NO331464B1 - Antistoff for immunoanalyse for neonicotinyl-insekticider, proteinkonjugat, fremgangsmate for bestemmelse av konsentrasjon, samt et sett. - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer immunogenerfor generering av antineonikotinoid antistoffer så vel som antistoffer, fremgangsmåter, reagenser og sett for bestemmelse av tilstedeværelsen av en eller flere neonikotinoid insektisider i en prøve ved immunoanalyse. Den foreliggende oppfinnelsen kan spesielt anvendes for bestemmelse av konsentrasjonen av neonikotinoid insektisider påført til et planteforplantningsmateriale slik som frø.

Description

Denne oppfinnelsen vedrører immunoanalyser for pestisider, og til antistoffer og reagenser for utføring av slike analyser. Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåter for utføring av slike analyser og sett omfattende reagenser for å praktisere slike fremgangsmåter. Oppfinnelsen er spesielt anvendelig for deteksjon og kvantifisering av neonikotinoid insektisider i en prøve.

Insektisider

Anvendelsen av syntetiske insektisider for å kontrollere insektskadedyr i avlinger er en universal praksis. Denne praksis har gitt en høy grad av kommersiell suksess, fordi det er blitt vist at slik kontroll kan øke utbyttet av avling. Imidlertid krever effektiv anvendelse av insektisider fast styring med hensyn til bekymringer for insektresistens og utsettelse for miljø og personell. En løsning anvendt på dette problem har vært anskaffelsen av nye, mer høyeffektive insektisider for å redusere behovet for eldre faktisk toksiske insektisider og for å redusere miljøbelastningsrater.

En ny klasse av insektisider som har fått signifikant anerkjennelse på markedet er de såkalte "neonicotinoid" insektisider. Forbindelser av denne klassen omfatter for eksempel forbindelsene imidakloprid, acetamiprid, og tiametoksam som er beskrevet hhv. i US-patent nr. 4742060 og 5304566 og EP580553A2.

Fra US 5723306 A er det kjent at immunogener av pyrethrm- og pyrethroidforbindelser for fremstilling av antistoff for deteksjon av neonikotinoid insektisider påført planter. Immunogenene dannes ved å fremstille pyrethrm- og pyrethroid-haptener koblet til bærerproteiner som bovint serum albumin.

EP 580553 A2 beskriver tiametoksam-hapten-forbindelsen og anvendelse av denne som insektisid

Direkte behandling av planteforplantningsmaterialer (slik som frø) med insektisider er målrettede anvendelser som taler for behovet for en reduksjon av miljø og personell eksponering og skadedyrresistens oppbygning når anvendt alene eller sammen med blad eller plogfure insektisidapplikasjoner. Imidlertid må man være forsiktig med å sikre at frøbelegningsapparatet er passende kalibrert for å påføre insektisidet ensartet på frømaterialet for å unngå problemer med blant annet insektisidyteevne og frøfytotoksisitet. Analytiske målinger kan anvendes til å bestemme om frøbelegningsutstyret er blitt kalibrert passende, om det drives passende og om en behandlet serie av frø kan frigis for forsendelse. Imidlertid er tradisjonelle fremgangsmåter for detektering av insektisidrester på frø ekstremt tidkrevende og kostnadskrevende siden de krever høyt spesialisert og dyre analytiske fremgangsmåter slik som gass-væske eller høy-yteevne væskekromatografi. Begge kromatografiske teknikker krever dyre instrumenter som det er kostnadskrevende å opprettholde og som må drives av høyt utdannede teknikere. Frøbehandlingsfasiliteter og dyrkere har vanligvis ikke slikt utstyr eller ansatt personell så prøver av frø må sendes til analyselaboratorier annet sted. Når prøver er analysert med en hurtig gjennomløpstid av slike laboratorier kan behandlingsfasiliteten motta analysedata ca. 24 timer etter forsendelse. Mindre hurtige analyser resulterer i mer langvarige forsinkelser. Disse forsinkelser resulterer i mange timer med ledig maskintid ved belegmngsfasiliteten. Forsinkelser i forsendelse av belagte frø påbeløper også.

Det er et presserende behov innenfor teknikken å forbedre eksisterende måleteknikker for å gjøre dem mindre dyre, mer effektive og lettere å administrere. De ønskede fremgangsmåter bør også være nyttig utenfor laboratoriet under feltbetingelser slik at de hurtig og pålitelig gir en dyrker eller frøbehandlingspersonell informasjon om tilstedeværelse og konsentrasjonene av et gitt insektisid i en frøprøve. I dette henseende er det viktig at fremgangsmåtene differensierer det aktive pestisidmaterialet fra andre produkter tillatende kvantitativ bestemmelse av den ønskede aktive ingrediensen tilstede på frøet. Imidlertid forblir et antall av alvorlige begrensninger til klassiske analysemetoder. Noen av disse begrensningene ville kunne overkommes ved anvendelse av immunoanalyseteknologi.

Immunoanalyse og bestemmelse av pestisider

Mens immunonanalyser ble utviklet primært for medisinsk og veterinær anvendelse er de begynt å finne flere anvendelser innenfor landbruksområdet. For eksempel er immunoanalyse tilgjengelig for deteksjon og kvantifisering av avlssykdommer, aflatoksiner og bestemte antibiotika. Mens immunoanalyser for pestisid deteksjon er blitt beskrevet i vitenskapelig litteratur (se nedenfor), er de kun blitt tilgjengelig på en kommersiell basis innenfor de siste tiår.

Immunoanalyser bygger på høyt spesifikke antistoffreagenser og relativt enkle analytiske apparater til å detektere og/eller kvantifisere et bredt utvalg av målrettede materialer. Antistoffene snarere enn instrumentet eller driftsbeitngelsene tilveiebringer den analytiske spesifisiteten. Immunoanalyser kan derfor utføres på relativt ubearbeidede prøver. Videre er immuno analysefremgangsmåter blitt optimert for anvendelse i avsidesliggende, ikke-laboratoirebetingelser, som tillater deres anvendelse i felten, så vel som i spesialiserte laboratorier.

Immunologiske fremgangsmåter er kjent for deteksjonen av bestemte herbisider inklusiv 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (Fleeker, L, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874-878

(1986)), klorsulfuron (Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem. 33:962-965 (1985)), haloacetamider (Winzenburger, P.A. et al. (European Patent Publication EP 340198), og et flertall av pestisider inklusiv diflubenzuron (Wie, S. I. et al., J. Agric. Food Chem. 30:949-957 (1982)), metalaksyl (Newsome, W. K., J. Agric. Food Chem. 33:528-530

(1985)) ogparation (Ercegovich, C. D. et al., J. Agric. Food Chem. 29:559-563

(1981)). En fremgangsmåte er også blitt beskrevet for immunologisk deteksjon av atrazin (U.S. Pat. No. 4.530.786). Immunologiske analyser for cyanazin, diklofop-metyl, fentaklorfenol, 2,4,5-T og terbutryn er også kjent.

Alle de ovenfor nevnte immunologiske fremgangsmåtene anvender polyklonal antisera som ble oppnådd fra vertsdyr (typisk kaniner) immunisert med et passende antigen (immunogen). Flere nylige monoklonale antistoffer (mAbs) spesifikke for antrazin og dets derivater og nedbrytningsprodukter og anvendelse av slike mAbs i immunoanalyser er blitt publisert (Schlaeppi et al., European Patent Publication EP 365818 (1990)).

På grunn av deres lave molekylvekt er insektisider ikke immunogene og fremkaller ikke spesifikke antistoffer fra vertsdyr. Siden utviklingen av en insektisidimmunoanalyse krever et antall av trinn, begynnende med design av haptener, derivater av insektisider som opprettholder den strukturelle spesifisiteten til insektisidmolekylet mens det tillater konjugering til et høy molekylær vektimmunogen "bære" protein. Videre for screening av antistoffer under framstillingsprosessen kan ytterligere haptener også bli fremstilt hvis kjemiske strukturer varierer fra haptenene anvendt til å immunisere dyrene. Endelig når en antistoffremstilling er oppnådd (enten polyklonal eller monoklonal), må en tilstrekkelig sensitiv immunoanalyse utvikles.

Basisstrategier anvendt innen moderne immunoanalyser er blitt beskrevet i et flertall av referanser (se for eksempel Voller, A. et al., eds. Immunoassays for The SO ' s University Park, 1981; Voller A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Assocites Quarterly Publication, WalkersviUe, Md.; Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed). Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980). Essensielt for hver tilnærming er frembringelsen av kalibreringskurver ved å anvende kjente mengder av den ønskede analytten.

En "merket antistoff' fremgangsmåte som vanligvis anvendes refereres til som den enzym-forbundede immunosorbentanalyse (ELISA). Her fremstilles et proteinkonjugat til pestisidet (kalt et "belagt" eller "screenet antigen") ved å anvende et protein som er strukturelt ikke-relatert til bæreproteinet anvendt i pestisidimmunogenet imot hvilket anti-pestisid antistoffene ble generert. Belegningsantigenkonjugatet immobiliseres på en fast fasebærer slik som overflaten til en mikroplatebrønn, resulterende i en fast mengde av fastfasepestisid pr. reaksjon. En kjent mengde antistoff tilsettes sammen med tesrprøven. Det immobiliserte pestisidet konkurrerer med det frie pestisidet i den ukjente prøven om et begrenset antall av antistoffbindingsposisjoner. Interaksjonen mellom antistoff og analytt i flytende fase inhiberer bindingen av antistoff til fast fase pestisid. Antistoff bundet til den faste fasen detekteres med et enzym konjugert andre antistoff spesifikk for den konstante regionen til den tunge kjeden til anti-pestisid antistoffet. Mange enzymlignende andre antistoffer er kommersielt tilgjengelig for slik anvendelse. Etter at ubundet annet antistoff er vasket vekk, detekteres immobilisert annet antistoff typisk ved lilsetning av et kromogent substrat for enzymet hvilket resulterer i et farget reaksjonsprodukt dannet i direkte proporsjon til mengden av bundet annet antistoff. Mengden av reaksjonsproduktet er således omvendt proporsjonal til mengden av analytt i den ukjente prøven.

En modifikasjon av "merket antistoff' fremgangsmåten eliminerer anvendelsen av belegningsantigenet. Enzymimmunoanalyse (EIA) immobiliserer anti-pestisid antistoffet på en fast fase. Et pestisid hapten kobles kovalent til et enzym og det resulterende enzymkonjugat inkuberes med prøven i mikrobrønner eller dyrkningsrør belagt med anti-pestisid antistoff. Pestisid i prøven konkurrerer med pestisid hapten-enzymkonjugat for å binde til immobilisert antistoff. Den faste fasen vaskes for å fjerne ubundne materialer og antistoff-bundet enzymkonjugat detekteres ved tilsetning av kromogent substrat. Se for eksempel Bushway, R.J., L.P. Perkins, S.A. Savage, S.L. Lekousi og B.S. Ferguson, 1988, Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunosassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40:647-654; Fleeker, J.R. and L.W. Cook. 1991. Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water. P. 78-85 in M. Vanderlann, L.H. Stanker, B.E. Watkins, and D.W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington, D.C.: American Chemical Society.

Der er et behov innenfor landbruksområdet for en fremgangsmåte for å analysere frø behandlet med aktive ingredienser slik som insektisider som kan utføres på åkeren eller inne i et frøbehandlingsanlegg.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer neonikotinoid haptener og immunogener for generering av anti-neonikotinoid antistoffer så vel som antistoffer, fremgangsmåter, reagenser og sett for bestemmelse av tilstedeværelsen av en eller flere neonikotinoid insektisider i en prøve ved immunoanalyse. Den foreliggende oppfinnelsen har spesielt anvendelse for bestemmelse av konsentrasjonen av neonikotinoid insektisider påført på planteforplantingsmaterialer slik som frø.

Foreliggende oppfinnelse omfatter antistoff nyttig i en immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff (I) er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid hapten konjugert til et immunogent bæreprotein og (II) spesifikt binder til neonikotinoid insektisidet og hvor nevnte

antistoff er selektivt for en forbindelse av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl,

R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl ellerR<1>ogR<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin- eller en oksam"azinring, og

XerN-N02ellerN-CN.

Vider omfatter oppfinnelsen proteinkonjugat av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R<3>er hydrogen eller Ci-Gralkyl,

R<1>og R<2>er uavhengig hydrogen eller Ci-C4-alkyl ellerR<1>ogR<2>danner sammen med nitrogenatomene til hvilket de er bundet en imidazolidin- eller en oksadiazinring,

n er et heltall fra 1 til 4,

X er N-NO2 eller N-CN, og

PR er en proteinrest til et bæremolekyl valgt blant gruppen bestående av et renset proteinderivat (PPD, tuberkulin) fra Diptheria virus, bovin serum albumin, katonisert bovin serum albumin, humant serum albumin, ovalbumin og "keyhole limpet hemocyanin" eller en enzymrest valgt blant gruppen bestående av alkalisk fosfatase, pepperrotperoksidase og 6-galaktosidase.

Også fjerngangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av et neonikotinoid insektisid i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) tilveiebringe en fast fase med et immobilisert antistoff selektivt for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff er selektiv for en forbindelse av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl,

R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-Gt-alkyl ellerR<1>ogR<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin-eller en oksadiazinring, og

XerN-NCbeUerN-CN.

(b) bringe nevnte prøve i kontakt med det immobiliserte antistoffet i nærvær av en

kjent mengde av et neonikotinoid insektisid hapten-enzym konjugat; (c) vaske den faste fasen fra trinn (b) for å fjerne et hvilket som helst ubundet

hapten-enzymkonjugat eller prøve;

(d) reagere et kromogent substrat spesifikt for nevnte hapten-enzymkonjugat med

den vaskede faste fasen fira trinn (c) for å generere et kromogen, og

(e) måle mengden av kromogenet produsert ved trinn (d) for å bestemme mengden av antistoff bundet hapten-enzymkonjugat og følgelig mengden av neonikotinoid insektisid i nevnte prøve, er omfattet av oppfinnelsen.

Omfattet av oppfinnelsen er også sett nyttig for immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid, kjenntegnet ved at settet omfatter en kombinasjon av en eller flere beholdere: a) en fast fase med et immobilisert antistoff selektiv for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoffer selektivt for en forbindelse av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl,

R og R er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R og R danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin-eller en oksadiazinring, og

XerN-N02ellerN-CN.

b) et enzymkonjugat omfattende et enzym konjugert til et neonikotinoid hapten.

Omfattet er også antistoff nyttig i en immunoanalyse av en prøve for å bestemme

mengden av et neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff (I) er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid hapten konjugert til et immunogent bæreprotein og (H) spesifikt binder til neonikotinoid insektisidet og hvor nevnte

antistoff ei- selektivt for en forbindelse valgt fra nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid.

Videre omfattes fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av et neonikotinoid insektisid i en prøve, kjennetegnet ved å omfatte trinnene: (a) tilveiebringe en fast fase med et immobilisert antistoff selektivt for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoffer selektiv for en forbindelse valgt fra nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid. (b) bringe nevnte prøve i kontakt med det immobiliserte antistoffet i nærvær av en kjent mengde av et neonikotinoid insektisid hapten-enzym konjugat; (c) vaske den faste fasen fra trinn (b) for å fjerne et hvilket som helst ubundet hapten-enzymkonjugat; (d) reagere et kromogent substrat spesifikt for nevnte hapten-enzymkonjugat med den vaskede faste fasen fra trinn (c) for å generere et kromogen, og (e) måle mengden av kromogenet produsert ved trinn (d) for å bestemme mengden av antistoff bundet hapten-enzymkonjugat og følgelig mengden av neonikotinoid insektisid i nevnte prøve.

Foreliggende oppfinnelse om fatter også sett nyttig for immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid, kjennetegnet ved at settet omfatter en kombinasjon av en eller flere beholdere: a) en fast fase med et immobilisert antistoff selektiv for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoffer selektivt for en forbindelse valgt fra

nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid.

b) et enzymkonjugat omfattende et enzym konjugert til et neonikotinoid hapten.

hnmunoanalysefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir personale ved

frøbehandlingsanlegg hvor neonikotinoid insektisider påføres til frø mulighet for kvantitativt og måle mengden av påført aktiv ingrediens. Fremgangsmåten involverer en hurtig ekstraksjon av aktive ingredienser fra frøet og hurtig immunoanalysebasert måling av ekstraktoppløsningen. Disse målinger kan anvendes til å bestemme om fi:øbelegningsutstyret er blitt passende kalibrert, drevet passende og om behandlede partikler av frø kan frigis for forsendelse. Analysen er designet til å være enkel og utføre krevende kun ordinært laboratorieutstyr og reagenser. Derfor vil personalet som mangler ekspertise i å utføre immunoanalyser være i stand til suksessfult å utføre testen etter noen få praktiske forsøk.

Det har blitt funnet at antigene neonikotinoid konjugater (immunogener) kan fremstilles ved konjugering av et neonikotinoid pestisid hapten til et bæremolekyl slik som renset proteinderivat (PPD, Tuberculin) fra Diptheria virus, bovin serum albumin, human serum albumin, ovalbumin eller "keyhole limpet hemocyanin" til et neonikotinoid hapten. Konjugater av derivatiserte materialer slik som derivatisert bumin serum albumin, kationisert bovin serum albumin og lignende kan også fremstilles. Se A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce and J.G. Michael (1987) J. Immunol. 138:833-837. Disse immunogener kan deretter injiseres i vertsdyr som vil produsere antistoffer til neonikotinoid haptenet som kan høstes. Disse antistoffer kan deretter anvendes i et flertall av immunoanalysefremgangsmåter for å detektere korresponderende neonikotinoid insektisider ved å bruke forskjellige kjente markører for å markere enten insektisidet eller antistoffet. I noen utførelsesformer av immunoanalyser er enten et neonikotinoid insektisidderivat eller et antistoff immobilisert. Både polyklonale og monoklonale antistoffer kan anvendes i praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen. Antistoffene kan vises selektivt å binde til det ønskede neonikotinoid insektiside(r) selv i nærvær av andre pestisidaktive ingredienser inklusiv andre neonikotinoid insektisider inkorporert i en frøbelegningsformulering.

Deteksjonsfremgangsmåter som kan anvendes til å praktisere den foreliggende oppfinnelsen for måling av neonikotinoid insektisider i en prøve omfatter biosensorer og enzymatiske-, fluoresens-, kjemiluminessens- og radioimetiske systemer. Slike analyser kan anvende heterogene eller homogene formater og kan anvende mikrobrønnplater, dyrkningsrør og lateksperler eller partikler som faste faser.

Immunoanalysene ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes til å bestemme konsentrasjonen av neonikotinoid insektisidforbindelser slik som imidakloprid, nitenpyram, acetaminprid, tiametoksam, tiakloprid og klotiadin i en prøve stik som et planteforplantingsmateriale.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer immunoanalyser for testing av en prøve for tilstedeværelsen av neonikotinoid insektisider. I slike immunoanalyser kan neonikotinoidet (antigen)/antistoffreaksjon detekteres på et flertall av fremgangsmåter ved å anvende forskjellige markører for å markere enten antigenet eller antistoffet for å tillate deteksjon av reaksjonsproduktet. Videre vil immobilisering av enten antigen eller antistoffet fremme deteksjonen i mange tilfeller.

Antigen/antistoffanalyser kan generelt klassifiseres i to kategorier, heterogene og homogene. Heterogene analyser krever separasjon av bundet-markert komponent fra den frie-markerte komponenten før deteksjon av reaksjonsproduktet. Homogene analyser krever ikke et slikt separermgstrinn. Analysene kan videre være (1) kompetitive for eksempel hvor antigen konkurrer om markert antistoff med et fastfase antigen eller hvor antigen konkurrer med markert antigen om et fastfase antistoff eller (2) ikke-kompetitive hvor der er et direkte forhold mellom markør og antistoff eller antigen.

Immunoanalyserfemgangsmåter som kan anvendes ved praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen for å detektere neonikotinoid insektisider i en prøve omfatter enzym, fluoressens, kemiluminesens og biosensor immunoanalyse, så vel som radioirnmurioanalyse. I en enzym-bundet immunoanalyse (ELISA), i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen kan haptener korresponderende til neonikotinoid insektisidet/insektisidene av interesse markeres direkte et enzym eller indirekte ved anvendelse av enzymmarkerte antistoffer som under passende betingelser katalyserer en reaksjon med et substrat. Enzymaktiviteten detekteres typisk ved dannelsen av et farget reaksjonsprodukt dvs. et farget sluttprodukt som lett kan detekteres med øyet eller måles med spektroskopiske eller reflektansmidler.

I fluoressens immunoanalyseteknikker for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan haptener korresponderende til neonikotinoid insektisidet/insektisidene av interesse markeres direkte med fluorokromer eller indirekte med fluorokrom-markerte antistoffer. Fluorokromer er fargestoffer som absorberer stråling (for eksempel ultrafiolett lys) eksiteres av det og utsender lys (for eksempel synlig lys).

I en utførselsform av den foreliggende oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten for bestemmelse av konsentrasjonen av et neonikotinoid insektisid i en prøve trinnene: (a) tilveiebringelse av en fast fase med et immobilisert antistoff selektivt for nevnte

neonikotinoid insektisid;

(b) bringe nevnte prøve i kontakt med det immobiliserte antistoffet i nærvær av en

kjent mengde av et neonikotinoid insektisid hapten-enzym konjugat;

(c) vasking av den faste fasen fra trinn (b) for å fjerne hvilket som helst ubundne

hapten-enzymkonjugater eller prøve;

(d) reaksjon av et kromogent substrat spesifikt for nevnte hapten-enzymkonjugat

med den vaskede faste fasen fra trinn (c) for å generere et kromogen, og

(e) måling av mengden av kromogenet fremstilt ved trinn (d) for å bestemme mengden av antistoff bundet hapten-enzymkonjugat og følgelig mengden av neonikotinoid insektisid i nevnte prøve.

I en utførselsform leveres immunoanalysen i form av et sett ("kit") omfattende antistoffbelagte rør, neonikotinoid hapten-enzymkonjugat, enzymsubstrat og løsning for å teiminere produksjonen av det kolorimetriske signalet.

Mens oppfinnelsen ofte er beskrevet med referanse til anvendelsen av polyklonale antistoffer, vil fagfolk innen fagfeltet innse at monoklonale antistoffer vil kunne anvendes som et alternativt til anvendelsen av polyklonale antistoffer. Betegnelsen "antistoffer" anvendt heri refererer generelt til polyklonale eller monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer til neonikotinoid insektisider for anvendelse ved praktisering av den foreliggende oppfinnelsen fremstilles ved å anvende immunisering og hybridoma dyrkningsteknikker velkjent for fagfolk innen fagfeltet. Egnede hybridoma cellelinjer produseres fortrinnsvis ved fusjonen av en antistoffproduserende celle og en myelomacelle avledet fra en art fra musefamilien. De antistoffproduserende cellene er fortrinnsvis miltceller. En hvilken som egnet myelomacellelinje kan anvendes, det er imidlertid ønskelig å anvende en velkarakterisertcellelinje av hvilke et antall vanligvis anvendes.

Likeledes er polyklonale antistoffer til neonikotinoid insektisider for anvendelse ved praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen også fremstilt ved å anvende teknikker kjent for fagfolk innen fagfeltet.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også et polyklonalt IgG antistoffpreparat som binder minst et neonikotinoid insektisid, antistoffpreparatet fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter trinnene: (a) administrering til en vert av en forutbestemt mengde av en sammensetting omfattende et neonikotinoid insektisid eller en immunologisk ekvivalent koplet til et biologisk akseptabelt bæreprotein, (b) oppsamling av serum fra verten og (c) rensing av IgG antistoff fra serumet. En immunologisk ekvivalent til et antigen har evnen når introdusert i en vert å forårsake produksjonen av antistoffer til antigenet.

Som bemerket over har immunoanalysen ifølge den foreliggende oppfinnelsen spesielt anvendbarhet ved deteksjonen av mengden av et neonikotinoid insektisid som er blitt påført til et planteforplantningsmateriale. Betegnelsen "planteforplanmingsmateriale" forstås å angi alle de generative delene til planten slik som frø som kan anvendes for multiplikasjonen av den sistnevnte og vegetativt plantemateriale slik som fraskjæringer og knoller (for eksempel poteter). Det kan for eksempel nevnes frøene (i den strikse betydningen), røtter, frukter, løk, rizomer og deler av planter. Spirene planter og unge planter som skal transplanteres etter spiring eller etter de kommer opp av jorden kan også nevnes. Disse unge planter kan beskyttes før transplanteringen med en total eller delvis behandling ved neddypping.

I en utførselsform er neonikotinoid insektisidet som kan detekteres med analysen ifølge den foreliggende oppfinnelsen representert ved formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C^alkyl,

R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R1 ogR<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin eller en oksadiazinring,

og

X er N-N02eller N-CN.

I en annen utførsel er neonikontinoid insektisidet som kan detekteres med analysen ifølge den foreliggende oppfinnelsen representert ved formelen

hvor A, R3 og X er som definert over for formel (I).

I en foretrukket utførselsform anvender irnmunoanalysen ifølge den foreliggende oppfinnelsen polyklonale antistoffer for et neonikotinoid insektisid. Disse antistoffer kan oppnås fra sera fra et immunisert dyr. Immunosering kan oppnås ved injisering av immunogenet (hapten-PPD antigenisk konjugat) i en antistoffproduserende art, typisk et pattedyr og fortrinnsvis en kanin eller sau. Typisk etterfølges en innledende injeksjon av en serie av etterfølgende boosterinjeksjoner for å maksimere antistofrfesponsen. Optimalt er injeksjonsregimet en multippel dose gitt til New Zealandske hvite hunnkaniner. Mengden av injisert immunogen varierer, men må være passende for å fremkalle en detekterbar mengde av antistoffer. Antistoffproduksjon kan verifiseres ved analysering av sera oppnådd i forsøksblødninger ved å anvende EIA, ELISA eller indirekte fluoressens immunoanalyse analyse.

De samme markørene anvendt i kjente immunometriske analyser kan anvendes til å markere haptenen anvendt i den foreliggende oppfinnelsen. Blant disse kan det nevnes reportermolekyler (RM) inklusiv enzymer slik som alkalisk fosfatase, pepperrotoksidase og fi-galaktosidase. I tillegg kan fluoressens, luminesens og radioaktive markører slik som fluorescein, rhodamin, luminol, acridium og radioaktive isotoper<125>I, osv. eller kolloidale partikler slik som gull og selen osv. anvendes. Endelig kan lantanide gelate fluoroforer slik som europium og terbium anvendes til å generere tidsbestemte fluoressens signaler. De mest vanlige enzymatiske markørene er pepperrotperoksidase (HRP) og alkalisk fosfatase.

I en utførelsesform anvendes et spektrofotometer ved å detektere mengden av neonikotinoid i en prøve. Imidlertid kan fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilpasses av en fagperson innen fagfeltet til å anvende andre typer av kromogene detektorer. Tilsvarende er det detekterbare reaksjonsproduktet ikke begrenset til en kromofor men omfatter andre markører som beskrevet over.

Haptener av de følgende formler (TA), (IB) og (TIA) er blitt funnet å være nyttige ved fremstillingen av antigene neonikotinoid konjugater (immunogener) og analysekonjugater:

Hapten ( IA)

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl;

R<3>er hydrogen eller Ci-Q-alkyl,

R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R<1>ogR<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin eller en oksadiazinring,

n er et heltall fra 1 til 5 (fortrinnsvis et heltall fra 3 til 5); og

X er O, N-N02eller N-CN.

Hapten ( TB)

hvor A, R<1>, R<2>, R<3>og X er som definert i formel (IA); og

E er en enkelt kovalent binding eller er en forbindelsesgruppe av formelen -(CH2)m-hvor m er et heltall fra 1 til 3.

Eksempel 1: Hapten ( IDA)

hvor A, R<3>, X og n er som definert for formel (IA).

Ha pten f nm)

hvor A, R<3>og X er som definert for formel (IA) og E er som definert for formel (IB).

Haptener av formel (HIA) og (UIB) kan fremstilles analogt til den følgende metodelæren:

Det ettertraktede haptenet (HIA) eller (liiB) fremstilles ved anvendelse av et passende 2-aminoetanetiolderivat valgt blant en forbindelse av formelen:

hvor R har betydningen gitt over for formel (I).

De følgende haptenene er blitt funnet å være spesielt nyttig ved praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen:

hvor n i hvert tilfelle er heltall fra 1 til 5, fortrinnsvis er n et heltall fra 3 til 5.

Antigene neonikotinoid konjugater (immunogener) og analysekonjugater kan fremstilles ved konjugering av et neonikotinoid pestisidhapten til et bæremolekyl eller reportermolekyl alt etter tilfellet ved å anvende teknikker kjent for fagfolk innen fagfeltet. To basis tilnærminger er blitt gjort. Den første anvender forbindelsesgrupper som blir en del av konjugatet. Disse forbindelsesgrupper er homobifunksjonelle eller heterobifunksjonelle og omfatter at de er i stand til å danne for eksempel disulfidbindinger gjennom tiolgruppene til cysteingruppene i substratproteiner eller dannelsen av amidbindinger mellom N-terminal aminogruppe eller aminosidekj edene eller lysinrester og aktiverte acylgrupper slik som suksirmriidylestrer. Generelt involverer denne tilnærmingen høyt reaktive funksjonelle grupper på forbindelsesgruppen og er relativt lett tilgjengelig med hensyn til substratene for konjugering. Imidlertid er det ofte nyttig å anvende funksjonelle grupper som er mindre reaktive slik som de som er i stand til hydrazondannelse.

Den andre timærmingen, spesielt nyttig ved konjugeringen av to proteingrupper anvender et dehydreringsmiddel slik som et karbomirnid for å frembringe dannelsen av for eksempel nye peptidbindinger ved reaksjon av en karboksylgruppe i et medlem av konjugatet med en fri aminogruppe på det andre. I dette tilfellet blir reagensen ikke en del av konjugatet. Denne reaksjon er ikke spesielt lett tilgjengelig siden karboksylgruppen ikke er aktivert, karbodiimidet tilveiebringer det aktive mellomproduktet og flytter likevekten ved fjernelse av elementer av vann for å danne peptidbindingen.

Begge tilnærmelser til konjugering er generelt blitt utført i vandige løsemidler fordi proteinmaterialet som danner konjugatet lett denatureres. Proteiner er designet til å være stabile i et vandig miljø og er kjent for å denaturere selv i løsemidler slik som etanol som kan tenkes å være relativt analog med et vandig medium. Også proteinkonjugerte forbindelser har tendens til å være relativt uoppløselige i ikke-vandige løsemidler.

Haptenkonjugater av den følgende formelen er blitt funnet å være nyttig ved praktiseringen av oppfinnelsen:

hvor A, Ri, R2, R3, n og X har betydninger angitt i formel (IA) over og PR er en proteinrest: (1) et bæremolekyl slik som et renset proteinderivat (PPD, tuberkulin) fra Diptheria virus, bovin serum albumin, humant serum albumin, ovalbumin eller "keyhole limpet hemocyanin" i tilfellet med et immunogen eller (2) et reportermolekyl (RM) slik som alkalisk fosfatase, pepperrot peroksidase og B-galaktosidase.

I tillegg er haptenkonjugater av den følgende formel tilsvarende nyttige:

hvor A, Ri, R2, R3, E og X har de samme betydningene som angitt i formel (IB) over.

De følgende konjugatene er blitt funnet å være spesielt nyttig ved praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen:

hvor n i hvert tilfelle er et heltall fra 1 til 5, fortrinnsvis er n et heltall fra 3 til 5.

Det umerkede polyklonale antistoffet anvendt i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å binde det antigene neonikotinoid eller hapten-RM konjugatet i prøven som testes, kan irnmobiliseres på et hvilket som helst av de vanlig anvendte bærematerialene i immunomeriske analyser. Blant disse som kan anvendes er filterpapir, lateks eller polystyrenperler og polyetylen, polystyren, polypropylen eller andre egnede mikrobrønnplater eller testrør. Disse bærematerialer kan fremstilles av en hvilken som helst polymer av naturUg eller syntetisk opprinnelse eller av et amorft materiale slik som glass. Med fordelaktighet anvendes membraner av nitrocellulose eller nylon for de reaktive stripsene og polyvinyl, polypropylen, polystyren eller annen plast for perlene eller mikroplatene. Geler eller partikler basert på agarose, akrylamid eller lateks kan også anvendes. Ytterligere kan en hvilken som helst irnmuno-kromatografisk anordning, teststriper og lateral flow-anordning kjent innen kjent teknikk tilpasses til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Blant de egnede laterale flow-anordninger kan det for eksempel nevnes typen av lateral flow-anordning angitt i US-patent 4.366.241. Teknikkene for binding av antistoffer til slike materialer er velkj ent for fagfolk innen fagfeltet. En egnet Mlde for oppnåelse av antistoffer bundet til en bærer, er for eksempel Beacon Analytical Systems, Inc. (Portland, Maine).

For forberedelse av en frøprøve for anvendelse i analysen dispergeres representative underprøver av frø fra et neonikotinoid behandlet parti (for eksempel fra fem til 100 gram canola frø, fra ti til 200 gram dura, hvete, bomull, fSrmais eller sukkermaisfrø) i et egnet løsemiddel slik som aceton, acetonnitril, etanol, isopropanol, metanol eller blandinger av disse løsemidler med forskjellige prosenter av vann. Egnede løsemiddel-vannblandinger omfatter for eksempel fra 1 til 50% MeOH/H20 og fra 1 til 20% acetonnitril/H20. Det dispergerte frø blandes ved rotasjon og anbringes deretter i et sonisk bad i omkring 20 minutter og etterfølges av ytterligere rotasjon. Innholdet får lov å falle til ro. En kjent del av væskeekstraktet fjernes og tilsettes til kjente mengder av en løsning av for eksempel 1% acetonnitril/vann. Ekstraktet fortynnes videre for å bringe konsentrasjonen av det ekstraherte neonikotinoid inn i området til kahbreringskurven. Fortynninger på ett tusen til seksti tusen ganger er blitt funnet å være nyttig. Immunoanalysen tar omkring 35 minutter å gjennomføre. Ekstraksjonen og forberedelsen av ekstraktet fra analyse tar omkring 30 minutter. Derfor kan en frøprøve ekstraheres og analyseres i omkring 1 time og 5 minutter. I en utførelsesform kan opptil to frøprøver (med opptil fem underprøver pr. prøve) analyseres på en time.

Konsentrasjoner av neonikotinoid insektisider fra omkring ti tusen eller pr. million til en halv del på milliard kan detekteres i immunoanalysene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Imidlertid er fremgangsmåten egnet for en hvilken som helst mengde av neonikotinoid insektisid tilstede så lenge som mengden av neonikotinoid insektisid i en prøve eller et prøveekstrakt faller innenfor eller passende kan fortynnes til å falle innenfor området til kalibreringskurven.

Forberedelsen av antigenet, produksjonen av de polyklonale antistoffene og en immunoanalyse er illustrert i flere detaljer i de følgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1 — Svntesefremgangsmåte for tiametoksam hapten

1.1 2- metyl- 1 - nitroisurea

Oppløs O-metylisoureasulfat (38,5 g) i salpetersyre (120 ml)/svovelsyre (280 ml) bland ved 0°C og omrør i 2 h ved 0°C. Hell forsiktig blandingen på knust is med omrøring og fjern deretter den knuste isen ved filtrering. Oppløs de nålelignende krystallene d i etylacetat og gjør oppløsningen alkalisk ved tilsetning av kaliumkarbonat. Tørr oppløsningen over magnesiumsulfat og filtrer. Konsentrer filtratet for å oppnå et hvitt pulver (5 g).

1.2

En løsning fremstilles av 3 g metyl 4-aminobutyrathydroklorid (1.1a) og 15 ml vann. pH'en justeres til 11 ved dråpevis tilsetning av 2N NaOH mens oppløsningen kjøles på et isbad. Reaksjonskolben utstyres med en pH elektrode og termometer og den resulterende klare basiske løsningen omrøres hurtig idet 2-metyl-l-nitroisourea (2,38 g) tilsettes i små porsjoner for å opprettholde temperaturen til oppløsningen under 2°C. Når tilsetningen er fullført omrør reaksjonen i l,5h ved 0°C, bemerk at pH har stabilisert seg ved 9,6. Tilsett THF (1 ml) og omrør i ytterligere 2h, Fortynn reaksjonsblandingen med vann og hell ned i etylacetat. Deretter separeres den organiske fasen, tørr den organiske fraksjonen over magnesiumsulfat og filtrer løsningen. Konsentrer filtratet for å oppnå en klar olje. Flashkromatografer den rå oljen på silikagel eluerende med 3:1 diklormetan/acetonitril for å tilveiebringe 750 mg av det ønskede produkt som et hvitt faststoff.

1.3

Kombiner produktet fra 1.2 (1,44 g) med paraformaldehyd (422 mg), metansulfonsyre (0,023 ml) og maursyre (10 ml) og oppvarm til 55°C i 15h. Konsentrer reaksjonen i vakuum. Suspender den resulterende brune oljen i toluen og stripp oppløsningen azeotropisk til tørrhet. Oppløs den resulterende olje i 1:1:1 THF/dioksan/acetonitril og behandle den med overskudd av diazometan. Omrør denne løsningen i 30 minutter og behandle reaksjonen med eddiksyre. Konsentrer reaksjonsblandingen med olje. Rekonstituer oljen i etylacetat, vask med fortynnet natriumbikarbonatoppløsning, tørr over magnesiumsulfat og rekonsentrer til en olje. Rens denne oljen ved flashkromatografi i 3:1 diklormetan/acetonitril for å tilveiebringe 658 mg av den ønskede oksadiazinamin-smørsyreester (1.3) som en klar olje.

1.4

Oppløs produktet fra 1.3 (1,1 g) d i acetomtril (50 ml) og tilsett 3g kaliumkarbonat. Tilsett klormetylklortiazol i en porsjon og oppvarm reaksjonsblandingen til 55°C i 20h. Avkjøl reaksjonsblandingen ved romtemperatur og filtrer for å fjerne faste stoffer. Konsentrer det resulterende brune filtratet til en olje. Rens oljen ved flashkromatografi i 3:1 diklormetan/acetonitril for å tilveiebringe 894 mg av det ønskede produktet som en gul/brun olje.

1.5

Oppløs forbindelse 1.4 (372 mg) i 8-ml konsentrert HC1 og 1 ml vann og omrør i 6h ved romtemperatur. Fortynn reaksjonsblandingen med vann og gjør forsiktig blandingen basisk ved tilsetning av IN NaOH inntil en pH på 4,5 er oppnådd. Ekstraher med etylacetat og tørk den organiske fraksjonen over magnesiumsulfat. Konsentrer den tørkede organiske fraksjonen til en olje og rens ved flashkromatografi i 1:1 diklormetan/acetonitril ved å tilveiebringe det ønskede produktet 1.5 (100 mg).

Eksempler 2- 5 - Tiametaoksamheptener

Syntesemetodelæren fra eksempel 1 anvendes for å fremstille de følgende tiametoksamhaptener vist i tabell 1 ved å erstatte mellomproduktet 1.1a med en passende analog forbindelse av formel NH2(CH2)nC02R (1.1b) hvor n er et heltall fra 1 til 5 og R er H eller Ci-C4-alkyl.

Eksempler 6- 9 — Tiametoksamhaptener

Syntesemetodelæren fra eksempel 1 anvendes til å fremstille de følgende tiametoksamhaptener vist i tabell 2 ved å erstatte mellomproduktet 1.1a med en passende analog forbindelse av formelen

(1.1c) hvor E er en kovalent binding eller en forbindelsesgruppe -(CH2)m- hvor m er et heltall fra 1 til 3, R er H eller Ci-C4-alkyl. Eksempel 10 - Svntesefremgangsmåte for des- nitroimino tiametoksamhapten

Fremgangsmåte:

Tiametoksam-smørsyi-ehapten (100 mg, 0,275 mmol) og anisol (6,5 ml) ble kombinert i en lOml rundbunnet kolbe utstyrt med en magnetisk omrøringsstav og en reflukskondensor. Kolben ble anbrakt i et oljebad og oppvarmet til 165°C i 2h. Anisolen ble fjernet under redusert trykk ved 50°C i 5h. Det resulterende oljeproduktet (90,2 mg) var 93% rent ved HPLC analyse.

Spektroskopiske data for karakterisering:

HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18 5u (25 x 0,46 cm); Acetonitril: 20 mM fosforsyre (40:60); 1,0 ml/min.; T=40C; UV ved 240 mn (BW = 100 nm); Gangtid: 14 min,; Oppholdstid: 4,6 min.

TLC: (diol gel) diklonnetan/acetonitril, 2:1 Rf = 0,25.

lH NMR ( CD^ CN. 300MHz) : 8 7,43 (t, 1H); 4,78 (s, 4H), 4,75 (s, 4H), 4,48 (d, 2H), 3,29 (t, 2H), 2,27 (t, 2H), 1,73 (q, 2H).

EI/ DEP massespektrum: m/z 319 (M+).

Forbrermingsanalyse: Teoretisk: C, 41,32; H, 4,41; N, 13,14;

Funnet: C, 40,13; H, 4,43; N, 12,99.

Eksempler 11- 18 - des- nitroimin- tiaroetnkaarnhaptener

Syntesemetodelæren fra eksempel 10 ble anvendt for å fremstille de følgende des-nifroimin-tiametoksamhaptener vist i tabell 3 ved erstatning av forbindelsen oppnådd i eksempel 1 med en passende analog forbindelse fra eksempel 2-9.

Eksempler 19- 27 - Iondaklopridhaptener

Syntesemetodelæren fira eksempel 1 anvendes til å fremstille de følgende haptenene av imidakloprid vist i tabell 4 ved anvendelse av nitroguanidylderivatene oppnådd i 1.2 eller en analog dertil oppnådd ved erstatning av mellomproduktet 1.1a med en passende analog av formel 1.1b eller 1.1c som vist i eksempel 1-9.

Eksempler 28- 36 - des- ru1roirnin- imidaklopridhapteiier

Syntesemetodelæren fra eksempel 10 anvendes til å fremstille de følgende des-nita)imin-imidaklopridhaptener vist i tabell 5 ved erstatning av forbindelsen oppnådd i eksempel 1 med en passende analog forbindelse ifølge eksempel 19-27.

Eksempler 37- 45 - Klotiadinhaptener

Syntesemetodelæren fra eksempel 1 anvendes til å fremstille de følgende haptener av klotiadin vist i tabell 6 ved anvendelse av nitroguanidylderivatene oppnådd i 1.2 eller en analog derav oppnådd ved å erstatte mellomproduktet 1.1a med en passende analog av formel 1.1b eller 1.1c som vist i eksempel 2-9.

Eksempler 46- 54 — des- nitroimin- klotiadirihaptener

Syntesemetodelæren fra eksempel 10 anvendes til å fremstille de følgende des-nitroirnin-klotiadinhaptener vist i tabell 7 ved å erstatte forbindelsen oppnådd i eksempel 1 med passende analog forbindelse fra eksempel 37-45.

Eksempler 55- 63 - Tialopridhaptener

Syntesemetodelæren spesifisert for haptener av formel (HIA) og (ITIB) anvendes for å fremstille følgende haptener av klotiadin vist i tabell 8.

Eksempel 64 - Fremstillin g av tiametoksamimr<q>uno<g>en

64.1

Fremstill en løsning av renset proteinderivat (tuberculin, PPD) i 0,0 IM PBS, pH 7,4 til en konsentrasjon på 1 mg/ml. Juster pH'en av en 0,5 ml aliquot av denne løsningen til 4,5-5,0 med 0,1MHC1.

64.2

Oppløs tiametoksamhaptenen fra eksempel 1 (1 mg) i 250 ul 0,1M 2-(N-morfolin)-etansulfonsyre, pH 4,5. Kombiner hapten med PPD løsninger.

64.3

Oppløs 1 mg l-(dimetylammopropyl)-3-etyU^bodiimidh.ydroklorid (EDC) i 100 p.1 destillert deionisert vann. Tilsett umiddelbart EDC løsningen til hapten-PPD løsningen fra 3.2. Bland hapten-PPD-EDC løsningen ved rotasjon i 2 timer ved romtemperatur. Overfør reaksjonsblandingen til et dialysepose med en 1000-2000 Dalton molekylvekt cut-off. Dialyser ekstensivt mot 2 liter PBS ved 4°C med tre endringer/dag i førtiåtte timer.

Eksempel 65 - Fremstilling av imidaklopridimmunogen

Metodelæren fra eksempel 64 anvendes til å fremstille et imidaMo<p>ridirnmunogen ved å anvende haptenen fra eksempel 21. jun.

Eksempel 66 - Fremstilling av Motiadinimmunogen

Metodlæren fra eksempel 64 anvendes til å fremstille et klotiadinimmunogen ved å anvende haptenen fra eksempel 39.

Eksempel 67 - Fremstilling av tiaklopridimmunogen

Metodelæren fra eksempel 64 anvendes til å fremstille et ldotiadmimmunogen ved å anvende haptenen fra eksempel 57.

