·:ΦΦ »·*·φ φ # * . * ♦ » Φ « > φφφφ ώ JÍ »β» φ <
rét# illetve terjedelmét nem korlátozzák#
ΟΜε
Λ
N'Oí
- H.SO,
O OMe
-Nt. <A.
Ο N N
G-msill-Kokaítsamid-szukát
Λ #Ν Μ
Μ ο
’ Cítütt hangyasav <1-1}
&.
2cos α—4 s
I Ν <5
CJ
COjCHj korcs, HCI
{15} cctn (1.1) képietű vegyulet:__2-Met.íl-l-nitro-izokarbami-d
120 ml salétromsav és 280 ml kénsav keverékét ö °C-ra hütöttük# majd a keverékben feloldottunk 38,5 g ö-metll-izokarbamid-szulfátot. A reakció-keveréket 2 órán keresztül 0 cC--on kevertettük, majd keverés közben óvatosan tört jégre öntöttük# $«· ·'# » * * »> -Λ $ * ν** * * « « « » * *«*« ' * <*·>· #.%· Ό végül pedig a tört jeget kiszűrtük. A tűszerű kristályokat feloldottuk etll-acetátban, majd az oldatot kálium-karbonát, hozzáadásával meglögosítottuk. As oldatot vízmentes magnézium-szulfát felett szárítottuk, ezt követően szűrtük, majd a szűrietet betöményitettük, amelynek eredményeként 5 g fehér port nyertünk·.
g íl.la) képletü .metii-4-amino-bütírát—hidrokIorídot feloldottunk 15 mi vízben, majd miközben az oldatot jégfürdöben hűtőttűk, 2 M vizes nátríum-hidroxid-oldat oseppenkénti hozzáadásával a pH~t li~re állítottuk be. A lombikra pH~e.lektródot és hőmérőt szereltünk, ezt követően a képződött tiszta lúgos oldatot gyorsan kevertettük és eközben kis részietekben 2,38 g 2~metil-l-nitro~izokarbamidot adagoltunk az oldathoz, miközben az oldat hőmérsékletét mindvégig 2 °C alatt tartottuk. A beadagolás befejezése után a reakciókeveréket 1,5 órán keresztül 0 öC-on .kevertettük (a p.H 9,6-en stabilizálódott). A rsakoíőkeverékhez. hozzáadtunk 1 ml tetxahidrofuránt, majd további két órán át folytattuk a keverést. Ezt követően a reakciőkeveréket meghígítottuk vízzel, majd a vizes keveréket etil-acetátra öntöttük. Miután a szerves fázis elvált, a szerves réteget vízmentes magnézium-szulfát felett szárítottuk, ezt kővetően szűrtük, majd a szűrietet betöményítettük, amelynek eredményeként egy tiszta olajat nyertünk. A nyers terméket szilikagélen gyorskromatografáituk, amelynek során eluensként 3:1 térfogatarányú metilén-diklerid/acetonitril oidószereiegyet alkalmaztunk. Fehér, szilárd anyag formájában 750 mg kívánt terméket nyertünk.
» *« * φφ φ «' * « « *
Φ *Χ* ΦΧ» X Φ * Λ · * « ♦ Sr ΦΦχχ
Φ* Φφ φ Λ. «
(.1.3) képletü vegyűlet
1,44 g (1.2) képletö vegyűlet, 422 mg psraformaldehíd, 0,023 ml metánsz-ulfonsav és 10 ml .hangyasav keverékét 15 órán keresztül 55 oC~o-n melegítettük, majd a reakció-keveréket vákuumban betöményítettük. A maradékként kapott barna olajat toluolban .szuszpendáltuk, majd a keveréket azeotrop desztiliációval szárazra pároltuk. A maradékként kapott olajat feloldottuk 1:1:1 térfogatárányú tetrahi.drof urán/díoxán/acetonítril oldószerelegyben, majd feleslegben diazo-metánt adtunk, az oldathoz. A reakciókeveréket 30 percen keresztül kevertettük, majd ecetsavval. reagáitattuk. A reakció-keveréket betöményí.tett ük, a maradékként kapott olajat feloldottuk etil-aoetátban, ezt követően az oldatot híg, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mostuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítottuk, majd betöményí tettük.. A maradékként kapott olajat gyors kromatografáltuk, amelynek során eluensként 3:1 térfogatárányú- metilén-díklorid/acetonítríl oldőszerelegyet alkalmaztunk. Tiszta olaj formájában 558 mg kívánt (1.3) képletü oxadíaziníl-vajsav-észtert nyertünk.
{1.4) képietű vegyűlet
1,1 g (1.3) képietű vegyűletet feloldottunk 50 ml aoetonítrilben, majd az oldathoz hozzáadtunk 3 g kálium-karbonátot. A keverékhez egy részletben, hozzáadtuk a. 2'~kiór-5-(kló-r-metil)-tiazolt, ezt kővetően a reakciókeveréket 20 órán keresztül 55 *C-on melegítettük, majd. szoba-hőmérsékletre hűtöttük és kiszűrtük a szilárd, anyagot. A barna, szűrletet betöményí tettük, amelynek eredményeként egy olajat nyertünk. A maradékként. ka29 «* Φφ «φ pott olajat gyorskromatográfiás úton tisztítottuk, amelynek során eluensként 3:1 térfogatarányú metílén-díklorid/acetonitriX oidőszerelegyet alkalmaztunk. Sárgásbarna olaj formájában és 894 mg mennyiségben nyertük a. képleté vegyületet.
(!♦5) képletű vegyület
37.2 mg (1,4) képletű vegyületet feloldottunk 8 ml tömény sósav és 1 ml viz elegyében. A reakció keveréket 6 órán. keresztül szobahőmérsékleten keverhettük, ezt követően vízzel meghígitottuk, majd 1 M vizes nátrium-hídroxid-oldat hozzáadásával pH 4,5-ig óvatosan meglúgosítottuk. A keveréket etíl-acetáttal extraháltuk, a szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítottuk, majd betöményítettü.k. A maradékként kapott olajat gyorskromatográfiás úton tisztítottuk, amelynek során eluensként 1:1 térfogatarányú metilén-díkloríd/acetonitril oldószerelegyet alkalmaztunk. 100 mg kívánt (1.5) képletű vegyületet nyertünk.
