KR100752536B1 - 네오니코티닐 살충제에 대한 면역분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-네오니코티노이드 항체를 제조하기 위한 면역원 뿐만 아니라, 면역분석법에 의해 샘플중의 하나 이상의 네오니코티노이드 살충제의 존재를 측정하기 위한 항체, 이의 방법, 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명은 특히 종자와 같은 식물 번식 물질에 살포되는 네오니코티노이드 살충제의 농도를 측정하는데 적용되며, 상기 항체는 하기 화학식 I의 화합물에 선택적이다.
화학식 I
Figure 112005071186518-pct00040
상기 화학식 I에서,
A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
R 및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
또한, 하기 화학식 IA의 화합물 및 화학식 II의 단백질 접합체가 청구되어 있다.
화학식 IA
Figure 112005071186518-pct00041
화학식 II
Figure 112005071186518-pct00042
상기식에서,
A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들에 결합된 질소 원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
n은 1 내지 5의 정수(바람직하게는 3 내지 5의 정수이다)이고,
X는 O, N-NO2 또는 N-CN이고,
PR은 디프테리아 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 양이온화된 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 캐리어 분자의 단백질 잔기 또는 알칼린 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소 잔기이다.
면역분석법, 네오니코티닐 살충제, 항-네오니코티노이드 항체, 이미다클로프리드, 니텐피람, 아세트아미프리드

Description

네오니코티닐 살충제에 대한 면역분석법{Immunoassay for neonicotinyl insecticides}
본 발명은 살충제에 대한 면역분석, 이러한 분석을 수행하기 위한 항체 및 시약에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 분석을 수행하기 위한 방법 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 특히 샘플중에 네오니코티노이드 살충제를 검출하고 정량하는데 적용된다.
살충제
농작물중의 해충을 방제하기 위한 합성 살충제의 사용은 일반적인 관행이다. 이러한 방제로 농작물 수확을 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌기 때문에 이러한 관행은 상업적으로 고도로 성공하게 되었다. 그러나, 살충제를 효과적으로 사용하기 위해서는 곤충 내성, 환경 노출 및 노동자의 노출에 대한 우려의 관점에서 안전하게 취급되어야만 한다. 이러한 문제점에 적용되는 한가지 해결책은 보다 고도로 활성인 신규 살충제를 제공하여 구식의 매우 독성인 살충제에 대한 필요성을 감소시키고 환경적 살포 비율을 감소시키는 것이다.
시장에서 중요하게 인식되고 있는 하나의 새로운 부류의 살충제는 소위 "네오니코티노이드"라고 하는 살충제이다. 이러한 부류의 화합물은 예를 들어, 이미 다클로프리드, 아세트아미프리드 및 티아메톡삼이고 이들 각각은 미국 특허 제4742060호, 제5304566호 및 유럽 특허 제580553A2호에 기재되어 있다.
식물 번식 물질(예: 종자)을 살충제로 직접 처리하는 것은 단독으로 적용되거나 잎 또는 경작지 살충제 살포와 연계되는 경우 환경적 노출, 노동자 노출 및 해충 내성 증가를 감소시킬 필요성을 겨냥한 목적하는 응용법이다. 그러나, 종자 피복 장치를 적절히 조정하여 살충제가 종자 물질에 균일하게 살포되어 무엇보다 살충제 수행능 및 종자 식물독성과 관련된 문제점을 회피하는데 주력해야만 한다. 분석 장치를 사용하여 종자 피복 기구가 적절히 조정되고 적당히 작동하는지 및 처리된 다수의 종자가 선적을 위해 출하될 수 있는지를 결정할 수 있다. 그러나, 종자상에 살충제 잔사를 검출하기 위한 통상적인 방법은 매우 시간 소모적이고 비용이 많이 드는데 그 이유는 이들 방법이 가스-액체 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 고도로 전문적이고 값비싼 분석 절차를 요구하기 때문이다. 상기 두 크로마토그래피 기술은 유지비가 많이 들고 고도로 숙련된 기술자에 의해 작동되어야만 하는 값비싼 계기 작동을 요구한다. 종자 처리 기관 및 재배자는 통상적으로 그러한 기구를 갖고 있지 않거나 그러한 일에 대한 자질을 갖고 있지 않아 종자 샘플은 멀리 위치해 있는 분석 연구실로 운송되어야만 한다. 샘플이 상기 연구실에 의해 신속하게 일을 수행하는 바탕에서 분석되는 경우, 처리 기관은 운송된 뒤 대략 24시간에 분석 데이터를 받을 수 있다. 분석이 덜 신속한 경우 보다 길게 지연된다. 이들 지연으로 인해 피복 기관에서의 기계 공전 시간이 많아진다. 피복된 종자의 운송이 또한 지연된다.
보다 저렴하고 보다 효율적이며 보다 용이하게 취급될 수 있도록 현존하는 측정 기술을 개선시키는 것이 당해 기술분야의 급선무이다. 목적하는 방법은 또한 야외 조건하에 연구실 밖에서도 유용하여 이들이 종자 샘플상에 살포된 살충제의 존재 및 농도에 대한 정보가 재배자 또는 종자 처리 요원에게 신속하고 확실하게 제공될 수 있도록 해야한다. 이와 관련하여, 당해 방법이 다른 생성물로부터 활성 살충 물질을 구분하여 종자상에 존재하는 목적하는 활성 성분이 정량적으로 결정될 수 있도록 하는 것이 중요하다. 그러나, 다수의 전형적인 분석 방법은 아직도 심각한 한계를 안고있다. 이들 몇몇 한계는 면역분석 기술을 사용하여 극복될 수 있다.
살충제의 면역분석 및 검출
의학용 및 수의학용으로 주로 개발된 면역분석은 농학 분야에서 보다 많이 응용될 수 있는 것으로 밝혀지기 시작했다. 예를 들어, 면역분석은 농작물 병해, 아플라톡신 및 특정 항생제를 검출하고 정량하는데 유용하다. 살충제 검출용 면역분석은 과학 문헌(하기 참조)에 기재되어 있고 이들은 불과 10년전부터 상업적으로 시판되어 왔다.
면역분석은 고도로 특이적인 항체 시약 및 비교적 단순한 분석 장치를 기반으로 하여 광범위한 표적 물질을 검출하고/하거나 정량한다. 장치 또는 작동 조건보다는 차라리 항체가 분석적 특이성을 제공한다. 따라서, 면역분석은 비교적 조악한 샘플에 대해 수행될 수 있다. 추가로, 면역분석 방법은 먼거리의 비-연구실 장소에서 사용하는데 최적화되어 전문 연구실 뿐만 아니라 야외에서도 사용할 수 있게 되었다.
2,4-디클로로페녹시아세트산[문헌참조: Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874-878(1986)],
클로르설푸론[문헌참조: Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem. 33:962-965(1985)] 및
할로아세트아미드[문헌참조: Winzenburger, P.A. et al.(유럽 특허 공개공보 제340198호, 1989]를 포함하는 특정 제초제 및
디플루벤주론[문헌참조: Wie, S.I. et al., J. Agric. Food Chem. 30:949-957(1982)],
메탈락실[문헌참조: Newsome, W. H., J Agric. Food Chem. 33:528-530(1985)] 및
파라티온[문헌참조: Ercegovich, C.D. et al., J, Agric. Food Chem. 29:599-563(1981)]를 포함하는 다양한 살충제를 검출하기 위한 면역학적 방법이 공지되어 있다. 또한, 아트라진(미국 특허 제4,530,786호)에 대한 면역학적 검출 방법이 기재되어 있다. 시아나진, 디클로포프-메틸, 펜타클로르페놀, 2,4,5-T 및 테르부트린에 대한 면역학적 방법이 또한 공지되어 있다.
