CN113009057B - 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相萃取‑超高效液相色谱‑串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法：(1)准备内标储备液和目标分析物标准储备液；(2)待测尿液样品预处理：①酶解；②固相萃取分离净化：a)活化固相萃取小柱；b)上样；c)洗脱：用二氯甲烷‑乙腈混合物洗脱待测物，二氯甲烷与乙腈的体积比为8‑5:2‑5；③萃取结晶去杂质：将洗脱液吹干后，加入前述二氯甲烷‑乙腈混合物溶解残渣，离心，取上清液，吹干，用甲醇‑甲酸水复溶得到复溶液，所述的甲醇‑甲酸水是由甲醇与浓度为0.15％的甲酸水溶液按照体积比1‑2:9‑8混合得到；④滤膜过滤；(3)尿液样品分析；(4)标准曲线的绘制；(5)数据分析。
Description
技术领域
本发明涉及杀虫剂检测技术领域，具体涉及一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法。
背景技术
新烟碱类杀虫剂是20世纪末开发并投入使用的一类新型杀虫剂。该类杀虫剂作用方式新奇独特、杀虫效率高效快速、且与传统农药不易产生交叉抗性，一经问世，便成为市场上发展最快、销售额最大的一类杀虫剂。
然而，经过三十年的大量频繁使用，其对非靶标生物及人体的毒性影响逐渐引起了社会的关注。大量的体内和体外实验揭示，新烟碱类杀虫剂对哺乳动物具有潜在的肝毒性、神经毒性、生殖毒性、遗传毒性等多种毒性。对孕期新烟碱类杀虫剂慢性暴露的母亲及后代的研究指出，孕期母亲暴露于新烟碱类杀虫剂，其子代出现先天无脑畸形、孤独症谱系障碍、法洛四联症以及包括失忆、手指颤抖等神经系统症状的风险增加。
研究发现，新烟碱类杀虫剂在人群中有普遍暴露。对中国12个省份324名1-97岁人群尿中6种新烟碱类杀虫剂浓度的研究报告显示，噻虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、呋虫胺4种品种有高检出率，分别为99％、98％、97％、96％，其浓度总和占6种新烟碱类杀虫剂总浓度的98％(中位数为1.2ng/mL)。对中国浙江地区10名8-10岁儿童的尿液样本检测发现，尿液中7种新烟碱类杀虫剂被检出，检出率范围为10-80％。
鉴于新烟碱类杀虫剂对人体健康构成的潜在威胁，发展一种适用于检测大样本人群尿液中多种新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法有利于开展新烟碱类杀虫剂的生物监测及准确掌握人体内新烟碱类杀虫剂的暴露水平及风险。
目前，关于尿液中多种新烟碱类杀虫剂同时检测的方法多采用固相萃取预处理技术结合液相色谱-质谱联用检测方法。选择固相萃取作为尿液样品预处理方法是基于其自动化程度高、易于批量处理，更能满足大样本检测的要求。然而，新烟碱类杀虫剂不同品种之间的水溶性质差异较大(184–590000μg/mL)，导致其在吸附剂填料上的保留行为或在溶剂中的溶解行为差异较大。在固相萃取淋洗步骤，选择淋洗液洗去尿液中水溶性杂质的同时，易导致水溶性大的新烟碱类待测物同时被洗掉损失，回收率降低。若不进行淋洗，待测物整体的回收率较高，但基质效应相比于淋洗样本却明显增大。若用于大样本人群的尿液检测，易损伤色谱柱和质谱仪，导致仪器稳定性逐渐变差。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法，包括如下步骤：
(1)准备内标储备液和目标分析物标准储备液；所述目标分析物为新烟碱类杀虫剂和/或新烟碱类杀虫剂的代谢产物；
(2)待测尿液样品预处理：
①酶解：取待测尿液，加入内标储备液、酶解应用液，震荡孵育，将结合态的新烟碱类杀虫剂分解为游离状态；
②固相萃取分离净化：
a)活化固相萃取小柱；
b)上样：将酶解后的尿样加到固相萃取小柱上；
c)洗脱：用二氯甲烷-乙腈混合物洗脱待测物得到洗脱液，二氯甲烷与乙腈的体积比为 8-5:2-5，优选7:3；