Az. 1, példa szerinti szintetikus eljárást alkalmazzuk az alábbi 1, táblázatban látható thiamethoxam háttériek előállttá30 —
Φ φ » φ 4 φφφ ΦΑφ φ »ς ♦ '· Φ * * * X X V Φ> φ sára, azzal az eltéréssel, hogy az helyett egy megfelelő H^KCCHgl^COgS. analóg vegyületet alkalmazunk, ahol értéke 1, 2, 3, 4 vagy 5, és R jelen (1.1a). képietü intermedier (1.1b) általános képietü az általános képletben n tése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos ár kilesöpört
!
6-9.
Thiamethoxam haptének
Az 1- pézda szerinti szxnte alábbi 2. táblázatban látható thr sóra, azzal az ©méréssel, hogy tikos eljárást alkalmazzuk az Lametboxam haptének előállltáaz (í.la) képletű intermedier helyett egy mec
(1.1c) általános képietü « * ««
Η Μ 9
ΦΦ * φ Χ*ί * » *
ΦΦ ΦΦ analóg vegyűletet alkalmazunk, ahol az jelentése .kovalens egyes kötés vagy ~(C. csoport, amelyben .m értéke .1, 2 vagy 3, génatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport általános képletben ^2)5®“ általános képlet és R jelentése hídro
*φ φφ φ «X φ φ « φ * *Χ« ♦ Χφφ φ φ > * X Φ » φ * « ΧΦΦ
CÍΛ ΟΓ Ν ι
Ν
ΛΌ, fi 1 ft 'fi <χ»„η ϊ órás svefegífe 15» Wtn $'~γ·'
Ci—y ft *ϊ
J 'co.h zojarás
Egy mágneses keverőrúddal és vísszafoiyató hűtővel felszerelt 10 ml-es gömblombikban összekevertünk 100 mg (0,275 mmol) thiamethoxam-vajsav haptént és 6,5 ml anizolt. Ezt követően a lombikot olaj fürdőbe helyeztük és 2 órán keresztül 165 °C-on melegítettük. Ezt kővetően az ani.zol eltávolításához a lombikot csökkentett nyomás alá helyeztük és 5 órán keresztül 50 ®C-on melegítettük. Az így kapott 90,2 mg olajos maradék a HPLC analízis szerint 93 %-os tisztaságú volt.
Fi z lkai á ila adók
HPLC: Keystone Soientific Aquasil C-13 5μ (25 x 0,46 cm); 4Q:60 térfogatarányú aeetonitríi/20 mM foszforsav; 1,0 ml/perc; T ~ 40 °C; UV 240 » (BW « 100 na) ; kromatograf álás ideje: 13 perc; retencíós idő: 4,6 perc.
VEK: (diói gél) 2:1 térfogataxányú metilén-dikloríd/aceíonxtril, Rf 0,25.
(300 MHz, CD3CN) δ (ppm) : 7,43 ít, 11), 4,78 (s, 41), 4,75 (s, 41), 4,48 (d, 21} , 3,29 (t, 21), 2,27 (t, 21}, 1,73 (q, 21),
EI/DSP tömegspektrum: m/z 319 (2H-) .
XX*-ν ν Φφφ Φ Φ Φ. ΦΦφ φ > * ♦ » ♦ χ Φ ΦΦΦ ♦ ♦ Φ * * λ ** φ
| Elementáranalizis: | |||
| számított ·{%}·.; C 41,32; | H 4,41; N | 13, | 14; |
| talált (%) ; C 40,13; | K 4,43; N | 12, | 99. |
11-18. példa
Dez(nitro-imlno)-thíamet&oxsm h&ptének
A 10. példa szerinti szintetikus eljárást alkalmazzuk az alábbi 3. táblázatban látható dez(nito-imino)-thíamethoxam napkének előállítására, azzal az eltéréssel, hogy az 1. példában nyert vegyület .helyett egy megfelelő 2-9. példa szerinti analóg vegyü letet a.1 kaimé zunk.
3. táblázat
* * *
ζ. pexaa
Az. 1. példa szerinti szintetikus eljárást alkalmazzuk az alábbi 4. táblázatban látható imidacioprid haptének előállítására, azzal az eltéréssel, h-ogy az (1.2) képletű nítro-guanídíl-ssámazékot vagy ennek egy olyan analógját alkalmazzuk, .amelyet űgv állítunk elő, hogy 2.-9. példában bemutatott módon az (1.1a) képletű intermediert egy megfelelő (1.1b) vagy (l.le) általános képletű vegyülettei helyettesítjük.
φφ
Ser (nitxo-is
A ΙΟ. példa szerinti szintetikus eljárást alkalmazzuk az
X φ φφ ,50 * Φ φφ φφ φ
Φ X φ Φ φ Φ * *#Χ «·*« χ * φ ** φφ φφ φ* ♦ » **«♦ alábbi 5. táblázatban látható dez(níto-iminoj-imídacroprid haptének előállítására, azzal az eltéréssel, hogy az 1. példában nyert vegyüiet helyett egy megfelelő 19-27. példa szerinti analóg vegyületet alkalmazunk.
n.
CL .N
φφφ *φ ΦΦ «φ φ * * Φ 9 * Φ * Φχχ ΦΦΦ * * Φ Φ Φ Φ Φ χ φ χ ** Φ« φφ φφί
37-45. példa
Az 1. példa szerinti szintetikus eljárást alkalmazzuk az alábbi 6. táblázatban látható imídacloprid haptőnek előállítására, azzal az eltéréssel, hogy az (.1.2) képietü nitro-guanidil^származékot vagy ennék egy olyan analógját alkalmazzuk, amelyet úgy állítunk elő,· hogy 2-9. példában bemutatott módon az (1.1a) képietü intermediert egy megfelelő (1.1b) vagy (1.1c) általános képietü vegyülettel helyettesítjük.
& ^,á&v5 sísp'.s&í*
| 1 Példa. | ί | |
| 1 37. | -CH2CG2H j | |
| 38. -CH2CH2CO2H | | |
| 39. | —CH2CÜ2CH2^-''^2^ í |
| 40. | -CH2CH2CH2CH2CO2H 1 |
| 41. | -CH-jCH'sCB'?CB'?CH'3CO-?H i | Φ. Φ. Ί |
| ! 1 42. | i \ CO,H 1 ( |
* * χ * 4 a * ί ΐ «» «XX φ y * ♦ < φ φ * φ φ«.