모든 상기 면역학적 방법은 적당한 항원(면역원)으로 면역화된 숙주 동물(전형적으로 래빗)으로부터 수득한 폴리클로날 항혈청을 사용하였다. 보다 최근에는 아트라진 및 이의 유도체 및 분해산물에 대해 특이적인 모노클로날 항체(mAb), 및 면역분석에서의 이러한 mAb의 용도가 문헌[참조: Schlaeppi et al., European Patent Publication EP 365818(1990)]에 기재되어 있다.
이들은 저분자량이기 때문에 살충제는 비-면역원이고 동물 숙주로부터 특이적 항체를 유발시키지 못한다. 따라서, 살충제 면역분석의 개발은 고분자량의 면역 유발성 "캐리어" 단백질에 접합되고 살충제의 구조적 특이성을 유지하는 살충제의 유도체인 합텐을 고안하는 것으로 시작하여 다수의 단계를 요구한다. 추가로, 이의 제조 공정동안에 항체를 스크리닝하기 위해 추가의 합텐이 또한 제조될 수 있고 이의 화학적 구조는 동물을 면역화시키기 위해 사용된 합텐과는 상이하다. 최종적으로 일단 항체 제제(폴리클로날 또는 모노클로날)가 수득되면 충분히 민감한 면역분석법이 개발되어야만 한다.
현대의 면역분석법에 사용되는 기본 전략이 다양한 문헌[참조: Voller, A. et al., eds., Immunoassays For the 80's, University Park, 1981; Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520(1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980]에 기술되어 있다. 각각의 방법에 중요한 것은 공지된 양의 목적하는 분석물을 사용하여 보정 곡선을 작성하는 것이다.
통상적으로 "표지된 항체"는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA)로서 언급된다. 여기서, 살충제의 단백질 접합체(소위 "피복" 또는 "스크리닝 항원")는, 생성되는 항-살충제 항체의 면역 대상이 되는 살충제 면역원에 사용된 캐리어 단백질과 구조적으로 무관한 단백질을 사용하여 제조된다. 피복 항원 접합체는 마이크로플레이트 웰의 표면과 같은 고형 상 지지체상에 고정화되어, 반응당 고형 상 살충제의 양이 고정된다. 공지된 양의 항체는 시험 샘플과 함께 첨가된다. 고정화된 살충제는 제한된 수의 항체 결합 부위에 대해 미지의 샘플중의 유리된 살충제와 경쟁한다. 액체상중의 항체와 분석물간의 상호작용은 고형 상 살충제에 항체가 결합하는 것을 억제한다. 고형 상에 결합된 항체는 항-살충제 항체의 중쇄의 불변 영역에 특이적인 효소 접합된 제2 항체에 의해 검출된다. 많은 효소 결합된 제2 항체는 상기 용도를 위해 시판되고 있다. 결합되지 않은 제2 항체를 세척한 후에, 고정화된 제2 항체는, 전형적으로 효소의 발색 기질을 첨가하여 결합된 제2 항체의 양에 직비례하여 형성되는 반응 생성물이 색을 나타냄으로써 검출된다. 따라서, 반응 생성물의 양은 미지의 샘플중의 분석물의 양에 역비례한다.
"표지된 항체" 방법을 변형시켜 피복 항원을 사용하지 않는다. 효소 면역분석법(EIA)은 항-살충제 항체를 고형 상에 고정화시키는 것이다. 살충제 합텐은 효소에 공유 결합시키고 수득한 효소 접합체를, 항-살충제 항체로 피복된 마이크로웰 또는 배양 시험관중에서 샘플과 함께 항온처리한다. 샘플중의 살충제는 살충제 합텐-효소 접합체와 경쟁하면서 고정화된 항체에 결합하게 된다. 고형 상을 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 항체-결합 효소 접합체는, 발색 기질을 첨가하여 검출된다[문헌참조: Bushway, R.J., L.P. Perkins, S.A. Savage, S.L. Lekousi, and B.S. Ferguson. 1988. Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40:647-654; Fleeker, J.R. and L.W. Cook. 1991. Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water. P. 78-85 in M. Vanderlann, L.H. Stanker, B.E.Watkins, and D.W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington, D.C.: American Chemical Society.]
야외 또는 종자 처리 기관에서 수행될 수 있는 살충제와 같은 활성 성분으로 처리된 종자를 분석하는 방법이 농학 분야에서 요구되고 있다.
본 발명은 항-네오니코티노이드 항체를 제조하기 위한 네오니코티노이드 합텐 및 면역원 뿐만 아니라, 면역분석법에 의해 샘플중의 하나 이상의 네오니코티노이드 살충제의 존재를 결정하기 위한 항체, 방법, 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명은 특히 종자와 같은 식물 번식 물질에 살포되는 네오니코티노이드 살충제의 농도를 결정하는데 응용된다.
본 발명의 면역분석법은, 네오니코티노이드 살충제가 종자에 살포되는 종자 처리 기관에서 개인이 살포된 활성 성분의 양을 정량적으로 측정할 수 있도록 해준다. 당해 방법은 종자로부터 활성 성분의 신속한 추출 및 추출 용액의 신속한 면역분석 기반의 측정을 포함한다. 이들 측정을 사용하여 종자 피복 장치가 적절히 조정되고 적당하게 작동하고 있는지 및 처리된 많은 종자가 운송을 위해 출하될 수 있는지를 결정한다. 당해 분석법은 작동이 단순하여 단지 통상적인 실험실 장치 및 시약만이 요구되도록 고안되어 있다. 따라서, 면역분석법을 수행하는데 미숙한 개인도 단지 몇차례 시도한 후에 성공적으로 시험을 수행할 수 있다.
항원성 네오니코티노이드 접합체(면역원)는 네오니코티노이드 살충제 합텐을 디프테리아(Diptheria) 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 캐리어 분자에 접합시킴으로써 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 유도체화된 소 혈청 알부민, 양이온화된 소 혈청 알부민등과 같은 유도체화된 물질의 접합체가 제조될 수 있다[문헌참조: A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce and J.G. Michael(1987) J. Immunol. 138:833-837]. 이어서, 이들 면역원을 숙주 동물에게 주사하여 숙주 동물이 네오니코티노이드 합텐에 대한 항체를 생산하도록 하고 이러한 항체를 수거할 수 있다. 이어서 이들 항체는 살충제 또는 항체를 표지시키는 다양한 공지된 마커를 사용함으로써 상응하는 네오니코티노이드 살충제를 검출하기 위한 다양한 면역분석법에 사용될 수 있다. 면역분석법의 몇몇 양태에서, 네오니코티노이드 살충제 유도체 또는 항체는 고정화된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 항체는 심지어 종자 피복 제제중에 혼입된 다른 네오니코티노이드 살충제를 포함하는 또 다른 살충제 활성 성분의 존재하에서도 목적하는 네오니코티노이드 살충제에 선택적으로 결합되는 것으로 밝혀졌다.
