CZ303174B6

CZ303174B6 - Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy

Info

Publication number: CZ303174B6
Application number: CZ20021969A
Authority: CZ
Inventors: Francis Brady@James; Philip Simmons@Dana; Edward Wilson@Timothy
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2012-05-16
Also published as: CZ20021969A3; MA25635A1; KR20020065554A; ATE343564T1; IL150009A; PL205061B1; DE60031570T2; PT1235805E; NZ519152A; AU778677B2; CA2393084A1; ZA200204582B; US7148029B2; MXPA02005514A; WO2001042787A2; NO20022684D0; EA200200620A1; ES2272357T3; PL355630A1; KR100752536B1

Abstract

Protilátky použitelné v imunologickém testu pro stanovení množství neonikotinoidního insekticidu, jakož i protilátek, zpusobu, reagencií a souprav pro stanovení prítomnosti jednoho nebo více neonikotinoidních insekticidu ve vzorcích imunologickým testem. Rešení je zejména užitecné pro stanovení koncentrace neonikotinoidních insekticidu aplikovaných na materiály pro množení rostlin, jako jsou semena.

Description

Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy

Oblast techniky

Vynález se týká imunologických testů pro pesticidy a protilátky a reakčních činidel používaných pro provádění těchto testů. Vynález se dále týká metod provádění těchto testů a souprav obsahujících reakční činidla pro provádění těchto metod. Vynález je zejména použitelný pro detekci a kvantitativní stanovení neonikotinoidních insekticidů ve vzorku.

Dosavadní stav techniky

Insekticidy

Používání syntetických insekticidů pro kontrolu hmyzích škůdců v plodinách patří k obecné praxi. Tato praxe dosáhla vysokého stupně komerčního úspěchu, protože bylo možno prokázat, že tato kontrola může zvýšit výtěžek plodin. Avšak efektivní používání insekticidů vyžaduje solidní management z hlediska rezistence hmyzu, ekologie a rizika kterému jsou pracovníci vystavováni. Jedním z řešení tohoto problému je příprava nových insekticidů tak, aby se snížila potřeba starších akutně toxických insekticidů a snížilo se ekologické zatížení vysokými dávkami.

Jednou novou skupinou insekticidů, která získává signifikantní uznání na trhu jsou tak zvané „neonikotinoidní“ insekticidy. Sloučeniny této skupiny zahrnují například sloučeniny imidakloprid, acetamiprid, a thiamethoxam, které jsou popsány v patentech US 4 742 060 a US 5 304 566 a EP 580 553 A2, respektive.

Přímé ošetřování rostlinných materiálů pro množení (jako jsou semena) insekticidy jsou cílem aplikací, které ukazují potřebu pro snižování ekologické zátěže, vystavování pracovníků riziku a vytváření rezistence ať již při aplikaci samotné nebo ve spojení s insekticidními aplikacemi na list nebo do brázdy. Je však nutný dohled, aby zařízení pro povlékání semen bylo dobře kalibrováno tak, aby insekticid byl stejnoměrně aplikován a zabránilo se tak problémům mezi jiným s insekticidním účinkem a fytotoxicitou semen. Analytické metody se používají pro stanovení zda je zařízení pro povlékání semen správně kalibrováno a správně pracuje a zda jednotlivé dávky semen se mohou uvolnit pro odeslání. Tradiční metody pro detekci insekticidních reziduí jsou extrémně časově náročné a nákladné, protože vyžadují vysoce specializované a nákladné analytické metody, jsou jako plynová chromatografie nebo kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností. Obě chromatografické techniky vyžadují nákladné přístrojové vybavení, které je drahé pro udržování a které musí být obsluhováno kvalifikovanými techniky. Za řízení pro ošetřování semen a pěstitelé obvykle takovéto přístrojové vybavení nebo technický personál nemají a tak se semena musí posílat mimo do analytických laboratoří. Jestliže se vzorky analyzují v laboratořích s rychlým obratem, pak zpracovatelské zařízení může dostat analytické výsledky přibližně dvacet čtyři hodin po zaslání. Méně rychlé laboratoře pak poskytují výsledky s větším odstupem. Tyto odklady mají za následek mnohahodinové odstávky strojového vybavení zařízení pro povlékání. Odklady způsobené posíláním povlečených semen jsou také nezanedbatelné.

V dosavadním stavu techniky existuje potřeba pro zlepšení existující měřicí techniky tak, aby byla méně nákladná, účinnější a snadněji zvládnutelná. Tyto požadované metody by měly být také použitelné mimo laboratoř za polních podmínek tak, aby poskytly pěstiteli nebo pracovníkům provádějícím ošetřování semen rychlou a spolehlivou informaci o přítomnosti a koncentraci použitých insekticidů ve vzorku semen. Z tohoto důvodu je důležité, aby metody odlišovaly aktivní pesticidní materiál od ostatních produktů a dovolovaly tak kvantitativní stanovení žádoucí aktivní složky přítomné v semenech. Existuje však stále řada vážných omezení v klasických analytických metodách. Některá tato omezení by bylo možno odstranit použitím technologie imunologických testů.

-1 CZ 303174 B6

Imunologické testy a detekce pesticidů

Zatímco imunologické testy byly primárně vyvinuty pro lékařské a veterinární použití, mají imunologické testy čím dál více použití v oblasti zemědělství. Například imunologické testy se používají pro detekci a kvantifikaci onemocnění plodin, aflatoxinů a některých antibiotik. Přestože imunologické testy jsou popsány ve vědecké literatuře (viz níže), jsou dostupné na komerční bázi pouze v poslední dekádě.

Imunologické testy se opírají o vysoce specifické protilátky a relativně jednoduché analytické aparatury pro detekci a kvantifikaci širokého rozsahu cílových materiálů. Protilátky, spíše než přístroj nebo podmínky provedení poskytují analytickou specificitu. Imunologické testy se proto mohou provádět na relativně surových vzorcích. Dále byly imunologické testy optimalizovány pro použití ve vzdálených ne-laboratomích podmínkách, které umožňují jejich použití v polních podmínkách, stejně jako ve specializovaných laboratořích.

Imunologické metody jsou známé pro detekci některých herbicidů, včetně 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70: 874-878 (1986)), chlorsulfuronu (Kelley, M. aj., J. Agric. Food Chem. 33: 962-965 (1985)), haloacetamidů (Winzenburger, P. A. a j. (Evropská patentní publikace EP 340 198, 1989), a řady jiných pesticidů, včetně difluobenzuronu (Wie, S. I. aj., J. Agric. Food Chem. 30: 949-957 (1982)), metalaxylu (Newsome, W. H„ J. Agric. Food Chem. 33: 528-530 (1985)) a parathionu (Ercegovich, C. D. aj., J. Agric. Food Chem. 29: 559-563 (1981)). Byla popsána také metoda pro imunologickou detekci atrazinu (patent US 4 530 786). Jsou také známé imunologické testy pro cyanazin, diclofop-methyl, phentachlorfenol, 2,4,5-T a terbutryn.

Veškeré tyto výše uvedené imunologické metody využívají polyklonálního antiséra, které bylo získáno z hostitelských zvířat (typicky králíků imunizovaných příslušným antigenem (imunogenem). Nedávno byly objeveny monoklonální protilátky (mAbs) specifické pro atrazin ajeho deriváty a produkty jeho štěpení a použití těchto mAbs v imunologických testech je nárokováno (Schaeppi ea j., Evropská patentní publikace EP 365 818 (1990)).

Vzhledem k jejich nízké molekulární hmotnosti, nejsou insekticidy imunogenní a nevyvolávají specifické protilátky z těla zvířecího hostitele. Proto vývoj insekticidního imunologického testu vyžaduje řadu stupňů počínaje vytvoření heptenů, to je derivátů insekticidů, které si udržují strukturální specificitu insekticidní molekuly a které současně umožňují připojení na výšemolekulární imunogenní proteinový „nosič“. Dále pro sledování protilátek během postupu jejich produkce se mohou také připravit další hapteny, jejichž chemické struktury mohou být odlišné od haptenů používaných pro imunizaci zvířat. Konečně, jakmile se získá preparát protilátky (buď polyklonální nebo monoklonální), musí se vyvinout dostatečně citlivý imunologický test.

Základní strategie používané v moderních imunologických testech jsou popsány v řadě odkazů (viz například Voliér, A. a j., eds., Immunoassays For The 80's, University Park, 1981; Voliér, A., The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)“, Diagnostic Horizons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voliér, A. a j., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme lmmunoassay, CRC Press, Boča Raton, Fla., 1980). Základem každého postupu je vytvoření kalibrační křivky použitím známých množství požadovaného analytu.

Metoda „značené protilátky“ se v běžném použití označuje jako imunosorbční test vázaného enzymu (ELISA). Při něm se proteinový konjugát pesticidu (nazývaný jako „coating“ nebo „screening antigen“) se připraví použitím proteinu, který je strukturně nesouvisející s proteinovým nosičem používaným u pesticidního imunogenu, proti kterému se antipesticidní protilátka má vyvinout. Povlak konjugátu protilátky se imobilizuje na pevné fázi nosiče, jako je povrch jamky mikrodesky, což vede kneměnému množství pevné fáze pesticidu na reakci. Přidá se

-2CZ 303174 B6 známé množství protilátky spolu s testovaným vzorkem. Imobilizovaný pesticid konkuruje s volným pesticidem v neznámém vzorku o omezené množství vazebných míst protilátky. Interakce mezi protilátkou a analytem v kapalné fázi inhibuje vazbu protilátky k pesticidu v pevné fázi. Protilátka vázaná na pevnou fázi se detekuje enzymem s konjugovanou sekundární proti5 látkou specifickou pro konstantní oblast anti pesticidních protilátek s řetězcem o velké hmotnosti. Mnohé sekundární protilátky spojené s enzymem jsou komerčně dostupné pro toto použití. Po vymytí nevázané sekundární protilátky se imobilizovaná sekundární protilátka detekuje typicky přidáním chromogenního substrátu pro enzym, což vede k barevné reakci produktu vzniklého v přímé proporci k množství vázané sekundární protilátky. Množství reakčního produktu je tak io nepřímo úměrné k množství analytu v neznámém vzorku.