·** β * a* .«.« «
8 -~ 3 δ , példa
De®(aitro-imino)-clofcbiadln
| A .10. példa szar | inti szintetikus eljárást | a 1 ka Írna z z u k a z |
| alábbi 7. táblázatban | látható dez. (nito-ímino) -cl | othíadin hapté- |
| ne-k előállítására, azzal az eltéréssel, hegy | az 1. példában | |
| nyert vegyület helyett | egy megfelelő 37-45. páld | La szerinti ana- |
| lóg vegyületet alkalma | zunk. |
Cl
* φ *·* X <
Ά 8. táblázatban látható clothladin hapténeket a (ΙΙΣΑ) éí (IIIB) általános képletö haptének szintézisénél ismertetett eljárással állítjuk elő.
«Λ . » Φ * * * s. f * Φφφ 99* « χ
Φ Φ φ φ φ φ φ φφ»$
Tfexamefchoxass ámmasaogén előállítása
64.1,
0,01 M foszfátpuffereit fiziológiás sóoldattal (PBS) (pH 7,4) előállítjuk a tisztított proteínszármazék (purified protein derivative, PPD) 1 mg/ml koncentrációjú oldatát. Az oldat 0,5 ml-es részletének a pH-ját 0,1 M sósav-oldattal 4,5-5,0 közötti értékre- állítjuk be.
64.2.
250 ul 0,1 M 2-mo.rfolinO'-e-tánszulfonsav-oldatban (pH 4,5) feloldunk 1 mg 1. példa szerinti thíamethoxam haptént. összekeverjük a haptén- és a PPD-oidatot.
64.3.
100 .pl ionmentes- desztillált vízben feloldunk 1 mg 1- [3- (dímetil-amino) -propil) -B-etil-karbodiimi-d—hidrokloridot (SDC). Az EDC-oldatot azonnal hozzáadjuk a 3.2. lépés szerinti h.aptén-P'PD-oldathoz. A haptén-PPD-SDC-oldatot 2 órán keresztül szobahőmérsékleten kever tét juk. Ezt kővetően a reakció-keveréket egy 1000-2000 Dalion molekulatömeg-vis-szatartásű (cut-off) dia-, llziszsákb-a töltjük. Két liter 4 4C hőmérsékletű PBS-sel szemben 48 órán keresztül intenzív dialízist végzünk, amelynek során naponta- háromszor cseréljük a PBS-oldato-t.
Imidacloprid immmogén előállítása
A 21. példa szerinti haptén alkalmazásával., a 64. példa szerinti metodológiának megfelelően egy imida-clop-rid immunogént φ* *** **« *** X * κ ♦ * * « Φ « X χ ♦* 99 φφ φ állítunk elő.
CXofehiadiö immunogén előállítása A 39. példa szerinti haptén alkalmazásával, a 64. példa szerinti metodológiának megfelelően egy ciothiadin Immunogént állítunk elő.
ThíacXoprid immunogén előállítása Az 57. példa szerinti hapfén alkalmazásával, a 64. példa szerinti metodológiának megfelelően egy thiaclopríd iramunogént állítunk elő.,
Immunizálási program és az antitestek kinyerése
A kezdeti immunizáláshoz .a 64. példa szerinti iwnunogént komplett Freund-adjuvánsban oldjuk fel. Nőstény New Sealand fehér nyálakat inokulálunk. Minden egyes esetben hozzávetőleg 25 pg immunogént injektálunk. Hasonlóan végezzük el juhok immunizálását is, azzal az eltéréssel, hogy itt minden egyes esetben 38 pg immuno-gént injektálunk.
A későbbi immunizálásokhoz az immunogénfc inkomplett Freund-adjuvánsban oldjuk fel. Az immunizálások között az állatokat négy héten át nyugton hagyjuk, majd tíznapos posztímmunizációt követően vért veszünk.
Erősítő (booster) injekciók beadása mellett az állatoktól majd ekkor az állatokat kivéfc fcfc fc fc * * fc fc .fc fc* fcfc fcfc fc* fc ♦ ♦* « χ fcfc X « fcfc fc kilenc hónapon át veszünk vért, reztetjük.
Az ezen a. területen jártas szerek alkalmazásával kinyerjük szakember számára ismert mód™ a poiíkionálís antitesteket.
Sgy kisméretű fiolában összekeverünk 3,1 mg 1. példa sze$~hidroxi- s zukcínimídeé
-propil]-3-etil-karbodienyhe nitrogénáram alatt szárítj uk.
rinti thiamethoxam haptént, 4,0 mg (NMS) és 4,6 mg 1-{3- (dimetil-amino) imid—hidrokioridot (EDO» A keveréket percen keresztül szobahőmérsékleten
Az előbbi keverékhez 2 ml vízmentes b,tr-dímetil-formamidot adunk, majd a keveréket egy percen keresztül ultrahanggal kezeljük. A képződött oldatot egy éjszakán keresztül ssobahőmérsékle t en 1nkubéÍjuk.
69.3.
Egy kisméretű fiolában 2,0 mi 0,05 M karbonátpufferben (pH 9,6) feloldunk 3,5 mg torma-peroxidázt. A fiolát jégfürdőbe helyezzük.
Az előbbi oldathoz egy óra. alatt lassan hozzáadunk összesen 1ÖÖ μΐ. 6.2. lépés szerinti öaptén-NbS-EDC-oidatot, majd a keveréket 2 órán keresztül keverés közben inkubáijuk.
A reakeiókeveréket felvisszük egy PSS-sel (0,01 M, pH 7,2} *♦ • * * » ί **♦ «φφ ΦΧφ # * · * « φ Φ«φφ ekvilibrált Sephadex G-25M oszlopra, Az eluátum. első 3,0 miében kinyerjük áz enzim-konjugátumot, majd azonos térfogatú glicerint adunk hozzá, A keveréket -20 °C-on tároljuk.
70. példa
Thiametboxammal kezeit repcemag (canoXa eeed) xsraunoesssséje
A magextraktum egy részét 1 % MeOH/í-^O oldószereleggyel addig hígítjuk, amíg a thiamethoxam várt koncentrációja a kalibrációs görbe tartományába, azaz 0,5-120 ppb közé kerül.