샘플중의 네오니코티노이드 살충제를 측정하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 검출 방법은 바이오센서, 및 효소적 측정, 형광 측정 , 화학발광 측정 및 방사선 측정 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 이종성 또는 동종성 포맷을 사용할 수 있고 마이크로웰 플레이트, 배양 시험관 및 고형 상으로서 라텍스 비드 또는 입자를 사용할 수 있다.
본 발명의 면역분석을 사용하여 식물 번식 물질과 같은 샘플중의 네오니코티 노이드 살충제 화합물, 예를 들어, 이미다클로프리드, 니텐피람, 아세트아미프리드, 티아메톡삼, 티아클로프리드 및 클로티아딘의 농도를 결정한다.
본 발명은 네오니코티노이드 살충제의 존재에 대해 샘플을 시험하기 위한 면역분석법을 제공한다. 이러한 면역분석법에서, 네오니코티노이드(항원)/항체 반응이, 항원 또는 항체를 표지시켜 반응 생성물이 검출되도록 할 수 있는 다양한 마커를 사용하여, 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 추가로, 항원 또는 항체의 고정화는 많은 경우에 검출을 용이하게 한다.
항원/항체 분석은 일반적으로 2개의 카테고리, 즉 이종성 분석법 및 동종성 분석법으로 분류될 수 있다. 이종성 분석법은 반응 생성물을 검출하기 전에 표지된 유리 성분으로부터 표지된 결합 성분을 분리함을 필요로 한다. 동종성 분석법은 이러한 분리 단계를 필요로하지 않는다. 분석법은 추가로 (1) 경쟁적(예를 들어, 항원이 표지된 항체에 대해 고형 상의 항원과 경쟁하거나 항원이 고형 상의 항체에 대해 표지된 항원과 경쟁한다) 또는 (2) 비경쟁적(표지와 항체 또는 항원간에 직접적인 관련이 있다)일 수 있다.
샘플중의 네오니코티노이드 살충제를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 실시에서 사용될 수 있는 면역분석 방법은 효소, 형광성, 화학발광성 및 바이오센서 형광분석법 및 방사선 면역분석법을 포함한다. 본 발명에 따른 효소 결합된 면역분석법(ELISA)에서, 목적하는 네오니코티노이드 살충제에 상응하는 합텐이 적절한 조건하에서 기질의 반응을 촉매하는 효소로 직접적으로 표지될 수 있거나 효소 표지된 항체에 의해 간접적으로 표지될 수 있다. 전형적으로 효소 활성은 발색 반응 생성물의 생성, 즉 육안으로 또는 분광측정 또는 굴절측정 수단에 의해 용이하게 검출될 수 있는 발색 종점(end point)에 의해 검출된다.
본 발명에 사용하기 위한 형광성 면역분석 기술에서, 목적하는 네오니코티노이드 살충제에 상응하는 합텐이 혈광발색단으로 직접적으로 표지되거나 형광발색단 표지된 항체로 간접적으로 표지될 수 있다. 형광발색단은 방사선(예: 자외선)을 흡수학고 이에 의해 여기되며 광(예: 가시광선)을 방출하는 염료이다.
본 발명의 한 양태에서, 샘플중의 네오니코티노이드 살충제의 농도를 결정하기 위한 방법은,
(a) 네오니코티노이드 살충제에 대해 선택적인 고정화된 항체를 고형 상에 제공하는 단계,
(b) 공지된 양의 네오니코티노이드 살충제 합텐-효소 접합체의 존재하에 샘플을 상기 고정화된 항체와 접촉시키는 단계,
(c) 단계 (b)의 고형 상을 세척하여 임의의 결합되지 않은 합텐-효소 접합체 또는 샘플을 제거하는 단계,
(d) 합텐-효소 접합체에 대해 특이적인 발색 기질을 단계(c)의 세척된 고형 상과 반응시켜 발색단을 생성하는 단계 및
(e) 단계(d)에 의해 생성된 발색단의 양을 측정하여 항체-결합된 합텐-효소 접합체의 양을 결정하여 상기 샘플중의 네오니코티노이드 살충제의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 면역분석법은 항체-피복된 시험관, 네오니코티노이드 합텐-효소 접합체, 효소 기질 및 발색측정 시그날의 생성을 종료시키는 용액을 포함하는 키트 형태로 제공된다.
본 발명은 폴리클로날 항체의 용도를 기준으로 기술되지만 당해 분야의 기술자는 폴리클로날 항체 대신 모노클로날 항체가 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 용어 "항체"는 일반적으로 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 언급하는데 사용된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 네오니코티노이드 살충제에 대한 모노클로날 항체는 당해 분야의 기술자에게 널리 공지된 면역화 기술 및 하이브리도마 배양 기술을 사용하여 제조된다. 적합한 하이브리도마 세포주는 바람직하게 항체 생산 세포와 쥐로부터 유래된 골수종 세포를 융합시켜 제조된다. 항체 생산 세포는 바람직하게 췌장 세포이다. 임의의 적합한 골수종 세포주가 사용될 수 있지만 일반적으로 다수의 널리 특징화된 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 네오티코티노이드 살충제에 대한 폴리클로날 항체는 당해 분야의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 제조된다.
본 발명은 또한,
(a) 생물학적으로 허용되는 캐리어 단백질에 커플링되는 네오니코티노이드 살충제 또는 면역학적 등량체를 포함하는 미리 결정된 양의 조성물을 숙주에게 투여하는 단계,
(b) 숙주로부터 혈청을 수거하는 단계 및
(c) 혈청으로부터 IgG 항체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 하나 이상의 네오니코티노이드 살충제에 결합하는 폴리클로날 IgG 항체 제제를 제공한다. 면역학적 등가의 항원은 숙주로 도입되는 경우 항원에 대한 항체가 생산되도록 하는 능력을 갖는다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 면역분석법은 특히 식물 번식 물질에 살포되는 네오니코티노이드 살충제의 양을 검출하는데 사용된다. 용어 "식물 번식 물질"은 이후 식물의 증식을 위해 사용될 수 있는 종자와 같은 식물의 모든 생식능 부분, 및 삽수 및 덩이줄기와 같은 영양 식물 부분(예: 감자)을 지칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 엄격한 의미에서의 종자, 뿌리, 열매, 덩이줄기, 구근, 뿌리줄기, 및 식물의 일부가 언급될 수 있다. 발아후 또는 토양으로부터 출현된 후 이식가능한 발아된 식물 및 어린 식물이 또한 언급될 수 있다. 이들 어린 식물은 이식전에 침지시켜 전체 또는 일부를 처리하여 보호될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 분석에 의해 검출될 수 있는 네오니코티노이드 살충제는 하기 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112002017895657-pct00001
상기식에서,
A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
R 및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 이미다졸리딘 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 분석에 의해 검출될 수 있는 네오니코티노이드 살충제는 화학식 III의 화합물이다:
Figure 112002017895657-pct00002
상기식에서,
A, R3 및 X는 상기 화학식 I에서 정의한 바와 같다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 면역분석은 네오니코티노이드 살충제에 대한 폴리클로날 항체를 사용한다. 이들 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 수득할 수 있다. 면역원(합텐-PPD 항원 접합체)을 항체 생산 종, 전형적으로 포유동물 및 바람직하게는 래빗 또는 양에게 주사하여 면역화시킬 수 있다. 전형적으로, 초기 주입후에 연속적으로 부스터(booster)를 주사하여 항체 반응을 최대화한다. 최적의 주사 양태는 암컷 뉴질랜드 화이트 래빗에게 다중 투여량으로 주사하는 것이다. 주사된 면역원의 양은 다양하지만 적절하게 검출 가능한 양의 항체를 유발해야만 한다. 항체 생산은 채혈하여 수득된 혈청을 EIA, ELISA 또는 간접 형광성 면역분석법에 의해 분석하여 입증될 수 있다.
면역측정 분석법에 사용되는 동일한 표지를 사용하여 본 발명에 사용된 합텐을 표지시킬 수 있다. 이들중에서 알칼린 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제와 같은 효소를 포함하는 리포터 분자(RM)가 언급될 수 있다. 추가로, 형광성, 발광성 또는 방사성 표지(예: 플루오레세인, 로다민, 루미놀, 아크리디움 및 방사성 동위원소 125I 등), 또는 금 및 셀레늄등과 같은 콜로이드 입자가 사용될 수 있다. 최종적으로, 란타니드 킬레이트 형광 발색단(예: 유로피움 및 테르비움)을 사용하여 시간 방출 형광 시그날을 생성할 수 있다. 가장 공통적인 효소 마커는 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 알칼린 포스파타제이다.
한 양태에서, 분광측정기를 사용하여 샘플중의 네오니코티노이드의 양을 검출한다. 그러나, 본 발명의 방법은 또 다른 유형의 발색 검출기를 사용하여 당해 분야의 기술자에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 검출 가능한 반응 생성물은 발색단으로 제한되지 않고 상기된 또 다른 표지를 포함한다.
하기 화학식 IA, IB 및 IIA의 합텐은 항원 네오니코티노이드 접합체(면역원) 및 분석 접합체를 제조하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
합텐(IA)
Figure 112002017895657-pct00003
상기식에서,
A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들에 결합된 질소 원자와 함께 이미다졸리딘 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
n은 1 내지 5의 정수(바람직하게는 3 내지 5의 정수이다)이고,
X는 O, N-NO2 또는 N-CN이다.
합텐(IB)
Figure 112002017895657-pct00004
상기식에서
A, R1, R2, R3 및 X는 화학식 IA에서 정의된 바와 같고,
E는 단일 공유 결합 또는 화학식 -(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 3의 정수이다)의 결합 잔기이다.
실시예 1: 합텐(IIIA)
Figure 112002017895657-pct00005
상기식에서,
A, R3, X 및 n은 화학식 IA에서 정의된 바와 같다.
합텐(IIIB)
Figure 112002017895657-pct00006
상기식에서,
A, R3 및 X는 화학식 IA에서 정의된 바와 같고,
E는 화학식 IB에서 정의된 바와 같다.
화학식 IIIA 및 IIIB의 합텐은 하기의 방법과 동일하게 제조될 수 있다:
Figure 112005071186518-pct00043
목적하는 합텐 IIIA 또는 IIIB는 하기의 화학식 IIID 또는 IIIE의 화합물로부터 선택된 적절한 2-아미노에탄에티올 유도체를 사용하여 제조된다:
Figure 112002017895657-pct00008
Figure 112002017895657-pct00009
상기식에서,
R은 화학식 I에서 정의된 바와 같다.
하기의 합텐은 본 발명의 방법에서 특히 유용한 것으로 밝혀졌다:
Figure 112002017895657-pct00010
(여기서, n은 각각 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 3 내지 5의 정수이다)
항원 네오니코티노이드 접합체(면역원) 및 분석 접합체는 당해 분야의 기술자에게 공지된 기술을 그대로 사용하여 네오니코티노이드 살충제 합텐을 캐리어 분자 또는 리포터 분자에 접합시켜 제조될 수 있다. 2개의 기본 방법이 사용되었다. 제1 방법은 접합체의 일부인 링커를 사용하는 것이다. 이들 링커는 동종이작용성 또는 이종이작용성이고 예를 들어, 기질 단백질내 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 디설파이드 결합을 형성할 수 있거나 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노 측쇄 또는 라이신 잔기와 숙신이미딜 에스테르와 같은 활성화된 아실 잔기사이의 아미드 결합을 형성할 수 있는 것들을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 링커상에 고반응성인 작용 그룹이 존재하고 접합체에 대한 기질 각각에 대해 반응하기가 합당하다. 그러나, 종종 덜 반응성인 작용 그룹(예를 들어, 하이드라존을 형성할 수 있는 그룹들)을 사용하는 것이 유용하다.
특히 2개의 단백질 잔기를 결합시키는데 유용한 제2 방법은 카보디이미드와 같은 탈수제를 사용하여 예를 들어, 접합체의 한 구성원상의 카복실 잔기와 또 다른 구성원상의 유리 아미노 그룹을 반응시켜 새로운 펩타이드 결합을 형성할 수 있다. 이 경우에, 시약은 접합체의 일부가 되지 않는다.
이러한 반응은 특히, 카복실 그룹이 활성화되지 않기 때문에 일어나지 않는다. 카보디이미드는 활성 중간체를 제공하고 물 원소를 제거하여 펩타이드 결합이 형성되는 쪽으로 평형을 전환시킨다.
접합체에 대한 두 방법 모두는 방법은 일반적으로 수성 용매에서 수행되는데 그 이유는 접합체를 형성하는 단백질이 변성되기 용기하기 때문이다. 단백질은 수성 환경에서 안정할 수 있도록 고안되어 있고 수성 매질과 거의 유사한 것으로 사료되는 에탄올과 같은 용매에서도 변성되는 것으로 공지되어 있다. 또한, 단백질 접합체 성분은 비수성 용매중에서 상대적으로 불용성이 되는 경향이 있다.
하기 화학식 II의 합텐 접합체가 본 발명의 방법에 유용한 것으로 밝혀졌다:
Figure 112002017895657-pct00011
상기식에서,
A, R1, R2, R3, n 및 X는 상기 화학식 IA에서 정의된 바와 같고,
PR은 (1) 면역원인 경우에 디프테리아 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 캐리어 분자 또는 (2) 알칼린 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제와 같은 리포터 분자(RM)의 단백질 잔기이다.
추가로, 하기 화학식 IIA의 합텐 접합체가 유사하게 유용하다:
Figure 112002017895657-pct00012
상기식에서,
A, R1, R2, R3, E 및 X는 화학식 IB에서 정의된 바와 같다.