Eksempel 68 - Immuniseringsskjema og høsting av antistoffer

For den innledende immunisering oppløses immunogenet fra eksempel 64 i Freund's komplette adjuvant. Inokuler New Zealand hvite kaniner av hunnkjønn. Innjekter ca. 25 jig av immunogenet ved hver posisjon. Immuniser sauer tilsvarende bortsett fra at ca. 38 u.g av immunogenet injiseres på hvert sted.

I etterfølgende immuniseringer oppløs immunogenet i Freund's ukomplette adjuvant. La dyrene hvile i 4 uker mellom immunisering og tapp blod 10 dager etter immunisering.

Administrer boosterinjeksjoner og tapp blod fra dyrene i 10 måneder på hvilket tidspunkt de gjøres blodløse.

Polyklonale antistoffer høstes ved å anvende teknikker kjent for fagfolk innen fagfeltet.

Eksempel 69 - Fremstilling av hapten- enzymkonjugater

69.1

Tiametoksamhaptenet fra eksempel 1 (3,1 mg), N-hydroksysuksinimid (NHS) (4,0 mg), og EDC (4,6 mg) kombineres i en liten ampulle. Disse materialer tørkes under en mild strøm av nitrogen i 15 min. ved romtemperatur.

69.2

Tørr dimetylformamid (2,0 ml) tilsettes og blandingen lutbehandles i 1 minutt. Den resulterende oppløsningen inkuberes natten igjennom ved romtemperatur.

69.3

Pepperrotsperoksidase (8,5 mg) oppløses i karbonatbuffer (2,0 ml, 0,05M pH 9,6) i en liten ampull. Ampullen anbringes på isbad.

69.4

Totalt 100 ul av hapten-NHS-EDC oppløsningen fra 6.2 tilsettes langsomt over 1 h og blandingen inkuberes med omrøring i 2 h.

Reaksjonsblandingen føres over en sefadex G-25M kolonne utstyrt med PBS (0,01M, pH 7,2). Enzymkonjugatet oppsamles i de første 3,0 ml og et ekvivalent volum glyserol tilsettes, lagres ved -20°C.

Eksempel 70 - Immunoanalyse av Canola- frø behandlet med tiametoksam

En porsjon av frøekstraktet fortynnes i 1% MeOH/H20 inntil den forventede konsentrasjonen av tiametoksam er brakt innenfor området til kalibreringskurven, 0,5 til 120 deler pr. milliard.

Antistoff-belagte rør er markert og anbrakt i et rørstativ slik at det første og siste røret er standarder og de resterende standarder og prøver er blandet. Rørstativet griper om hvert rør slik at røret kan snus uten tap av rørene. En aliquot av en standard eller prøve (0,5 ml) tilsettes til alle korresponderende rør. Erjzymkonjugatløsning (0,5 ml) tilsettes alle rør. Stativet ristes forsiktig for å blande innholdet i alle rørene. Rørene inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur. Stativet vendes på hodet for å dekantere innholdet i alle rørene. Destillert H20 tilsettes til alle rørene til overflytning ved å anvende en "flip-top"-vaskeflaske og vaskevæsken dekanteres. Rørene vaskes ytterligere tre ganger. Etter den endelige vaskingen stativet og rørene bankes forsiktig på et rent papirhåndklede for å fjerne overskuddsvaskevæske. Enzymsubstrat (0,5 ml) tilsettes til alle rør som inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. Stativet ristes forsiktig hver 2,5 minutt under denne inkubasjonen. Sur stoppløsning (1 M HC1, 0,5 ml) tilsettes til alle rørene for og terminere signalgenereringen. Som vist i tabell 10 måles absorbansen for reaksjonsproduktet ved 450 nm. Absorbansene for standardene anvendes ved å konstruere en kalibreringskurve, en regresjonsfunksjon på formen av Y = m Ln(X) + B. Absorbansen av hver prøve innsettes i funksjonen for å bestemme konsentrasjonen av neonikotinoid pestisidet i den fortynnede prøven. Den resulterende konsentrasjonen multipliseres med fortynningsfaktoren for å beregne mengden av neonikotinoidpeptisid i originalprøven.

Funksjonen beskrivende responsen av tiametoksam standard genererende ved regresjonsanalyse. Dette datasett produserer en standardkurve på Y = -.191 Ln(X) + 1,23, r = -.999 i hvilken Y = den analytiske responsen og X = konsentrasjonen av tiametoksamstandardene.

Eksempel 71 - Kryssreaktivitetstest for avlingsfrø behandlet med tiametoksam 71.1 Ekstraksjon av frø

Prøver av behandlet frø deles opp i underprøver ved tilfeldig tilsetning av 50 g bomull, formais, dura, sukkermais og hvete eller 40 g canola til en 237 ml krukke med bred åpning. Canola underoppdeles fire ganger, fem underprøver av de andre frøtypene anvendes. Løsemiddel (150 ml) tilsettes og lokket forsegles tett. Bomull ekstraheres i 5% acetonitril/vann mens andre frø anvender et løsemiddelsystem av 20% metanol/vann. Krukken ristes kraftig for hånd i 30 sekunder og anbringes i et sonisk vannbad ved romtemperatur i 20 minutter. Prøven ristes en andre gang som tidligere beskrevet. Innholdene av hver krukke for lov til å roe seg i ca. 5 minutter og en aliquot (0,10 ml) fjernes for analyse. Aliquoten fortynnes ned i 1% metanol/vann for å bringe restene inn i området for standardkurven.

71.2 rmmunoanalvseanalvse

De antistoffbelagte polystyrendyrkningsrørene merkes og anbringes i et rørstativ slik at det første og siste røret er standarder og de resterende standarder og prøver er blandet. Prøve- og standardoppløsninger (0,50 ml) tilsettes til de korresponderende rørene. Et lignende volum av enzymkonjugatoppløsning tilsettes. Stativet ristes forsiktig for å blande løsningene og settes til inkubering i 20 minutter ved romtemperatur. Innholdet av alle rørene fjernes ved å snu stativet på hodet over en rustfri stålpanne. Hvert rør vaskes til overflytning med destillert vann. Stativet vendes om over vasken for å bli kvitt vaskevannet. Vaskingen gjentas fire ganger. Deretter vendes stativet om og slås forsiktig på et papirhandkle for å fjerne mest mulig av resterende vaskevann. (Noe væske resterende i rørene påvirker ikke analyseresultater). Enzymsubstratløsning (0,50 ml) tilsettes til rørene som inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. Stativet ristes forsiktig i 2,5 min. intervaller for å sikre at enzymet opprettholder en tilstrekkelig tilførsel av substrat. Genereringen av det blå fargede signalet termineres ved tilsetning av sur stoppløsning (0,50 ml). Absorbansen av løsningen i hvert rør måles spektrofotometrisk ved 450 nm. Konsentrasjonen av analytten i prøvene bestemmes ut fra en regresjonsfunksjon på form av y = m fri(x) + b.

71.3 Kryssreaktivitetsbestemmelse

Kryssreaktiviteten eller spesifisiteten til immunoanalysen evalueres for å bestemme om andre testsubstanser funnet i frøbelegninger vil interferere med måling av tiametoksam. Testsubstanser er oppløst i 1 % metanol/vann til konsentrasjoner varierende fra 1000 til 0,01 ng/ml. Aliquoter av hver konsentrasjon analyseres som beskrevet over. Reaktiviteten til hver testsubstans over dette området bestemmes som tidligere beskrevet i Brady, J.F.; Turner, J.; Skinner, D.H. "Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water samples". J. Agric. Food Chem. 1995,43:2542-2547.

71.4 RESULTATER

Blant testsubstansene som ble analysert ble kun tiametoksam funnet å være signifikant reaktiv med immunoanalysen (Tabell 9 nedenfor). Derfor er denne immunoanalyse spesifikk for tiametoksam.

Underprøver av behandlede partier av frø ble analysert ved immunoanalyse og ved HPLC. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 11. Tabell 11 avbilder korrelasjon av gjennomsnitt immunoanalyseresultater ved å anvende et polyklonalt antistoff og en HPLC analyse for førti frøprøver for tiametoksam. Den best tilpassede regresjonslinje indikerer at lignende resultater ble oppnådd ved hver metode.

Claims (30)

1. Antistoff nyttig i en immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff (I) er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid hapten konjugert til et irnmunogent bæreprotein og (II) spesifikt binder til neonikotinoid insektisidet og hvor nevnte antistoff er selektivt for en forbindelse av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl; R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl, R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R<1>og R<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin- eller en oksadiazinrhig, og XerN-N02ellerN-CN.

2. Antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte antistoff er selektiv for en forbindelse valgt blant gruppen bestående av imidakloprid, tiametoksam, og klotiadin.

3. Forbindelse av formel

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl; R er hydrogen eller Q-C^alkyl, R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl ellerR<1>og R<2>danner sammen med nitrogenatomene til hvilket de er bundet en imidazolidin- eller en oksadiazinring, n er et heltall fra 1 til 4, og XerN-N02ellerN-CN.

4. Forbindelse ifølge krav 3 av formel

5. Forbindelse ifølge krav 4 av formel

6. Forbindelse ifølge krav 3 av formel

7. Forbindelse ifølge krav 6 av formel

8. Proteinkonjugat av formelen hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl; R er hydrogen eller Ci-C4-alkyl, R<1>og R<2>er uavhengig hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R1 og R<2>danner sammen med nitrogenatomene til hvilket de er bundet en imidazolidin- eller en oksadiazinring, n er et heltall fra 1 til 4, X er N-N02eller N-CN, og PR er en proteinrest til et bæremolekyl valgt blant gruppen bestående av et renset proteinderivat (PPD, tuberkulin) fra Diptheria virus, bovin serum albumin, katonisert bovin serum albumin, humant serum albumin, ovalburnin og "keyhole limpet hemocyanin" eller en enzymrest valgt blant gruppen bestående av alkalisk fosfatase, pepperrotperoksidase og B-galaktosidase.

9. Proteinkonjugat ifølge krav 8 av formelen

10. Proteinkonjugat ifølge krav 8 av formelen

11. Fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av et neonikotinoid insektisid i en prøve,karakterisert vedå omfatte trinnene: (f) tilvdebringe en fast fase med et immobilisert antistoff selektivt for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff er selektiv for en forbindelse av formelen

hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl; R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl, R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R<1>og R<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin-eller en oksadiazinring, og XerN-N02eUerN-CN. (g) bringe nevnte prøve i kontakt med det immobiliserte antistoffet i nærvær av en kjent mengde av et neonikotinoid insektisid hapten-enzym konjugat; (h) vaske den faste fasen fra trinn (b) for å fjerne et hvilket som helst ubundet hapten-enzymkonjugat eller prøve; (i) reagere et kromogent substrat spesifikt for nevnte hapten-enzymkonjugat med den vaskede faste fasen fra trinn (c) for å generere et kromogen, og (j) måle mengden av kromogenet produsert ved trinn (d) for å bestemme mengden av antistoff bundet hapten-enzymkonjugat og følgelig mengden av neonikotinoid insektisid i nevnte prøve.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat nevnte prøve oppnås ved ekstrahering av et planteforedlingsmateriale i et egnet løsemiddel.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat nevnte planteforplantningsmateriale er et frø.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat nevnte frø er valgt blant gruppen bestående av canola, dura, hvete, bomull, fSrmais eller sukkermais.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat nevnte antistoffer polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid insektisid konjugert til et immunogent bæreprotein.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte immunogene bæreprotein er et bæremolekyl valgt blant gruppen bestående av et renset proteinderivat (PPD, tuberculin) fra Diptheria virus, bovint serum albumin, kationisert bovint serum albumin, humant serum albumin, ovalbumin og "key hole limpet hemocyanin".

17. Sett nyttig for immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid,karakterisert vedat settet omfatter en kombinasjon av en eller flere beholdere: c) en fast fase med et immobilisert antistoff selektiv for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoffer selektivt for en forbindelse av formelen hvor A er 2-kloropyrid-5-yl eller 2-klorotiazol-5-yl; R og R<3>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-Gj-alkyl, R<1>og R<2>er uavhengig av hverandre hydrogen eller Ci-C4-alkyl eller R<1>og R<2>danner sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet en imidazolidin-eller en oksadiazinring, og XerN-NC-2 eller N-CN. d) et enzymkonjugat omfattende et enzym konjugert til et neonikotinoid hapten.

18. Sett ifølge krav 17,karakterisert vedat antistoffet er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid konjugert bundet til et immunogent bæreprotein.

19. Sett ifølge krav 17,karakterisert vedat enzymet er pepperrotperoksidase.

20. Sett ifølge krav 17,karakterisert vedat antistoffet spesifikt bindes til et neonikotinoid insektisid valgt blant gruppen bestående av imidakloprid, nitenpyram, acetamidprid, tiametoksam, tiakloprid og Hotiadrn.

21. Antistoff nyttig i en immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff (I) er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid hapten konjugert til et immunogent bæreprotein og (II) spesifikt binder til neonikotinoid insektisidet og hvor nevnte antistoff er selektivt for en forbindelse valgt fra nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid.

22. Fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av et neonikotinoid insektisid i en prøve,karakterisert vedå omfatte trinnene: (f) tilveiebringe en fast fase med et immobilisert antistoff selektivt for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoff er selektiv for en forbindelse valgt fra nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid. (g) bringe nevnte prøve i kontakt med det immobiliserte antistoffet i nærvær av en kjent mengde av et neonikotinoid insektisid hapten-enzym konjugat; (h) vaske den faste fasen fra trinn (b) for å fjerne et hvilket som helst ubundet hapten-enzymkonjugat; (i) reagere et kromogent substrat spesifikt for nevnte hapten-enzymkonjugat med den vaskede faste fasen fra trinn (c) for å generere et kromogen, og (j) måle mengden av kromogenet produsert ved trinn (d) for å bestemme mengden av antistoff bundet hapten-enzymkonjugat og følgelig mengden av neonikotinoid insektisid i nevnte prøve.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte prøve oppnås ved eksfrahering av et planteforedlingsmateriale i et egnet løsemiddel.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat nevnte planteforplantningsmateriale er et frø.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat nevnte frø er valgt blant gruppen bestående av canola, dura, hvete, bomull formais eller sukkermais.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte antistoffer polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid insektisid konjugert til et immunogent bæreprotein.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat nevnte immunogene bæreprotein er et bæremolekyl valgt blant gruppen bestående av et renset proteinderivat (PPD, tuberculin) fra Diptheria virus, bovint serum albumin, kationisert bovint serum albumin, humant serum albumin, ovalbumin og "key hole limpet hemocyanin".

28. Sett nyttig for immunoanalyse av en prøve for å bestemme mengden av et neonikotinoid insektisid,karakterisert vedat settet omfatter en kombinasjon av en eller flere beholdere: c) en fast fase med et immobilisert antistoff selektiv for nevnte neonikotinoid insektisid, hvor nevnte antistoffer selektivt for en forbindelse valgt fra nitenpyram, acetamiprid og tiakloprid. d) et enzymkonjugat omfattende et enzym konjugert til et neonikotinoid hapten.

29. Sett ifølge krav 28,karakterisert vedat antistoffet er et polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av et dyr med et neonikotinoid konjugert bundet til et immunogent bæreprotein.

30. Sett ifølge krav 28,karakterisert vedat enzymet er pepperrotperoksidase.