Antitesttel bevont csöveket jelöléssel látunk el, majd a csöveket kémcsőtartó rekeszbe helyezzük, ahol az első és az utolsó cső a standard, míg a továbbiak standardok és minták vegyesen, A kémcső-tartó rekesz valamennyi csövet úgy fogja be, hogy a rekesz a csövek kicsüszása nélkül átfordítható, A megfelelő csövekbe 0,5 ml-es standard- vagy 'mintarészletet mérünk be. Valamennyi csőbe bemérünk 0,5 ml enzim konjugátum oldatot. A csöveket 20 percen keresztül szobahőmérsékleten ínkubáÍjuk. A csövek tartalmának a dekantálása érdekében a rekeszt átfordítjuk, Felfordítható mosópalack alkalmazásával túlfolyásig valamennyi csőbe desztillált vizet adunk, majd a mosóiolyadékot dekantáljuk. A csöveket további három alkalommal mossuk. Az utolsó mosás után a rekeszt átfordítjuk, majd a mosó-folyadék feleslegének az eltávolítása érdekében a csöveket óvatosan tiszta papírtörülközőhöz ütögetjufc, Valamennyi csőbe bemérünk 0,5 mi enzim, szubsztrátot, majd a csöveket 10 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálas ideje alatt a rekeszt 2,5 percenként óvatosan megrázogatjuk. A szignál generáció le45 * ♦ *« Χ«« «Φφ * # * X ·χ « « « χ««« ** Φ* XX w. ** állítása érdekében valamennyi csőbe bemérünk Ö/5 ml savas leállító oldatot (1 M sósav-oldatot} . Amint az a 10. táblázatban látható, a reakciótermék abszorbanciáját 450 m hullámhossznál, mérjük. A standardok ahszorbaneíáit használjuk egv kalibrációs görbe megszerkesztésére, amelynek során a következő formájú regressziós függvényt alkalmazzuk: Y - m Ln(X) + B. A hígított mintában lévő neonikotinoid pesztícid koncentrációjának a meghatározásához az egyes minták abszorbanciáját behelyettesítjük a függvénybe. Az eredeti mintában lévő neonikotinoid pesztícid mennyiségének a kiszámításához az előbbiekben nyert koncentrációt megszorozzuk a higítási faktorral.
A thiamethoxam standardok ressziós analízissel hozzuk lé dard görbét eredményezik: Y ~ ahol Y - az analitikai reakció reakcióját leíró függvényt regre. Az adatok a következő stan•,191 Ln (X) + 1,23, r - -, 999, koncentrációja.
* Φ* φφ * Φ « Φ X »
Φ *ΦΦ Φ«» φφ» φ » ’ ’ · ♦ »» . «...
** ** *φ β* φ »Φ
71. példa jwwwwwwwjwowffwmfl......
71.1. Magvak extra keiója
A. kezelt mágvag mintáiból véletlenszerűen almintákat készítünk, amelynek során 30 ml-es (8-ο·ζ) széles szájú lombikokba 50 g gyapotmagot, takarmánykukoricát, cirokmagot, csemegekukoricát és búzát, valamint 40 g repcemagot mérünk be. A repcemagból négy almintát készítünk, míg a többi magból öt almintát alkalmazunk.. A lombikokba 150 ml oldószert adunk, majd a szorosan lezárjuk a lombikok száját. A gyapotmagot. 5 % acetonitríl/víz oldószereleggyei, míg a többi magot 20 % metanol/víz oldószereleggyel extraháljuk. A lombikot kézzel 30 másodpercen keresztül erőteljesen rázzuk, majd 20 percre ultrahangos szobahőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük. A korábbiaknak, megfelelően a mintákat .másodszor is rázzuk. A lombikok tartalmát körülbelül 5 percen, keresztül hagyjuk leülepedni, majd 0,10 ml-es részletet veszünk ki az analízishez. A kivett részletet 1 % metanol/víz oldószereleggyei addig hígítjuk, amíg a hatóanyag-maradék a standard oörhe tartományába kerül.
V*
71.2. Immunoesszé vizsgálat
Antitesttel bevont polisztírol tenyésKtccsÖveket jelöléssel látunk el, majd a csöveket kémcső-tartó rekeszbe helyezzük, ahol az első és az utolsó cső a standard, míg a továbbiak standardok és minták vegyesen, A megfelelő csövekbe 0,5 ml-es standard vagy minta oldatot mérünk be. Valamennyi csőbe bemé* * φφ ·* Φ-X * * Φ » < * * *♦> ***· χ Λ* * * * Φ * *»«Μ rünk 0,5 ml enzim konjugátum oldatot. Az oldatok összekeveréséhez a rekeszt -óvatosan rázogatjnk, majd a csöveket 20 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A csövek tartalmának a dekantáiása érdekében a rekeszt egy rozsdamentes tál felett átfordítjuk. Túlfolyásig valamennyi csőbe desztillált vizet adunk, majd a mosófolyadékot a rekesz átfordításával dekantáljuk. A csöveket további négy alkalommal mossuk. Az utolsó mosás után a rekeszt átfordítjuk, majd a mosó-folyadék feleslegének az eltávolítása érdekében a csöveket óvatosan tiszta papírtörölközőhöz ütögetjök (a csövekben maradó kevés folyadék nem befolyásolja a vizsgálat eredményét). Valamennyi csőbe bemérünk 0,5 mi enzim szubsztrát oldatot, majd a csöveket 10 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás ideje alatt a rekeszt 2,5 percenként óvatosan megrázogatjuk, és így biztosítjuk, hogy az enzim és a szubsztrát megfelelően érintkezhessen. A kék szín kifejlődésének a leállítása érdekében valamennyi csőbe bemérünk 0,5 ml savas leállító oldatot. Az oldat abszorbandáját 450 nm hullámhossznál spektrofotometriás úton mérjük. A mintákban lévő analizálandó anyag koncentrációját a következő regressziós függvényből határozzuk meg: y - m ln(x) +· b.
71.3. Kereszt-reaktivitás meghatározás
Az Immunoesszé kereszt-reaktivitását, illetve specifitását annak érdekében értékeljük, hogy eldönthessüfc, a magbevonatokban található más tesztanyagok nem befolyáolják-e a thiamefhoxaa .mérését. A tesztanyagokat 1Ő00 ng/mi és 0,31 ng/mi közötti koncentrációtartományban 1 % metanol/víz -oldőszerelegyöen oldjuk, Minden egyes koncentráció esetén mintákat veszünk, amelye48 **** XX χχ.
* * * φ « ζ
X ·♦♦ «φφ φφφ « φ * * * * * Φ Χφφφ két a fentieknek megfelelően analizálunk. Az: egyes tesztanyagok reaktivitását az említett tartományban ismert eljárással határozzuk meg ÍBrady, J. F., Turnén, J., Skinner, D. H., Application of a triasulfuzon enzyzie íxu&unoassay to the analysis of incur&ed resldues ín soií and watez sa®ples.”f J. Asric. Font Crsm. , 43, 2542-2547 (1995)1.
71.4. EREDMÉNYEK
Az analizált tesztanyagok közül egyedül a thiamethoxam bizonyult szignifikánsan reaktívnak az immunoesszével (lásd az alábbi 9. táblázatot]. Tehát ez az immunoesszé a thiaraethoxamra specifikus.