하기의 접합체가 특히 본 발명의 방법에 유용한 것으로 밝혀졌다:
Figure 112002017895657-pct00013
(여기서, n은 1 내지 5의 정수이고 바람직하게는 3 내지 5의 정수이다)
시험될 샘플중의 항원 네오니코티노이드 또는 합텐-RM 접합체와 결합하는, 본 발명의 방법에 사용되는 비표지된 폴리클로날 항체는 면역측정 분석에 일반적으로 사용되는 임의의 지지체상에 고정화될 수 있다. 사용될 수 있는 지지체는 여과지, 라텍스 또는 폴리스티렌 비드 및 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 또 다른 적합한 마이크로웰 플레이트 또는 시험관이다. 이러한 지지체는 천연 또는 합성된 중합체 또는 유리와 같은 무정형 물질로 이루어질 수 있다. 니트로셀룰로스 또는 나일론 재질의 막이 반응 스트립용으로 유리하게 사용되고 폴리비닐, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 또 다른 플라스틱이 비드 또는 마이크로플레이트용으로 사용된다. 아가로스, 아크릴아미드 또는 라텍스계의 겔 또는 입자가 또한 사용될 수 있다. 추가로, 당해 기술 분야에 공지된 면역-크로마토그래픽 장치, 시험 스트립 및 측면 유동 장치가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 적합한 측면 유동 장치중에서, 예를 들어, 미국 특허 제4,366,241호에 기술된 유형의 측면 유동 장치가 언급될 수 있다. 이러한 물질에 항체를 결합시키는 기술은 당해 기술 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 지지체에 결합한 항체를 수득하기 위한 적합한 공급원은 예를 들어, 제조회사[Beacon Analytical Systems, Inc.(Portland, Maine)]이다.
분석용 종자 샘플을 제조하기 위해, 네오니코티노이드 처리된 로트(예를 들어, 캐놀라 종자 5mg 내지 100mg, 수수, 밀, 목화, 야생 옥수수 또는 사탕옥수수 10mg 내지 200mg)로부터 대표적인 서브샘플을 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 이소프로판올, 메탄올 또는 다양한 %의 물과 함께 이들 용매의 혼합물중에 분산시킨다. 적합한 용매-물 혼합물은 예를 들어, 1 내지 50% MeOH/H2O 및 1 내지 20% 아세토니트릴/H2O를 포함한다. 분산된 종자를 볼텍싱하여 혼합하고 이어서 약 20분동안 초음파 욕조에 방치하고 이어서 추가로 볼텍싱한다. 내용물을 방치시킨다. 액체 추출물의 공지된 분획을 제거하고 예를 들어, 공지된 양의 1% 아세토니트릴/물의 용액에 첨가한다. 추출물을 추가로 희석하여 추출된 네오니코티노이드의 농도가 보정 곡선 범위내에 있도록 한다. 103 내지 6 x 104 배의 희석물이 유용한 것으로 밝혀졌다. 면역분석은 약 35분의 시간이 소요된다. 추출, 및 분석용 추출물을 제조하는데는 약 30분이 소요된다. 따라서, 종사 샘플을 약 1시간 5분내에 추출하고 분석할 수 있다. 한 양태에서, 2개 이하의 종자 샘플(종자 샘플당 5개 이하의 서브샘플)을 1시간에 분석할 수 있다.
100만당 1만부 내지 10억당 1/2부인 네오니코티노이드 살충제의 농도를 본 발명에 따른 면역분석법으로 검출할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 샘플 또는 샘플 추출물중의 네오니코티노이드 살충제의 양이 보정 곡선 범위내에 있거나 이의 범위내에 있도록 희석될 수 있는 한 존재하는 임의의 네오니코티노이드 살충제의 양에 대해 적합하다.
항원 제제, 폴리클로날 항체의 제조 및 면역분석법은 하기의 비제한적인 실시예를 통해 보다 상세하게 설명된다.
실시예
실시예 1 - 티아메톡삼 합텐의 합성 방법
Figure 112002017895657-pct00014
1.1 2-메틸-1-니트로이소우레아
0℃에서 질산(120ml)/황산(280ml) 혼합물중에 O-메틸 이소우레아 설페이트(38.5g)을 용해시키고 0℃에서 2시간동안 교반시킨다. 혼합물을 교반시키면서 파쇄된 얼음상에 주의깊게 붓고 여과하여 파쇄된 얼음을 제거한다. 침상형 결정을 에틸 아세테이트중에 용해시키고 탄산칼륨을 첨가하여 용액을 알칼리화한다. 용액을 황산마그네슘상에서 건조시키고 여과한다. 여과물을 농축시켜 백색 분말(5g)을 수득한다.
1.2
메틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드(1.1a) 3g 및 물 15ml로부터 용액을 제조한다. 2N NaOH를 적가하여 pH를 11로 조정하고 용액을 빙욕조에서 냉각시킨다. 반응 플라스크에 pH 전극 및 온도계를 장착하고 2-메틸-1-니트로이소우레아(2.38g)을 소분획으로 첨가하여 용액의 온도를 2℃이하로 유지시키면서 수득한 투명한 염기성 용액을 신속하게 교반한다. 첨가를 종료한 경우 반응물을 1.5시간동안 0℃에서 교반시킨다. pH 9.6에서 안정화됨을 주의한다. THF(1ml)을 첨가하고 추가로 2시간동안 교반시킨다. 반응물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트에 붓는다. 유기상을 분리한 후에, 유기 분획물을 황산마그네슘상에서 건조시키고 용액을 여과한다. 여과물을 농축시켜 투명 오일을 수득한다. 3:1의 클로로메탄/아세토니트릴로 용출시키면서 실리카 겔상에서 조 오일을 섬광 크로마토그래피하여 백색 고체로서 목적하는 생성물 750mg을 수득한다.
1.3
1.2의 생성물(1.44g)을 파라포름알데하이드(422mg), 메탄설폰산(0.023ml) 및 포름산(10ml)과 배합하고 55℃에서 15시간동안 가열시킨다. 반응물을 진공 농축시킨다. 수득한 갈색 오일을 톨루엔중에 현탁시키고 공비적으로 용액을 제거하여 건조시킨다. 수득한 오일을 1:1:1의 THF/디옥산/아세토니트릴중에서 용해시키고 이를 과량의 디아조메탄으로 처리한다. 상기 용액을 30분동안 교반시키고 반응물을 아세트산으로 처리한다. 반응 혼합물을 오일로 농축시킨다. 에틸 아세테이트중에서 오일을 재구성하고 희석된 중탄산나트륨으로 세척하고 황산마그네슘으로 건조시키고 오일로 재농축시킨다. 이러한 오일을 3:1의 디클로로메탄/아세토니트릴중에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 투명 오일로서 목적하는 옥사디아진아민 부티릭 에스테르(1.3) 658mg을 수득한다.
1.4
1.3의 생성물(1.1g)을 아세토니트릴(50ml)중에 용해시키고 탄산칼륨 3g을 첨가한다. 1분획으로서 클로로메틸 클로로티아졸을 첨가하고 반응 혼합물을 55℃에서 20시간동안 가열한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하여 고체를 제거한다. 수득한 갈색 여과물을 오일로 농축시킨다. 오일을 3:1의 디클로로메탄/아세토니트릴중에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 황색/갈색 오일로서 목적하는 화합물 894mg을 수득한다.
1.5
화합물 1.4(372mg)를 진한 HCl 8ml 및 물 1ml중에 용해시키고 6시간동안 실온에서 교반시킨다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 pH가 4.5가 될때까지 1N NaOH를 첨가하여 주의깊게 염기성화한다. 에틸 아세테이트로 추출하고 유기 분획물을 황산마그네슘으로 건조시킨다. 목적하는 유기 분획물을 오일로 농축시키고 1:1의 디클로로메탄/아세토니트릴중에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 1.5(100mg)을 수득한다.