③萃取结晶去杂质：将洗脱液吹干后，加入前述二氯甲烷-乙腈混合物溶解残渣，离心，取上清液，吹干，用甲醇-甲酸水复溶得到复溶液，所述的甲醇-甲酸水是由甲醇与浓度为0.15％的甲酸水溶液按照体积比1-2:9-8混合得到，优选甲醇与浓度为0.15％的甲酸水溶液体积比为1:9；
④复溶液经滤膜过滤；
(3)尿液样品分析：过滤后的复溶液进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测定；
(4)标准曲线的绘制：使用目标分析物标准储备液进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测定分析物相对于内标的峰面积比减去空白样品中分析物相对于内标的峰面积比(y)与每种分析物浓度(x)之间的线性关系，得到目标分析物的标准曲线；
(5)数据分析：由目标峰面积与内标峰面积之比对分析物进行内标法定量。
所述酶解应用液为β-葡萄糖醛酸酶应用液，由β-葡萄糖醛酸酶原液于乙酸铵溶液中混匀得到。
所述新烟碱类杀虫剂为吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺、呋虫胺、氯噻啉、氟啶虫酰胺、氟啶虫胺腈中的一种或多种，所述代谢产物为2-咪唑烷酮、去甲基啶虫脒中的一种或多种，所述内标为啶虫脒-d3。
优选地，质谱法选择电喷雾离子源正离子模式以及多反应监测模式。
优选地，质谱检测中定量离子对分别为：呋虫胺203.1>129.1；啶虫脒223.1>126.1；噻虫胺250.0>169.0；吡虫啉256.0>209.1；烯啶虫胺271.0>225.1；噻虫嗪292.0>211.0；噻虫啉 253.1>126.0；氯噻啉262.0>181.0；氟啶虫酰胺230.1>203.0；氟啶虫胺腈278.1>174.1；2-咪唑烷酮87.1>44.1；去甲基啶虫脒209.0>125.7；啶虫脒-d3226.1>126.1。
优选地，质谱检测中分析物的定性离子对、锥孔电压、碰撞电压、保留时间如表3中所示。
在上述技术方案中，液相色谱检测中的流动相A相为甲醇，B相为含有乙酸铵和甲酸的水溶液，B相溶液中乙酸铵浓度为5mmol/L、甲酸的体积百分比浓度为0.2％。
在上述技术方案中，色谱分离的色谱柱为2.1×100 mm，柱温40℃；洗脱条件为梯度洗脱：0min，10％A；2.5min，30％A；4.0min，70％A；4.5min，90％A；6min，90％A；8min，10％A；11min，10％A；流速为0.23mL/min；进样量5μL。
在上述技术方案中，所述β-葡萄糖醛酸酶应用液的配制方法为：配制2mol/L的乙酸铵溶液，并用冰醋酸调节pH至4.5；吸取100μLβ-葡萄糖醛酸酶原液于100mLpH为4.5的乙酸铵溶液中，摇匀，备用。
在上述技术方案中，所述内标储备液和目标分析物标准储备液采用乙腈配制，所述步骤 a)活化固相萃取小柱方法为：依次用2mL甲醇、2mL水活化Oasis HLB固相萃取小柱。
本发明的有益效果是：采用萃取结晶技术替代固相萃取中的淋洗步骤，通过加入有机溶剂降低尿液基质中无机盐的溶解度，使其结晶析出，基质效应得到了显著改善，可使所有目标分析物的峰面积显著增加，提高了待测物的回收率以及检测方法的灵敏度，使得检测结果更加准确可靠。对洗脱条件、色谱和质谱条件进行了优化，该方法的线性很好，对于不同的分析物，最低检出限范围为1.5pg/mL至15pg/mL，最低定量限范围为5pg/mL至50pg/mL；三种加标水平下所有分析物的平均回收率在87.2％至104.2％之间；测试了日内和日间精度，该方法对所有分析物均具有令人满意的重现性(RSD<20.0％)。
附图说明
图1是不同预处理方法对目标化合物的影响。
图2是新烟碱类杀虫剂多反应监测色谱图，其中，(a)是200ng/mL混合标准溶液；(b)是混合尿样。
图3是不同流动相对目标化合物的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
1实验仪器与设备
本发明所用实验仪器与设备如表1所示。
表1实验仪器与设备
2实验试剂与材料
本发明所用实验试剂与材料如表2所示。
表2实验试剂与材料
待检尿样来源于：重庆某中学学生志愿者尿样。
3标准溶液及所用试剂的配制
用电子分析天平(万分之一)称取10种新烟碱类杀虫剂标准品(吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺、呋虫胺、氯噻啉、氟啶虫酰胺、氟啶虫胺腈)、2种代谢产物(2-咪唑烷酮、去甲基啶虫脒)、1种同位素内标(啶虫脒-d3)，均溶于乙腈中，配制成浓度为1000μg/mL的单标储备液。然后每个标准溶液各取10μL加入870μL乙腈，配置成浓度为10μg/mL的混标储备液。根据实验需要按一定浓度稀释成混标应用液，临用现配。所有储备液配制好后均封口置于-20℃保存。
β-葡萄糖醛酸酶应用液的配制：配制2mol/L的乙酸铵溶液，并用冰醋酸调节pH至4.5。吸取100μLβ-葡萄糖醛酸酶原液于100mLpH为4.5的乙酸铵溶液中，摇匀，分装于50mLEP 管中，存于4℃冰箱待用。
4实验方法
4.1尿液样品预处理
①酶解：取2mL解冻的尿液于5mL EP管中，依次加入10μL 1μg/mL的啶虫脒-d3内标应用液、200μL前面配制的β-葡萄糖醛酸酶应用液，置于37℃恒温震荡器，200r/min，孵育12h，将结合态的新烟碱类杀虫剂彻底分解为游离状态。
②固相萃取分离净化：
a)柱活化：依次用2mL甲醇、2mL水活化Oasis HLB固相萃取小柱；
b)上样：将2mL酶解后的尿样加到小柱上；
c)洗脱：用2mL二氯甲烷-乙腈(7:3，v/v)洗脱待测物。
③萃取结晶去杂质：将洗脱液氮吹至干后，加入1mL二氯甲烷-乙腈(7:3，v/v)溶解残渣，同时使无机盐结晶析出。13000r/min离心10min后，取上清液。氮吹至干，用300μL 甲醇-甲酸水(甲醇与体积百分比浓度为0.15％的甲酸水溶液以体积比为1:9混合配得)复溶。
④经0.22μm滤膜过滤后上机检测。
4.2尿液样品测定
采用超高效液相色谱(WatersACQUITYUPLC)与三重四极杆质谱(Waters Xevo TQ-S) 联用技术对尿液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物含量进行检测。质谱选择电喷雾离子源正离子模式以及多反应监测模式。定量离子对分别为：呋虫胺203.1>129.1；啶虫脒223.1>126.1；噻虫胺250.0>169.0；吡虫啉256.0>209.1；烯啶虫胺271.0>225.1；噻虫嗪292.0>211.0；噻虫啉253.1>126.0；氯噻啉262.0>181.0；氟啶虫酰胺230.1>203.0；氟啶虫胺腈278.1>174.1；2- 咪唑烷酮87.1>44.1；去甲基啶虫脒209.0>125.7；啶虫脒-d3226.1>126.1。
色谱分离选择C18色谱柱(2.1×100mm，Waters， USA)；柱温40℃。流动相为甲醇(A相)和5mmol/L乙酸铵溶液+0.2％甲酸(B相)，洗脱条件为梯度洗脱：0min，10％A；2.5min，30％A；4.0min，70％A；4.5min，90％A；6 min，90％A；8min，10％A；11min，10％A。流速为0.23mL/min；进样量5μL。
4.3标准曲线绘制：
将混标储备液用乙腈稀释成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200ng/mL 的混标应用液。取2mL解冻的混合尿样于5mL EP管中，依次加入10μL 1μg/mL的啶虫脒 -d3内标应用液、20μL混标应用液、200μL前面配制的β-葡萄糖醛酸酶应用液，置于37℃恒温震荡器，200r/min，孵育12h。接着，按前面“4.1②③④”的步骤进行处理。
5结果
5.1样品预处理优化
5.1.1洗脱条件选择
选择二氯甲烷和乙腈的混合物，并测试它们的体积比。几乎所有分析物的峰面积都随着乙腈比例的增加(从0％到50％)而增加。但是，当乙腈的比例超过30％时，洗脱液变为黄色，这表明基质被同时洗脱。因此，二氯甲烷-乙腈(70:30，v/v)是固相萃取实验中的最佳洗脱液。
5.1.2复溶条件选择
收集的洗脱液蒸发至干并在1mL二氯甲烷-乙腈(70:30，v/v)中复溶后，观察到明显的沉淀。但当残留物重新溶解在大比例的水溶液中时，没有发现明显的沉淀。我们推断这可能是由于从固相萃取程序中省去了洗涤步骤，导致尿液中某些水溶性基质共存(例如无机盐) 的共洗脱。为了证实这一发现，研究了两种预处理方法进行比较。
方法1：将洗脱液残留物直接重新溶解在300μL甲醇-甲酸水(甲醇与体积百分比浓度为 0.15％的甲酸水溶液以体积比为1:9混合配得)中，用于随后的上机检测。
方法2：在1mL二氯甲烷-乙腈(70:30，v/v)中复溶洗脱液残留物，并在13000×g下离心10分钟。然后将上清液浓缩至干，并重新溶于300μL甲醇-甲酸水(甲醇与体积百分比浓度为0.15％的甲酸水溶液以体积比为1:9混合配得)中，用于随后的上机检测。
结果如图1所示，与方法1相比，使用方法2可使所有分析物的峰面积显著增加，这表明干扰物的去除和基质效应均得到了显著改善。因此在本研究中选择了第2种预处理方法。
5.2质谱条件优化
本实验中，质谱仪在电喷雾离子源正离子模式下，检测到的结果响应值更高。我们基于多反应监测模式，对不同离子对、锥孔电压、碰撞电压等参数进行了优化，以保证12种待测物及内标的母离子和子离子均有较好的质谱响应信号。最终优化的质谱检测条件见表3，得到的质谱峰图见图2。
表3尿液中NNs同时检测的质谱参数
5.3色谱条件优化
本实验采用二元流动相，组分A为有机相，组分B为水相，考察了2种不同组成的流动相对NNs分离效果的影响。
(1)A相—甲醇，B相—5mmol/L乙酸铵溶液；
(2)A相—甲醇，B相—5mmol/L乙酸铵溶液+0.2％甲酸。
结果显示，“(2)A相—甲醇，B相—5mmol/L乙酸铵溶液+0.2％甲酸”作为流动相时，分离效果最好，峰形较佳，峰面积见图3所示。最终的色谱检测条件见表4。
表4尿液中NNs同时检测的色谱参数
5.4方法学评价
5.4.1线性范围、最低检出限和最低定量限
我们测试了加标样品中分析物相对于内标的峰面积比减去空白样品中分析物相对于内标的峰面积比(y)与每种分析物浓度(x)之间的线性关系。结果列在表5中，结果显示该方法的线性很好。
对于不同的分析物，最低检出限范围为1.5至15pg/mL，最低定量限范围为5至50pg/mL。
5.4.2回收率和精密度
测试了单个分析物的回收率，结果在表6-8中给出。三种加标水平下所有分析物的平均回收率在87.2％至104.2％之间。
测试了日内和日间精度，结果在表6-8中给出。该方法对所有分析物均具有令人满意的重现性(RSD<20.0％)。
5.4.3基质效应
对基质效应(ME)进行了评估，并将结果列在表5中。结果显示，尿液基质对所有分析物分析过程的干扰均可忽略，说明该预处理方法有效去除了基质中的共存干扰物。
5.4.4稳定性
测试了制备后尿液样品中分析物的稳定性，结果表明，所有分析物在室温下不暴露于光线下24h或在4℃下保存7天，没有表现出明显的降解，损失不超过5.0％。
表5尿样中目标分析物的线性、最低检出限(LOD)、最低定量限(LOQ)和基质效应(ME)
表6混标浓度0.1ng/mL
表7混标浓度10ng/mL
表8混标浓度100ng/mL
/>
Claims (5)
1.一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准备内标储备液和目标分析物标准储备液；所述目标分析物为新烟碱类杀虫剂和/或新烟碱类杀虫剂的代谢产物；所述新烟碱类杀虫剂为吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺、呋虫胺、氯噻啉、氟啶虫酰胺、氟啶虫胺腈中的一种或多种，所述代谢产物为2-咪唑烷酮、去甲基啶虫脒中的一种或多种；所述内标储备液和目标分析物标准储备液采用乙腈配制；
(2)待测尿液样品预处理：
①酶解：取待测尿液，加入内标储备液、酶解应用液，震荡孵育，将结合态的新烟碱类杀虫剂分解为游离状态；所述酶解应用液为β-葡萄糖醛酸酶应用液，由β-葡萄糖醛酸酶原液于乙酸铵溶液中混匀得到；
②固相萃取分离净化：
a)活化固相萃取小柱：依次用甲醇、水活化Oasis HLB固相萃取小柱；
b)上样：将酶解后的尿样加到固相萃取小柱上；
c)洗脱：用二氯甲烷-乙腈混合物洗脱待测物得到洗脱液，二氯甲烷与乙腈的体积比为8-5:2-5；
③萃取结晶去杂质：将洗脱液吹干后，加入前述二氯甲烷-乙腈混合物溶解残渣，离心，取上清液，吹干，用甲醇-甲酸水复溶得到复溶液，所述的甲醇-甲酸水是由甲醇与浓度为0.15％的甲酸水溶液按照体积比1-2:9-8混合得到；
④复溶液经滤膜过滤；
(3)尿液样品分析：过滤后的复溶液进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测定；
质谱法选择电喷雾离子源正离子模式以及多反应监测模式，质谱检测中定量离子对分别为：呋虫胺203.1>129.1；啶虫脒223.1>126.1；噻虫胺250.0>169.0；吡虫啉256.0>209.1；烯啶虫胺271.0>225.1；噻虫嗪292.0>211.0；噻虫啉253.1>126.0；氯噻啉262.0>181.0；氟啶虫酰胺230.1>203.0；氟啶虫胺腈278.1>174.1；2-咪唑烷酮87.1>44.1；去甲基啶虫脒209.0>125.7；
液相色谱检测中的流动相A相为甲醇，B相为含有乙酸铵和甲酸的水溶液，B相溶液中乙酸铵浓度为5mmol/L、甲酸的体积百分比浓度为0.2％；
色谱分离的色谱柱为BEH C181.7μm，2.1×100mm，柱温40℃；洗脱条件为梯度洗脱：0min，10％A；2.5min，30％A；4.0min，70％A；4.5min，90％A；6min，90％A；8min，10％A；11min，10％A；流速为0.23mL/min；进样量5μL；
(4)标准曲线的绘制：使用目标分析物标准储备液进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测定分析物相对于内标的峰面积比减去空白样品中分析物相对于内标的峰面积比y与每种分析物浓度x之间的线性关系，得到目标分析物的标准曲线；
(5)数据分析：由目标峰面积与内标峰面积之比对分析物进行内标法定量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述内标为啶虫脒-d3，啶虫脒-d3定量离子对为226.1>126.1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖醛酸酶应用液的配制方法为：配制2mol/L的乙酸铵溶液，并用冰醋酸调节pH至4.5；吸取100μLβ-葡萄糖醛酸酶原液于100mL pH为4.5的乙酸铵溶液中，摇匀，备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a)活化固相萃取小柱方法为：依次用2mL甲醇、2mL水活化Oasis HLB固相萃取小柱。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤②固相萃取分离净化c)洗脱步骤中，二氯甲烷与乙腈的体积比为7:3；所述③萃取结晶去杂质步骤中，所述的甲醇-甲酸水是由甲醇与浓度为0.15％的甲酸水溶液按照体积比1:9混合得到。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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