A kezelt magtételek almíntáit immunoesszével és HPLC-vel analizáltuk. Az elemzések eredményei a 11. táblázatban láthatók. A thiamethoxam 40 magmintája esetén a 11. táblázat összefüggést mutat ki a poliklonális antitestek alkalmazásával végzett ímmunoesszé átlagos eredményei és a HPLC analízis eredményei között. A legjobb illeszkedést! regressziós vonal azt jelzi, hogy mindkét eljárással hasonló eredményeket nyertünk.
- 4 9 ί
** «φ φφ
Φ χ *φφ φ*φ
Φ * Φ Φ Φ * * φφ ««
rea tesztelt hatóanyagok reaktivit aktivitásához viszonyított százai
NR « nem reaktív ásanak a
Lékos ért thiamethoxam :ke
Π
3368
Üi ο
628
690
757
915
?iz íiswesszévei minden egyes adatánál ismételt analíziseket (öt aérsstí végeztünk. Sz egyes minták áasössszé analíziseinek átlagértékét regressziós analízissel hasonlitöttúk össze a f® eredsértyével. így a következő regressziós függvényt nyertük: ϊ ~ 1,(13 X +13,3, r = 0,316, jj = 43, aho.1 Ϊa a? isfiunsesszével sért thiamethoxsti ígpxO , és X a HPLC-vel sért thíaseítas (ppi ♦ « ♦ » X * * ♦ x« »
* X í 4 « « m
* S 4 4 « x í
4»» x :» « i « í « ♦
(H í
* ·,Λ
O't
♦ » ♦ ί ♦ 4 χ * ♦» χ ♦ 4 ♦ ♦ * ♦♦« ♦♦♦ χ ♦ χ « < ♦ ♦ »4«
V 4 * 4 » 4 ♦ 444 <
♦ 44
Λ;
464
457
298316
Λί
3055
te iwMinoesszével sínden egyes ©intánál ismételt analíziseket Sőt ©érést) végezttó, te egyes ©íntál issnoesszé analíziseinek átlagértékét regressziós analízissel tosonlítottsk össze a sreÖényéveL, ♦ í í X * « X « M ΐ
♦ « « « í « m
»** « φ x * < * x*x ♦ í X x X 1) « ♦♦»+
X *0 «<
« X
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1, .Egy mintában lévő neonikotinoid ínszekfcicid mennyiségének a meghatározására szolgáló immuno-esszében felhős znál ható antitest, amely antitest. U; -egy állat immunogén hordozd- proteinhez kapcsolt neonikotinoid hapténnel történő- immunizáláséval -termelt polikionális antitest, és. (2} specifikusan kötődik a neonikotinoid inszektleidhez és amely antitest szelektív agy (1) általános képietű vegyületre.} (1) amelynek képletébenA jelentése z-kiór-5-piridil- vagy 2-kiór-5-tia-zolil~csc-~ port;R és R' jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénát o-mo s a 1 ki 1-c-s o po r t; i 2R es R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy í~4 szénatomos alkilesoport,. vagyR és R<' azzal a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik, egy imidazo!idin- vagy egy oxadíazingyürűt képez; ésX jelentése -N-ECg vagy képietű csoport.
- 2, Az 1. igénypont szerinti antitest, amely antitest szelektív egy, a következők közül kiválasztott vegyületre; imida-c.loprid, thiamethcxam, és clothiad-in.
- 3. Egy ÍXA) általános képietű vegyűlet,Φ φa.m.e .yne k kép1etébenFf RΜ _ΜX...:..........>ÍQV φφφ » fc * » φ ♦ ♦ * φφ φ φ φ φ »φ φport;R~ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;R1 és K~ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos: alkilcsoport, vagy 1 '>R. es R azzal a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik, egy ímidazolidin- vagy egy oxadiazíngyűrüt képet;es értéke 1, 2,· 3 vagy 4; jelentése «-Ν-ΝΟ2 vagy -N-CN képletű csoport,
- 4, Sgy 3. igénypont szerintiClOXX z‘ \z <w~ n;OH ;alános képletű vegyület.
- 5, A 4. igénypont szerintiN' ,NO, N N C1~v é JN OΧΑ,ΖΧΧ'CO.H :é ο 1 e tű vegyület.Egy 3. igénypont szerinti.O // φφφW'· í.,O OH általános képletű vegyület.
- 7, A 6. igénypont szerinti „NO,Γ#ΊΡ^ν'χ'...Ο-. j_Cl N χ~\3O,H kepretu vegyület.
- 9. Egy (11/ általános képletű prote:<5 iFT H sete 1 y n e fc képi e t éhe nA jelentése 2~fclőr~5~píridí 1~ vegy 2-klŐT~S-tiazoiil--csoport;R’ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;1 2R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy .1-4 szénatomos alkilcsoport, vagyRx és Ri4· azzal a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik, egy imídazolidín- vagy egy oxadiazingyűrüt képez;értéke 1, 2, 3 vagy 4;ObΦ4 ΦΦ * ΦΦ )( φ « ** * *Χ*Φ » φ * φ φ ♦ φ · »Χ ΧΦΦΦ ·♦* ΦΦΦX jelentése -N-hOg vagy -N~CN képietü csoport; ésPR jelentése egy, a következő csoportból kiválasztott hordozó molekula proteincsöpörtja; Pipánerű a vírusból származó tisztított protein-származék (PPQ, Tufcerkuiinj , bovin-szérumaibumin, kstíonizáit bovin-s-zérumalbumin, humán szérumalbumin, ovalbumín és KHL (Keyhole Limpet, .01 odora aspera) hemocianín; vagy egy a következő csoportból kiválasztott enzimcsoport: alkáiikus foszfatáz, torma-peroxidáz és β-galaktozidáz,9. Egy 3. igénypont szerinti ki <·£! NH—PRN ίΟ általános képietü protein konjugátum
- 10. Egy 8. igénypont szerinti $o általános képietü protein konjugátum.