Figure 112002017895657-pct00015

실시예 2 내지 5 - 티아메톡삼 합텐
실시예 1의 합성 방법을 사용하여 중간체 1.1a를 화학식 NH2(CH2)nCO2R(1.1b)(여기서, n은 1 내지 5의 정수이고 R은 H 또는 C1-C4알킬이다)의 적절한 동족 화합물로 대체하여 표 1에 나타낸 하기의 티아메톡삼 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00016
실시예 6 내지 9 - 티아메톡삼 합텐
실시예 1의 합성 방법을 사용하여 중간체 1.1a를 화학식
Figure 112002017895657-pct00017
(1.1c)[여기서, E는 단일 공유 결합이거나 연결 잔기 -(CH2)m이고, m은 1 내지 3의 정수이고 R은 H 또는 C1-C4 알킬이다)의 적절한 동족 화합물로 대체하여 표 2에 나타낸 하기의 티아메톡삼 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00018
실시예 10 - 데스-니트로이미노 티아메톡삼 합텐의 합성 방법
Figure 112002017895657-pct00019

방법:
티아메톡삼-부티르산 합텐(100mg, 0.275mmol) 및 아니졸(6.5ml)을, 자성 교반 막대 및 환류 콘덴서를 장착한 10ml 들이 환저 플라스크에서 배합한다. 플라스크를 오일 욕조에 놓고 2시간동안 165℃에서 가열한다. 아니졸을 50℃에서 5시간동안 감압하에 제거한다. 수득한 오일 생성물(90.2mg)을 HPLC로 분석한 결과 순도가 93%이다.
특성화를 위한 분광측정 데이터:
HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18 5u(25 x 0.46cm); 아세토니트릴: 20mM 인산(40:60); 1.0ml/분; T = 40C; UV @ 240nm(BW = 100nm); 수행 시간: 13분; 체류 시간: 4.6분.
TLC:(디올 겔) 디클로로메탄/아세토니트릴, 2:1 Rf = 0.25.
1H NMR(CD3CN, 300MHz): δ7.43(t, 1H), 4.78(s, 4H), 4.75(s, 4H), 4.48(d, 2H), 3.29(t, 2H), 2.27(t, 2H), 1.73(q, 2H).
EI/DEP 질량 스펙트럼: m/z 319(M+)
연소 분석: 이론치: C, 41.32; H, 4.41; N, 13.14;
실측치: C, 40.13; H, 4.43; N, 12.99
실시예 11 내지 18 - 데스-니트로이미노 티아메톡삼 합텐
실시예 10의 합성 방법을 사용하여 실시예 1에서 수득한 화합물을 실시예 2 내지 9의 적절한 동족 화합물로 대체하여 표 3에 나타낸 하기 데스-니트로이미노 티아메톡삼을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00020
실시예 19 내지 27 - 이미다클로프리드 합텐
실시예 1의 합성 방법을 사용하여 1.2에서 수득한 니트로구아니딜 유도체를 통해 또는 중간체 1.1a를 실시예 2 내지 9에서 나타낸 바와 같은 화학식 1.1b 또는 1.1c의 적절한 동족체로 대체함으로써 수득한 동족체를 통해 표 4에 나타낸 이미다클로프리드의 하기 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00021
실시예 28 내지 36 - 데스-니트로이미노 이미다클로프리드 합텐
실시예 10의 합성 방법을 사용하여 실시예 1에서 수득한 화합물을 실시예 19 내지 27의 적절한 동족 화합물로 대체하여 하기의 데스-니트로이미노 이미다클로프리드 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00022
실시예 37 내지 45 - 클로티아딘 합텐
실시예 1의 합성 방법을 사용하여 1.2에서 수득한 니트로구아니딜 유도체를 통해 또는 중간체 1.1a를 실시예 2 내지 9에서 나타낸 바와 같은 화학식 1.1b 또는 1.1c의 적절한 동족체로 대체하여 수득한 동족체를 통해 표 6에 나타낸 클로티아딘의 하기 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00023
실시예 46 내지 54 - 데스-니트로이미노 클로티아딘 합텐
실시예 10의 합성 방법을 사용하여 실시예 1에서 수득한 화합물을 실시예 37 내지 45의 적절한 동족체 화합물로 대체하여 표 7에 나타낸 하기의 데스-니트로이미노 클로티아딘을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00024
실시예 55 내지 63 - 티아클로프리드 합텐
화학식 IIIA 및 IIIB의 합텐에 대해 특정화된 합성 방법을 사용하여 표 8에 나타낸 하기 클로티아딘의 합텐을 제조한다.
Figure 112002017895657-pct00025
실시예 64 - 티아메톡삼 면역원의 제조
64.1
정제된 단백질 유도체(튜버큘린, PPD)의 용액을 0.01M PBS(pH 7.4)중에서 1mg/ml의 농도로 제조한다. 당해 용액의 분액 0.5ml의 pH를, 0.1M HCl를 사용하여 4.5 내지 5.0으로 조정한다.
64.2
실시예 1의 티아메톡삼 합텐을 0.1M 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(pH 4.5)중에 용해시킨다. 합텐 및 PPD 용액을 배합한다.
64.3
1-(디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 1mg을 증류된 탈이온수 100㎕중에 용해시킨다. 즉시 EDC 용액을 3.2의 합텐-PPD 용액에 첨가한다. 실온에서 2시간동안 회전시킴에 의해 합텐-PPD-EDC 용액을 혼합한다. 반응 혼합물을 1000 내지 20000 돌턴의 분자량 컷 오프를 갖는 투석 백으로 옮긴다. 48시간동안 하루 3회에 걸쳐 4℃에서 PBS 2ℓ에 대해 충분히 투석한다.
실시예 65 - 이미다클로프리드 면역원의 제조
실시예 64의 방법을 사용하여 실시예 21의 합텐을 통해 이미다클로프리드 면역원을 제조한다.
실시예 66 - 클로티아딘 면역원의 제조
실시예 64의 방법을 사용하여 실시예 39의 합텐을 통해 클로티아딘 면역원을 제조한다.
실시예 67 - 티아클로프리드 면역원의 제조
실시예 64의 방법을 사용하여 실시예 57의 합텐을 통해 클로티아딘 면역원을 제조한다.
실시예 68 - 면역화 스케줄 및 항체의 수거
초기 면역화를 위해, 실시예 64의 면역원을 프로인트 완전 애쥬반트중에 용해시킨다. 암컷 뉴질랜드 화이트 래빗에 접종한다. 각 부위에 면역원 약 25㎍을 주사한다. 면역원 약 38㎍이 각부위에 주사되는 것을 제외하고는 유사하게 양을 면역화시킨다.
후속 면역화에서, 프로인트 완전 애쥬반트중에 면역원을 용해시킨다. 면역화 사이에 4주 동안 동물을 방치하고, 면역화 10일 후 채혈한다.
부스터 주사액을 투여하고 동물들을 9개월 동안 채혈하는데, 이 시점에서 동물들을 방혈한다.
당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 폴리클로날 항체를 수거한다.
실시예 69 - 합텐-효소 접합체의 제조
69.1
실시예 1의 티아메톡삼 합텐(3.1mg), N-하이드록시숙신이미드(NHS)(4.0mg) 및 EDC(4.6mg)을 동일 바이엘에서 배합한다. 실온에서 15분동안 질소를 약하게 주입하여 이들 물질을 건조시킨다.
69.2
무수 디메틸포름아미드(2.0ml)을 첨가하고 혼합물을 1분동안 초음파 처리한다. 수득한 용액을 실온에서 밤새 항온처리한다.
69.3
고추냉이 퍼옥시다제(8.5mg)을 소형 바이엘의 탄산 완충액(2.0mL. 0.05M pH 9.6)중에 용해시킨다. 바이엘을 빙 욕조중에 놓는다.
69.4
6.2의 합텐-NHS-EDC 용액 총 100㎕를 1시간에 걸쳐 서서히 첨가하고 혼합물을 2시간동안 교반시키면서 항온처리한다.
반응 혼합물을 PBS(0.01M, pH 7.2)로 평형화시킨 세파덱스 G-25M 칼럼에 통과시킨다. 효소 접합체를 첫번째 용출물 3.0mL중에서 수거하고 동일 용적의 글리세롤을 첨가한다. -20℃에서 저장한다.
실시예 70 - 티아메톡삼으로 처리된 캐놀라 종자의 면역분석
종자 추출물 소량을 예상되는 티아메톡삼의 농도가 0.5 내지 120부/109의 보정 곡선의 범위에 있을때까지 1% MeOH/H2O로 희석한다. 항체 피복된 시험관을 표지시키고 첫번째 및 마지막 시험관이 표준물이고 잔여 표준물 및 샘플이 상호 혼합되도록 시험관 랙에 놓는다. 시험관 랙은 랙이 시험관의 손실 없이 뒤집어 질수 있도록 시험관을 잡고 있다. 표준물 또는 샘플(0.5ml)의 분액을 모든 상응하는 시험관에 첨가한다. 효소 접합체 용액(0.5ml)을 모든 시험관에 첨가한다. 랙을 약하게 진탕시켜 모든 시험관의 내용물을 혼합시킨다. 시헌관을 실온에서 20분동안 항온처리한다. 랙을 뒤집어서 모든 시험관의 내용물을 제거한다. 증류된 H2O를, 플립 톱(filp-top) 세척병을 사용하여 넘쳐 흐를정도로 모든 시험관에 첨가하고 세척액을 버린다. 시험관을 추가로 3회 세척한다. 최종적으로 세척한후에 랙을 뒤집고 시험관을 깨끗한 종이 타월위에 약하게 두들겨 여분의 세척액을 제거한다. 효소 기질(0.5ml)을 모든 시험관에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리한다. 랙을 상기 항온처리동안에 2.5분 마다 약하게 진탕시킨다. 산성 스톱 용액(1M HCl 0.5ml)을 모든 시험관에 첨가하고 시그날 생성을 종료시킨다. 표 10에 나타낸 바와 같이 반응 생성물의 흡광도를 450nm에서 측정한다. 표준물의 흡광도를 사용하여 Y = m Ln(X) + B의 형태로 회귀 함수로서 보정 곡선을 작성한다. 각 샘플의 흡광도를 함수에 삽입하여 희석된 샘플중의 네오니코티노이드 살충제의 농도를 측정한다. 수득한 농도에 희석 배수를 곱하여 본래의 샘플중의 네오니코티노이드 살충제의 양을 계산한다.
Figure 112002017895657-pct00026
티아메톡삼 표준물의 반응을 기술하는 함수는 회귀 분석을 통해 작성한다. 이러한 데이터 설정을 통해 Y = -0.191 Ln(X) + 1.23, r = -0.999(여기서, Y는 분석 반응이고 X는 티아메톡삼 표준물의 농도이다)인 표준 곡선을 작성한다.
실시예 71 - 티아메톡삼으로 처리된 농작물 종자의 교차 반응성 시험
71.1 종자의 추출
목화, 야생 옥수수, 수수, 사탕옥수수 및 밀 50g 또는 캐놀라 40g을 8온스의 입구가 넓은 자르(jar)에 무작위로 첨가하여 처리된 종자를 서브샘플링한다. 캐놀라를 4회 서브샘플링하고 또 다른 종자 유형의 5개의 서브샘플을 사용한다. 용매(150ml)를 첨가하고 뚜껑을 단단히 밀봉한다. 목화를 5% 아세토니트릴/물중에서 추출하는 반면, 다른 종자들은 20% 메탄올/물의 용매계를 사용하여 추출한다. 자르를 30초동안 손으로 격렬하게 진탕시키고 20분동안 실온에서 초음파 처리 물 욕조에 방치한다. 샘플을 이전에 기술된 바와 같이 2회 진탕시킨다. 각 자르의 내용물을 약 5분동안 방치시키고 분취액(0.10ml)을 분석을 위해 취한다. 상기 분취액을 1% 메탄올/물로 희석하여 잔사가 표준 곡선의 범위내에 있도록 한다.
71.2 면역분석법
항체-피복된 폴리스티렌 항온처리 시험관을 표지시키고 첫번째 및 마지막 시험관이 표준물이고 잔여 표준물 및 샘플이 혼합되도록 시험관 랙에 놓는다. 샘플 및 표준 용액(0.50ml)을 상응하는 시험관에 첨가한다. 유사한 용적의 효소 접합체 용액을 첨가한다. 랙을 약하게 진탕시켜 용액을 혼합하고 실온에서 20분동안 항온처리되도록 설정한다. 스테인레스강 팬 위에서 랙을 뒤집어서 모든 시험관의 내용물을 제거한다. 증류수를 사용하여 넘쳐 흐르도록 하면서 각각의 시험관을 세척한다. 랙을 뒤집어서 경사지게 하여 세척수를 버린다. 세척을 4회 반복한다. 이어서 랙을 뒤집고 종이 타월상에 약하게 두들겨 대부분의 잔여 세척액을 제거한다(시험관에 잔류하는 임의의 액체는 분석 결과에 영향을 미치지 않는다). 효소 기질 용액(0.50ml)을 시험관에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리한다. 랙을 2.5분 간격으로 약하게 흔들어 효소에 충분한 양의 기질이 확실히 공급될 수 있도록 한다. 산성 스톱 용액(0.50ml)을 첨가하여 청색 시그날의 생성을 종료한다. 각 시험관내 용액의 흡광도는 450nm에서 분광학적으로 측정한다. 샘플내 분석물의 농도는 y= m In(x) + b의 형태의 회귀 함수로부터 측정한다.
71.3 교차 반응성 측정
교차 반응성 또는 면역분석의 특이성을 평가하여 종자 피복에서 발견되는 또 다른 시험 물질이 티아메톡삼에 대한 측정을 방해하는지를 결정한다. 시험 물질을 1% 메탄올/물중에 용해시켜 농도가 1000 내지 0.01ng/ml이 되도록 한다. 각 농도의 분액을 상기한 바와 같이 분석한다. 이러한 범위에 대한 각 시험 물질의 반응성은 문헌[참조: Brady, J.F; Turner, J.; Skinner, D.H. "Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water sample." J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2542-2547]에 기재되어 있다.
71.4 결과
분석된 시험 물질중에서, 티아메톡삼만이 면역분석에 있어서 상당한 반응성이 있는 것으로 밝혀졌다(하기 표 9). 따라서, 면역분석은 티아메톡삼에 대해 특이적이다.