Modifikace metody „značené protilátky“ eliminuje použití povlečené protilátky. Enzymový imunologický test (EIA) imobilizuje anti-pesticidní protilátku na pevné fázi. Pesticidní hapten se kovalentně váže na enzym, a vzniklý enzymový konjugát se inkubuje se vzorkem v jamkách mikrodesky nebo v kultivačních zkumavkách potažených anti-pesticidní protilátkou. Pesticid ve vzorku konkuruje s pesticidním konjugátem hapten-enzym o vazbu na imobilizovanou protilátku. Pevná fáze se promývá, aby se odstranila nevázaná látka a protilátka vázaná na enzymový konjugát se detekuje přidáním chromogenního substrátu. Viz například, Bushway, R. J., L. P. Perkins, S. A. Savage, S. L. Lekousi, a B. S. Ferguson. 1988. Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40: 647-654; Fleeker, J. R. a L. W. Cook. 1991. Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water. str. 78-85 v M. Vanderlann, L. H. Stanker, B. E. Watkins, a D. W. Roberts., eds. Immunoassay for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington, D. C.: American Chemical Society. Stále však existuje potřeba v oblasti zemědělských metod pro analýzu semen ošetřovaných aktivními látkami, jako jsou insekticidy, které by bylo možno provádět v polních podmínkách nebo v zařízeních, ve kterých se toto ošetření semen provádí.

Podstata vynálezu

Vynález se týká neonikotinoidních haptenů a imunogenů pro vytváření antineonikotinoidních protilátek, jakož i protilátek, metod, reakčních činidel a souprav pro stanovování přítomnosti jednoho nebo více neonikotinoidních insekticidů ve vzorku imunologickým testem. Vynález má zejména použití při stanovování koncentrace neonikotinoidních insekticidů aplikovaných na materiály pro rozmnožování rostlin, jako jsou semena.

Metoda imunologického testu podle vynálezu umožňuje zaměstnancům v zařízeních pro ošetřování semen, ve kterých se neonikotinoidní insekticidy aplikují na semena, aby mohli kvantitativně měřit množství aplikované aktivní složky. Metoda zahrnuje rychlou extrakci aktivní složky ze semen a rychlé měření extrahovaného roztoku imunologickým testem. Tato měření se mohou použít pro stanovování zda zařízení pro pov lekání je dobře kalibrováno, dobře funguje a zda ošetřená násada semen se může uvolnit pro expedici. Test je označen jako jednoduchý pro provádění vyžadující pouze běžné laboratorní přístroje a reagencie. Proto osoby, které mají zkušenosti s prováděním imunologických testů, jsou schopné úspěšně provádět testy po několika praktických pokusech.

Bylo nalezeno, že antigenní neonikotinoidní konjugáty (imunogeny) se mohou připravit konjugací neonikotinoidního pesticidního haptenu s molekulou nosiče, jako je vyčištěný proteinový derivát (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z lidského séra, albumin nebo hemocyanin z mořského plže (keyhole limpet hemocyamin), na neonikotinoidní hapten. Mohou se také připravit konjugáty s derivatizovanými materiály, jako je derivatizovaný albumin z hovězího séra, kationizovaný albumin z hovězího séra a podobně. Viz A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce a J. G. Michael (1987) J. Immunol. 138: 833-837. Tyto imunogeny se mohou injikovat do hostitelských zvířat, které pak vytváření protilátky na neonikotinoidní hap55 ten, který je možno sklidit. Tyto protilátky se mohou pak použít v řadě imunologických testů pro

-3CZ 303174 B6 detekci odpovídajících neonikotinoidních insekticidů, použitím různých známých značení pro označení buď insekticidu nebo protilátky. V některých provedeních imunologických testů se buď neonikotinoidní insekticidní derivát nebo protilátka imobilizuje. Jak polyklonální a monoklonální protilátky se mohou použít pri praktickém provedení podle tohoto vynálezu. Protilátky mohou vykazovat selektivní vazbu na požadovaný neonikotinoidní insekticid (insekticidy) i v přítomnosti jiných pesticidně aktivních složek, včetně neonikotinoidních insekticidů inkorporovaných do formulace pro povlékání semen.

Detekční metody se v praxi podle tohoto vynálezu mohou aplikovat pro měření neonikotinoidních insekticidů ve vzorcích, včetně v biosenzorech a enzymatických, fluorescenčních a radiometrických systémech. Tyto testy mohou používat heterogenní nebo homogenní úpravu a mohou používat mikrojamkové desky, kultivační zkumavky a latexové kapky nebo částečky pevných fází.

Imunologické testy podle tohoto vynálezu se používají pro stanovení koncentrací neonikotinoidních insekticidních sloučenin, jako jsou imidacloprid, nitenpyram, acetamiprid, thiamethoxam, thiacloprid a clothianidin ve vzorcích, jako jsou materiály pro množení rostlin.

Tento vynález poskytuje imunologické testy pro testování vzorků na přítomnost neonikotinoidních insekticidů. V takovémto imunologickém testu se neonikotinoidní reakce (antigen)/protilátka může detekovat různými metodami, použitím různých značkovačů pro označení buď antigenu nebo protilátky, které umožňují detekci reakčního produktu. Dále i mobil izace buď antigenů nebo protilátky v mnoha případech usnadňuje detekci.

Testy antigen/protilátka se mohou obecně klasifikovat do dvou kategorií, heterogenní a homogenní. Heterogenní testy vyžadují separaci vázané označené složky před detekcí reakčního produktu. Homogenní testy nevyžadují tento separační stupeň. Testy mohou být dále (1) kompetitivní, například, kdy antigen konkuruje s označeným antigenem o protilátku na pevném nosiči nebo (2) někom pěti ti vní, kde je přímý vztah mezi protilátkou a antigenem.

Metody imunologických testů, které se mohou použít v praxi podle tohoto vynálezu pro stanovení neonikotinoidních insekticidů ve vzorku, zahrnují enzymatický, fluorescenční, chem i luminiscenční a biosensorový imunologický test, jakož i radioimunologický test. V enzymatických imunologických testech (ELISA), se podle tohoto vynálezu zainteresované hapteny neon i kot inoidního insekticidu (insekticidů) mohou značit přímo enzymem nebo nepřímo použitím enzymem značených protilátek, které za vhodných reakčních podmínek katalyzují reakci se substrátem. Enzymová aktivita se běžně detekuje tvorbou barevného reakčního produktu, například, koncového bodu, který může být snadno detekovaný očima nebo měřitelný spektroskopicky nebo refraktometricky.

Při použití fluorescenčních imunologických technik podle tohoto vynálezu se hapteny odpovídající zainteresovanému neonikotinoidnímu insekticidu (insekticidům) mohou značit přímo fluorochromem nebo nepřímo fluorochromem značenými protilátkami. Fluorochromy jsou barviva, která absorbují záření (například ultrafialové světlo) a jsou jím excitovány a emitují světlo (například viditelné světlo).

Při jednom konkrétním provedení podle tohoto vynálezu metoda pro stanovení neonikotinoidního insekticidu ve vzorku zahrnuje stupně:

(a) opatření pevné fáze s imobilizovanou protilátkou selektivní pro tento neonikotinoidní insekticid;

(b) uvedení vzorku ve styk s imobilizovanou protilátkou v přítomnosti známého množství konjugátu neonikotinoidního insekticidu s hapten-enzymem;

-4CZ 303174 B6 (c) promytí pevné fáze ze stupně (b) tak, aby se odstranil jakýkoli nevázaný konjugát nebo vzorek, (d) reakci chromogenního substrátu specifického pro uvedený konjugát hapten-enzym s promytou pevnou fází ze stupně (c) tak, aby se generoval chromogen; a (e) změření množství chromogenu vzniklého ve stupni (d) tak, aby se stanovilo množství protilátky vázané na konjugát hapten-enzym a tak množství neonikotinoidního insekticidu v uvedeném vzorku.

Podle jednoho konkrétního provedení se imunologický test dodává ve formě soupravy zahrnující protilátkou povlečených zkumavek, nikotinoidní hapten—enzymový konjugát, enzymový substrát a roztok pro ukončení produkce kolorimetrického signálu.

Zatímco vynález je často popsán s odkazem na použití polyklonálních protilátek, je odborníkům v oboru známo, že se také mohou použít monoklonální protilátky jako alternativa pro poly15 klonální protilátky. Výraz „protilátky“ jak je zde použit se týká jak polyklonálních tak monoklonálních protilátek.

Monoklonální protilátky neonikotinoidnich insekticidů se při praktickém použití podle tohoto vynálezu připraví použitím imunizace a hybridomových kultivačních technik, dobře známých odborníkům v oboru. Vhodné buněčné linie hybridom se s výhodou připravují fúzí buněk produkujících protilátku a buněk myelomu myších druhů. Buňky produkující protilátky jsou především buňky sleziny. Jakékoli vhodné buněčné linie myelomu se mohou použít, avšak je žádoucí, aby se použily dobře charakterizované buněčné linie, z nichž řada se běžně používá.

Stejně tak polyklonální protilátky se mohou také v praxi podle tohoto vynálezu použít pro neon ikotinoidní insekticidy technikami známými odborníkům v oboru.

Tento vynález se také týká přípravy polyklonálních IgG protilátek, které váží alespoň jeden neonikotinoidní insekticid, protilátka se připravuje metodou, která zahrnuje: (a) aplikaci hostiteli předem stanoveného množství směsi obsahující neonikotinotdní insekticid nebo imunologický ekvivalent vázaný na biologicky přijatelný proteinový nosič, (b) odebrání séra z hostitele a (c) čištění IgG protilátky ze séra. Imunologický ekvivalent antigenu má schopnost, jestliže se zavede do hostitele, způsobit tvorbu protilátek na antigen.

Jak bylo uvedeno výše, imunologický test podle tohoto vynálezu je zejména aplikovatelný při detekci množství neonikotinoidního insekticidu, který byl aplikován na materiál pro množení rostlin. Pod pojmem „materiál pro množení rostlin“ se rozumí veškeré generativní části rostlin, které se mohou použít, jako jsou semena, která se mohou použít pro jejich násobení a vegetativní rostlinné materiály, jako jsou řízky a hlízy, například brambory. Je možno uvést například seme40 na (ve striktním slova smyslu), kořeny, plody, hlízy, oddenky a části rostlin. Je možno také uvést klíčící rostliny a mladé rostliny, které se mohou přesazovat po vyklíčení nebo po vynoření z půdy. Tyto mladé rostliny se mohou chránit před přesazením úplným nebo částečným ošetřením ponořením.

Podle jedné konkrétní formy je neon i kotinoidní insekticid, kteiý se detekuje testem podle vynálezu reprezentován obecným vzorcem

Ff R¹

I I

N

X

-5CZ 303174 B6 ve kterém

A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5-ylová skupina,

R a R³ jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,

R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R* a R² dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny tvoří imidazolidinový nebo oxadiazinový kruh, a

X je skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN.

Podle jiné konkrétní formy je neonikotinoidní insekticid detekovatelný testem podle vynálezu reprezentován obecným vzorcem III

ve kterém

A, R³ a X mají význam uvedený ve vzorci I.

Ve výhodném provedení imunologický test podle tohoto vynálezu používá polyklonální protilátky pro neonikotinoidní insekticidy. Tyto protilátky se mohou připravit ze séra imunizovaných zvířat. Imunizace se může provádět tak, že se injíkuje imunogen (hapten-PPD antigenní konjugát) do druhu, který produkuje protilátku, běžně savcům a s výhodou králíkům a ovcím. Běžně je počáteční injekce následovaná sérií druhých injekcí tak, aby se maximalizovala tvorba protilátek. Optimálně se injekční režim několika dávek podává samicím bílých Novozélandských králíků. Množství injikovaného imunogenu je proměnlivé, ale musí vyvolávat adekvátní odpověď detekovatelného množství protilátky. Produkce protilátky se může ověřovat analýzou séra získaného v pokusných odběrech krve za použití testů El A, ELISA nebo nepřímým fluorescenčním imunologickým testem.

Stejná značení, jaká se používají ve známých imunometrických testech, se mohou použít pro značení haptenu používaného v tomto vynálezu. Z nich je možno uvést „reportér molekuly“ (RM) včetně enzymů, jakojsou alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza a β-galaktozidáza. Kromě toho se mohou použít fluorescenční, luminiscenční nebo radioaktivní značení, jako je značení fluores35 ceinem, rhodaminem, luminolem, akridínem a radioaktivními izotopy 251, a podobně, nebo koloidními částečkami, jako je zlato a selenium. Konečně se pro generování časově rozlišitelných signálů také mohou použít lanthanidové chelátové fluorofóry, jako je europium a terbium. Nejběžnějším enzymatickým značením je značení křenovou peroxidázou (HRP) a alkalickou fosfatázou.

Podle jedné konkrétní formy se pro detekci množství neonikotinoidu ve vzorku používá spektrofotometr. Avšak metody podle tohoto vynálezu se mohou upravovat odborníky v oboru tak, že se mohou použít i jiné typy chromogenních detektorů. Obdobně detekovatelný reakční produkt není omezen jen na chromofor, ale zahrnuje i jiné značení, jak bylo popsáno výše.

Hapten následujících vzorců I A, I B a II A byly nalezeny jako použitelné při přípravě antigenních neonikotinoidních konjugátů:

-6O (I A)

Hapten (I A)

F? R¹

I I

A. ,N.

F? X

CH ve kterém

A je 2-chlorpyrid~5-ylová skupina nebo 2-chlorth iazo l-5-y lová skupina,

R³ je atom vodíku nebo aikylová skupina s 1 az 4 atomy uhlíku,

R¹ a R² jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo aikylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R¹io a R² dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolidinový kruh nebo oxadiazinový kruh, n je celé číslo od 1 do 4 a

X je atom kyslíku, skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN.

Hapten (I B)

ve kterém

A, R^l, R², R³ a X mají význam uvedený ve vzorci I A a

E je jednoduchá kovalentní vazba nebo spojující část vzorce -(CH₂)_m- kde m je celé číslo od 1 do 3.

Hapten (III A)

O

(HIA) ve kterém A, R³, X a n mají význam definovaný u vzorce ΪΑ.

-7CZ 303174 B6

Hapten (11IB)

ve kterém

A, R³ a X mají význam definovaný u vzorce (1 A) a E má význam definovaný u vzorce I B. Hapteny vzorců lil A a I! 1 B se mohou připravit analogicky podle následující metodologie:

COjH kschch₂nh₂

OM“ OMe

s

CO_řH (UtC) derivát

2-aminoethanthiolu (N-kyano-imido)karbonát (HIC) substituovaný 2-{N-kyanoimino)thiazolidin

N

CN

Požadovaný hapten III A nebo III B se připraví použitím příslušného derivátu 2-aminoethan ío thiolu vybraného ze sloučenin vzorců III D nebo III E hschch₂nh (CH₂)_nco₂r co₂r ve kterých

R má význam uvedený u vzorce I.

Bylo nalezeno, že následující hapteny jsou použitelné v praxi podle tohoto vynálezu:

-8CZ 303174 B6

ve kterých n je v každém případě celé číslo od 1 do 4.

Antigenní neonikotinoidní konjugáty (imunogeny) a konjugáty pro testy se mohou připravit konjugací neonikotinoidního pesticidního haptenu na molekulu nosiče nebo na molekulu přenašeče, jak tomu může být v případě použití technik známých odborníkům v oboru. Mohou se použít dva základní přístupy. Prvý používá vazeb, které se stanou částí konjugátu. Tyto vazby io jsou homobifunkční nebo heterobi funkční a zahrnují ty, které jsou schopné tvorby, například disulfidové vazby přes thiolové skupiny cysteinovýeh částí molekuly v proteinovém substrátu nebo tvorby amidových vazeb řetězce nebo zbytkem lysinu a aktivovanými acylovými částmi, jako jsou sukeinimidy lově estery.

is Obecně tento přístup zahrnuje vysoce reaktivní funkční skupiny na spojovací části aje dostatečně snadný z hlediska substrátu pro konjugaci. Je však často nutné používat i funkční skupiny, které jsou méně reaktivní, jako jsou ty, které jsou schopné tvorby hydrazonu.

Druhý přístup, který je zejména vhodný pro konjugaci dvou proteinových částí používá dehydratační činidlo, jako je karbodiimid pro vytvoření nové peptidické vazby reakcí karboxylové části molekuly na jednom členu konjugátu a volné aminoskupiny na druhém. V tomto případě reakční činidlo se nestane částí konjugátu. Reakce není příliš snadná, protože karboxylová skupina není aktivovaná, karbodiimid poskytuje aktivní meziprodukt a posunuje rovnováhu tím, že se odstraňuje voda za vytvoření peptidické vazby.

Oba přístupy pro vytvoření konjugátů se provádějí ve vodných rozpouštědlech, protože proteinový materiál tvořící konjugát se snadno denaturuje. Proteiny jsou stabilní ve vodném prostředí aje známo, že se denaturují i v rozpouštědlech, jako je ethanol, o kterém by bylo možno uvažovat jako o přiměřeně analogickém k vodnému prostředí. Také proteinové konjugátové komponenty mají tendenci být poměrně nerozpustné v nevodných rozpouštědlech.

Bylo nalezeno, že haptenové konjugáty následujícího obecného vzorce II jsou užitečné v praxi podle tohoto vynálezu:

-9ιο

(») ve kterém A, R¹, R², R³, n a X mají významy uvedené u vzorce I A výše a PR je zbytek proteinu:

(1) molekuly nosiče, jako je vyčištěný derivát proteinu (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin hovězího séra, lidský sérový albumin, albumin nebo keyhole limpet hemocyanin v případě imunogenu, nebo (2) přenosová molekula (RM), jako je alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza, a β-galaktosidáza.

Kromě toho jsou obdobně použitelné haptenové konjugáty následujícího vzorce 11 A:

TU-PR (HA) ve kterém A, R¹, R², R³, E a X mají významy uvedené ve vzorci I B: výše.

Bylo nalezeno, že následující konjugáty jsou v praxi podle tohoto vynálezu zejména užitečné: α o ¥=? r ί

NH—PR

Cl „N

Nk & N I _

O

NH-PR

(^ch₂)„Y

PR

Cl

Y ^(CH₂)_n-Y N. NH—PR

N i

O ve kterých ve všech případech n je celé číslo od 1 do 4.

- 10CZ 303174 B6

Neznačené polyklonální protilátky používané v postupu podle tohoto vynálezu pro vázání antigenních neonikotinoidů nebo hapten-RM konjugátů ve vzorku, který má být testován se mohou imobilizovat na jakýkoli nosič běžně používaný při imunometrických testech. Z těchto použitelných nosičů je možno jmenovat filtrační papír, latex, polystyrénové částečky, polyethylen, poly5 styren, polypropylen nebo jiné vhodné mikrojamkové desky nebo zkumavky. Tento nosič může být jakýkoli polymer přírodního nebo syntetického původu nebo amorfní materiál, jako je sklo. S výhodou pro testovací proužky se používají membrány z nitrocelulózy nebo nylonu a polyvinylové, polypropylenové, polystyrénové nebo jiné plastické materiály pro částečky nebo mikrojamkové desky. Také se mohou použít gely nebo částečky na bázi agarózy, akry lam idu io nebo latexu. Kromě toho se pro postup podle tohoto vynálezu může upravit jakékoli imunochromatografické zařízení, známé odborníkům v oboru. Mezí vhodné laterální průtokové zařízení, které je možno uvést, je například laterální průtokové zařízení nárokované v patentu US 4 366 241. Technika pro vázání protilátek na tyto materiály je dobře známá odborníkům v oboru. Vhodným zdrojem pro získání protilátek vázaných na nosič je například Beacon

Analytical Systems, lne. (Portland, Maine).

Pro přípravu vzorku semen pro použití v testu podle tohoto vynálezu se reprezentativní vzorky semen ošetřených neonikotinoidem (například, 5 až 100 g olejovité rostliny canola, z 10 až 200 g semen čiroku, pšenice, bavlny, krmné kukuřice nebo sladké kukuřice) se disperguje ve vhodném rozpouštědle, jako je aceton, acetonitril, ethanol, isopropanol, methanol, nebo jejich směsi s různým procentem vody. Vhodné směsi rozpouštědel s vodou jsou například směsi 1 až 50 % methanol/voda a 1 až 20 % acetonitril/voda. Dispergovaná semena se zvíří a pak se umístí na 20 minut do ultrazvukové lázně, načež se znovu zvíří. Obsah se nechá usadit. Známá část kapalného extraktu se oddělí a přidá ke známému množství roztoku, například směsi 1 % aceto25 nitril/voda. Extrakt se dále zředí tak, aby koncentrace extrahovaného neonikotinoidů byla v rozsahu kalibrační křivky. Bylo nalezeno, že vhodné ředění je jedna tisícina až Šedesát tisícin. Imunologický test trvá 35 minut. Extrakce a příprava extraktu pro analýzu trvá přibližně třicet minut. Proto vzorek semen se může extrahovat a analyzovat během jedné hodiny a pěti minut. Podle konkrétního provedení se až do dvou vzorků semen (s až pěti podvzorky semen na jedno semeno) mohou analyzovat současně.

Imunologickými testy podle tohoto vynálezu se mohou detekovat koncentrace neonikotinoidních insekticidů od asi desetitisíc částí na milion do jedné poloviny ěásti per bilion. Metoda je však vhodná pro jakékoli množství neonikotinoidního insekticidu pokud množství neonikotinoidního insekticidu ve vzorku nebo ve vzorku extraktu spadá nebo se může příslušně zředit, aby spadalo do rozsahu kalibrační křivky.

Příprava antigenů, produkce polyklonálních protilátek a imunologický test jsou blíže podrobně objasněny v následujících příkladech, které vynález žádným způsobem neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Syntetický postup pro přípravu thiametoxam haptenu

-11 CZ 303174 B6

OMe

N^N

H₂SO₄

HNOj/H₂S0₄->.

O OMe .N„

O Ν N

O·met hyl isourea sulfáte aqNaOH

OMe o

N .NO,

CH₃SO_aH o^o foímic acid | I v

Ν N.

il N

NO,

OMe

1.2 .NO, ,N0,

N ²Jí ,^SV^^{N N}a-4 JJ J

COjCHj conc HCI ->.

a—<\

1.5

COjH

1.4

2-methy 1-1 -n itroisomočov ina

Sulfát O-methylisomočoviny (38,5 g) se rozpustí ve směsi kyseliny dusičné (120 ml) a kyseliny 5 sírové (280 ml) při teplotě 0 °C a reakční směs se míchá při této teplotě 2 hodiny. Směs se opatrně naleje za míchání na ledovou drť, načež se zbylá ledová tříšť odfiltruje. Jehličkové krystaly se rozpustí v ethylacetátu a roztok se zalkalizuje přidáním uhličitanu draselného. Roztok se vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Získá se bílý práškovitý produkt (5 g).

io 1.2

Připraví se roztok z 3 g hydrochloridu methy 1-4—aminobutyrátu (1.1 a) a 15 ml vody. Hodnota pH se upraví na hodnotu 11, přikapáním 2M hydroxidu sodného, přičemž se roztok chladí v lázni s ledem. Reakční baňka se opatří pH elektrodou a teploměrem a k vzniklému čirému bazickému roztoku se přidává po malých částech za intenzivního 2-methyl-l-nitroisomočovina (2.38 g), přičemž teplota se udržuje pod 2 °C. Po skončení přidávání se reakční směs míchá 1,5 hodiny při teplotě 0 °C a pH se přitom stabilizuje na 9,6. Přidá se tetrahydrofuran (1 ml) a reakční směs se míchá další dvě hodiny. Reakční směs se zředí vodou a naleje do ethylacetátu. Organická fáze se oddělí, vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Zahuštěním filtrátu se získá čirý olej. Rychlou chromatografíí surového oleje na silikagelu použitím směsi 3 : 1 dichlormethan/acetonitril se získá 750 mg požadovaného produktu ve formě bílé pevné látky.

1.3

- 12CZ 303174 B6

Produkt z odstavce 1.2 (1,44 g) s paraformaldehydem (422 mg), methan sulfonovou kyselinou (0,023 ml), a kyselinou mravenčí (10 ml) se zahřívá na 55 °C po dobu 15 hodin. Reakční směs se pak zahustí ve vakuu a vzniklý hnědý olej se suspenduje v toluenu a azeotropickou destilací se produkt vysuší. Vzniklý olej se rozpustí ve směsi 1:1:1 tetrahydrofuran/dioxan/aceton itril a nechá se reagovat s přebytkem diazomethanu. Roztok se míchá 30 minut, načež se reakční směs zpracuje s kyselinou octovou. Zahuštěním se získá olej, který se rozpustí v ethylacetátu, promyje zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší síranem sodným a znovu zahustí na olej. Tento olej se čistí rychlou chromatografii ve směsi 3 : 1 dichlormethan/acetonitril a získá se 658 mg požadovaného methylesteru oxadiazinamin máselné kyseliny (1.3) ve formě čirého oleje.

io

1.4

Produkt z odstavce 1.3 (1,1 g) se rozpustí v acetonitrilu (50 ml) a přidají se 3 g uhličitanu draselného. V jedné dávce se přidá chlormethyl chlorthiazol a reakční směs se zahřívá 20 hodin na 55 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se odfiltrují pevné podíly. Zahuštěním získaného hnědého filtrátu se získá olej, který se čistí rychlou chromatografii 3 : 1 dichlormethan/acetonitril a získá se 894 mg požadované sloučeniny ve formě žlutohnědého oleje.

1.5

Rozpustí se sloučenina z odstavce 1.4 (372 mg) v 8 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a I ml vody a reakční směs se míchá 6 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se pak zředí vodou a opatrně se zalkalizuje přidáním 1 M roztoku hydroxidu sodného až se dosáhne pH 4,5. Extrakcí ethylacetátem a vysušením organické fáze síranem hořečnatým se získá olej, který se čistí rychlou chromatografii na silikagelu směsí 1 : I dichlormethan/acetonitril a získá se požadovaný produkt 1.5 (100 mg).

Příklady 2 až 5 30 Thiamethoxan hapteny

Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících thiamethoxan haptenů uvedených v tabulce 1 náhradou meziproduktu 1.1 za příslušnou analogickou sloučeninu vzorce NH₂(CH₂)_nCO₂R (1.1 b), kde n je celé číslo od 1 do 5 a R je atom vodíku nebo alkyl s 1 až

4 atomy uhlíku.

- 13CZ 303174 B6

Tabulka 1

_ O

Příklad	n
2	1
3	2
4	4
5	5

Příklady 6 až 9

Thiamethoxam hapteny

Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících thiamethoxam haptenů io uvedených v tabulce 2 náhradou meziproduktu 1.1 .a za příslušnou analogickou sloučeninu vzorce (l.l.c)

NH₂

CO_aR kde E je kovalentní jednoduchá vazba nebo spojující skupina -(CFDm- kde m je celé číslo od I do 3 a R. je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku

- 14CZ 303174 B6

Tabulka 2

Cl

R⁴ +·£>

N 1 _ O

Příklad	R⁴
6	V
7
8
9	Ό“·

Příklad 10

Syntetický postup pro přípravu des-nitroamino thiamethoxam haptenu

2hod/165° C>

S'

- 15Hapten thiamethoxam máselné kyseliny (100 mg, 0,275 mmol) a anisol (6,5 ml) se smísí v 10 ml io kulaté baňce opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem. Baňka se umístí do olejové lázně a zahřívá se 2 hodiny na 165 °C. Anisol se odstraňuje za sníženého tlaku při 50 °C po dobu 5 hodin. Vzniklý olejovitý produkt (90,2 mg) má podle HPLC analýzy čistotu 93 %.

Spektroskopická data pro charakterizaci:

HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18,5p (25 x 0,46 cm); aceton i tri 1/20 mM kyselina fosforečná (40 : 60); 1,0 ml/min.; T=40C; UV @ 240 nm (BW = 100 nm); doba záznamu: 13 minut; retenční čas: 4,6 minut.

TLC: (diolový gel) dichlormethan/acetonitril, 2 : 1 Rf = 0,25.

'H NMR (CDjCN, 300 MHz): δ 7,43 (t, IH), 4,78 (s, 4H), 4,75 (s, 4H), 4,48 (d, 2H), 3,29 (t, 2H), 2,27 (t,2H), 1,73 (q, 2H).

EI/DEP hmotové spektrum: m/z 319 (M+),

Analýza: vypočteno: C, 41,32; H, 4,41; N, 13,14;

nalezeno: C, 40,13; H, 4,43; N, 12,99

Příklady 11 až 18 des-nitroimino thiamethoxam hapteny

Syntetický postup podle příkladu 10 se použije pro přípravu následujících des-nitroimino thiamethoxam haptenů, uvedených v tabulce 3 náhradou sloučenin připravených v příkladu 1 za příslušné analogické sloučeniny příkladů 2 až 9.

-16CZ 303174 B6

R⁵

Tabulka 3

Cl

Příklad	R^ó
11	-CH₂C0₂H
12	“CHrCH^CCLH
13	-CH2CH2CH2CO2H
14	-CHzCH-zCHaCHžCOsH
15	v
16
17	COjH
18

Příklady 19 až 27 5

Imidacloprid hapteny

- 17CZ 303174 B6

Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících haptenů ímidaclopridu uvedených v tabulce 4. Použijí se nitroguanidylové deriváty připravené v odstavci 1.2 nebo jejich analogy připravené náhradou meziproduktu 1.1 za příslušný analog vzorce 1.1 b nebo vzorce

1.1 c, jak jsou uvedeny v příkladech 2 až 9.

Tabulka 4

Cl

N.

Příklad	R⁶
19	-CH₂CO₂H
20	-CH2CH2CO2H
21	-CH2CH2CH2CO2H
22	-CH₂CH2CH₂CH₂CO₂H
23	-ch₂ch₂ch₂ch₂ch₂co₂h
24	V
25
26
27	Ό0·“·^η

-18CZ 303174 B6

Příklady 28 až 36 des-nitroimino imidacloprid hapteny

Syntetickým postupem podle příkladu 10 se připraví následující des-nitroimino imidacloprid hapteny uvedené v tabulce 5 náhradou sloučeniny připravené v příkladu 1 za příslušnou analogickou sloučeninu podle příkladů 19 až 27.

Tabulka 5

O

Příklad	R⁷
28	-CH₂CO₂H
29	-CH₂CH₂CO₂H
30	-CH2CH2CH2CO2H
31	-CH2CH2CH2CH2CO2H
32	-CH2CH2CH2CH2CH2CO2H
33
34
35
36

- 19CZ 303174 B6

Příklady 37 až 45 Clothiadinové hapteny

Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících haptenů clothiadinů uvedených v tabulce 6 použitím derivátů nitroguanidylu připravených podle odstavce 1.2 nebo jeho analogů náhradou meziproduktu 1.1 za příslušné analogy vzorce 1.1 b nebo 1.1c, jak jsou uvedeny v příkladech 2 až 9.

Tabulka 6

_ o

Příklad	R⁸
37	-CH₂CO₂H
38	CH2CH2CO2H
39	-CH₂CH₂CH2CO₂H
40	-CH2CH2CH2CH2CO2H
41	-CH2CH2CH2CH2CH2CO2H
42	V
43	ΤΓ
44
45	Ό·^η

-20CZ 303174 B6

Příklady 46 až 54 des-nitroimino clothiadinové hapteny

Syntetický postup podle příkladu 10 se použije pro přípravu následujících des-nitroimino clothiadin haptenů uvedených v tabulce 7 náhradou sloučenin připravených podle příkladu 1 za analogické sloučeniny podle 37 až 45.

Tabulka 7

Cl

V=s

N. NH NH —R^e o

Příklad	R⁹
46	-CH₂CO₂H
47	-ch₂ch₂co₂h
48	-ch₂ch₂ch₂co₂h
49	-CH₂CH₂CH2CH₂CO2H
50	-ch₂ch₂ch₂ch₂ch₂co₂h
51	v
52
53
54

io

-21 CZ 303174 B6

Příklady 55 až 63 Thiacloprid hapteny

Syntetický postup specifikovaný pro hapteny vzorců 1IIA a II1B se použije pro přípravu následu jících haptenů clothiadinu uvedených v tabulce 8

Tabulka 8

55	-CH₂CO₂H
56	-CH_zCH₂CO₂H
57	-ch₂ch₂ch₂co₂h
58	-ch₂ch₂ch₂ch₂co₂h
59	-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO₂H
60	v
61
62
63	'O“·

-22CZ 303174 B6

Příklad 64

Příprava thiamethoxamového imunogenu

64.1

Připraví se roztok vyčištěného proteinového derivátu (Tuberculin, PPD) v 0,01 PBS, pH 7,4, a upraví se na koncentraci 1 mg/ml. Hodnota pH se upraví na 4,5 až 5,0 přidáním alikvotního množství 0,5 ml 0,1 M kyseliny chlorovodíkové.

64.2

Thiamethoxamový hapten z příkladu 1 (1 mg) se rozpustí v 250 μΙ 0,1Μ 2-(N-morfolino)ethansulfonové kyseliny, pH 4,5. Roztoky haptenu a PPD se pak spojí.

64.3 mg l-(dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu (EDC) se rozpustí v 100 μΐ destilované deionizované vody a ihned se k hapten-PPD roztoku přidá roztok EDC. Roztoky hapten-PPD a EDC se míchají 2 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se umístí do dialyzaěního sáčku odstraňujícího molekulovou hmotnost 1000 až 2000 Daltonů. Dialýza se provádí proti 2 litrům PBS při teplotě 4 °C 48 hodin při třech výměnách.

Příklad 65

Příprava imidaclopridového imunogenu

Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu 21 se provede příprava imidaclopri30 dového imunogenu.

Příklad 66

Příprava clothiadinového imunogenu

Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu 39 se provede příprava clothiadinového imunogenu

Příklad 67

Příprava thiaclopridového imunogenu

Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu 57 se provede příprava clothiadinového imunogenu

Příklad 68

Imunizaění rozpis a sklízení protilátek

Pro počáteční imunizaci se imunogen z příkladu 64 rozpustí v kompletní Freundově přísadě a tímto roztokem se naočkují samice Novozélandských bílých králíků. Injikuje se přibližně,

-23CZ 303174 B6 pg imunogenu na každou stranu. Obdobně se imunizují ovce, kterým se na každou stranu aplikuje 38 pg imunogenu.

Po následných imunizacích se imunogen rozpustí ve Freundově nekompletní přísadě. Zvířata se ponechají odpočívat Čtyři týdne mezi imunizacemi a odběr krve se provede deset dní po imunizaci. Druhé injekce a odběry krve se provádějí po devět měsíců, kdy se pak nechají vykrvácet. Polyklonální protilátky se sklidí použitím technik, které jsou odborníkům v oboru známé.

Příklad 69

Příprava konjugátů hapten-enzym

69.1

Thiamethoxamový hapten z příkladu 1 (3,1 mg), N-hydroxysukcinimid (NHS) (4,0 mg), a EDC (4,6 mg) se v malé vialce smísí. Tyto materiály se suší mírným proudem dusíku po 15 minut při teplotě místnosti.

69.2

Přidá se suchý dimethylformamid (2,0 ml) a směs se sonikuje 1 minutu. Vzniklý roztok se inkubuje přes noc při teplotě místnosti.

69.3

Křenová peroxidáza (8,5 mg) se rozpustí v malé vialce v uhličitanovém pufru (2,0 ml, 0,05M, pH 9,6). Vialka se umístí do ledové lázně.

69.4

Celkové množství 100 pl roztoku hapten-NHS-EDC z odstavce 6.2 se pomalu během 1 hodiny přidává a směs se inkubuje za míchání po dobu 2 hodin. Reakční směs se prolije přes kolonu Sephadexu G-25M ekvilibrované PBS (0,01 M, pH 7,2). V prvých 3,0 ml eluátu se vymyje enzymový konjugát a k němu se přidá stejný objem glycerolu a roztok se skladuje při -20 °C.

Příklad 70

Imunologický test canola ošetřené thiamethoxamem.

Část extraktu semen se zředí 1% roztokem methanol/voda, až očekávaná koncentrace thiamethoxamu je v rozmezí kalibrační křivky, 0,5 až 120 částí na bilion. Zkumavky potažené protilátkou se označí a umístí do stojanu na zkumavky tak, že první a poslední zkumavka jsou standardy a zbylé standardy a vzorky jsou promíšeny. Stojan drží zkumavky tak, že se mohou převrátit, aniž by došlo k vypadnutí zkumavky. Do všech zkumavek se přidá alikvotní množství (0,5 ml) standardu nebo vzorku. Pak se do všech zkumavek přidá (0,5 ml) roztoku enzymového konjugátu. Stojan se jemně třepe, aby se obsah všech zkumavek promísil. Zkumavky se inkubují 20 minut při teplotě místnosti. Stojan se převrátí, aby se dekantoval obsah všech zkumavek. Do všech zkumavek se přidá stričkou voda až do přetečení a promývací roztok se dekantuje. Zkumavky se promyjí ještě třikrát. Po konečném promytí se stojan obrátí a všechny zkumavky se jemné vytřou čistým papírovým ubrouskem, aby se odstranil zbylý promývací roztok. Enzymový substrát (0,5 ml) se přidá do všech zkumavek, které se pak inkubují 10 minut při teplotě místnosti. Stojan se během inkubace mírně třepe každých 2,5 minut. Pro ukončení reakce se do každé zkumavky přidá kyselý roztok (IM HCI, 0,5 ml). Jakje patrné z tabulky 10, měří se

-24CZ 303174 B6 absorbance reakčního produktu při 450 nm. Absorbance standardů se použijí pro konstrukci kalibrační křivky s regresní funkcí ve formě Y = mLn(X) + B. Absorbance každého vzorku se vynese do funkce pro stanovení koncentrace neonikotinoidního pesticidu v zředěném vzorku. Získané koncentrace se násobí zřeďovacím faktorem a vypočítá se množství neonikotinoidního pesticidu v původním vzorku.

Tabulka 10 io Typická standardní křivka pro thiamethoxamový imunologický test.

¹ Koncentrace	Absorbance při 450 nm
thiamethoxamu	(Analytická odezva)
120	0,3145
20	0,6636
3	1,0283
0,5	1,3618

jednotky v dílech na bilion

Funkce popisující odezvu na thiamethoxamové standardy se vytváří z regresní analýzy. Tato data is vznikají ze standardní křivky Y = -0,191 Ln (X) + 1,23, r = -0,999 kde Y = analytická odezva a X = koncentrace thiamethoxamových standardů.

Příklad 71

Test křížové reaktivity u semen ošetřených thiamethoxamem.

71.1 Extrakce semen

Vzorky ošetřených semen se náhodně rozdělí na podvzorky tak, že se po 50 g bavlníkových semen, krmné kukuřice, ěiroku, sladké kukuřice a pšenice nebo 40 g canola se umístí do 0,25 l širokohrdlé láhve. Canola se rozdělí na čtyři podvzorky a pět pod vzorků se připraví z ostatních typů semen. Do každé láhve se přidá 150 ml rozpouštědla a nádoba se dokonale uzavře. Bavlníková semena se extrahují 5% směsí aceton itril/voda, zatímco ostatní semena se extrahují směsí 20% methanol/voda. Nádoby se dobře protřepou 30 vteřin v ruce a pak se umístí při teplotě místnosti do sonikované vodní lázně na dobu 20 minut. Vzorky se třepou ještě jednou jak bylo popsáno. Obsah každé nádoby se nechá asi 5 minut usadit a alikvotní podíl (0,10 ml) se odebere pro analýzu. Alikvotní podíl se zředí ve směsi 1 % methanol/voda tak, aby odparek spadal do rozsahu standardní křivky.

71.2 Imunologická analýza

Protilátkou povlečené polystyrénové kultivační zkumavky se označí a umístí do stojanu na zkumavky tak, že první a poslední zkumavka obsahuje standardy a zbylé zkumavky se standardy a vzorky se promíchají. Do odpovídajících zkumavek se přidají roztoky vzorků a standardů (0,50 ml). Pak se přidá obdobný objem konjugátu enzymu. Stojan se jemně protřepe, aby se roztoky promíchaly a nechá inkubovat 20 minut při teplotě místnosti. Pak se obsahy všech zkumavek odstraní obrácením stojanu na pánev z nerezové oceli. Každá zkumavka se promyje naplněním destilovanou vodou. Stojan se obrací pro naplnění a vylití promývací vody.

Promývání se provádí čtyřikrát. Pak se stojan obrátí a jemně vytře papírovým kapesníkem, aby se odstranila převážná část promývací lázně. (Trochu kapaliny, která zbude ve zkumavkách testu nevadí). Roztok enzymového substrátu (0,50 ml) se přidá do každé zkumavky a tyto se pak inkubují 10 minut při teplotě místnosti. Stojan se přitom třepe v 2,5 minutových intervalech, aby se zajistilo, že enzym je dostatečně ve styku se substrátem. Tvorba modře zbarveného signálu se

-25CZ 303174 B6 ukončí přidáním kyselého roztoku (0,50 ml). Absorbance roztoku v každé zkumavce se měří spektrofotometricky při 450 nm.

Koncentrace analytu ve vzorcích se stanoví z regresní funkce ve formě y = m I n(x) + b.

71.3

Stanovení křížové reaktivity io Křížová reaktivita, nebo specifická, imunologického testu se vyhodnocuje tak, aby se stanovilo zda ostatní látky přítomné v povlaku semen by byly na překážku měření thiamethoxamu. Testované látky se rozpustí v 1 % směsi methanol/voda na koncentrace v rozmezí od 1000 do 0,01 ng/ml. Alikvotní podíly každé koncentrace se analyzují postupem popsaným výše. Reaktivita každé testované látky v tomto rozmezí se stanoví jako bylo dříve popsáno Brady, J. F; Turner,

J.; Skinner, D. H. „Applicatioon of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water samples. ,J. Agric. Food Chem. 1995,43: 2542-2547.

71.4

Výsledky

Ze všech testovaných látek bylo nalezeno, že pouze thiamethoxam je signifikantně reaktivní pri imunologickém testu (Tabulka 9, níže). Proto tento imunologický test je specifický na thiamethoxam.

Pod-vzorky ošetřených dávek semen se analyzují imunologickým testem a HPLC. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11 zobrazuje korelaci průměrných výsledků imunologického testu pri použití polyktonálních protilátek a HPLC analýz 40 vzorků semen na thiamethoxam. Dobrá shoda regresní linie ukazuje, že oběma metodami byly získány obdobné výsledky.

Tabulka 9

Křížová reaktivita thiamethoxamového imunologického testu

Testovaná látka	'Procenta reaktivity relativně na thiamethoxam
Thiamethoxam	100
Clothiadin	<1,0
Imidacloprid	²NR
Chlorpyrifos	NR
Difenoconazole	NR
Fludioxonil	NR
Pentach loronitrobenzene	NR
Metalaxyl	NR
Mefenoxam (R- Metalaxyl)	NR

-26CZ 303174 B6

Fluxofenim NR

Carboxin NR

Captan NR

Systhane (Myclobutanil) NR

TCMTB NR

Primifos-methyl NR

Thiophanate-methyl NR ‘reaktivity testovaných látek relativně k reaktivitě thiamethoxamu, vyjádřeno jako procenta.

²NR, ne-reaktivní.

Rozumí se, že odborníci v oboru mohou provést řadu obměn a modifikací aniž by došlo 5 k odchýlení od široce popsaného duchu tohoto vynálezu.

-27CZ 303174 B6

u

1 1 Xp

m

σι

LO

o

CM

ΓΟ

O

i—l

ro

v*

CM

LO

1—1

1—t

1—1

1 (M

I—1

LO

r*

CM

ro

co

LO

r~

LO

CM

•-I

i-l

xp

co

cu K

1 t''·

m

γ-

OD

cn

r—

Γ—

CD

QO

cn

LO

Γ-

r—

Γ-

!

co

γο

ro

i-4

ι—1

i—1

i—l

Tabulka 11. Srovnání analytických výsledků získaných imunologickými testy a HPLC.

CM

r-

OO

in

co

O

o

LO

CM

CO

LO

«—I

LO

r-

i—l

LO

m

LO

m

xp

LQ

xp

o

O

CM

LO

O

CM

Ch

O

CM

σι

co

xp

co

r*

r-

σι

o

CO

LO

Γ-

QO

LO

cn

r~-

ro

co

ro

co

i-l

1—t

i—l

1—1

CM

i—1

QO

*3»

Lf)

Ch

co

Ch

O

LO

CM

ι-H

o

OO

LO

LQ

Ch

r-4

ď)

xp

o

CM

σι

r-

OO

LO

CM

1-1

xp

t-M

Ch

o

xp

ch

Γ-

CM

XT

xr

Ch

<h

Ch

i—l

LO

r-

CD

OD

co

tn

Xp

XP

CO

co

i—l

i—1

t—l

i—4

CM

i—l

XT

o

Lf)

xp

Γ-

xp

co

Ch

ro

xp

o

co

Ch

co

LO

QO

\D

r*

QO

CO

ιο

LO

Γ-

LO

lf)

Ch

o

'a·

Lf)

tn

m

co

LO

Vp

r*

Ch

cn

[—

CO

m

r-

LO

co

CO

1—1

<—1

i-H

I—1

i—1

LO

Sl 1

Φ -U

i“1 ní cj

1 1

co

CO

r-

xp

Γ-

CM

co

1-1

LO

*3·

LO

rH

XP

lO

o

m

co

XT

1

o

XP

QO

f-4

i-H

LO

Γ-

o

LO

xp

XP

i—1

CO

m

th

CM

tn

o

fd

!

Xp

LD

LO

ΙΟ

LO

Ch

CM

r-

LD

LO

LD

00

LO

1

co

ro

CM

CO

1—1

t—l

1-1

CM

t—d

O

u-4

1

•H

c

1

th

-Π3

1

O

>

1

i—1

O

1

O

1

G

fO

1

tí

Λ o

1

LD

LO

Ch

xp

Γ-

uo

XP

tn

XP

o

1—1

XP

OD

CM

r-

m

xp

1—4

e

1

OO

I—1

σ

o

ιο

LO

Lf)

m

Lf)

OO

CM

LO

ao

co

r-4

LO

ch

LO

γΊ

t

Lf)

xp

CM

t—l

co

LO

00

o

GD

co

LO

Γ-

ao

LQ

cn

CO

I

CM

co

ro

1-1

CM

,—1

t—l

Γ— r—( LO CO

i—4

XT

χρ

i~4

th

CO

co

Γ*

m

CM

i—l

OO

O

r-

Γ—

UO

ro

LO

m

XP

xp

r—

m

CM

th

CO

m

i—1

r4

O

CM

Γ

LO

co

Γ

Ch

LO

th

Γ-

o

ch

co

CO

CM

r-f

i-H

1-4

rH

i—4

i-4

τ—1

Λί

CM

i—l

CM

CO

xp

co

m

LO

Γ-

00

XT

<h

O

t—l

CM

xp

00

ao

00

xp

XP

co

OO

ΟΟ

00

xp

OO

00

Ch

LO

LD

LO

LD

•3*

XP

xp

XP

xp

XT

XP

XT

XP

Xp

xp

XP

xp

XP

Ch

ch

cn

ch

Ch

σ

ch

cn

ch

(h

Ch

th

Ch

th

CM

ÍM

CM

tí

0)

£:	1		a>
	> ccJ		u
ta	I rH	Λί	—i
	¹ O	O	tí
δ	ί ΰ ¹ (0	Ul •r4	cu >w
E-·	> u	KJ	cu

Opakování analýz (pět) každého vzorku bylo provedeno imunologickým testem. Průměrné hodnoty všech imunologických testů pro každý vzorek byly srovnány s HPLC výsledky pro tyto vzorky regresní analýzou. Tyto poskytovaly regresní funkci Y = 1,00 X + 10,9, r = .0,976, N = 40 kde Y » PPM thiamethoxamu nalezeného imunologickým testem a X = PPM thiamethoxamu nalezeného HPLC.

Tabulka 11 Srovnání analytických výsledků získaných imunologickými testy a HPLC (pokračování).

X

O x

-M

OJ e <0 ·—I X

O x

Ό c

Φ

N

OJ i—I £

S

ĚX a

1 1 N·

cn

Γ-

Γ'

<n

m

Ν’

o

r~-

co

CN

LO

o

cn

o

CN

cn

o

1 01

CN

O

m

cn

CD

Γ*

co

tp

oo

LO

σι

LO

X

1 CO

oo

cn

r—

σι

cn

CD

cn

tn

m

cn

LO

r-l

LD

Γ-

00

CM «

1 OJ 1

CN

OJ

cn

Ν’

cn

>0) β

«tí íj

CM

m

o

LO

t—1

O

00

O

00

r-

n*

ν’

tn

LO

CO

LO

Γ'

LD

p-*

rH

cn

o

CO

CN

θ'

Γ-Ι

CN

oo

i—1

cn

LD

θ'

CM

cn

00

r-

O

r-

LD

Ν’

LO

Ν'

Ν’

cn

o

Γ'

LD

LO

00

OJ

CN

OJ

n

Ν’

cn

LO o lO

cn CN cn

cn LO co

00 cn iO

ot rH i—1

i—1 00 Ν'

<n Ν’ LD

LO Lf> Ν’

cn cn Ν'

i—1 00 Ν'

r- 00 cn

o rH N*

to 00 Ν’

Γ- ΟΟ CN

LD cn CN

Γ- cn LD

CN cn LO

CN

cn

CN

OJ

CM

CN

Ν’

ιθ

Ν'

cn

Ν’

o cn o lo lo ν' ld λ, ld r- cn lo tn n· _ω η ω γ o οί h cxj cn cn cn oj oj cn

Lf) LD OJ co ™ £ η 'X) rn ρη ld m n* rco oo tn oo cn o oj co o cn ς? (η T

4-J

N

1

V) cu

'>1

t ]

cn

OJ

LO

rM

to

O

LO

N*

o

LO

r~

LO

o

oo

LD

w

4_)

(—1

i

o

N*

r-

lo

i—l

LO

LD

CO

r-

r~

to

lO

r-

Ν’

00

rtJ

|

cn

LD

cn

Ν'

CN

LO

CO

cn

Ν’

N*

cn

to

I—1

OJ

00

tí fd

1

CN

OJ

CN

Ν'

N*

cn

Ν’

CN

Λί

1

υ

'rj

1

•Η

£

1

tn

'fO

1

O

>

1

1—1 /—1

0

1

o c

1 |

Γ—|

Γ

Γ-

LO

LD

O

LO

oo

O

o

cn

ιθ

co

Γ-

OO

r—1

(0

i

cn

c—

ΟΟ

r-

O

lO

Γ-

CN

cn

1

N*

CN

LO

ΟΟ

CN

O

£

Dm

)

o

Ν’

LO

CN

O

r—

ΙΟ

N*

cn

1

N

cn

LD

o

IO

Ν’

<n

1—1

o

I

OJ

CN

tn

cn

CN

m

LO

cn

LO

N

OT

Ν'

O

r-

Γ-

cn

LO

cn

O

Ν’

LD

CO

I—1

Ν'

tH

<n

r-

Γ-

CN

LD

r-l

LD

LO

Ν'

tn

ιθ

tn

Γ-

o

Ο-

CN

Ν'

σι

<n

r~l

Ν’

Γ'

LO

Ν'

Ν’

cn

OO

N*

η

CM

ΟΙ

CN

i—l

CN

OJ

cn

N*

cn

ιθ

cn

Λί

I |

lC

r~

00

cn

o

LO

r—

co

cn

o

i—t

CN

tn

Ν’

LO

tu

j

r~

r-

Γ-

co

Ν’

cn

o

O

o

O

|

s

LD

ιο

LO

CN

cn

tn

cn

tn

o

|

N*

Ν'

N*

Ν'

Ν’

oo

OO

co

00

oo

00

co

N

|

cn

tn

σι

cn

tn

cn

tn

cn

σι

cn

>

1

CN

OJ

CN

OJ

CN

oj

CN

C 1
tu	1		cu
e	1		υ
(U	1 to	ίο	-H
w	1 tí
	1 <—i	Ό	tí
δ	1 >	tú	Λ1
i td	r-l	tí
	1 CO	CO	XÍ

^L0pakování analýz (pět) každého vzorku bylo provedeno imunologickým testem. Průměrné hodnoty všech imunologických testů pro každý vzorek byly srovnány s HPLC výsledky pro tyto vzorky regresní analýzou

e (0 >:

o

-G

4->

CU

OJ •H

Λ

4-4

O ι-ι

NJ

G cu

N

QJ <fl

G

ÍX a

o	1 CN	σι	O O O	00	ΟΊ Η Γ4 H
1 CN	00	o r co	00	N CO H kO
►G	1 *^p	oo	η n	o	uo ío r— co
cm	1			co	m <η m tn
W	1 1

><D

S i	LQ	CN	ro	r*	Γ-	o	«-(	Ό	00	CN
°G i	r~	o	Γ-	CO	ιΟ	ÍO	rd	LQ	CN	LO
1	xp		η	co	xp	ro	LQ	tQ	LQ	Γ-
pm i						cq	co	oo	CO	xP

<N	Ό	co	CN	00	r~	LQ	CN	Γ-	CQ
CN	00	ro	iQ	σι	CN	co	r-	ΟΟ	Γ-
xp	co	CQ	lQ	CQ	co	r—4	ch	o	ΟΟ
					CQ	CQ	CQ	XT	xr

i—1	CN	co	Γ-	CN
tQ	CN	Γ-	1—4	O
xp	XP	ΟΟ	XP	XP

ÍN	r-	lQ	LQ	o
CN	o	LQ	xr	σι
ÍO	CQ	o	XP	lQ
ro	0Q	00	00	XP

4-4 w

tu

O

-H

N '>1 r-4 σ» o

—I O '(fl >

O (fl r- <h co co río o to Ch o m ·*τ m n* m

XT	<3*	co	IQ	r-
CO	co	o	σ	o
XP	CQ	XT	00	XP

iq	LQ		1-1	oo
xp	tQ	o	r-	r-t
CO	σ	co	CN	T—1
CN	CN	OQ	CQ	tn

ÍO	XP	t—	t—l	00
iQ	Ch	xp	o	o
ÍO	ÍO	00	00	σι
00	00	00	00	xp

σ	σ	σ	co	o	O	CN	CN	00	Í0
CO	o	Γ-	CN	CN	IQ	CN	O	ÍO	CN
xp	xp	ΟΟ	xp	CQ	O	oO	CO	lQ	00
					CQ	XP	CQ	00	xP

44 t	r—	CO	σι	o	1—4	CN	OQ	xp	LQ	CO
CD 1	o	o	o	i—1	i—1	<-4	Γ—1	1-1	r-t	p—1
G 1	CQ	00	oo	CO	CQ	CQ	co	co	CQ	CQ
O 1	CO	co	co	CD	CO	00	co	co	00	OO
Ν 1	σ	σ	σ	σι	Ch	σ»	σι	<h	σι	Ch
> 1	CN	CN	CN	ÍN	CN	CN	CN	CN	CN	CN

G cu £

cu co δ

A

Ή

G r—1 o

íi.

<u o

-H >G

G

Aí

G

Opakování analýz (pět) každého vzorku bylo provedeno imunologickým testem. Průměrné hodnoty všech imunologických testů pro každý vzorek byly srovnány s HPLC výsledky pro tyto vzorky regresní

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protilátka použitelná v imunologickém testu vzorku pro stanovení množství neonikotinoidního insekticidu, kde protilátka (1) je polyklonální protilátka získaná imunizací živočichů neonikotinoidním haptenem konjugovaným s imunogenním proteinovým nosičem a (2) specificky se váže na neon i kotinoidní insekticid, přičemž uvedená protilátka je selektivní na deriváty guanidinu obecného vzorce I (I) ve kterém

A je 2-chIorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5-ylová skupina,

R a R³ jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkyiové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku,

R^l a R²jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkyiové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R¹ a R² tvoří dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, imidazolidinový nebo oxadiazinový kruh a

X je skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN.
2. Protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka je selektivní na sloučeniny vybrané ze skupiny, kterou tvoří imidacloprid, thiamethoxam a clothiadin.
3. Derivát guanidinu obecného vzorce I A ve kterém

A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5-ylová skupina

R³ je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až
4 atomy uhlíku,

R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkyiové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo

R¹ a R² dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolidinový kruh nebo oxadiazinový kruh,

-31CZ 303174 B6 n je celé číslo od I do 4 a

X je skupina N-NCL nebo skupina N-CN. 4. Derivát guanidinu podle nároku 3 vzorce

C'

V=f o íf ^(CH^”\ rsk OH

N I _ o ίο kde n má v nároku 3 uvedený význam.
5. Derivát guanidinu podle nároku 4 vzorce

COjH
6. Derivát guanidinu podle nároku 3 vzorce CL v <^chh>H.

kde n má v nároku 3 uvedený význam.
7. Derivát guanidinu podle nároku 6 vzorce ^NO_?

-32(»)

NH-PR
8. Proteinový konjugát obecného vzorce II fť Π’ ΐϊ ve kterém

5 A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-ehlorthiazol-5-ylová skupina R³ je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,

R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo io R^l a R² dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolidinový kruh nebo oxadiazinový kruh, n je celé číslo od 1 do 4

15 X je skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN a

PR je proteinový zbytek molekuly nosiče vybraný ze skupiny, kterou tvoří vyčištěný proteinový derivát (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z kat ionizovaného hovězího séra, albumin z lidského séra, ovalbumin a keyhole limpet hemocyanin;

nebo zbytek enzymu vybraného ze skupiny sestávající z alkalické fosfatázy, křenové peroxidázy a β-galaktosidázy.
9. Proteinový konjugát podle nároku 8 vzorce

Γ°Ί

K NH-PR kde n a PR mají v nároku 8 uvedený význam.
10. Proteinový konjugát podle nároku 8 vzorce Cl^N.

V o

PR

30 kde n a PR mají v nároku 8 uvedený význam.
11. Způsob stanovení koncentrace neonikotinoidního insekticidu ve vzorku, vyznačující se t í m, že zahrnuje stupně:

-33 CZ 303174 B6 (a) poskytnutí pevné fáze s imobilizovanou protilátkou selektivní pro daný neonikotinoidní insekticid, přičemž uvedená protilátka je selektivní na deriváty guanidinu obecného vzorce I ve kterém

A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorth iazo 1-5-y lová skupina,

R a R³ jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku,

R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R¹ a R² tvoří dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, imidazolidinový nebo oxadiazinový kruh a

X je skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN;

(b) uvedení tohoto vzorku ve styk s imobilizovanou protilátkou v přítomnosti známého množství konjugátu neonikotinoidního insekticidového konjugátu hapten-enzym, (c) promytí pevné fáze ze stupně (b), aby se odstranil všechen nevázaný konjugát hapten-enzym nebo vzorek, (d) reakce chromogenního substrátu specifického pro tento konjugát hapten-enzym s promytou pevnou fází ze stupně (c) tak, aby se generoval chromofor a (e) změření množství chromogenu vzniklého ve stupni (d), aby se tak stanovilo množství konjugátu hapten-enzym vázaného na protilátku, a tak se stanovilo množství neonikotinoidního insekticidu v daném vzorku.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený vzorek se připraví extrakcí rostlinných rozmnožovacích materiálů vhodným rozpouštědlem.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedeným rozmnožovacím materiálem je semeno.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedená semena jsou vybraná ze skupiny, kterou tvoří canola, čirok, pšenice, bavlník, kukuřice nebo sladká kukuřice.
15. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená protilátka je polyklonální protilátka produkovaná imunizací živočichů neonikotinoidním insekticidem konjugovaným na imunogenní proteinový nosič.
16. Způsob podle nároku 15, v y z n a č u j í c í se t í m, že uvedený imunogenní proteinový nosič je molekula nosiče vybraného ze skupiny, kterou tvoří vyčištěný proteinový derivát PPD, Tuberculin zDiptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z kationizovaného hovězího séra, albumin z lidského séra, ovalbumin a keyhole limpet hemocyanin.

-34CZ 303174 B6
17. Souprava použitelná pro imunologický test vzorku pro stanovení množství neonikotinoidní ho insekticidu, vyznačující se tím, že souprava v kombinaci jednoho nebo více zásobníků obsahuje:

(a) pevnou fázi s imobilizovanou protilátkou, která je selektivní pro uvedený neonikotinoidní insekticid, kde uvedená protilátka je selektivní pro derivát guanidinu obecného vzorce I (I) ve kterém

A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorth iazo l-5-y lová skupina,

R a R³ jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku,

R¹ a R²jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R¹ a R² tvoří dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, imidazolidinový nebo oxadiazinový kruh a

X je skupina N-NO₂ nebo skupina N-CN;

(b) konjugát enzymu obsahující enzym konjugovaný na neonikotinoidní hapten.
18. Souprava podle nároku 17, vyznačující se tím, že protilátka je polyklonátní protilátka produkovaná imunizací živočichů neonikotinoidem konjugováným na imunogenní proteinový nosič.
19. Souprava podle nároku 18, vyznačující se tím, že enzymem je křenová peroxidáza.
20. Souprava podle nároku 17, vyznačující se tím, že protilátka, se specificky váže na neonikotinoidní insekticid vybraný ze skupiny, kterou tvoří imidacloprid, thiamethoxam a clothiadin.
21. Protilátka použitelná v imunologickém testu vzorku pro stanovení množství neonikotinoidního insekticidu, kde protilátka (a) je polyklonální protilátka získaná imunizací živočichů neonikotinoidním haptenem konjugo váným s imunogenním proteinovým nosičem a (b) se specificky váže na neonikotinodní insekticid, přičemž uvedená protilátka je selektivní na sloučeniny vybrané ze skupiny kterou tvoří nitenpyram, acetamiprid a thiacloprid.
22. Způsob stanovení koncentrace neonikotinoidního insekticidu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

(a) poskytnutí pevné fáze s imobilizovanou protilátkou selektivní pro daný neonikotinoidní insekticid, přičemž uvedená protilátka je selektivní na sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří nitenpyram, acetamiprid a thiacloprid;

(b) uvedení tohoto vzorku ve styk s imobilizovanou protilátkou v přítomnosti známého množství neonikotinoidního insekticidu s konjugátem hapten-enzym,

-35CZ 303174 B6 (c) promytí pevné fáze ze stupně (b), aby se odstranil všechen nevázaný konjugát hapten-enzym nebo vzorek, (d) reakce chromogenního substrátu specifického pro tento konjugát hapten-enzym s promytou

5 pevnou fází ze stupně (c) tak, aby se generoval chromofor; a (e) změření množství chromogenu vzniklého ve stupni (d), aby se tak stanovilo množství konjugátu hapten-enzym vázaného na protilátku a tak se stanovilo množství neonikotinoidního insekticidu v daném vzorku.
23. Způsob podle nároku II, vyznačující se tím, že uvedený vzorek se připraví extrakcí rostlinných rozmnožovacích materiálů vhodným rozpouštědlem.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedeným rostlinným rozmno15 žovacím materiálem pro množení je semeno.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená semena jsou vybraná ze skupiny, kterou tvoří canola, čirok, pšenice, bavlník, kukuřice nebo sladká kukuřice.

20
26. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedená protilátka je polyklonální protilátka produkovaná imunizací živočichů neonikotinoidním insekticidem konjugovaným na imunogenní proteinový nosič.
27. Způsob podle nároku 26, vy z n ač u j í cí se tí m, že uvedený imunogenní proteinový

25 nosič je molekula nosiče vybraná ze skupiny, kterou tvoří vyčištěný proteinový derivát PPD,

Tuberculin z Diptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z katíonizovaného hovězího séra, albumin z lidského séra, ovalbumin a keyhole limpet hemocyanin.
28. Souprava použitelná pro imunologický test vzorku pro stanovení množství neonikotinoid30 ního insekticidu, vyznačující se tím, že souprava v kombinaci v jednom nebo více zásobnících obsahuje:

(a) pevnou fázi s i mobilizovanou protilátkou, která je selektivní pro uvedený neonikotinoidní insekticid, kde uvedená protilátka je selektivní pro sloučeninu vybranou ze skupiny, kterou tvoří

35 nitenpyram, acetamiprid a thiacloprid;

(b) konjugát enzymu obsahující enzym konjugovaný na neonikotinoidní hapten.
29. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální

40 protilátkou produkovanou imunizací živočichů neonikotinoidem konjugovaným na imunogenní proteinový nosič.
30. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že enzymem je křenová peroxidáza.