- 11, Eljárás mintákban lévő neonikotinoid inszeiktícidek koncentrációjának a meghatározására, ezrei j a I i es e z ve , hogy az eljárás a következő lépéseket foglalja magában:(a) kialakítunk egy szilárd fázist a neonikotinoid inszektieidxe szelektív immobilizált antitesttel, ahol az antitest szelektív egy (1) általános képietü vegyüietre.amelynek képletébenA jelentése 2~kl0.r-5~p.lrid.il~ vagy 2-klór-5~t.iazoli.l~cso~ port?R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;1.2.R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1~4 szénatomos alkilcsoport, vagy1 2R és R aszal a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik,, egy imidazolidin- vagy egy oxadiazingyűrűt képez; ésX jelentése -N-NOj vagy -N-CN képlető csoport;(b) a mintát egy neonikotinoid. inszektieid heptán-enzim, konjugátum ismert mennyiségének a jelenlétében érintkezésbe hozzuk az immob-ilizált antitesttel;(c) a nem kötött heptán-enzim, konjugátum vagy a minta eltávolítása érdekében a <b) lépés szerinti szilárd fázist mossuk;(d) egy kromogén létrehozása érdekében a (c) lépés szerinti mosott szilárd, fázist egy, a haptén-enzim konjugátumra specifikus kromogén szubsztráttal reagáltakjuk; és (a) az antitest-kötött haptén-enzim konjugátum mennyiségének és ezen keresztül a mintában lévő neonikotinoid inszekticid mennyiségének a meghatározása érdekében mérjük a .fd) lépésben képződött kromogén mennyiségét.
- 12, A 11, igénypont szerinti eljárás, azzal jelle*x »♦♦♦ **· **♦ ** igezve, hogy « mintát egy növényi szaporítóanyag alkalmas oldószerben végzett extrakolójávai nyerjük.
- 13. A 12. igénypont szerinti -eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi szaporítóanyag mag.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mag következő csoportból kerül kiválasztásra: repce, cirok, búza, gyapot, takarmánykukorica és csemegekukorica.
- 15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jel leve zve, hogy az antitest egy állat immunogén hordozó proteinhez kapcsolt neoníkotínoid hapténnel történő immun!zárásával termelt poliklónál..is antitest.
- 16, A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunogén hordozó protein egy, a következő csoportból kiválasztott hordozó molekula: Diptneris vitásból származó tisztított proteínssármazék (PPD? Tnberkulin) , bcvin-szárurnazbumín, kationízált bovin-szérumalbumin, humán szérumalbumin, ovaibumin és KHL (Keyhole Limpet, Diodora aspe.rai hemocianin.
- 17. Egy mennyiségének felhasználható tárolóé dé n yben (a) egy, mintában lévő neonikotinoid inszektícid a meghatározására szolgáló immunoesszében készlet (kit), amely készlet egy vagy több kombinálva a következőket tartalmazza:a neonikotinoid inszektleidre szelektív immobilizált antitesttel rendelkező .szilárd fázis, ahol az antitest szelektív egy (1) általános képletü vegyületre, ·?* ♦ ♦.*» amelynek képletébenA jelentése 2-klor~5~píridíi~ vagy 2-kiör---5-tiazoiii~cso~ port;zR. és H jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy i ~4 szénatomos alkilcsoport;; 2 ,R~ és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomon alkilcsoport, vagy l ?R és R azzal a .nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódik, egy imidazolidin- vagy egy cxadiazíngyűrüt képez; ésX jelentése -h-NQz vagy -N-C.H képietü csoport;(b) egy neonlkotInoid hapténhez kapcsolt enzimből állő enzim konjagátum.1.8. A 17. igénypont szerinti készlet, amelyben az antitest egy állat immunogen hordozó proteinhez kapcsolt neoníkotinoiddal történő immunizálásával termelt pollklonális antitest.
- 19, A 17. igénypont szerinti készlet, amelyben az enzim torma-peroxidáz.
- 20, A 17. igénypont szerinti készlet, amelyben az antitest specifikusan. kötődik egy, a következő csoportból kiválasztott neonékorinaid ínszektieidhez; imídacioprid, thíamethoxam, és clothíadin.
- 21, Egy mintában lévő neonlkotinoid ínszekticid mennyiségének a meghatározására szolgáló immunoesszében felhasználható antitest, amely antitest U) egy állat a»* « * « * * «« **♦ *♦* immunogén hordozó proteinhez kapcsolt neonikotinoíd hapténnel történő immunizálásával termelt poiiklonális antitest, és (2j specifikusan kötődik a neonikotinoíd Íriszeké leidhez és amely antitest szelektív a nítenpyramra, aeetamipridre vagy thiacloprídre,
- 22. il. Eljárás mintákban lévő neonikotinoid inszekticidek koncentrációjának a meghatározására, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépéseket foglalja magában:(a) kialakítunk egy szilárd fázist a. neonikotinoíd inszekticidre szelektív immobiiizáit antitesttel, ahol az antitest szelektív a nítenpyramra, aeetamipridre vagy thiaclopridre;(b) a mintát egy neonikotinoíd inszekticid heptán-enzim kenjegátura. ismert mennyiségének a jelenlétében érintkezésbe hozzuk az immobiiizáit antitesttel;(c) a nem kötött heptán-enzim. konjugátum vagy a minta eltávolítása érdekében a (b). lépés szerinti szilárd fázist mossuk;(dj egy kromogén létrehozása érdekében a (c) lépés szerinti mosott szilárd fázist egy, a haptén-enzim konjugátómra specifikus kromogén szufosztráttal reagáltatjuk? és te) az antitest-kötött haptén-anzim konjugátnm mennyiségének és ezen keresztül a mintában lévő neonikotinoíd inszekticid mennyiségének a meghatározása érdekében mérjük a (d) lépesben képződött kromogén mennyiségét,
- 23, A 22, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemerve, hogy a mintát egy növényi szaporítóanyag alkalmas ol— 61ΧΦ Φ jir * φ φ Λ Κ* * φφ* * *9 Λ X V *χ.φ φφ«« *** «*Χ dószerben végzet
24 . A 23. merve. hogy í 25. A 24. merve, hogy repce, cirok, t attrakciójával nyerjük, igénypont szerinti eljárás, növényi szaporítóanyag mag. igénypont szerinti, eljárás, azzal azzal jeliemsg következő csoportból kerül kiválasztásra:bűze, gyapot, takarmánykukorica és csemegekukorica.28. A 22. igénypont szerinti eljárás, aszal jellemezve, hogy az antitest egy állat immunogén hordozó proteinhez kapcsolt neonékotinoid napkénnel történő immunizálásával termeit poliklonális antitest. - 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jel isme zve, hogy az immunogén hordozó protein egy, a következő csoportból kiválasztott hordozó molekula: Diptheria vírusból származó tisztított prOteíuszármazék (PHD, Tufoerkulín), toovin-széromalbumín, .kát ionizált teovin-szérum-albumin, humán szérumalbumin, ovalbumin es KHL (Keyhole Limpet, Dí odora aspera) hemo-cianin.23. Egy mennyiségének felhasználható t á r ο 1 öe d é n y be n (a.) egy, mintában lévő neonékotinoid inszekticid a meghatározására szolgáié immunoesszében késztet (kit), amely készlet egy vagy több kombinálva a kővetkezőket tartalmazza:a neonékotinoid inszekticiore szelektív immobílíráit antitesttel rendelkező szilárd fázis, ahol az antitest szelektív ni.tenpyram.ra, aoetamipridre vagy thiaclopridre;(b) egy neonlkotinoid hapténhez kapcsolt enzimből álló enzim kenj ugatom.