처리된 종자 로트의 서브샘플은 면역분석법 및 HPLC로 분석된다. 이들 분석 결과는 표 11에 나타낸다. 표 11은 티아메톡삼에 대한 40개의 종자 샘플에 대한 폴리클로날 항체 및 HPLC 분석을 사용한 평균 면역분석 결과의 상호관계를 나타낸다. 가장 잘 일치하는 회귀선은 유사한 결과가 각 방법에 의해 수득됨을 나타낸 다.
Figure 112005071186518-pct00044
당해 기술 분야의 기술자는 광범위하게 기술된 바와 같이 본 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않으면서 상기된 발명에 대해 수많은 변형 및 변화를 가할 수 있음을 인지할 것이다.
Figure 112002017895657-pct00028
Figure 112002017895657-pct00029
Figure 112002017895657-pct00030

Claims (31)

  1. 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드 합텐을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 제조된 폴리클로날 항체이고 하기 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는, 샘플중의 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제의 양을 결정하기 위한 면역분석법에 유용한 항체.
    화학식 I
    Figure 112007005842527-pct00031
    상기식에서,
    A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
    R 및 R3는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
    X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 이미다클로프리드, 티아메톡삼 및 클로티아딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물에 선택적인 항체.
  4. 하기 화학식 IA의 화합물.
    화학식 IA
    Figure 112002017895657-pct00032
    상기식에서,
    A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
    R3는 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
    n은 1 내지 4의 정수이고,
    X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
  5. 제4항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112002017895657-pct00033
  6. 제5항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112002017895657-pct00034
  7. 제4항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112002017895657-pct00035
  8. 제7항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112002017895657-pct00036
  9. 하기 화학식 II의 단백질 접합체.
    화학식 II
    Figure 112007005842527-pct00037
    상기식에서,
    A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
    R3은 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들에 결합된 질소원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
    n은 1 내지 4의 정수이고,
    X는 N-NO2 또는 N-CN이고,
    PR은 디프테리아(Diptheria) 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 양이온화된 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 및 키홀 림펫 헤모시아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 캐리어 분자의 단백질 잔기이거나 알칼린 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소 잔기이다.
  10. 제9항에 있어서, 하기 화학식의 단백질 접합체.
    Figure 112005071186518-pct00038
  11. 제9항에 있어서, 하기 화학식의 단백질 접합체.
    Figure 112005071186518-pct00039
  12. (a) 하기 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제에 대해 선택적인 고정화된 항체를 고형 상에 제공하는 단계,
    (b) 공지된 양의 네오니코티노이드 살충제 합텐-효소 접합체의 존재하에 샘플을 상기 고정화된 항체와 접촉시키는 단계,
    (c) 단계 (b)의 고형 상을 세척하여 임의의 결합되지 않은 합텐-효소 접합체 또는 샘플을 제거하는 단계,
    (d) 합텐-효소 접합체에 대해 특이적인 발색 기질을 단계(c)의 세척된 고형 상과 반응시켜 발색단을 생성하는 단계 및
    (e) 단계(d)에 의해 생성된 발색단의 양을 측정하여 항체-결합된 합텐-효소 접합체의 양을 결정하고 상기 샘플중의 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플중의 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제의 농도를 측정하는 방법.
    화학식 I
    Figure 112007005842527-pct00045
    상기식에서,
    A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
    R 및 R3는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
    X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
  13. 제12항에 있어서, 적합한 용매중에서 식물 번식 물질을 추출하여 샘플을 수득하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 식물 번식 물질이 종자인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 종자가 캐놀라, 수수, 밀, 목화, 야생 옥수수 및 사탕 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 항체가, 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드 살충제로 동물을 면역화시켜 생성되는 폴리클로날 항체인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질이 디프테리아 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 양이온화된 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 및 키홀 림펫 헤모시아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 캐리어 분자인 방법.
  18. 하나 이상의 컨테이너에 배합된,
    (a) 하기 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제에 선택적인 고정화된 항체를 갖는 고형 상 및
    (b) 네오니코티노이드 합텐에 접합된 효소를 포함하는 효소 접합체를 포함하는, 화학식 I의 네오니코티노이드 살충제의 양을 측정하기 위한 샘플의 면역분석법에 유용한 키트.
    화학식 I
    Figure 112007005842527-pct00046
    상기식에서,
    A는 2-클로로피리드-5-일 또는 2-클로로티아졸-5-일이고,
    R 및 R3는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이거나 R1 및 R2는 이들이 결합된 질소원자와 함께 이미다졸린 또는 옥사디아진 환을 형성하고,
    X는 N-NO2 또는 N-CN이다.
  19. 제18항에 있어서, 항체가, 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드로 동물을 면역화시킴으로써 생성되는 폴리클로날 항체인 키트.
  20. 제18항에 있어서, 효소가 고추냉이 퍼옥시다제인 키트.
  21. 제18항에 있어서, 항체가 이미다클로프리드, 티아메톡삼 및 클로티아딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 네오니코티노이드 살충제에 특이적으로 결합하는 키트.
  22. 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드 합텐을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 제조된 폴리클로날 항체이고 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는, 샘플중의 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제의 양을 결정하기 위한 면역분석법에 유용한 항체.
  23. (a) 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제에 대해 선택적인 고정화된 항체를 고형 상에 제공하는 단계,
    (b) 공지된 양의 네오니코티노이드 살충제 합텐-효소 접합체의 존재하에 샘플을 상기 고정화된 항체와 접촉시키는 단계,
    (c) 단계 (b)의 고형 상을 세척하여 임의의 결합되지 않은 합텐-효소 접합체 또는 샘플을 제거하는 단계,
    (d) 합텐-효소 접합체에 대해 특이적인 발색 기질을 단계(c)의 세척된 고형 상과 반응시켜 발색단을 생성하는 단계 및
    (e) 단계(d)에 의해 생성된 발색단의 양을 측정하여 항체-결합된 합텐-효소 접합체의 양을 결정하고 상기 샘플중의 네오니코티노이드 살충제의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플중의 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제의 농도를 측정하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 적합한 용매중에서 식물 번식 물질을 추출하여 샘플을 수득하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 식물 번식 물질이 종자인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 종자가 캐놀라, 수수, 밀, 목화, 야생 옥수수 및 사탕 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 항체가, 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드 살충제로 동물을 면역화시켜 생성되는 폴리클로날 항체인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질이 디프테리아 바이러스 기원의 정제된 단백질 유도체(PPD, 튜버큘린), 소 혈청 알부민, 양이온화된 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 난알부민 및 키홀 림펫 헤모시아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 캐리어 분자인 방법.
  29. 하나 이상의 컨테이너에 배합된,
    (a) 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제에 선택적인 고정화된 항체를 갖는 고형 상 및
    (b) 네오니코티노이드 합텐에 접합된 효소를 포함하는 효소 접합체를 포함하는, 니텐피람, 아세트아미프리드 및 티아클로프리드로부터 선택된 네오니코티노이드 살충제의 양을 측정하기 위한 샘플의 면역분석법에 유용한 키트.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 네오니코티노이드로 동물을 면역화시킴으로써 생성되는 폴리클로날 항체인 키트.
  31. 제29항에 있어서, 효소가 고추냉이 퍼옥시다제인 키트.
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