KR102225307B1 - 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 엔도설판 잔류 여부 판단용 바이오마커 조성물 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 이용에 관한 것으로, 10 ppb 이상의 엔도설판이 있는 환경에서, 제브라피쉬의 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]의 양이 증가함을 확인하였는 바, 이를 수중의 엔도설판 잔류 여부를 판단할 때뿐만 아니라, 개체에서 엔도설판의 독성을 확인하기 위한 바이오마커로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarker Composition for Discriminating Remaining Endosulfan or Determining Toxicity of Ensodulfan Comprising Wax Ester, and Use thereof}
본 발명은 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물, 이를 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 조성물, 키트, 엔도설판 잔류 여부 판단 방법 및 엔도설판 독성 확인 방법에 관한 것이다.
농식품 중 유해화학물질에 의한 오염을 저감하는 것은 해당 유해물질에 대한 국민들의 안전한 먹거리 확보를 유도하며, 물질에 대한 노출 감소를 통한 국민건강의 증진의 효과를 기대할 수 있다. 이에 따라, 작물재배 농경지 및 농업용수에서의 농약을 포함한 의도성 및 비의도성 유기유해화학물질에 대한 실태조사를 지속적으로 실시해야 하고, 그 잔류양상 및 잔류정도를 파악하여 안전관리체계를 확립할 필요가 있다.
그러나 이들 의도성 및 비의도성 유기유해화학물질에 대한 농경지 및 농업용수 중 잔류 실태조사를 일반적이고 고전적인 방법으로 실시할 때에는 분석기간이 길고 분석 비용이 높으며 더불어 전문적인 훈련을 받은 인력이 절대적으로 필요하다는 문제가 발생한다.
따라서 의도성 및 비의도성 유기유해화학물질에 대한 수(水)생태계 환경에 잔류하는 실태를 보다 신속하고 저비용으로 분석하는 방법을 개발하여 모니터링 체계를 구축할 필요성이 있는데, 이러한 신속한 분석방법으로 바이오마커를 사용하여 항체반응을 일으켜 환경에 존재하는 유무기 오염물질을 분석하는 방법이 있다. 현재 환경 중 유무기 오염물질의 독성에 대한 생물체의 바이오마커는 단백질류와 이차 대사산물류의 물질이 존재하며, 최근에 이르러 대사체 기법을 이용한 지질류 바이오마커의 개발이 많이 연구되고 있다.
엔도설판은 수서생물에서 그 독성이 특히 강하게 나타나며 이들은 2012년부터 잔류 유기 오염물질로 지정되어(Persistent Organic Pollutants, POPs) 국내에서도 사용이 금지된 유기염소계 살충제이다. 이들의 사용이 금지됨에 따라 검출 빈도 수는 줄어들고 있음에도 끊임없이 국내에 여러 환경 매체 중 그 잔류가 보고되고 있는 바, 이들의 환경 중 동태는 지속적으로 조사되어야 할 필요가 있다.
한국등록특허 제10-0752536호(2007.08.21 등록).
본 발명의 목적은 엔도설판의 수서 환경 중 잔류 양상, 정도를 효과적으로 확인할 수 있는 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔도설판의 수서 환경 중 잔류 양상, 정도를 효과적으로 확인할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔도설판의 수서 환경 중 잔류 양상, 정도를 효과적으로 확인할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔도설판의 독성을 효과적으로 확인할 수 있는 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔도설판의 독성을 효과적으로 확인할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔도설판의 독성을 효과적으로 확인할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적이고 정확하게 수상 환경에서 엔도설판 잔류 여부를 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적이고 정확하게 엔도설판의 독성을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 엔도설판 잔류 여부 판단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 독성 확인용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조성물을 포함하는 엔도설판 독성 확인용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 엔도설판의 잔류량을 측정하고자 하는 수서 환경에 제브라피쉬를 투여하는 단계; (2) 상기 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계; (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (4) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 상기 수서 환경에 엔도설판이 10 ppb 내지 100 ppb로 잔류하고 있다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 잔류 여부를 판단하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계; (2) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 엔도설판의 독성이 나타났다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 독성을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 총 6 종류의 왁스 에스테르[WE(53:1), WE(53:2), WE(55:2), WE(55:3), WE(58:0), WE(58:1)]를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 판단용 바이오마커 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 조성물, 키트, 엔도설판 잔류 여부 판단 방법 내지 엔도설판 독성 확인 방법에 관한 것으로, 엔도설판이 10 ppb 이상의 수서환경의 제브라피쉬에서 상기 왁스 에스테르들의 양이 증가한 바, 이들을 단독 바이오마커 또는 병합 바이오마커로 활용하여 엔도설판의 수서 환경 중 잔류 양상, 정도 내지는 엔도설판의 독성을 효과적으로 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 제브라피쉬 성체에 여러 농도의 엔도설판을 처리한 후 말디토프 질량분석기를 통해 얻은 크로마토그램-지질 스펙트럼을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 환경 중 엔도설판의 잔류는 이 물질의 살충독성과 함께 강한 어독성을 나타내기에 수서생태계에서 매우 중요하므로, 이러한 엔도설판의 잔류독성을 신속하고 저비용으로 측정하기 위하여, 제브라피쉬를 엔도설판에 노출시킨 뒤 유의성 있게 생성 또는 감소된 지질류 바이오마커를 개발하고자 하였으며, 이에 따라 연구를 하던 중, 엔도설판 처리 시 제브라피쉬에서 유래한 6종의 왁스 에스테르 화합물들이 유의성있게 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 엔도설판 잔류 여부 판단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
이때, 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상은 10 ppb 내지 100 ppb 의 엔도설판에 노출되면 그 양이 증가하므로, 이를 엔도설판의 잔류 여부 판단용 바이오마커로 활용할 수 있다.
더불어, 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 키트를 제공한다.
더욱이, 본 발명은, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물을 제공한다.
즉, 본원발명에 따른 바이오마커를 활용하면, 수중에 남아 있는 엔도설판을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 개체를 대상으로 엔도설판의 독성이 나타났는지 여부를 확인할 수 있다.
이때, 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상은 10 ppb 내지 100 ppb 의 엔도설판에 노출되면 그 양이 증가하므로, 이를 엔도설판의 독성 확인용 바이오마커로 활용할 수 있다.
더불어 본 발명은 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 독성 확인용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 엔도설판 독성 확인용 키트를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 (1) 엔도설판의 잔류량을 측정하고자 하는 수서 환경에 제브라피쉬를 투여하는 단계; (2) 상기 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계; (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (4) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 상기 수서 환경에 엔도설판이 10 ppb 내지 100 ppb로 잔류하고 있다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 잔류 여부를 판단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계; (2) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 엔도설판의 독성이 나타났다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 독성을 확인하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "시료"란 바이오마커인 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]의 양에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 방법은, 예를 들어, 질량 분석법, 광흡수 분석법, 기체크로마토그래피 또는 발광분광분석법을 이용한 정량 분석일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]의 양에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학물질, 펩타이드, 뉴클레오타이드, DNA, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 제브라피쉬의 성체를 이용한 엔도설판의 급성 독성 평가
(1) 실험 방법
야생형의 제브라피쉬의 성체(3-5cm)를 구매하여 염소를 제거한 물에 26±1℃ 의 온도를 맞춰 준 후, 낮과 밤의 길이를 16:8로 조정해 주고, 일주일 동안 순화시켰다. 독성실험은 OECD Guideline NO. 203을 따라 수행하였으며, 5 L의 비커에 염소를 제거한 수돗물을 5 L를 이용하여 각 비커 별로 10마리의 순화된 제브라피쉬의 성체를 실험에 사용하였다. 엔도설판은 DMSO를 전달자로 사용하여 물에 대한 비율이 1%가 넘지 않도록 농도를 조절하여 처리하였다. 각 처리군은 3 번의 반복을 두어 시행하였다. 실험은 96시간 동안 시행하였으며, 온도 26±1℃, 낮과 밤의 길이는 16:8 의 조건을 맞추어 주었다. 치사 개체는 24시간 단위로 96시간 동안 기록하였으며, 반수치사농도(Lethal concentration 50; LC50)를 SPSS를 사용하여 도출하였다.
(2) 실험 결과
엔도설판의 제브라피쉬에 대한 급성 독성을 평가한 결과, 하기 <표 1>에 나타난 바와 같이, 엔도설판은 제브라피쉬에 대하여 96시간 노출 시 반수치사량 값이 4.587 ppb였고, 이러한 반수치사량 값은 48시간 노출 시에도 유사하여 4.774 ppb였다. 그러나 24시간 노출 시에는 그 값이 상승하여 6.508 ppb 였다. 이는 짧은 노출 시간에는 더 높은 엔도설판의 농도에 노출되어야 그 독성이 나타난다는 사실을 입증한 결과이다.
시간(h) 세그먼트 치사농도(㎍ L-1, 95 % Fiducial limits)






엔도설판

24		 LC10 0.468 (-5.214 ~ 2.668)
LC20 2.542 (-1.133 ~ 4.468)
LC50 6.508 (4.584 ~ 10.002)
LC95 14.260 (10.526 ~ 26.049)


48		 LC10 0.903 (-1.859 ~ 2.354)
LC20 2.232 (0.197 ~ 3.534)
LC50 4.774 (3.468 ~ 6.451)
LC95 9.743 (7.692 ~ 14.323)


96		 LC10 1.021 (-2.106 ~ 2.505)
LC20 2.245 (0.022 ~ 3.609)
LC50 4.587 (3.199 ~ 6.441)
LC95 9.164 (7.09 ~ 14.296)
< 실시예 2> 엔도설판의 제브라피쉬 성체에서 지질 생성에 미치는 영향 평가
(1) 실험 방법
엔도설판에 노출된 제브라피쉬의 성체의 지질 변화를 알아보기 위하여 성체의 시료는 2 마리를, 메탄올-클로로포름(1:2, v/v) 용액 15 mL을 넣고 균질화하여 상온에서 20분간 진탕해주었다. 셀 스트레이너(cell strainer)를 사용하여 여과한 뒤, 0.9% 염화나트륨 용액 3 mL을 첨가하여 섞어주고 2000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 아래층(메탄올-클로로포름 층)을 취하여 분석에 사용하였다. 이때, 엔도설판은 각각 0, 1, 2.5, 10, 25 ppb 수준으로 제브라피쉬에 처리되었는데, 이는 상기 실시예 1에서 얻은 엔도설판의 반수치사량 값인 4.587 ppb 수준의 약 5배 이상 부터 약 4.5 배 이하 수준으로 처리한 값이다.
1 μL 지질 추출액을 엠티피 384 타겟 플레이트 그라운드 스틸(MTP 384 ground steel target)에 놓고 상온에서 말려주었다. 샘플이 완전히 마른 후, 0.5 μL 포화 아미노아크리딘 매트릭스 용액(2-프로판올/아세토니트릴, 60/40, v/v)을 말린 샘플 위에 놓고 상온에서 말려주고 말디토프 질량분석기(MALDI-TOF MS)를 통해 지질을 분석하였다. 샘플 별로 3번 반복 수행하였으며 결과는 지질 데이터베이스(www.lipidmaps.org)를 이용하여 지질 질량분석 결과를 확인하였다.
구체적으로, MALDI-TOF MS 분석 방법은 다음과 같았다: 제브라피쉬 지질 추출 시료와 시료 바인딩 버퍼를 희석 배수에 따라 희석한 후 4℃에 보관하였다. 지질 분석 칩의 최적화를 위하여 시료 바인딩 버퍼를 200 ul를 취하여 웰에 첨가하고, 실온에서 250 rpm으로 5분 교반 후 바인딩 버퍼를 제거하였다. 위와 같은 방법을 1회 더 반복하였다. 바인딩 버퍼가 제거된 지질 분석 칩에 희석된 지질시료를 150 ul 취하여 웰에 첨가하고 실온에서 30분간 250 rpm으로 교반하였다. 지질 분석 칩에 결합이 안 된 지질의 세정은 바인딩 버퍼 200 ul를 취하여 웰에 첨가하여 실온에서 5분간 250 rpm으로 흔들어 실시하였다. 이와 같은 방법을 2회 반복하였다. HPLC용 증류수로 2회 세정 과정을 반복하여 남아있던 바인딩 버퍼를 제거하였다. 지질 분석 칩을 완전히 건조한 후 EAM를 1 ul씩 첨가하여 결정체를 형성하도록 하였고, EAM 첨가를 1회 더 반복하였다. EAM으로는, 1 내지 15 kD 분석에 용이한 CHCA를 50% CHCA EAM 용액(50% ACN, 0.25% TFA)으로 용해하여 실온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 함으로써 얻은 상등액을 사용하였다.
MALDI-TOF MS 분석의 반복은 지질 추출 3 반복으로 실시하였다. 레이저 에너지의 설정은 EAM-CHCA로 최적화하여 조사하였고, 피크의 검출과 군집분석은 칩 데이터 매니저(Chip Data manager)를 이용하였다. 스펙트럼은 500 Da에서 1,000 Da로 표준화하였으며, 피크 검출 시, 1차-패스 피크(first-pass peak) 검출은 S/N의 비율을 5, 곡의 깊이(valley depth)를 3으로 설정하여 얻었고, 2차-패스 피크(Second-pass peak)의 검출은 S/N의 비율을 2, 곡의 깊이(valley depth)를 2의 신호로 설정하여 얻었다. 측정 피크(Estimated peak)는 At 클러스터 센터(cluster center)로 설정하였으며, 검출된 지질 피크 분석은 Bio Rad에서 제공하는 lipid Chip Data Manager Software를 이용하여 분석하였다. 단별량 분석을 위해서는 Kruskal-Wallis test를 이용하여 p 값이 0.01 이하에서 유의성을 판정하였다.
(2) 실험 결과
상기 실시예 1의 결과를 토대로, 제브라피쉬 성체를 다섯 농도 구배에 노출시켜 이들 농도에서의 제브라피쉬 지질 대사체를 분석한 결과가 하기 <표 2>에 나타난 바와 같았다.
Figure 112017103262679-pat00001
상기 <표 2>를 참조하면, 769.8 m/z의 지질은 대조군에 비해서 2.5 ppb에서 반으로 그 생성이 감소된 후 10 ppb와 25 ppb에서는 각각 약 8배와 3배 증가하였고, 771.8 m/z의 지질의 경우도 대조군에 비해서 10 ppb의 엔도설판에 노출된 제브라피쉬에서 약 6.6배 증가하였다. 또한, 795.84 m/z 지질은 대조군에 비해서 무려 10배가량 증가하였으며, 841.86 m/z 분자량의 지질은 대조군에 비해서 무려 42배 증가하였다. 이들 모두 왁스 에스테르(wax ester)에 속하는 지질이었으며, 이들은 도 1에 나타난 것처럼, 생성량이 극히 적었던 대조군에 비해, 특히 10 ppb의 농도 수준의 엔도설판에 노출된 제브라피쉬에서 새로이 생성된 지질류였다.
따라서, 이들 왁스 에스테르류 지질들을 제브라피쉬가 10 ppb 이상의 엔도설판에 노출되었을 때 반응하여 나타내는 지질 바이오마커로서 유용하게 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (10)

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  9. (1) 엔도설판의 잔류량을 측정하고자 하는 수서 환경에 제브라피쉬를 투여하는 단계;
    (2) 상기 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
    (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (4) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 상기 수서 환경에 엔도설판이 10 ppb 내지 100 ppb로 잔류하고 있다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 잔류 여부를 판단하는 방법.
  10. (1) 제브라피쉬에서 분리된 시료로부터, 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
    (2) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 왁스 에스테르(53:1)[WE(53:1)], 왁스 에스테르(53:2)[WE(53:2)], 왁스 에스테르(55:2)[WE(55:2)], 왁스 에스테르(55:3)[WE(55:3)], 왁스 에스테르(58:0)[WE(58:0)] 및 왁스 에스테르(58:1)[WE(58:1)]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 엔도설판의 독성이 나타났다고 판단하는 단계;를 포함하는 엔도설판 독성을 확인하는 방법.
KR1020170135900A 2017-10-19 2017-10-19 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 KR102225307B1 (ko)

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