- 29, A 28, igénypont szerinti készlet, amelyben az antitest * fcΦΦΦΦ .»«*·«·Φ s * * φ * ♦ * *'*♦. φφφ egy állat immunogéri hordozó proteinhez képcsőit neoníkotínoiodai történő immun!zálásévei termelt políklonális antitest.
- 30. A 28. igénypont szerinti készlet, amelyben az enzim íorma-peroxídáz.TsssőR-íS
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45678299A | 1999-12-08 | 1999-12-08 | |
| PCT/EP2000/012310 WO2001042787A2 (en) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Immunoassay for neonicotinyl insecticides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0203499A2 HUP0203499A2 (hu) | 2003-03-28 |
| HUP0203499A3 HUP0203499A3 (en) | 2004-12-28 |
| HU229490B1 true HU229490B1 (en) | 2014-01-28 |
Family
ID=23814141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0203499A HU229490B1 (en) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Immunoassay for determining the concentration of a neonicotinoid insecticide |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7148029B2 (hu) |
| EP (1) | EP1235805B1 (hu) |
| JP (1) | JP4980536B2 (hu) |
| KR (1) | KR100752536B1 (hu) |
| CN (1) | CN100379725C (hu) |
| AR (2) | AR026735A1 (hu) |
| AT (1) | ATE343564T1 (hu) |
| AU (1) | AU778677B2 (hu) |
| BR (1) | BR0016265B1 (hu) |
| CA (1) | CA2393084C (hu) |
| CZ (1) | CZ303174B6 (hu) |
| DE (1) | DE60031570T2 (hu) |
| DK (1) | DK1235805T3 (hu) |
| EA (1) | EA005380B1 (hu) |
| ES (1) | ES2272357T3 (hu) |
| HU (1) | HU229490B1 (hu) |
| IL (2) | IL150009A0 (hu) |
| MA (1) | MA25635A1 (hu) |
| MX (1) | MXPA02005514A (hu) |
| NO (1) | NO331464B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ519152A (hu) |
| PL (1) | PL205061B1 (hu) |
| PT (1) | PT1235805E (hu) |
| UA (1) | UA76708C2 (hu) |
| WO (1) | WO2001042787A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA200204582B (hu) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1761774A1 (en) | 2004-07-01 | 2007-03-14 | The Central Science Laboratory, "CSL", Representing The Secretary of State for Environment, Food and Rural Affairs | Analyte detection system |
| JP2006282547A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Horiba Ltd | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 |
| JP4841856B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2011-12-21 | 株式会社堀場製作所 | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 |
| MX363423B (es) * | 2005-05-18 | 2019-03-22 | Ablynx Nv | Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor. |
| KR100696615B1 (ko) | 2005-10-06 | 2007-03-19 | 충북대학교 산학협력단 | 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템 |
| JP2007187650A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Horiba Ltd | 免疫測定法を用いたフィプロニルの測定キット |
| WO2007069681A1 (ja) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Horiba, Ltd. | 免疫測定法を用いたシロアリ駆除剤の有効成分の測定キット |
| CA2641544C (en) | 2006-02-10 | 2011-01-11 | Mitsui Chemicals, Inc. | Process for producing o-methyl-n-nitroisourea |
| CN100402522C (zh) * | 2006-02-13 | 2008-07-16 | 中国农业大学 | 一种净化常山酮的方法及其专用免疫亲和色谱柱 |
| KR100879222B1 (ko) | 2006-05-09 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 제초제 메타미포프 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| KR100879223B1 (ko) | 2007-05-22 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| KR100876435B1 (ko) | 2007-05-22 | 2008-12-31 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체 |
| US9207240B2 (en) * | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
| CN101880325A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-11-10 | 南京农业大学 | 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 |
| EP2705366B1 (en) | 2011-05-04 | 2017-07-12 | Pop Test LLC | Diagnostic device |
| CN102636643A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-15 | 上海交通大学 | 用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法 |
| WO2014031662A2 (en) | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc | Antibodies to olanzapine and use thereof |
| AU2013305970B2 (en) | 2012-08-21 | 2017-08-17 | Saladax Biomedical Inc. | Antibodies to aripiprazole haptens and use thereof |
| CN104755631B (zh) | 2012-08-21 | 2017-09-05 | 詹森药业有限公司 | 阿立哌唑的抗体及其用途 |
| EP2888269B1 (en) * | 2012-08-21 | 2018-10-24 | Janssen Pharmaceutica NV | Haptens of olanzapine |
| CA2882449C (en) | 2012-08-21 | 2018-09-04 | Ronghui Lin | Haptens of aripiprazole and their use in immunoassays |
| EP3581195A1 (en) | 2012-08-21 | 2019-12-18 | Janssen Pharmaceutica NV | Antibodies to olanzapine haptens and use thereof |
| CN102942519B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-08-13 | 天津科技大学 | 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 |
| CN104974256B (zh) * | 2015-04-10 | 2018-06-05 | 南京农业大学 | 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途 |
| CN105037344A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-11-11 | 环境保护部南京环境科学研究所 | 一种噻虫啉半抗原的合成方法 |
| CN105087498B (zh) * | 2015-09-07 | 2018-01-09 | 江南大学 | 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN105572376B (zh) * | 2016-03-07 | 2017-07-11 | 中国烟草总公司贵州省公司 | 一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法 |
| KR102225307B1 (ko) | 2017-10-19 | 2021-03-11 | 경북대학교 산학협력단 | 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 |
| CN109813894A (zh) * | 2017-11-18 | 2019-05-28 | 镇江亿特生物科技发展有限公司 | 一种检测大米中乙虫腈的化学发光免疫检测试剂盒 |
| CN108998422A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 江南大学 | 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN109111394B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种啶虫脒半抗原与抗原的制备方法及应用 |
| CN109061158B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109917126A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-21 | 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) | 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法 |
| CN111646959B (zh) * | 2020-05-14 | 2022-07-15 | 广州海关技术中心 | 一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置 |
| CN112111011B (zh) * | 2020-07-28 | 2022-04-19 | 浙江大学 | 一种特异性抗噻虫嗪抗体的可变区序列及其重组全长抗体 |
| CN113009057B (zh) * | 2020-10-22 | 2023-11-07 | 重庆医科大学 | 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法 |
| CN112595850A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-04-02 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种噻虫胺人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113281501B (zh) * | 2021-05-12 | 2023-07-07 | 北京勤邦科技股份有限公司 | 一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113979994A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-01-28 | 信达安检测技术(天津)有限公司 | 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及其合成与应用 |
| CN114397441A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-26 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN114636768B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-11-07 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5334528A (en) * | 1989-10-30 | 1994-08-02 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same |
| JPH0580553A (ja) | 1991-09-24 | 1993-04-02 | Mita Ind Co Ltd | 電子写真感光体 |
| TW240163B (en) * | 1992-07-22 | 1995-02-11 | Syngenta Participations Ag | Oxadiazine derivatives |
| GB9304191D0 (en) * | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Process for the preparation of aqueous nicotinaldehyde |
| DE4329952C1 (de) * | 1993-09-04 | 1994-08-04 | Draegerwerk Ag | Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung |
| US5553209A (en) | 1994-01-28 | 1996-09-03 | Hughes Aircraft Company | Method for automatically displaying map symbols |
| US5849758A (en) * | 1995-05-30 | 1998-12-15 | American Cyanamid Company | Herbicidal 2, 6-disubstituted pyridines and 2, 4-disubstituted pyrimidines |
| EP0854721B1 (en) * | 1995-08-02 | 2001-10-24 | Smithkline Beecham Corporation | Endothelin receptor antagonists |
| US5972842A (en) * | 1996-12-12 | 1999-10-26 | American Cyanamid Company | Herbicidal cyanopyridines |
| AU727669B2 (en) * | 1996-12-19 | 2000-12-21 | Syngenta Participations Ag | Process for the preparation of thiazole derivatives |
| JP2993902B2 (ja) * | 1997-02-26 | 1999-12-27 | 株式会社環境免疫技術研究所 | トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188641B2 (ja) * | 1997-03-18 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188642B2 (ja) * | 1997-03-19 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| US6355799B1 (en) * | 1997-10-27 | 2002-03-12 | Isk Americas Incorporated | Substituted benzene compounds, process for their preparation, and herbicidal and defoliant compositions containing them |
| US6121202A (en) * | 1997-11-07 | 2000-09-19 | American Cyanamid Company | Thienyloxypyridines and-pyrimidines useful as herbicidal agents |
| DE19831246A1 (de) * | 1998-07-11 | 2000-01-13 | Clariant Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arylpyridinen |
| JP3884586B2 (ja) * | 1998-12-24 | 2007-02-21 | 株式会社堀場製作所 | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| US6960595B2 (en) * | 2001-03-23 | 2005-11-01 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | 5-6 to 5-7 Heterobicycles as factor Xa inhibitors |
-
2000
- 2000-06-12 UA UA2002075564A patent/UA76708C2/uk unknown
- 2000-12-06 JP JP2001544026A patent/JP4980536B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 US US10/149,512 patent/US7148029B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 KR KR1020027007294A patent/KR100752536B1/ko active IP Right Grant
- 2000-12-06 EA EA200200620A patent/EA005380B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 NZ NZ519152A patent/NZ519152A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 CN CNB008177716A patent/CN100379725C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 PT PT00989956T patent/PT1235805E/pt unknown
- 2000-12-06 AT AT00989956T patent/ATE343564T1/de active
- 2000-12-06 ES ES00989956T patent/ES2272357T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CA CA2393084A patent/CA2393084C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 DK DK00989956T patent/DK1235805T3/da active
- 2000-12-06 BR BRPI0016265-5A patent/BR0016265B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 PL PL355630A patent/PL205061B1/pl unknown
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012310 patent/WO2001042787A2/en active IP Right Grant
- 2000-12-06 HU HU0203499A patent/HU229490B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 EP EP00989956A patent/EP1235805B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CZ CZ20021969A patent/CZ303174B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 MX MXPA02005514A patent/MXPA02005514A/es active IP Right Grant
- 2000-12-06 IL IL15000900A patent/IL150009A0/xx active IP Right Grant
- 2000-12-06 AU AU26721/01A patent/AU778677B2/en not_active Ceased
- 2000-12-06 DE DE60031570T patent/DE60031570T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 AR ARP000106458A patent/AR026735A1/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-03 IL IL150009A patent/IL150009A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-06 NO NO20022684A patent/NO331464B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-06-07 MA MA26676A patent/MA25635A1/fr unknown
- 2002-06-07 ZA ZA200204582A patent/ZA200204582B/xx unknown
-
2008
- 2008-01-11 AR ARP080100138A patent/AR064873A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU229490B1 (en) | Immunoassay for determining the concentration of a neonicotinoid insecticide | |
| CA2096495C (en) | Dual analyte immunoassay | |
| CN109734621B (zh) | 1-萘酚半抗原及其制备方法和应用 | |
| CN109061169B (zh) | 一种检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JP4841856B2 (ja) | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 | |
| JP2006282547A (ja) | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 | |
| CN109053477B (zh) | 一种仲丁灵半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| FR2637897A1 (fr) | Dosages immunologiques de l'azt, derives et conjugues et anticorps | |
| JP2732825B2 (ja) | 新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体 | |
| EP1732880B1 (en) | Assays for amphetamine and methamphetamine | |
| JP4916128B2 (ja) | フィプロニルのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 | |
| JP4289694B2 (ja) | 新規のサキシトキシン誘導体およびその製造方法 | |
| CN114317450B (zh) | 一株分泌氟苯虫酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN113307776B (zh) | 一种双特异性识别阿苯达唑和多菌灵的抗体制备和应用 | |
| JP2007204394A (ja) | テブフェノジドおよびその類似化合物に対する抗体の製造方法、抗体、ハイブリドーマ、その免疫学的測定方法および測定キット | |
| JPH08136540A (ja) | 免疫学的分析方法 | |
| KR19980026589A (ko) | 메탐페타민(methamphetamine)에 대한 특이항체 분비세포주 | |
| JP2003166991A (ja) | トリフルラリン化合物、免疫学的反応体、ハイブリドーマ及びトリフルラリンの測定方法 | |
| JPH10262663A (ja) | オキソリン酸に結合する新規な抗体及びそれを使用するオキソリン酸の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |