TR201910347T4

TR201910347T4 - Olanzapin haptenlerine yönelik antikorlar ve bunların kullanımı.

Info

Publication number: TR201910347T4
Application number: TR2019/10347T
Authority: TR
Inventors: Hryhorenko Eric; Sankaran Banumathi; R Decory Thomas; Tubbs Theresa; Colt Linda; M Remmerie Bart; Salter Rhys; Garrett Donahue Matthew; Gong Yong
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2019-07-22
Also published as: JP2015529201A; EP2887952B1; HK1211857A1; PL2887952T3; US20170343569A1; US10712353B2; WO2014031656A1; AU2019283807A1; AU2013305895A1; CN109400708A; US20170240653A1; AU2018200435B2; JP2019004889A; PT2887952T; JP6721641B2; JP6389177B2; EP3581195A1; AU2018200435A1; CN104755093B; CA2882595A1

Abstract

Örneğin bir rekabetçi immün analiz yönteminde bir numunede olanzapin tayini için kullanılabilecek olanzapine bağlanan bir antikor açıklanır. Antikor, tek bir yanal akış analiz cihazında çoklu aripiprazol, olanzapin, ketiapin ve risperidon tayini de dahil olmak üzere, hasta başı olanzapin tayinine yönelik bir yanal akış analiz cihazında kullanılabilir.

Description

TARIFNAME OLANZAPIN HAPTENLERINE YÖNELIK ANTIKORLAR VE BUNLARIN KULLANIMI Bulus Sahasi Mevcut bulus immün analiz alaniyla ilgili olup, daha özel bir ifadeyle, immün analizlerde olanzapin tayini için kullanilabilecek olanzapine baglanan antikorlar ile ilgilidir.

Bulusun Altyapisi Sizofreni, dünya popülasyonunun yaklasik olarak %O.45-l'ini etkileyen kronik ve zayif düsürücü bir psikiyatrik bozukluktur 645). Tedavinin temel hedefleri, psikotik semptomlarin sürekli remisyonunu saglamak, relapsin risk ve sonuçlarini azaltmak ve hastanin fonksiyonlarini ve genel yasam kalitesini iyilestirmektir. Birçok sizofreni hastasinda mevcut antipsikotik ilaçlarla semptom stabilitesi saglanir, ancak ilaca yetersiz baglilik, günlük uygulanan oral ilaçlarda relapsin yaygin nedenlerinden biridir. Uyumsuzlugun sonuçlarini arastiran birtakim çalismalarda (Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. "Pharmacotherapy Challenges in Patients with First-Episode Psychosis" Journal of Affective sizofreni hastalarinin daha yüksek relaps, hastaneye basvuru ve intihar oranlarina ve ayrica artmis mortalite oranlarina Sahip olduklari gösterilmistir. Sizofreni hastalarinin %40 ila 75'inin günlük oral tedavi rejimlerine bagli kalma konusunda zorlandigi kestirilmektedir (Lieberman, J. A.: Stroup, T. 8.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. 5.; Rosenheck, R. A.; Perkins, D. 0.; Keefe, R. S. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, E.

D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic TARIFNAME OLANZAPIN HAPTENLERINE YÖNELIK ANTIKORLAR VE BUNLARIN KULLANIMI Bulus Sahasi Mevcut bulus immün analiz alaniyla ilgili olup, daha özel bir ifadeyle, immün analizlerde olanzapin tayini için kullanilabilecek olanzapine baglanan antikorlar ile ilgilidir.

D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New England Terapötik ilaç izlemi (TDM), antipsikotik ilaçlar da dahil olmak 'üzere ilaçlarin seruni veya plazma konsantrasyonlarinin tedavi izlemi ve optimizasyon için tayin edilmesidir. Bu tip izlemler örnegin ilaç rejimlerine bagli kalmayan, terapötik dozlara ulasamayan, terapötik dozlara yanit vermeyen, optimum düzeyin altinda tolerans gösteren, ilaçlar arasi farmakokinetik etkilesimler sergileyen ya da anormal metabolizma sonucunda uygunsuz plazma konsantrasyonlari sergileyen hastalarin belirlenmesini saglar. Antipsikotik ilaçlarin hastada emilim, dagitim, metabolizma ve vücuttan atilma kapasitesi anlamli düzeyde bireysel degiskenlik gösterir. Bu tip farkliliklar eslik eden hastaliktan, yastan, eszamanli uygulanan ilaçtan veya genetik özelliklerden kaynaklanabilir. Farkli ilaç formülasyonlari da antipsikotik ilaçlarin netabolizmasini etkileyebilir. TDM, her hasta için doz optimizasyonu saglayarak terapötik ve fonksiyonel sonuçlari iyilestirir. TDM ilaveten reçete yazan hekimin reçete edilen dozajlara uyumu garanti etmesini ve etkili serum konsantrasyonlarinin elde edilmesini saglar.

Bugüne kadar, antipsikotik ilaçlarin serum veya plazma konsantrasyon düzeylerini belirlemeye yönelik yöntemler, UV veya kütle spektrometrisi tayini ile birlikte sivi kromatografisinin (LC) ve radyo immün analizlerin kullanimini içermistir (bkz. örnegin Woestenborghs vd., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA's" in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241- 246. Analysis of Drugs and Metabolites, including Anti- infective Agents; Heykants vd., 1994 'The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang vd., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New England Terapötik ilaç izlemi (TDM), antipsikotik ilaçlar da dahil olmak 'üzere ilaçlarin seruni veya plazma konsantrasyonlarinin tedavi izlemi ve optimizasyon için tayin edilmesidir. Bu tip izlemler örnegin ilaç rejimlerine bagli kalmayan, terapötik dozlara ulasamayan, terapötik dozlara yanit vermeyen, optimum düzeyin altinda tolerans gösteren, ilaçlar arasi farmakokinetik etkilesimler sergileyen ya da anormal metabolizma sonucunda uygunsuz plazma konsantrasyonlari sergileyen hastalarin belirlenmesini saglar. Antipsikotik ilaçlarin hastada emilim, dagitim, metabolizma ve vücuttan atilma kapasitesi anlamli düzeyde bireysel degiskenlik gösterir. Bu tip farkliliklar eslik eden hastaliktan, yastan, eszamanli uygulanan ilaçtan veya genetik özelliklerden kaynaklanabilir. Farkli ilaç formülasyonlari da antipsikotik ilaçlarin netabolizmasini etkileyebilir. TDM, her hasta için doz optimizasyonu saglayarak terapötik ve fonksiyonel sonuçlari iyilestirir. TDM ilaveten reçete yazan hekimin reçete edilen dozajlara uyumu garanti etmesini ve etkili serum konsantrasyonlarinin elde edilmesini saglar.

Bugüne kadar, antipsikotik ilaçlarin serum veya plazma konsantrasyon düzeylerini belirlemeye yönelik yöntemler, UV veya kütle spektrometrisi tayini ile birlikte sivi kromatografisinin (LC) ve radyo immün analizlerin kullanimini içermistir (bkz. örnegin Woestenborghs vd., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA's" in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241- 246. Analysis of Drugs and Metabolites, including Anti- infective Agents; Heykants vd., 1994 'The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang vd., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Radyo immün analizlerde risperidon ve/veya paliperidon saptanir.

Salamone Vd., U.S. Patent No. 8,088,594'te, risperidonu ve paliperidonu saptayan, ancak farmakolojik olarak pasif metabolitleri saptamayan antikorlarin kullanildigi risperidona yönelik bir rekabetçi immün analizi açiklar. Rekabetçi immün analizde kullanilan antikorlar belirli bir immünojene karsi gelistirilir. Yine bir rekabetçi formatin kullanildigi, baska bir antipsikotik ilaç olan olanzapine yönelik bir ELISA analizi ID Labs Inc. (London, Ontario, Kanada) tarafindan pazarlanmaktadir. Kullanim Talimatlarinda analizin tarama amaciyla tasarlandigi ve adli kullanimi veya arastirma amaçli kullanimi hedefledigi ve spesifik olarak terapötik kullanima yönelik olmadigi belirtilir. Talimatlarda tüm pozitif numunelerin gaz kromatografisi/kütle spektrometrisi (GC-MS) ile dogrulanmasi gerektigi önerilir ve kullanilan antikorun olanzapin ve klozapini saptadigi belirtilir (bkz. ID Labs maliyetli ve emek-yogun olabilir ve genelde sadece uygun ekipmanlara sahip büyük. veya özellesmis laboratuarlarda uygulanir. bir adli Olanzapin ELISA kitidir.

U856l6505'te 3-fenil-l-adamantanasetik asit esasli teterli hapten ara ürünleri ve ilgili konjügatlar tarif edilir. sizofreni hastalarina doz uygulamasi yapildiktan sonra olanzapinin plazma konsantrasyonu açiklanir.

WO 96/30375'te, bir kararli olanzapin polimorfu ("Form II") tarif edilir. healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Radyo immün analizlerde risperidon ve/veya paliperidon saptanir.

WO 96/30375'te, bir kararli olanzapin polimorfu ("Form II") tarif edilir.

Antipsikotik ilaç düzeylerini belirlemeye yönelik baska yöntemlere, özellikle reçete yazan bir hekimin muayenehanesinde (dolayisiyla her hastanin tedavisi çok daha vakitlice ayarlanabilir) ve LC veya GC/MS ekipmanlarini içermeyen veya hizli test sonuçlarina ihtiyaç duyulan diger tibbi ortamlarda uygulanabilecek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadir.

Olanzapin sudur: Bulusun Kisa Açiklamasi Bulus, olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik bir yöntem saglar, bu yöntem, (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesini ve (ii) konakçinin, bir Formül 1 bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasini içerir, burada konakçi, olanzapine baglanan bir antikor üretir; burada Formül (I) sudur: R1 degiskeni H, CH2NH2 veya CH2NHC(O) (CH2) mCO2H' dir; R2 degiskeni H, Antipsikotik ilaç düzeylerini belirlemeye yönelik baska yöntemlere, özellikle reçete yazan bir hekimin muayenehanesinde (dolayisiyla her hastanin tedavisi çok daha vakitlice ayarlanabilir) ve LC veya GC/MS ekipmanlarini içermeyen veya hizli test sonuçlarina ihtiyaç duyulan diger tibbi ortamlarda uygulanabilecek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadir.

Olanzapin sudur: Bulusun Kisa Açiklamasi Bulus, olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik bir yöntem saglar, bu yöntem, (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesini ve (ii) konakçinin, bir Formül 1 bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasini içerir, burada konakçi, olanzapine baglanan bir antikor üretir; burada Formül (I) sudur: R1 degiskeni H, CH2NH2 veya CH2NHC(O) (CH2) mCO2H' dir; R2 degiskeni H, CH2NH2 veya CHzNHC (O) (CI-12) mCOzH ' dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak Rl ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica Rl ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi gerekir; m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir.

Mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir.

Antikorun simdilik tercih edilen yapilanmalari, Formül II'ye sahip bilesige karsi üretilmis 35 ve 61 ile gösterilen antikorlar ve Formül III'e sahip bilesige karsi üretilmis 3Fll ve 4G9-l ile gösterilen antikorlardir. Uygun baska bir immünojen, Formül IV'e sahip bilesiktir.

FonnulHiBHe$k11t PROTEIN N i î CH2NH2 veya CHzNHC (O) (CI-12) mCOzH ' dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak Rl ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica Rl ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi gerekir; m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir.

FonnulHiBHe$k11t PROTEIN N i î FounuIHI(BHesm 15] Bilesik 15 H Protein -IJ _ _ -›i ` .I __fu 1 ' [1 ..

FonnmIV(BHe$k10): PROTEIN _N Antikorlar analiz kitlerinde ve analiz cihazlarinda sunulabilir, burada simdilik tercih. edilen bir cihaz, hasta basi analiz saglayan bir yanal akis analiz cihazidir.

Ayrica, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem sunlari içerir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi; (ii) konakçinin, yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi; (iii) olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir kaynasik hücre olusturmak üzere, asilanan konakçidan elde edilen bir hücre dizisinin sürekli bölünen bir hücre ile kaynastirilmasi ve (iv) kaynasik hücrenin, bir hibridoma hücre dizisi elde etmek için klonlanmasi.

Antikorlar, bir numunede olanzapin tayinine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Yöntem sunlari içerir: (i) bir FounuIHI(BHesm 15] Bilesik 15 H Protein -IJ _ _ -›i ` .I __fu 1 ' [1 ..

Antikorlar, bir numunede olanzapin tayinine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Yöntem sunlari içerir: (i) bir saptanabilir belirteç ile isaretlenen antikorun bir numuneye temas ettirilmesi, burada isaretli antikor ile numunede bulunan olanzapinin bir isaretli kompleks olusturmasi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretli kompleksin saptanmasi.

Antikorlar, bir rekabetçi immün analiz yönteminde, bir numunede olanzapin tayini için kullanilabilir. Yöntem sunlari içerir: (i) antikorun ve olanzapinin veya olanzapine yönelik bir rekabetçi baglanma partnerinin bir numuneye temas ettirilmesi, burada antikor ve olanzapin veya bunun rekabetçi baglanma partnerinden birinin bir saptanabilir belirteç ile isaretlenmesi ve burada numunedeki olanzapinin antikora baglanmak için olanzapin veya bunun rekabetçi baglanma partneri ile rekabet etmesi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretin saptanmasi.

Mevcut bulusun diger amaçlari, özellikleri ve avantajlari ilgili alanin uzmanlarinca ilerleyen kisimlardaki tercihli yapilanmalarin ayrintili olarak dikkate alinmasi suretiyle açikça anlasilacaktir.

Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekiller l-3, üç farkli fare füzyon ll.l hibridomasi ile elde edilen Rekabetçi ELISA sonuçlarini gösterir.

Sekil 4, bir yanal akis analiz cihazinda kullanilan rekabetçi immün analiz formatini gösterir.

Sekil 5, olanzapin antikor klonu 35 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 6, olanzapin antikor klonu 61 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 7, olanzapin antikor klonu 3Fll ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir. saptanabilir belirteç ile isaretlenen antikorun bir numuneye temas ettirilmesi, burada isaretli antikor ile numunede bulunan olanzapinin bir isaretli kompleks olusturmasi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretli kompleksin saptanmasi.

Sekil 7, olanzapin antikor klonu 3Fll ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 8, bir yanal akis analiz cihazinin çip tasarimini gösterir.

Sekil 9, bir aripiprazol pozitif kontrol için, antikor 5C7 ve aripiprazola yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 10, bir olanzapin pozitif kontrol için, antikor 4G9-1 ve olanzapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 11, bir ketiapin pozitif kontrol için, antikor 11 ve ketiapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 12, bir risperidon pozitif kontrol için, antikor 5-9 ve risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 13, aripiprazol içeren bir numune için, olanzapin, ketiapin veya risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda olanzapin, ketiapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, aripiprazola yönelik isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol antikoru 5C7 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 14, olanzapin içeren bir numune için, aripiprazol, ketiapin veya risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, ketiapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, olanzapine yönelikr bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda olanzapin antikoru 4G9-1 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 15, ketiapin içeren bir numune için, aripiprazol, olanzapin veya risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, olanzapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, ketiapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda ketiapin antikoru 11 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 8, bir yanal akis analiz cihazinin çip tasarimini gösterir.

Sekil 16, risperidon içeren bir numune için, aripiprazol, olanzapin veya ketiapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, olanzapin veya ketiapin için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda risperidon antikoru 5-9 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 17, aripiprazol içeren bir numune için, olanzapin, ketiapin veya risperidona yönelik bir antikor ve isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda olanzapin, ketiapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, aripiprazola yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol antikoru 5C7 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 18, olanzapin içeren bir numune için, aripiprazol, ketiapin veya risperidona yönelik bir antikor ve isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, ketiapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, olanzapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda olanzapin antikoru 4G9-l ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 19, ketiapin içeren bir numune için, aripiprazol, olanzapin veya risperidona yönelik bir antikor ve isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, olanzapin veya risperidon için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, ketiapine yönelik. bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda ketiapin antikoru 11 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 20, risperidon içeren bir numune için, aripiprazol, olanzapin veya ketiapine yönelik bir antikor ve isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda aripiprazol, olanzapin veya ketiapin için herhangi bir doz yanit egrisi olmaksizin, risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri varliginda risperidon antikoru 5-9 ile üretilen tipik bir doz yanit egrisini gösterir.

Sekil 21, pozitif kontrol olarak üretilen aripiprazol doz yanit egrisi ile çoklu formatta üretilen aripiprazol doz yanit egrisi arasinda bir karsilastirmayi gösterir.

Sekil 22, pozitif kontrol olarak üretilen olanzapin doz yanit egrisi ile çoklu formatta üretilen olanzapin doz yanit egrisi arasinda bir karsilastirmayi gösterir.

Sekil 23, pozitif kontrol olarak üretilen ketiapin doz yanit egrisi ile çoklu formatta üretilen ketiapin doz yanit egrisi arasinda bir karsilastirmayi gösterir.

Sekil 24, pozitif kontrol olarak üretilen risperidon doz yanit egrisi ile çoklu formatta üretilen risperidon doz yanit egrisi arasinda bir karsilastirmayi gösterir.

Tercih Edilen Yapilanmalarin Detayli Açiklamasi Bulus, olanzapine baglanan bir izole antikorun yapiminda kullanilabilir. Antikor, antikor içeren bir analiz kitinde ve bir analiz cihazinda kullanilabilir. Ayrica, antikor üretimine yönelik ve antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik yöntemler saglanir. Antikor, bir rekabetçi immün analiz yöntemi de dahil olmak üzere, bir numunede olanzapin tayinine yönelik bir yöntemde kullanilabilir.

Bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir.

Baska bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül 1 bilesigi ve bir immünojenik tasiyicininr bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir, Sekil 21, pozitif kontrol olarak üretilen aripiprazol doz yanit egrisi ile çoklu formatta üretilen aripiprazol doz yanit egrisi arasinda bir karsilastirmayi gösterir.

Baska bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül 1 bilesigi ve bir immünojenik tasiyicininr bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir, R1 degiskeni H, CHzNH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir; CHzNH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir; R2 degiskeni H, burada kosul olarak. Rl ve R2 degiskenlerinden, birinin H olmasi ve ayrica RÃ ve R? degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi gerekir; R3 degiskeni H'dir; m degiskeni 1, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir; n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir.

Tercih, edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül V bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Tercih. edilen bir yapilanmada. mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VI bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak *üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: R1 degiskeni H, CHzNH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir; CHzNH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir; R2 degiskeni H, burada kosul olarak. Rl ve R2 degiskenlerinden, birinin H olmasi ve ayrica RÃ ve R? degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi gerekir; R3 degiskeni H'dir; m degiskeni 1, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir; n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir.

Tercih, edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül V bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Tercih. edilen bir yapilanmada. mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VI bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak *üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: o F°rmü'V'N Q Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VII bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Formül VII Tercih› edilen bir yapilanmada, mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VIII bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Fmnülvm Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül IX bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole o F°rmü'V'N Q Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VII bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Formül VII Tercih› edilen bir yapilanmada, mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül VIII bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: Fmnülvm Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül IX bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: FonnmIX Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül X bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: FonnüIX Antikor, tercih edildigi haliyle, Formül I, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilir.

Yukaridaki formüller ile tanimlanan bilesikler ve bu bilesiklerin bir immünojenik tasiyici ile olusturdugu konjügatlar ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda Bulus konusu antikorlar ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Antikorlar" baslikli bölümde verilir.

Antikor, antikor içeren bir analiz kitinde ve ayrica antikor içeren bir analiz cihazinda kullanilabilir. Tercih edildigi10 antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: FonnmIX Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulus, olanzapine baglanan ve bir Formül X bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak 'üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir: FonnüIX Antikor, tercih edildigi haliyle, Formül I, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilir.

Antikor, antikor içeren bir analiz kitinde ve ayrica antikor içeren bir analiz cihazinda kullanilabilir. Tercih edildigi10 haliyle, analiz cihazi bir yanal akis analiz cihazidir. Analiz kitleri ve analiz cihazlari ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Analiz Kitleri ve Cihazlari" baslikli bölümde verilir.

Bulus, ilaveten, olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik bir yöntem saglar, yöntem sunlari içerir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi ve (ii) konakçinin, yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi, burada konakçinin olanzapine baglanan bir antikor üretmesi. Ilave yapilanmalarda, yöntemde kullanilan konjügat, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati olabilir. Antikorlarin üretimi ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Antikorlar" baslikli kisimda Ayrica, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem sunlari içerir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi; (ii) konakçinin, yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi; (iii) olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir kaynasik hücre olusturmak üzere, asilanan konakçidan elde edilen bir hücre dizisinin sürekli bölünen bir hücre ile kaynastirilmasi ve (iv) kaynasik hücrenin, bir hibridoma hücre dizisi elde etmek için klonlanmasi. Ilave yapilanmalarda, yöntemde kullanilan konjügat, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati olabilir. Mevcut bulusa göre hibridomalarin üretimi ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Antikorlar" baslikli bölümde verilir. haliyle, analiz cihazi bir yanal akis analiz cihazidir. Analiz kitleri ve analiz cihazlari ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Analiz Kitleri ve Cihazlari" baslikli bölümde verilir.

Bulus, ilaveten, olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik bir yöntem saglar, yöntem sunlari içerir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi ve (ii) konakçinin, yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi, burada konakçinin olanzapine baglanan bir antikor üretmesi. Ilave yapilanmalarda, yöntemde kullanilan konjügat, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati olabilir. Antikorlarin üretimi ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Antikorlar" baslikli kisimda Ayrica, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem sunlari içerir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi; (ii) konakçinin, yukarida tanimlanan bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi; (iii) olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir kaynasik hücre olusturmak üzere, asilanan konakçidan elde edilen bir hücre dizisinin sürekli bölünen bir hücre ile kaynastirilmasi ve (iv) kaynasik hücrenin, bir hibridoma hücre dizisi elde etmek için klonlanmasi. Ilave yapilanmalarda, yöntemde kullanilan konjügat, Formül V, Formül VI, Formül VII, Formül VIII, Formül IX ve Formül X bilesikleri arasindan seçilen bir bilesik ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati olabilir. Mevcut bulusa göre hibridomalarin üretimi ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Antikorlar" baslikli bölümde verilir.

Antikor, bir numunede olanzapin tayinine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Yöntem sunlari içerir: (i) bir saptanabilir belirteç ile isaretlenen antikorun bir numuneye temas ettirilmesi, burada isaretli antikor ile numunede bulunan olanzapinin bir isaretli kompleks olusturmasi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretli kompleksin saptanmasi. Olanzapin tayinine yönelik yöntem ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Immün Analizler" baslikli bölümde verilir.

Antikor, bir rekabetçi immün analiz yönteminde, bir numunede olanzapin. tayini için kullanilabilir; Yönteni sunlari içerir: (i) antikorun ve olanzapinin veya olanzapine yönelik bir rekabetçi baglanma partnerinin bir numuneye temas ettirilmesi, burada antikor ve olanzapin veya bunun rekabetçi baglanma partnerinden birinin bir saptanabilir belirteç ile isaretlenmesi ve burada numunedeki olanzapinin antikora baglanmak için olanzapin veya bunun rekabetçi baglanma partneri ile rekabet etmesi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretin saptanmasi. Olanzapin tayinine yönelik rekabetçi immün analiz yöntemi ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Immün Analizler" baslikli bölümde verilir.

Olanzapin, tayin esliginde tercihen olanzapine eki olarakr bir veya daha fazla analit tayin edilir. Tercih edildigi haliyle bir veya daha fazla analit, olanzapin disindaki antipsikotik ilaçlardir ve daha çok tercih edildigi haliyle olanzapin disindaki antipsikotik ilaçlar, aripiprazol, risperidon, paliperidon, ketiapin ve bunlarin metabolitlerinden olusan gruptan seçilir.

Yukarida ele alindigi üzere, antikorlar analizlerde antipsikotik ilacin hasta numunelerinde varligini ve/veya Antikor, bir numunede olanzapin tayinine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Yöntem sunlari içerir: (i) bir saptanabilir belirteç ile isaretlenen antikorun bir numuneye temas ettirilmesi, burada isaretli antikor ile numunede bulunan olanzapinin bir isaretli kompleks olusturmasi ve (ii) numunedeki olanzapini tayin etmek için isaretli kompleksin saptanmasi. Olanzapin tayinine yönelik yöntem ile ilgili ilave ayrintilar ilerleyen kisimlarda "Immün Analizler" baslikli bölümde verilir.

Yukarida ele alindigi üzere, antikorlar analizlerde antipsikotik ilacin hasta numunelerinde varligini ve/veya miktarini belirlemek için kullanilabilir. Böylesi bir tayin, terapötik ilaç izlemi saglayarak bunun tüm faydalarini mümkün kilar. Antipsikotik ilaçlarin düzeylerinin tayini, sunlar da dahil olmak üzere birçok amaç için kullanilabilir: hastanin reçete edilen tedaviye bagliligini veya uyumunu belirleme; bir hastanin bir oral antipsikotik rejimden bir uzun etkili enjekte edilebilir antipsikotik rejime geçmesi gerekip gerekmedigini belirlemek için bir karar araci olarak kullanim; etkili veya güvenilir ilaç düzeylerini elde etmek veya idame ettirmek amaciyla oral veya enjekte edilebilir antipsikotiklerin doz düzeyinin veya doz uygulama araliginin artirilmasi veya azaltilmasinin gerekip gerekmedigini belirlemek için bir karar araci olarak kullanim; antipsikotik ilaç tedavisinin baslangicinda minimum, pK düzeylerinin elde edildigine dair kanit saglamak suretiyle bir yardimci olarak kullanim; çok sayida formülasyonda bulunan veya çok sayida kaynaga ait olan antipsikotik ilacin biyoesdegerligini belirlemeye yönelik kullanim; polifarmasi ve potansiyel ilaç- ilaç etkilesimlerinin etkisini degerlendirmeye yönelik kullanim ve bir hastanin bir klinik deneye dahil edilip edilmeyecegine dair bir gösterge olarak› ve akabinde klinik deney ilaç gerekliliklerine bagliligin izlenmesi için bir yardimci olarak kullanim.

BILESIKLER, KONJ'ÜGATLAR VE IMMÜNOJENLER Bilesikler, konjügatlar ve immünojenler ile baglantili olarak su kisaltmalar kullanilir: AMAS: N-(d-maleimidoasetoksi) süksinimid ester; BTG: sigir tiroglobülini; Bu3N: tribütilamin; DCC: disikloheksilkarbodiimid; DCM: diklorometan; DIEA: diizopropiletilamin; DMF: N,N-dimetilformamid; DMSO: dimetilsülfoksit; EDTA: etilendiamintetrasetikasit; KLH: keyhole limpet hemosiyanin; SATA: N-süksinimidil S- asetiltioasetat; TEA: trietilamin; THF: tetrahidrofuran; TFA: trifloroasetik asit; o.s.: oda sicakligi; DIC: miktarini belirlemek için kullanilabilir. Böylesi bir tayin, terapötik ilaç izlemi saglayarak bunun tüm faydalarini mümkün kilar. Antipsikotik ilaçlarin düzeylerinin tayini, sunlar da dahil olmak üzere birçok amaç için kullanilabilir: hastanin reçete edilen tedaviye bagliligini veya uyumunu belirleme; bir hastanin bir oral antipsikotik rejimden bir uzun etkili enjekte edilebilir antipsikotik rejime geçmesi gerekip gerekmedigini belirlemek için bir karar araci olarak kullanim; etkili veya güvenilir ilaç düzeylerini elde etmek veya idame ettirmek amaciyla oral veya enjekte edilebilir antipsikotiklerin doz düzeyinin veya doz uygulama araliginin artirilmasi veya azaltilmasinin gerekip gerekmedigini belirlemek için bir karar araci olarak kullanim; antipsikotik ilaç tedavisinin baslangicinda minimum, pK düzeylerinin elde edildigine dair kanit saglamak suretiyle bir yardimci olarak kullanim; çok sayida formülasyonda bulunan veya çok sayida kaynaga ait olan antipsikotik ilacin biyoesdegerligini belirlemeye yönelik kullanim; polifarmasi ve potansiyel ilaç- ilaç etkilesimlerinin etkisini degerlendirmeye yönelik kullanim ve bir hastanin bir klinik deneye dahil edilip edilmeyecegine dair bir gösterge olarak› ve akabinde klinik deney ilaç gerekliliklerine bagliligin izlenmesi için bir yardimci olarak kullanim.

BILESIKLER, KONJ'ÜGATLAR VE IMMÜNOJENLER Bilesikler, konjügatlar ve immünojenler ile baglantili olarak su kisaltmalar kullanilir: AMAS: N-(d-maleimidoasetoksi) süksinimid ester; BTG: sigir tiroglobülini; Bu3N: tribütilamin; DCC: disikloheksilkarbodiimid; DCM: diklorometan; DIEA: diizopropiletilamin; DMF: N,N-dimetilformamid; DMSO: dimetilsülfoksit; EDTA: etilendiamintetrasetikasit; KLH: keyhole limpet hemosiyanin; SATA: N-süksinimidil S- asetiltioasetat; TEA: trietilamin; THF: tetrahidrofuran; TFA: trifloroasetik asit; o.s.: oda sicakligi; DIC: diizopropilkarbodiimid; DMAP: N,N-dimetil-4-aminopiridin; EDC: l-etil-3(3-dimetilaminopropil) karbodiimidhidroklorür; NHS: N- hidroksisüksinimid; TFP: tetraflorofenil; PNP: p-nitrofenil; TBTU: O-(benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronyum tetrafloroborat; HOBT: N-hidroksibenzotriazol; DEPBT: 3- (dietoksifosforiloksi)-l,2,3-benzotrazin-4(3H)-on; BOP-CI: bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfonik klorür; DTT: ditioeritritol. elde edilen herhangi bir maddeyi ifade eder. Örnek konjügatlar, bir küçük molekülün, örnegin Formül I bilesiklerinin büyük bir molekülle, örnegin bir tasiyici veya bir poliamin polimeri ve özellikle de bir proteinle birlestirilmesi yoluyla elde edilenleri kapsar. Konjügatta küçük molekül, büyük molekül üzerinde bir veya daha fazla aktif bölgeyle birlestirilebilir. hapten, antikor olusumunu, uyarma. kapasitesine sahip olmayan, ancak antikorlarla reaksiyona girebilen bir proteinsiz maddedir. Antikorlar, bir haptenin yüksek molekül agirlikli bir immünojenik tasiyiciya kenetlenmesi ve akabinde bu kenetli ürünün, yani immünojenin bir insan veya hayvan bireye enjekte edilmesi yoluyla uyarilir. üretme veya olusturma kapasitesine sahip bir maddeyi ifade Burada kullanildigi haliyle bir "immünojenik tasiyici", haptenlerle bir veya daha fazla konumda birlesebilen ve böylece bu haptenlere baglanabilen antikorlarin üretimini saglayabilen bir immünojenik maddedir ve yaygin olarak bir proteindir. Immünojenik tasiyici maddelerin örnekleri, diizopropilkarbodiimid; DMAP: N,N-dimetil-4-aminopiridin; EDC: l-etil-3(3-dimetilaminopropil) karbodiimidhidroklorür; NHS: N- hidroksisüksinimid; TFP: tetraflorofenil; PNP: p-nitrofenil; TBTU: O-(benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronyum tetrafloroborat; HOBT: N-hidroksibenzotriazol; DEPBT: 3- (dietoksifosforiloksi)-l,2,3-benzotrazin-4(3H)-on; BOP-CI: bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfonik klorür; DTT: ditioeritritol. elde edilen herhangi bir maddeyi ifade eder. Örnek konjügatlar, bir küçük molekülün, örnegin Formül I bilesiklerinin büyük bir molekülle, örnegin bir tasiyici veya bir poliamin polimeri ve özellikle de bir proteinle birlestirilmesi yoluyla elde edilenleri kapsar. Konjügatta küçük molekül, büyük molekül üzerinde bir veya daha fazla aktif bölgeyle birlestirilebilir. hapten, antikor olusumunu, uyarma. kapasitesine sahip olmayan, ancak antikorlarla reaksiyona girebilen bir proteinsiz maddedir. Antikorlar, bir haptenin yüksek molekül agirlikli bir immünojenik tasiyiciya kenetlenmesi ve akabinde bu kenetli ürünün, yani immünojenin bir insan veya hayvan bireye enjekte edilmesi yoluyla uyarilir. üretme veya olusturma kapasitesine sahip bir maddeyi ifade Burada kullanildigi haliyle bir "immünojenik tasiyici", haptenlerle bir veya daha fazla konumda birlesebilen ve böylece bu haptenlere baglanabilen antikorlarin üretimini saglayabilen bir immünojenik maddedir ve yaygin olarak bir proteindir. Immünojenik tasiyici maddelerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, yabanci olarak algilanan ve dolayisiyla konakçida bir immünolojik yaniti uyaran proteinler, glikoproteinler, kompleks poliamino- polisakkaritler, partiküller ve nükleik asitleri kapsar.

Poliamino-polisakkaritler, bu hazirlama için bilinen konvansiyonel yollarin herhangi biriyle polisakkaritlerden hazirlanabilir.

Immünojenik tasiyici olarak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla albüminler, serum proteinleri, lipoproteinler ve benzerleri de dahil olmak üzere çesitli protein türleri kullanilabilir. Örnek proteinler sigir serum albümini, keyhole limpet hemosiyanin, yumurta ovalbümini, sigir tiroglobulini, fraksiyon V insan serum albümini, tavsan albümini, kabak çekirdegi globülini, difteri toksoidi, tetanos toksoidi, botulinus toksini, süksinillenmis proteinler ve polilizin gibi sentetik poli(aminoasitler)'i kapsar.

Immünojenik tasiyicilar, monosakkaritlerin tekrarli kondenzasyonu üzerinden olusan yüksek molekül agirlikli polimerler olan poli amino-polisakkaritleri de içerebilir.

Polisakkaritlerin örnekleri nisastalar, glikojen, selüloz, karbonhidrat zamklari, örnegin arap zamki, agar ve benzerleridir. Polisakkarit ayrica poli(amino asit) rezidüleri ve/Veya lipit rezidüleri içerir.

Immünojenik tasiyici ayrica tek basina veya yukarida belirtilen poli(amino asitler) veya polisakkaritler ile konjüge edilmis halde bulunan bir poli(nükleik asit) olabilir.

Immünojenik tasiyici ayrica kati partiküller içerebilir.

Partiküller genel olarak en az yaklasik 0.02 mikron (pm) ve en fazla yaklasik 100 pm ve genellikle yaklasik 0.05 um ila 10 um çapindadir. Partikül organik veya inorganik, sisebilen veya sismeyen, gözenekli veya gözeneksiz olabilir, optimal olarak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, yabanci olarak algilanan ve dolayisiyla konakçida bir immünolojik yaniti uyaran proteinler, glikoproteinler, kompleks poliamino- polisakkaritler, partiküller ve nükleik asitleri kapsar.

Immünojenik tasiyici ayrica kati partiküller içerebilir.

Partiküller genel olarak en az yaklasik 0.02 mikron (pm) ve en fazla yaklasik 100 pm ve genellikle yaklasik 0.05 um ila 10 um çapindadir. Partikül organik veya inorganik, sisebilen veya sismeyen, gözenekli veya gözeneksiz olabilir, optimal olarak suyunkine yakin bir yogunluga, genel olarak yaklasik 0.7 ila 1.5 g/mL'lik bir yogunluga sahip olabilir ve saydam, yari saydam veya opak bir materyalden olusabilir. Partiküller, sinirlandirici olmayan örnekler olarak eritrositler, lökositler, lenfositler, hibridomalar, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli ve virüsler de dahil olmak üzere hücreler ve mikroorganizmalar gibi biyolojik materyaller olabilir. Partiküller ayrica organik ve inorganik polimerler, lipozomlar, lateks, fosfolipit veziküller veya lipoproteinlerden olusabilir. sonucunda. bir ana bilesikten üretilen bir kimyasal bilesigi veya molekülü ifade eder.

Bir kimyasal bilesigin "analogu", bir karbon atomlari zincirine ve bir referans bilesik ile ayni belirli fonksiyonel gruplara sahip olan bir kimyasal bilesigi ifade eder, ancak burada analogun karbon zinciri referans bilesige kiyasla daha uzun veya daha kisadir.

Bir "isaret", "saptayici molekül", "raportör" veya bir saptanabilir sinyal üretmek üzere uyarilabilen herhangi bir moleküldür. Isaret bir analit, immünojen, antikor veya baskar bir molekül, örnegin bir reseptör veya bir reseptöre baglanabilen bir molekül, örnegin bir ligand, özellikle bir hapten veya antikor ile konjüge edilebilir. Bir isaret dogrudan ya da bir baglanti veya köprü kismi üzerinden dolayli olarak baglanabilir. isaretlerin sinirlandirici olmayan örnekleri radyoaktif izotoplar (örnegin 1251), enzimler (örnegin ß-galaktosidaz, peroksidaz), enzim fragmanlari, enzim substratlari, enzim inhibitörleri, koenzimler, katalizörler, floroforlar (örnegin rodamin, floresin izotiosiyanat veya FITC veya Dylight 649), boyalar, kemilüminesan maddeler ve suyunkine yakin bir yogunluga, genel olarak yaklasik 0.7 ila 1.5 g/mL'lik bir yogunluga sahip olabilir ve saydam, yari saydam veya opak bir materyalden olusabilir. Partiküller, sinirlandirici olmayan örnekler olarak eritrositler, lökositler, lenfositler, hibridomalar, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli ve virüsler de dahil olmak üzere hücreler ve mikroorganizmalar gibi biyolojik materyaller olabilir. Partiküller ayrica organik ve inorganik polimerler, lipozomlar, lateks, fosfolipit veziküller veya lipoproteinlerden olusabilir. sonucunda. bir ana bilesikten üretilen bir kimyasal bilesigi veya molekülü ifade eder.

Bir "isaret", "saptayici molekül", "raportör" veya bir saptanabilir sinyal üretmek üzere uyarilabilen herhangi bir moleküldür. Isaret bir analit, immünojen, antikor veya baskar bir molekül, örnegin bir reseptör veya bir reseptöre baglanabilen bir molekül, örnegin bir ligand, özellikle bir hapten veya antikor ile konjüge edilebilir. Bir isaret dogrudan ya da bir baglanti veya köprü kismi üzerinden dolayli olarak baglanabilir. isaretlerin sinirlandirici olmayan örnekleri radyoaktif izotoplar (örnegin 1251), enzimler (örnegin ß-galaktosidaz, peroksidaz), enzim fragmanlari, enzim substratlari, enzim inhibitörleri, koenzimler, katalizörler, floroforlar (örnegin rodamin, floresin izotiosiyanat veya FITC veya Dylight 649), boyalar, kemilüminesan maddeler ve lüminesan maddeler (örnegin dioksetanlar, lüsiferin) veya duyarlastiricilari kapsar.

Burada kullanildigi haliyle bir "ara grup", bir kimyasal yapida haptenler, tasiyicilar, immünojenler, isaretler veya baglanma partnerleri gibi iki veya daha fazla alt yapiyi bir fonksiyonel baglanti grubu üzerinden birlestiren bir kismi ifade eder. Bu ara gruplar organik bilesiklerde tipik olarak mevcut olan ve organik bilesiklerde tipik olarak gözlemlenen yollarla bir araya getirilen atomlardan olusur ve dolayisiyla araya getirmek için kullanilan kimyasal yapi bloklari bu basvurunun ilerleyen kisimlarinda tarif edilecektir. Tercih edilen ara gruplar arasinda düz zincirli veya dallanmis, doymus veya doymamis karbon zincirleri bulunur. Bu karbon zincirleri ayrica zincirin içinde bir veya daha fazla heteroatom içerebilir, burada bir veya daha fazla heteroatom, zincirde veya zincirlerin terminuslarinda herhangi bir karbon atomuna ait bir veya daha fazla hidrojen atomunun yerini alabilir. "Heteroatomlar" teriminden kasit, oksijen, azot, fosfor* ve kükürtten olusan gruptan seçilen karbon disindaki atomlardir, burada azot, fosfor ve kükürt atomlari herhangi bir yükseltgenme durumunda bulunabilir ve kendilerine bagli karbon atomlarina veya baska heteroatomlara sahip olabilir.

Ara grup ayrica zincirin bir parçasi olarak veya zincirdeki atomlardan birinin üzerinde bir sübstitüsyon olarak siklik veya aromatik gruplar içerebilir.

Ara gruptaki atomlarin sayisi, hidrojen disindaki atomlarin sayilmasi yoluyla belirlenir. Bir ara grubun içindeki bir zincirde bulunan atomlarin sayisi, bagli alt yapilar arasinda en kisa yol üzerinde bulunan hidrojen disindaki atomlarin sayilmasi yoluyla belirlenir. Tercih edilen zincir uzunluklari l ila 20 atomdur. lüminesan maddeler (örnegin dioksetanlar, lüsiferin) veya duyarlastiricilari kapsar.

Ara gruptaki atomlarin sayisi, hidrojen disindaki atomlarin sayilmasi yoluyla belirlenir. Bir ara grubun içindeki bir zincirde bulunan atomlarin sayisi, bagli alt yapilar arasinda en kisa yol üzerinde bulunan hidrojen disindaki atomlarin sayilmasi yoluyla belirlenir. Tercih edilen zincir uzunluklari l ila 20 atomdur.

Bir "fonksiyonel baglanti grubu", bir hapten üzerinde bulunan ve bir hapten ile baska bir grubun (örnegin bir isaret veya tasiyici) bir konjügatini üretmek üzere hapten kisminin bir kovalent kimyasal bag olusumu üzerinden baska bir gruba kenetlendirilmesi için bir kullanilabilir reaktif bölge saglamak amaciyla kullanilabilen bir reaktif grubu ifade eder.

Hapten bu yolla bir rekabetçi baglanma partneri olusturmak üzere biyotin gibi bir gruba baglanabilir.

Ara gruplar hapteni tasiyiciya baglamak için kullanilabilir.

Farkli uzunluktaki ara gruplar, antikor olusum sürecinin optimizasyonu için bagisiklanan hayvanin veya insanin immün sistemine sunulmak üzere haptenin tasiyiciya farkli mesafelerde eklenmesini saglar. Hapten molekülünde farkli konumlara ekleme, antikor tanimayi etkilemek üzere hapten üzerindeki spesifik bölgelerin immün sisteme sunulma firsatini mümkün kilar. Ara grup, hapten türevini sulu ortamlarda daha çözünür hale getirmek için hidrofilik çözündürücü gruplar içerebilir. Hidrofilik çözündürücü gruplarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polioksialkiloksi gruplarini, örnegin polietilen glikol Zincirlerini; hidroksil, karboksilat ve sülfonat gruplarini kapsar. bir kimyasal bag olusturmak üzere bir elektron çifti veren bir türü ifade eder. "Elektrofilik grup" veya "elektrofil" terimi, bir reaksiyonda bir kimyasal bag olusturmak üzere bir nükleofilden bir elektron çifti alan bir türü ifade eder. herhangi bir konumda bir karbon atomu üzerinde bir hidrojen atomu yerine bir atomun veya atomlar grubunun sübstitüsyonunu ifade eder. Sübstitüentlerin sinirlandirici olmayan örnekleri halojen atomlari, amino, hidroksi, karboksi, alkil, aril, Bir "fonksiyonel baglanti grubu", bir hapten üzerinde bulunan ve bir hapten ile baska bir grubun (örnegin bir isaret veya tasiyici) bir konjügatini üretmek üzere hapten kisminin bir kovalent kimyasal bag olusumu üzerinden baska bir gruba kenetlendirilmesi için bir kullanilabilir reaktif bölge saglamak amaciyla kullanilabilen bir reaktif grubu ifade eder.

Ara gruplar hapteni tasiyiciya baglamak için kullanilabilir.

Farkli uzunluktaki ara gruplar, antikor olusum sürecinin optimizasyonu için bagisiklanan hayvanin veya insanin immün sistemine sunulmak üzere haptenin tasiyiciya farkli mesafelerde eklenmesini saglar. Hapten molekülünde farkli konumlara ekleme, antikor tanimayi etkilemek üzere hapten üzerindeki spesifik bölgelerin immün sisteme sunulma firsatini mümkün kilar. Ara grup, hapten türevini sulu ortamlarda daha çözünür hale getirmek için hidrofilik çözündürücü gruplar içerebilir. Hidrofilik çözündürücü gruplarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polioksialkiloksi gruplarini, örnegin polietilen glikol Zincirlerini; hidroksil, karboksilat ve sülfonat gruplarini kapsar. bir kimyasal bag olusturmak üzere bir elektron çifti veren bir türü ifade eder. "Elektrofilik grup" veya "elektrofil" terimi, bir reaksiyonda bir kimyasal bag olusturmak üzere bir nükleofilden bir elektron çifti alan bir türü ifade eder. herhangi bir konumda bir karbon atomu üzerinde bir hidrojen atomu yerine bir atomun veya atomlar grubunun sübstitüsyonunu ifade eder. Sübstitüentlerin sinirlandirici olmayan örnekleri halojen atomlari, amino, hidroksi, karboksi, alkil, aril, heteroalkil, heteroaril, siyano, alkoksi, nitro, aldehit ve keton gruplarini kapsar. sahip doymus veya doymamis, düz zincirli ve dallanmis radikalleri ifade eder ve bu terimin spesifik olarak herhangi bir doygunluk derecesine veya düzeyine sahip radikalleri kapsamasi amaçlanir. Alkil, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, metil, etil, propil, izopropil, bütil, izobütil, sek-bütil, tert-bütil, pentil, izopentil, heksil, izoheksil, heptil, oktil, 2,2,4-trimetilpentil, nonil, desil, undesil ve dodesili doymus veya kismen doymamis monosiklik veya bisiklik hidrokarbon halka radikalini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler siklopropil, l,l-dimetil siklobütil, l,2,3-trimetilsiklopentil, sikloheksil ve sikloheksenili kapsar. heteroatom, zincirde veya zincirlerin terminuslarinda herhangi bir karbon atomundaki bir veya daha fazla hidrojen yerine bir veya daha fazla heteroatom içeren bir alkil grubunu ifade karbon atomuna bagli olan en az bir primer veya sekonder amino grubunu ifade eder. bagli 12 kadar karbon atomuna sahip düz veya dallanmis Zincirli radikalleri ifade eder. Örnekler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi ve bütoksiyi kapsar. heteroalkil, heteroaril, siyano, alkoksi, nitro, aldehit ve keton gruplarini kapsar. sahip doymus veya doymamis, düz zincirli ve dallanmis radikalleri ifade eder ve bu terimin spesifik olarak herhangi bir doygunluk derecesine veya düzeyine sahip radikalleri kapsamasi amaçlanir. Alkil, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, metil, etil, propil, izopropil, bütil, izobütil, sek-bütil, tert-bütil, pentil, izopentil, heksil, izoheksil, heptil, oktil, 2,2,4-trimetilpentil, nonil, desil, undesil ve dodesili doymus veya kismen doymamis monosiklik veya bisiklik hidrokarbon halka radikalini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler siklopropil, l,l-dimetil siklobütil, l,2,3-trimetilsiklopentil, sikloheksil ve sikloheksenili kapsar. heteroatom, zincirde veya zincirlerin terminuslarinda herhangi bir karbon atomundaki bir veya daha fazla hidrojen yerine bir veya daha fazla heteroatom içeren bir alkil grubunu ifade karbon atomuna bagli olan en az bir primer veya sekonder amino grubunu ifade eder. bagli 12 kadar karbon atomuna sahip düz veya dallanmis Zincirli radikalleri ifade eder. Örnekler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi ve bütoksiyi kapsar. karbon atomuna bagli olan en az bir alkoksi grubunu ifade karbon atomuna bagli olan en az bir kükürt grubunu ifade eder.

Kükürt grubu herhangi bir yükseltgenme durumunda olabilir ve sülfoksitler, sülfonlar ve sülfatlari kapsar. aril veya aralkil karboksilat esterlerini kapsar. bir karbon atomuna bagli olan bir karbonil grubuna sahip bir grubu ifade eder. üyeli bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder ve burada herhangi bir halka, N, 0 veya 8 arasindan seçilen bir ila dört heteroatomdan olusabilir ve azot ve kükürt atomlari izin verilen herhangi bir yükseltgenme durumunda bulunabilir. Örnekler benzimidazolil, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, furil, imidazolil, izotiazolil, izoksazolil, oksazolil, pirazinil, pirazolil, piridil, pirimidinil, pirrolil, kinolinil, tiazolil ve tienili kapsar. veya bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler fenil, bifenil ve naftalini kapsar. grubunu ifade eder. Örnekler benzil, feniletil ve 2- naftilmetili kapsar. karbon atomuna bagli olan en az bir alkoksi grubunu ifade karbon atomuna bagli olan en az bir kükürt grubunu ifade eder.

Kükürt grubu herhangi bir yükseltgenme durumunda olabilir ve sülfoksitler, sülfonlar ve sülfatlari kapsar. aril veya aralkil karboksilat esterlerini kapsar. bir karbon atomuna bagli olan bir karbonil grubuna sahip bir grubu ifade eder. üyeli bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder ve burada herhangi bir halka, N, 0 veya 8 arasindan seçilen bir ila dört heteroatomdan olusabilir ve azot ve kükürt atomlari izin verilen herhangi bir yükseltgenme durumunda bulunabilir. Örnekler benzimidazolil, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, furil, imidazolil, izotiazolil, izoksazolil, oksazolil, pirazinil, pirazolil, piridil, pirimidinil, pirrolil, kinolinil, tiazolil ve tienili kapsar. veya bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler fenil, bifenil ve naftalini kapsar. grubunu ifade eder. Örnekler benzil, feniletil ve 2- naftilmetili kapsar. hidrojen, alkil, sikloalkil, heteroalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. Bir “asilleme maddesi" bir moleküle -C(O)Ra grubunu ekler. degiskeni hidrojen, alkil, sikloalkil, haloalkil, haloalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. "Sülfonilleme maddesi" bir moleküle -S(=O)2-Ra grubunu ekler.

Haptenlerin tasiyici gruplara eklenmesi için reaktif fonksiyonel baglanti gruplari tasiyan ara gruplar çok çesitli yöntemlerle hazirlanabilir. Ara grup, hapten ve tasiyici ile seçici sirali reaksiyon saglamak için herhangi bir uçta gruplarla diferansiyel olarak fonksiyonellestirilmis veya aktiflestirilmis bir molekül kullanilarak elde edilebilir, ancak ayni reaktif grup her iki uçta da kullanilabilir.

Tasiyiciya baglanacak hapten ve fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için seçilen gruplar, hapten ve haptenin baglanacagi tasiyici üzerindeki fonksiyonellik türüne göre belirlenir. Ara gruplar ve haptenlere ve tasiyicilara baglanti yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, London, Amsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 ve Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook; çevrimiçi indirme veya basili kopya talebi için Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, http://www.piercenet.com/ ve dahil edilen referanslarda tarif edilenleri kapsar. Ara gruplarin olusturulmasi için farkli olarak aktiflestirilmis birçok molekül örnegin Thermo Scientific gibi firmalardan temin edilebilir. hidrojen, alkil, sikloalkil, heteroalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. Bir “asilleme maddesi" bir moleküle -C(O)Ra grubunu ekler. degiskeni hidrojen, alkil, sikloalkil, haloalkil, haloalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. "Sülfonilleme maddesi" bir moleküle -S(=O)2-Ra grubunu ekler.

Tasiyiciya baglanacak hapten ve fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için seçilen gruplar, hapten ve haptenin baglanacagi tasiyici üzerindeki fonksiyonellik türüne göre belirlenir. Ara gruplar ve haptenlere ve tasiyicilara baglanti yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, London, Amsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 ve Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook; çevrimiçi indirme veya basili kopya talebi için Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, http://www.piercenet.com/ ve dahil edilen referanslarda tarif edilenleri kapsar. Ara gruplarin olusturulmasi için farkli olarak aktiflestirilmis birçok molekül örnegin Thermo Scientific gibi firmalardan temin edilebilir.

Bir amino grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, ara grup ile hapten arasindaki baglanti modlari, hapten üzerindeki aminin bir asil halojenür veya aktif ester tasiyan bir ara grup yapi blogu ile reaksiyonunu içerir. "Aktif esterler", kararli bir baglanti olusturmak üzere hafif kosullar altinda bir nükleofilik grup, örnegin bir amino grubu ile reaksiyona giren esterler olarak tanimlanir. Kararli bir baglanti, ileriki kullanim kosullarinda, örnegin sonraki sentez adimlarinda, bir immünojen olarak kullanimda veya bir biyokimyasal analizde saglam kalan bir baglanti olarak tanimlanir. Kararli bir baglantinin tercihli bir örnegi bir amid bagidir. Aktif esterler ve üretim yöntemleri Benoiton, N.L., in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, New York, vol E22 section 3.2:443 ve Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006 tarafindan tarif edilir. Tercih edilen aktif esterler p- nitrofenil ester (PNP), N-hidroksisuksinimid ester (NHS) ve tetraflorofenil esteri (TFP) kapsar. Asil halojenurler ilgili alanin uzmanlarinca bilinen birçok yöntemle, örnegin karboksilik asidin tionil klorür veya oksalil klorür ile reaksiyonu üzerinden hazirlanabilir, bkz. Fieser, L.F. ve Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 ve içindeki referanslar. Bunlar p-nitrofenil esterler (PNP) gibi baska aktif esterlere dönüstürülebilir, bu tarafindan tarif edildigi üzere aktif bifonksiyonel ara gruplar olarak kullanilabilir. N-hidroksisüksinimid (NHS) esterler, WOZOl2012595'teki Örnek 35'te açiklandigi üzere N,N- disüksinimidil karbonat (CAS 74124-79-1) ile bir bilesigin karboksilik asidinin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin 'veya diizopropiletilamin gibi bir organik baz varliginda reaksiyona sokulmasi yoluyla ya da susuz kosullar altinda N-hidroksisüksinimid ve disikloheksilkarbodiimid (DCC) veya baska bir dehidrasyon maddesi kullanilarak hazirlanabilir. Tetraflorofenil esterler Bir amino grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, ara grup ile hapten arasindaki baglanti modlari, hapten üzerindeki aminin bir asil halojenür veya aktif ester tasiyan bir ara grup yapi blogu ile reaksiyonunu içerir. "Aktif esterler", kararli bir baglanti olusturmak üzere hafif kosullar altinda bir nükleofilik grup, örnegin bir amino grubu ile reaksiyona giren esterler olarak tanimlanir. Kararli bir baglanti, ileriki kullanim kosullarinda, örnegin sonraki sentez adimlarinda, bir immünojen olarak kullanimda veya bir biyokimyasal analizde saglam kalan bir baglanti olarak tanimlanir. Kararli bir baglantinin tercihli bir örnegi bir amid bagidir. Aktif esterler ve üretim yöntemleri Benoiton, N.L., in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, New York, vol E22 section 3.2:443 ve Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006 tarafindan tarif edilir. Tercih edilen aktif esterler p- nitrofenil ester (PNP), N-hidroksisuksinimid ester (NHS) ve tetraflorofenil esteri (TFP) kapsar. Asil halojenurler ilgili alanin uzmanlarinca bilinen birçok yöntemle, örnegin karboksilik asidin tionil klorür veya oksalil klorür ile reaksiyonu üzerinden hazirlanabilir, bkz. Fieser, L.F. ve Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 ve içindeki referanslar. Bunlar p-nitrofenil esterler (PNP) gibi baska aktif esterlere dönüstürülebilir, bu tarafindan tarif edildigi üzere aktif bifonksiyonel ara gruplar olarak kullanilabilir. N-hidroksisüksinimid (NHS) esterler, WOZOl2012595'teki Örnek 35'te açiklandigi üzere N,N- disüksinimidil karbonat (CAS 74124-79-1) ile bir bilesigin karboksilik asidinin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin 'veya diizopropiletilamin gibi bir organik baz varliginda reaksiyona sokulmasi yoluyla ya da susuz kosullar altinda N-hidroksisüksinimid ve disikloheksilkarbodiimid (DCC) veya baska bir dehidrasyon maddesi kullanilarak hazirlanabilir. Tetraflorofenil esterler (TFP), Wilbur Vd., Bioconjugate Chem., 2004, 15(l):203 tarafindan bildirildigi üzere karboksilik asitlerin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin veya diizopropiletilamin gibi bir organik bazin varliginda 2,3,5,6-tetraflorofeniltrifloroasetat ile reaksiyona sokulmasi yoluyla hazirlanabilir. Ilgili alanin uzmanlari, digerlerini yani sira, Tablo 1'de gösterilen ara gruplarin bilinen yöntemlerle hazirlanabilecegini ve reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden amino tasiyan haptenlere baglanabilecegini takdir edecektir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiol grubuna baglanmasini saglar.

Q.OEÄNOVN1:Ç &Son gwg? m ve n iîânaîîîîgiîâîâîîer l Hapten üzerindeki amin ve ara grup yapi blogu üzerindeki bir karboksilik asit fonksiyonelliginin birbirine bir kenetleme10 (TFP), Wilbur Vd., Bioconjugate Chem., 2004, 15(l):203 tarafindan bildirildigi üzere karboksilik asitlerin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin veya diizopropiletilamin gibi bir organik bazin varliginda 2,3,5,6-tetraflorofeniltrifloroasetat ile reaksiyona sokulmasi yoluyla hazirlanabilir. Ilgili alanin uzmanlari, digerlerini yani sira, Tablo 1'de gösterilen ara gruplarin bilinen yöntemlerle hazirlanabilecegini ve reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden amino tasiyan haptenlere baglanabilecegini takdir edecektir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiol grubuna baglanmasini saglar.

Q.OEÄNOVN1:Ç &Son gwg? m ve n iîânaîîîîgiîâîâîîer l Hapten üzerindeki amin ve ara grup yapi blogu üzerindeki bir karboksilik asit fonksiyonelliginin birbirine bir kenetleme10 maddesinin varliginda dogrudan kenetlenmesi de bir baglanti modu olarak kullanilabilir. Tercih edilen reaktifler, peptit sentezinde tipik olarak kullanilanlardir. Peptit kenetleme reaktifleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla su reaktifleri kapsar: O-(Benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronyum tetrafloroborat (TBTU, CAS #125700-67-6), bkz. Pruhs, S., Org. maddesi, örnegin N-N-disikloheksilkarbodiimid (DCC), diizopropilkarbodiimid (DIC) veya l-etil-3(3- dimetilaminopropil)karbodiimidhidroklorür (EDC) ile birlikte N-Hidroksibenzotriazol (HOBT, CAS #2592-95-2), bkz. König W., (dietoksifosforiloksi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-on (DEPBT, CAS#165534-43-O), bkz. Liu, H. Vd., Chinese Chemical Letters, (BOP-CI, CAS #68641-49-6), bkz. Diago-Meseguer, J vd.

Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, Chapter 2 ve Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), tarafindan saglanan teknik bültende; www.aapptec.com ve dahil edilen referanslarda ayrintili olarak tarif edilen digerleri.

Bu yöntemler, hapteni ara gruba baglayan kararli bir amid baglantisi saglar. Bilinen yöntemlerle elde edilebilen ve yukarida açiklanan ve belirtilen yöntemlerle reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu araciligiyla amino tasiyan haptenlere baglanabilen ara gruplarin örnekleri Tablo 2'de gösterilir, ancak bunlarla sinirli degildir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiol grubuna baglanmasini maddesinin varliginda dogrudan kenetlenmesi de bir baglanti modu olarak kullanilabilir. Tercih edilen reaktifler, peptit sentezinde tipik olarak kullanilanlardir. Peptit kenetleme reaktifleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla su reaktifleri kapsar: O-(Benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronyum tetrafloroborat (TBTU, CAS #125700-67-6), bkz. Pruhs, S., Org. maddesi, örnegin N-N-disikloheksilkarbodiimid (DCC), diizopropilkarbodiimid (DIC) veya l-etil-3(3- dimetilaminopropil)karbodiimidhidroklorür (EDC) ile birlikte N-Hidroksibenzotriazol (HOBT, CAS #2592-95-2), bkz. König W., (dietoksifosforiloksi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-on (DEPBT, CAS#165534-43-O), bkz. Liu, H. Vd., Chinese Chemical Letters, (BOP-CI, CAS #68641-49-6), bkz. Diago-Meseguer, J vd.

Bu yöntemler, hapteni ara gruba baglayan kararli bir amid baglantisi saglar. Bilinen yöntemlerle elde edilebilen ve yukarida açiklanan ve belirtilen yöntemlerle reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu araciligiyla amino tasiyan haptenlere baglanabilen ara gruplarin örnekleri Tablo 2'de gösterilir, ancak bunlarla sinirli degildir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiol grubuna baglanmasini n için makul aralik l-lO'dur Ara gruplar ayrica tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip fonksiyonel baglanti grubunun olusturulmasi adimi da dahil olmak üzere uygun kimyasal gruplarin haptene adimlar halinde sirali olarak baglanmasi yoluyla üretilebilir. Bkz. Genel Reaksiyon Semalari altinda verilen temsili örnekler.

Ilaveten, ara grubun baglanti noktasi olarak haptenin bir nükleofilik gruba, örnegin bir tiol grubu, bir amino grubu veya bir hidroksil grubuna sahip oldugu durumlarda, ara grup ayrica tiol, amin veya hidroksil grubunun alkillenmesi yoluyla da olusturulabilir. Ara grubu baglamak için bir sübstitüsyon reaksiyonuna ugrama kapasitesine sahip bir grup, örnegin bir alkil halojenür veya sülfonik asit ester, mesela p- Tolüensülfonat ile uygun sekilde sübstitüe edilmis herhangi bir alkil grubu kullanilabilir. Alkilleme reaksiyonlari ile ilgili birçok örnek ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve spesifik örnekler genel kimya literatüründe bulunabilir ve rutin deneyler üzerinden optimize edilebilir. Alkilleme reaksiyonlari ile ilgili birçok referans içeren bir tartisma March's Advanced Organic Chemistry, Smith, M.B. ve March, J., John Wiley & sons, Inc. NY, 2001, Bölüm lO'da bulunabilir.

Hapten üzerindeki nükleofilik grubun, örnegin bir aminin bir üre olusturmak üzere bir izosiyanat ile reaksiyonu veya bir tioüre baglantisi olusturmak üzere bir izotiosiyanat ile reaksiyonu gibi baska baglantilar da kullanilabilir, bkz. Li, Z. Vd., Phosphorus, Sulfur and Silicon ve the Related üretan baglantilari olusturmak üzere izosiyanat gruplari ile reaksiyona sokularak hidroksil gruplari tasiyan haptenlere baglanabilir. Ara grup bir uçta izosiyanat fonksiyonel grubuyla ve tasiyici ile reaksiyona girme kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubuyla diferansiyel olarak n için makul aralik l-lO'dur Ara gruplar ayrica tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip fonksiyonel baglanti grubunun olusturulmasi adimi da dahil olmak üzere uygun kimyasal gruplarin haptene adimlar halinde sirali olarak baglanmasi yoluyla üretilebilir. Bkz. Genel Reaksiyon Semalari altinda verilen temsili örnekler.

Hapten üzerindeki nükleofilik grubun, örnegin bir aminin bir üre olusturmak üzere bir izosiyanat ile reaksiyonu veya bir tioüre baglantisi olusturmak üzere bir izotiosiyanat ile reaksiyonu gibi baska baglantilar da kullanilabilir, bkz. Li, Z. Vd., Phosphorus, Sulfur and Silicon ve the Related üretan baglantilari olusturmak üzere izosiyanat gruplari ile reaksiyona sokularak hidroksil gruplari tasiyan haptenlere baglanabilir. Ara grup bir uçta izosiyanat fonksiyonel grubuyla ve tasiyici ile reaksiyona girme kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubuyla diferansiyel olarak aktiflestirilebilir, bkz. Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. ve Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212- Bir karboksilik asit grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, bir ara grup kisminin haptene baglanma modlari, örnekleri Tablo 3'te gösterildigi ve hazirlanisi yukarida tarif edildigi üzere karboksilik asit grubunun bir asil halojenür veya aktif ester olarak aktiflestirilmesi, akabinde bir amid, hidrazit, diasilhidrazin veya ester baglantisi olusturmak üzere ara grup kismi üzerinde bir amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) veya hidroksil (-OH) grubu ile reaksiyona sokulmasi ya da karboksilik asit grubunun dogrudan ara grup kismi üzerinde bir amino grubuna kenetlenmesi veya yukarida tarif edildigi üzere örnekleri Tablolar` 4 ve 5'te gösterilen. bir` peptit. kenetleme reaktifi ve/veya karbodiimid dehidrasyon reaktifi ile dogrudan tasiyiciya kenetlenmesini içerir. Aktiflestirilmis esterlerin yapimina ve peptit kenetleme maddelerinin kullanimina yönelik olarak yukarida atif yapilan referanslarda bulunan prosedürler, reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden, karboksilik asit tasiyan haptenlerin amino gruplari içeren ara grup yapi bloklarina ve protein tasiyicilara baglanmasi için kullanilabilir.

N_Og-g N-Og-g F I F g_c02X g/lkoû Sülfo NHS ve NHS TFP X Cl ESASil PNP aktiflestirilebilir, bkz. Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. ve Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212- Bir karboksilik asit grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, bir ara grup kisminin haptene baglanma modlari, örnekleri Tablo 3'te gösterildigi ve hazirlanisi yukarida tarif edildigi üzere karboksilik asit grubunun bir asil halojenür veya aktif ester olarak aktiflestirilmesi, akabinde bir amid, hidrazit, diasilhidrazin veya ester baglantisi olusturmak üzere ara grup kismi üzerinde bir amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) veya hidroksil (-OH) grubu ile reaksiyona sokulmasi ya da karboksilik asit grubunun dogrudan ara grup kismi üzerinde bir amino grubuna kenetlenmesi veya yukarida tarif edildigi üzere örnekleri Tablolar` 4 ve 5'te gösterilen. bir` peptit. kenetleme reaktifi ve/veya karbodiimid dehidrasyon reaktifi ile dogrudan tasiyiciya kenetlenmesini içerir. Aktiflestirilmis esterlerin yapimina ve peptit kenetleme maddelerinin kullanimina yönelik olarak yukarida atif yapilan referanslarda bulunan prosedürler, reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden, karboksilik asit tasiyan haptenlerin amino gruplari içeren ara grup yapi bloklarina ve protein tasiyicilara baglanmasi için kullanilabilir.

N_Og-g N-Og-g F I F g_c02X g/lkoû Sülfo NHS ve NHS TFP X Cl ESASil PNP HOBT DEPT BOP-Cl TBTU 1-etil-3(3- dimetilaminopropil)karbodiim id.HCl (EDC) diizopropilkarbo disikloheksilkarb diimid (DIC) odiimid (DCC) Hapten üzerinde ara grubu baglamak için baska elektrofilik gruplar bulunabilir, örnegin bir sülfonil halojenür veya elektrofilik fosfor grubu, örnegin Bkz. Malachowski, Williani P., Coward, James K., Journal of burada Rc degiskeni alkil, sikloalkil, aril, sübstitüe edilmis aril, aralkildir.

Aldehit veya keton gruplari tasiyan haptenler, bununla sinirli olmamak kaydiyla bir asilhidrazon olusturmak üzere ara grup üzerinde HgN-NH-C(O)- ile gösterilen bir hidrazit grubuyla reaksiyon da dahil olmak üzere birtakim yöntemlerle ara gruplara baglanabilir, bkz. Chamow, S.M., Kogan, T.P., Peers, D.H., Hastings, R.C., Byrn, R.A. ve Askenaszi, A., J. Biol. baglanti saglayan bifonksiyonel hidrazit ara gruplarinin örnekleri Tablo 6'da gösterilir.

HOBT DEPT BOP-Cl TBTU 1-etil-3(3- dimetilaminopropil)karbodiim id.HCl (EDC) diizopropilkarbo disikloheksilkarb diimid (DIC) odiimid (DCC) Hapten üzerinde ara grubu baglamak için baska elektrofilik gruplar bulunabilir, örnegin bir sülfonil halojenür veya elektrofilik fosfor grubu, örnegin Bkz. Malachowski, Williani P., Coward, James K., Journal of burada Rc degiskeni alkil, sikloalkil, aril, sübstitüe edilmis aril, aralkildir.

Haptenler ayrica tasiyicinin tiol ile reaksiyona girebilen bir grup saglayacak sekilde degistirilmis olmasi kaydiyla tasiyici ile reaksiyona girebilen tiol gruplari içerebilir. Tasiyici gruplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, haptenin tasiyiciya baglanmasini saglayan bir reaksiyona girebilen bir grubun katilimi için, tasiyici üzerinde bulunan bir amino grubunun N-Süksinimidil maleimidoasetat (AMAS, CAS# 55750-61- 1'de gösterilen bifonksiyonel ara gruplardan herhangi biriyle reaksiyona sokulmasi suretiyle bir fonksiyonel maleimid grubu içeren bir grubun baglanmasi gibi yöntemlerle degistirilebilir.

Tasiyici ile bir bag olusturma kapasitesine sahip fonksiyonel baglanti grubu, kararli bir baglanti olusturma kapasitesine sahip olan ve tasiyici üzerinde bulunan birtakim farkli gruplara karsi reaktif olabilen herhangi bir grup olabilir.

Fonksiyonel baglanti grubu tercihen tasiyici veya türevi üzerinde bulunan bir amino grubu, bir karboksilik asit grubu veya bir tiol grubu ile reaksiyona girer. Fonksiyonel baglanti grubunun sinirlandirici olmayan örnekleri bir karboksilik asit grubu, asil halojenür, aktif ester (yukarida tarif edilmistir), izosiyanat, izotiosiyanat, alkil halojenür, amino grubu, tiol grubu, maleimid grubu, akrilat grubu (H2C=CH-C(O)-) veya Vinil sülfon grubudur (H2C=CH-SO2-), bkz. Park, J.W. Vd., grubu, hapten ile kademeli olarak reaksiyona girebilen diferansiyel olarak aktiflestirilmis bir ara grup yapi blogunun bir parçasi olarak bulunabilir ve elde edilen hapten türevi akabinde tasiyici ile reaksiyona sokulabilir.

Alternatif olarak hapten, sonraki bir reaksiyon ile fonksiyonel baglanti grubuna. dönüstürülebilen, bir` öncül grup tasiyan bir ara grup ile türevlendirilebilir. Ara grup üzerinde bulunan fonksiyonel baglanti grubunun bir amin veya bir karboksilik asit grubu olmasi halinde, tasiyici üzerinde bulunan karboksilik asit grubu veya amin ile kenetlenme reaksiyonu, peptit kenetleme reaktiflerinin yukarida bu reaktifler için atif yapilan referanslarda verilen prosedürlere göre kullanilmasi yoluyla dogrudan gerçeklestirilebilir.

Bir karisik disülfit baglantisi olusturmak üzere tasiyici üzerinde bir tiol grubu ile etkilesime girebilen ara grup üzerindeki fonksiyonel baglanti grubu olarak belirli disülfit gruplari, örnegin piridildisülfitler kullanilabilir, bkz.

Ghetie, V. vd., Bioconjugate Chem., 1990, 1:24-31. Bu ara gruplar, örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Tablo 7'de gösterilenleri içerdigi uzere, amin tasiyan haptenin, piridildisülfit grubunu tasiyan bir ara gruba bagli bir aktif ester ile reaksiyonu üzerinden baglanabilir. 8/8 'N` Tasiyici çogu kez bir proteindir ve baglanti için lizin rezidülerinin s-amino gruplari kullanilabilir, burada dogrudan bir amin-reaktif fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon gerçeklestirilir ya da N-Süksinimidil S-Asetiltioasetat (SATA, CAS 76931-93-6) veya bir analogu, da dahil olmak *üzere tiol içeren bir grup ile türevlendirmeden sonra, hapten üzerindeki10 Alternatif olarak hapten, sonraki bir reaksiyon ile fonksiyonel baglanti grubuna. dönüstürülebilen, bir` öncül grup tasiyan bir ara grup ile türevlendirilebilir. Ara grup üzerinde bulunan fonksiyonel baglanti grubunun bir amin veya bir karboksilik asit grubu olmasi halinde, tasiyici üzerinde bulunan karboksilik asit grubu veya amin ile kenetlenme reaksiyonu, peptit kenetleme reaktiflerinin yukarida bu reaktifler için atif yapilan referanslarda verilen prosedürlere göre kullanilmasi yoluyla dogrudan gerçeklestirilebilir.

Ghetie, V. vd., Bioconjugate Chem., 1990, 1:24-31. Bu ara gruplar, örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Tablo 7'de gösterilenleri içerdigi uzere, amin tasiyan haptenin, piridildisülfit grubunu tasiyan bir ara gruba bagli bir aktif ester ile reaksiyonu üzerinden baglanabilir. 8/8 'N` Tasiyici çogu kez bir proteindir ve baglanti için lizin rezidülerinin s-amino gruplari kullanilabilir, burada dogrudan bir amin-reaktif fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon gerçeklestirilir ya da N-Süksinimidil S-Asetiltioasetat (SATA, CAS 76931-93-6) veya bir analogu, da dahil olmak *üzere tiol içeren bir grup ile türevlendirmeden sonra, hapten üzerindeki10 fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için tiol grubunu açiga çikarmak üzere asetat grubu hidroksilamin ile kesime ugratilir. Tiol gruplari ayrica bunlarla sinirli olmamak kaydiyla 2-merkaptoetilamin (bkz. Bilah, M. Vd., Bioelectrochemistry, 2010, 80(l):49), fosfin reaktifleri (bkz.

Kirley, T.L., Analytical Biochemistry, 1989, l80(2):23l veya ditioeritritol (DTT, CAS 3483-12-3) (bkz. Cleland, W., indirgen reaktifler kullanilarak. disülfit baglarinin. protein tasiyicilar ile indirgenmesi yoluyla tasiyiciya dahil edilebilir.

GENEL REAKSIYON SEMALARI Antikorlarin üretimi için faydali bilesikler, asagida tarif edilen genel sentez yöntemlerine göre sentezlenebilir. Formül (I) bilesikleri ilgili alanin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle hazirlanabilir. Asagidaki reaksiyon semalarinin sadece örnekleri temsil etmesi ve bulusu herhangi bir sekilde sinirlandirmamasi amaçlanir.

.N _ja `hi 1;. '~' .::1:- "F-_- -. N _I'Â `h I Tanimi 'UH .'l'_ (fî-:Ilk Q/'°^ Ili.` /^- "i -' x sx›` R2 degiskeninin CHgNHC(O)(CHQnC02H oldugu Formül I bilesikleri Sema l'e göre hazirlanabilir. Örnek 1, Adim I'da tarif edildigi gibi hazirlanan (l-metil-4-(2-metil-lOH- benzo[b]thieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)methanamin bilesigi, yaklasik 48 saat boyunca, oda sicakligi ila 60°C araliginda degisen sicakliklarda, piridin gibi bir solvent içerisinde, süksinik anhidrür veya glutarik anhidrür gibi bir siklik anhidrür bilesigi ile reaksiyona fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için tiol grubunu açiga çikarmak üzere asetat grubu hidroksilamin ile kesime ugratilir. Tiol gruplari ayrica bunlarla sinirli olmamak kaydiyla 2-merkaptoetilamin (bkz. Bilah, M. Vd., Bioelectrochemistry, 2010, 80(l):49), fosfin reaktifleri (bkz.

.N _ja `hi 1;. '~' .::1:- "F-_- -. N _I'Â `h I Tanimi 'UH .'l'_ (fî-:Ilk Q/'°^ Ili.` /^- "i -' x sx›` R2 degiskeninin CHgNHC(O)(CHQnC02H oldugu Formül I bilesikleri Sema l'e göre hazirlanabilir. Örnek 1, Adim I'da tarif edildigi gibi hazirlanan (l-metil-4-(2-metil-lOH- benzo[b]thieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)methanamin bilesigi, yaklasik 48 saat boyunca, oda sicakligi ila 60°C araliginda degisen sicakliklarda, piridin gibi bir solvent içerisinde, süksinik anhidrür veya glutarik anhidrür gibi bir siklik anhidrür bilesigi ile reaksiyona sokulur. Ilgili alanin uzmanlari, R1 degiskeninin CHzNHC(O)(CH2h&IbH oldugu Formül I bilesiklerinin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir. x 0 'J 7%43_nr_hu { g-1\_J A i c? k_J 1 f-"li' nirA R2 degiskeninin oldugu bilesikler Sema Z'ye göre hazirlanabilir. Sema l'de tarif edildigi gibi hazirlanan R2 degiskeninin (HhNHC(O)(CHNmCOýi oldugu Formül I bilesikleri, N-t- bütoksikarbonilpiperazin, dietil siyanofosfonat ve bir baz, örnegin diizopropiletilamin ile muamele edilir. Reaksiyon yaklasik 2 saat boyunca oda sicakliginda diklorometan gibi bir solvent içerisinde gerçeklestirilir. Piperazinil grubu Sema 2'te tarif edildigi üzere trifloroasetik anhidrür ile korumadan çikarilir ve akabinde diizopropiletilamin gibi uygun bir baz varliginda süksinik anhidrür veya maleik anhidrür gibi uygun bir anhidrür ile reaksiyon gerçeklestirilir. Ilgili alanin uzmanlari, Rl degiskeni asagidakine karsilik gelen bilesiklerin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir: sokulur. Ilgili alanin uzmanlari, R1 degiskeninin CHzNHC(O)(CH2h&IbH oldugu Formül I bilesiklerinin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir. x 0 'J 7%43_nr_hu { g-1\_J A i c? k_J 1 f-"li' nirA R2 degiskeninin oldugu bilesikler Sema Z'ye göre hazirlanabilir. Sema l'de tarif edildigi gibi hazirlanan R2 degiskeninin (HhNHC(O)(CHNmCOýi oldugu Formül I bilesikleri, N-t- bütoksikarbonilpiperazin, dietil siyanofosfonat ve bir baz, örnegin diizopropiletilamin ile muamele edilir. Reaksiyon yaklasik 2 saat boyunca oda sicakliginda diklorometan gibi bir solvent içerisinde gerçeklestirilir. Piperazinil grubu Sema 2'te tarif edildigi üzere trifloroasetik anhidrür ile korumadan çikarilir ve akabinde diizopropiletilamin gibi uygun bir baz varliginda süksinik anhidrür veya maleik anhidrür gibi uygun bir anhidrür ile reaksiyon gerçeklestirilir. Ilgili alanin uzmanlari, Rl degiskeni asagidakine karsilik gelen bilesiklerin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir: H..” 1i.. ::L-p __L ›_,')--_ TF; nci.' ' i "vr" JT'lîni : 1:-. ./`“' "2" ::k-v Rl degiskeninin 3i^pIIJLMR oldugu Formül 1 bilesikleri Sema 3'e göre hazirlanabilir.

Maleimid ilgili alanda bilinen herhangi bir yöntemle dahil edilebilir. DMF veya CHzClz gibi bir solvent ve tribütilamin veya trietilamin gibi bir baz içerisinde 2,5-dioksopirrolidin- l-il 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)asetat (burada m degiskeni 1 degerini alir) gibi maleimid fonksiyonellestirici gruplar kullanilabilir. Alternatif olarak, Sema 2'de tarif edildigi üzere korumadan çikarilmis piperazinil grubuna Sema 3'te tarif edildigi gibi bir maleimid fonksiyonelligi kazandirilabilir ve böylece R1 degiskeni asagidakine karsilik gelen Formül I bilesikleri elde edilebilir: Ilgili alanin uzmanlari, R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen Formül I bilesiklerinin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir: H..” 1i.. ::L-p __L ›_,')--_ TF; nci.' ' i "vr" JT'lîni : 1:-. ./`“' "2" ::k-v Rl degiskeninin 3i^pIIJLMR oldugu Formül 1 bilesikleri Sema 3'e göre hazirlanabilir.

Maleimid ilgili alanda bilinen herhangi bir yöntemle dahil edilebilir. DMF veya CHzClz gibi bir solvent ve tribütilamin veya trietilamin gibi bir baz içerisinde 2,5-dioksopirrolidin- l-il 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)asetat (burada m degiskeni 1 degerini alir) gibi maleimid fonksiyonellestirici gruplar kullanilabilir. Alternatif olarak, Sema 2'de tarif edildigi üzere korumadan çikarilmis piperazinil grubuna Sema 3'te tarif edildigi gibi bir maleimid fonksiyonelligi kazandirilabilir ve böylece R1 degiskeni asagidakine karsilik gelen Formül I bilesikleri elde edilebilir: Ilgili alanin uzmanlari, R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen Formül I bilesiklerinin yapiminda ayni kimyanin kullanilabilecegini takdir edecektir: Ara grubun ve baglanti grubunun, olanzapine ait diazepin halkasinda sübstitüe edilmemis sekonder azota bagli oldugu bilesikler, semalar 4 ila 8'de gösterilen reaksiyonlarla elde edilebilir. Azotun asillenmesi, Su, J. Vd., Bioorganic ve Med.

Susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde bir baz varliginda süksinik asit mono ester mono asit klorür kullanimi, yukarida tarif edilen ve bu tarifnamenin örnekleri üzerinden açiklanan yöntemlerle islenerek bir immünojene dönüstürülebilecek bir hapten saglamak üzere, ester fonksiyonelligi ilgili alanin uzmanlarinca bilinen standart kosullar altinda, örnegin sulu baz kullanilarak hidrolize h( 1) COZCH3 h( N Q 5, N Q Su Vd. (yukarisi) ayrica sülfonamidlerin hazirlanisini bildirir. Sema 5'te gösterildigi üzere susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde bir baz varliginda bir fonksiyonellestirilmis sülfonilklorür kullanilarak bir karboksi hapten hazirlanabilir ve yukarida tarif edilen ve bu tarifnamenin örnekleri üzerinden açiklanan yöntemlerle bir immünojene dönüstürülebilir.

Ara grubun ve baglanti grubunun, olanzapine ait diazepin halkasinda sübstitüe edilmemis sekonder azota bagli oldugu bilesikler, semalar 4 ila 8'de gösterilen reaksiyonlarla elde edilebilir. Azotun asillenmesi, Su, J. Vd., Bioorganic ve Med.

Su vd. (yukarisi) ayrica Sema 6'da gösterildigi üzere halka azotunun bir nitrit ester ile diazotizasyonu ve akabinde asetik asit içerisinde çinko ile indirgenmesi yoluyla bir hidrazinin hazirlanmasina yönelik yöntemleri ögretir. Meydana gelen hidrazin Sema 7'de gösterildigi üzere birtakim yollarla tekrar fonksiyonellestirilebilir. Burada baska bölümlerde tarif edildigi üzere DMF gibi bir solvent içerisinde tribütilamin gibi bir amin bazi varliginda AMAS gibi bir bifonksiyonel ara grup yapi blogu ile reaksiyon, bir tiol grubu ile reaksiyona sokularak bir tasiyiciya baglanabilecek bir maleimid hapten verebilir. Baz varliginda m- karboksibenzensülfonilklorür gibi bir fonksiyonellestirilmis sülfonil klorür ile sülfonilleme, yukarida tarif edilen ve bu tarifnamenin örnekleri üzerinden açiklanan yöntemlerle bir tasiyiciya baglanmak üzere bir karboksi grubuna sahip bir sülfonilhidrazit verebilir. Ilaveten, kondenzasyon sonucunda olusan suyun uzaklastirildigi kosullar altinda katalitik miktarda asit varliginda hidrazinin bir fonksiyonellestirilmis aldehit veya keton, örnegin US4022780'de tarif edildigi üzere levülinik asit ile reaksiyonu sema 7'de gösterildigi üzere bir hidrazon verir. Hidrazon akabinde yukarida atif yapilan Su, J. vd. tarafindan açiklanan yönteme göre sodyum siyanoborohidrür ile indirgenebilir ve böylece bir doymus türev elde edilebilir.

Q 1) izoamil nitrit Q N- 22 ` ' N- ) n/asehkasn sumH, ,/ ri "5 Sema 8'de gösterildigi üzere bir alkil grubunu olanzapine dogrudan baglamak için U86034078'de tarif edilen yönteme göre halka azotu dogrudan alkillenebilir. 4-Klorometilbütirat gibi bir fonksiyonellestirilmis alkil halojenür kullanilarak elde edilebilen bir ara ürün, ilgili alanin uzmanlarinca bilinen standart kosullar altinda hidrolize tabi tutuldugunda, yukarida tarif edilen ve bu tarifnamenin örnekleri üzerinden açiklanan yöntemlerle tekrar islenerek bir immünojene dönüstürülebilecek bir hapten saglar.

N_ 4'P4 ., Pno TEIN mi 4,.

. J 54 b .. _A_ .lk ?Jr/_5 ”“1~PROTEIN OLANziPiN” L* "'7m 1:?` R? veya R? degiskeninin oldugu maleimid fonksiyonlu haptenler Sema 9'da gösterilen yönteme göre proteinler ile konjüge edilebilir. Epsilon-azotun N-süksinimidil S-asetiltioasetat (SATA) ile asillenmesi yoluyla protein lizin rezidülerinin aktivasyonu ve akabinde S- asetil grubunun hidroksilamin ile hidrolizi sonucunda bir nükleofilik sülfhidril grubu üretilir. Sülfhidril aktivasyonlu proteinin, maleimid türevli hapten (genel sema 3'te açiklandigi gibi hazirlanir) ile konjügasyonu, bir Michael katilma reaksiyonu üzerinden ilerler. Uygun proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, R1 N_ 4'P4 ., Pno TEIN mi 4,.

. J 54 b .. _A_ .lk ?Jr/_5 ”“1~PROTEIN OLANziPiN” L* "'7m 1:?` R? veya R? degiskeninin oldugu maleimid fonksiyonlu haptenler Sema 9'da gösterilen yönteme göre proteinler ile konjüge edilebilir. Epsilon-azotun N-süksinimidil S-asetiltioasetat (SATA) ile asillenmesi yoluyla protein lizin rezidülerinin aktivasyonu ve akabinde S- asetil grubunun hidroksilamin ile hidrolizi sonucunda bir nükleofilik sülfhidril grubu üretilir. Sülfhidril aktivasyonlu proteinin, maleimid türevli hapten (genel sema 3'te açiklandigi gibi hazirlanir) ile konjügasyonu, bir Michael katilma reaksiyonu üzerinden ilerler. Uygun proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, R1 veya R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen maleimid fonksiyonlu haptenleri proteinler ile konjüge etmek için kullanilabilir: 3 H m !:E 0 .1iî;rJL*.~-îf#"Y^`OLANZIPINE 'b ;7 #uff-1:“OLANZIPINE pnoran rk# PROTQN_ H. H I". ?%h"u“'_"'OLANZIPINE Rl veya R2 degiskeninin (HbNHC(O)(CHQmCOýl oldugu karboksilik asit fonksiyonlu haptenler Sema lO'da gösterilen yönteme göre proteinler ile konjüge edilebilir. Yaklasik 18 sa boyunca yaklasik 20°C'lik bir sicaklikta DMF gibi bir solvent içerisinde N-hidroksisüksinimid ve disikloheksilkarbodiimid gibi uygun bir kenetleme maddesi ve tribütil amin gibi bir baz ile reaksiyon, hidroksipirrolidin-Z,5-dion ayrilan grubu ile karboksilik asidi aktiflestirir. Aktiflestirilen baglanti kismi ve hapten akabinde fosfat tamponu (pH 7.5) gibi bir solvent içerisinde yaklasik 20°C'de yaklasik 2.5 saat boyunca bir protein ile konjüge edilebilir. Uygun. proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, R1 veya R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen karboksilik asit fonksiyonlu haptenleri proteinler ile konjüge etmek için kullanilabilir: veya R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen maleimid fonksiyonlu haptenleri proteinler ile konjüge etmek için kullanilabilir: 3 H m !:E 0 .1iî;rJL*.~-îf#"Y^`OLANZIPINE 'b ;7 #uff-1:“OLANZIPINE pnoran rk# PROTQN_ H. H I". ?%h"u“'_"'OLANZIPINE Rl veya R2 degiskeninin (HbNHC(O)(CHQmCOýl oldugu karboksilik asit fonksiyonlu haptenler Sema lO'da gösterilen yönteme göre proteinler ile konjüge edilebilir. Yaklasik 18 sa boyunca yaklasik 20°C'lik bir sicaklikta DMF gibi bir solvent içerisinde N-hidroksisüksinimid ve disikloheksilkarbodiimid gibi uygun bir kenetleme maddesi ve tribütil amin gibi bir baz ile reaksiyon, hidroksipirrolidin-Z,5-dion ayrilan grubu ile karboksilik asidi aktiflestirir. Aktiflestirilen baglanti kismi ve hapten akabinde fosfat tamponu (pH 7.5) gibi bir solvent içerisinde yaklasik 20°C'de yaklasik 2.5 saat boyunca bir protein ile konjüge edilebilir. Uygun. proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, R1 veya R2 degiskeni asagidakine karsilik gelen karboksilik asit fonksiyonlu haptenleri proteinler ile konjüge etmek için kullanilabilir: ANTIKORLAR Mevcut bulus, olanzapine baglanan ve yukarida tanimlandigi üzere bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir. kapasitesine sahip (bir antipsikotik ilaca veya bunun bir metabolitine baglanma kapasitesine sahip) spesifik bir proteini ifade eder. Bir antikor, bir konakçiya, örnegin bir hayvana veya bir insana enjeksiyon yoluyla uygulanmis olabilen bir immünojene yanit olarak üretilir. Genel bir terim olarak antikor fragmanlarini kapsar. saglam antikoru ya da bunun antijene baglanma bakimindan saglam antikor ile rekabet eden bir baglayici fragmanini ifade eder. Genel olarak, ayrisma sabitinin 1 1nd veya daha düsük, tercih edildigi haliyle lOO nM veya daha düsük ve en çok tercih edildigi haliyle lO nM veya daha düsük oldugu durumlarda bir antikorun veya antijen baglayici antikor fragmaninin bir antijene spesifik olarak baglandigi söylenir.

Baglanma, ilgili alanin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle, örnegin bir BIAcoreTM cihaziyla ölçülebilir. tercihen saglam antikorun antijen baglayici veya degisken bölgesini içerir. Baglayici fragmanlar Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlarini; diakorlari; lineer antikorlari; tek Zincirli ANTIKORLAR Mevcut bulus, olanzapine baglanan ve yukarida tanimlandigi üzere bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügatina yanit olarak üretilen bir izole antikorun veya bunun bir baglayici fragmaninin yapiminda kullanilabilir. kapasitesine sahip (bir antipsikotik ilaca veya bunun bir metabolitine baglanma kapasitesine sahip) spesifik bir proteini ifade eder. Bir antikor, bir konakçiya, örnegin bir hayvana veya bir insana enjeksiyon yoluyla uygulanmis olabilen bir immünojene yanit olarak üretilir. Genel bir terim olarak antikor fragmanlarini kapsar. saglam antikoru ya da bunun antijene baglanma bakimindan saglam antikor ile rekabet eden bir baglayici fragmanini ifade eder. Genel olarak, ayrisma sabitinin 1 1nd veya daha düsük, tercih edildigi haliyle lOO nM veya daha düsük ve en çok tercih edildigi haliyle lO nM veya daha düsük oldugu durumlarda bir antikorun veya antijen baglayici antikor fragmaninin bir antijene spesifik olarak baglandigi söylenir.

Baglanma, ilgili alanin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle, örnegin bir BIAcoreTM cihaziyla ölçülebilir. tercihen saglam antikorun antijen baglayici veya degisken bölgesini içerir. Baglayici fragmanlar Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlarini; diakorlari; lineer antikorlari; tek Zincirli antikor moleküllerini ve antikor fragmanlarindan olusan multispesifik antikorlari kapsar. "Bispesifik" veya baglayici bölgesinin özdes oldugu anlasilmalidir.

Burada kullanildigi haliyle "epitop", bir immünglobüline veya T hücre reseptörüne spesifik olarak baglanma kapasitesine sahip herhangi bir protein determinanti kapsar. Epitopik determinantlar genellikle amino asitler veya seker yan zincirleri gibi moleküllerin kimyasal olarak aktif yüzey gruplarindan meydana gelir ve spesifik üç boyutlu yapisal karakteristiklerin yani sira spesifik yük karakteristiklerine de sahiptir. Ilgili alanin uzmanlarinca iyi bilinen yöntemlerin herhangi birine (örnegin yukarida belirtilen BIAcoreTM yöntemine) göre bir rekabetçi baglanma analizinde bir antikorun ikinci bir antikor ile rekabet ettigi gösterildiginde, bu iki antikorun "ayni epitopa baglandigi" ifade edilir. Bir hapten (örnegin olanzapin. veya baska bir antipsikotik ilaç) söz konusu oldugunda, haptenin bir immünojenik 'tasiyici ile konjüge edilmesi yoluyla, antijenik olmayan hapten molekülüne karsi bir antikor üretilebilir.

Sonrasinda hapten ile tanimlanan bir "epitopu" taniyan bir antikor üretilir.

Bir antikor ile baglantili olarak kullanilan "izole" veya eliyle" degisiklige ugratilmis, yani dogada bulunmasi halinde baslangiçtaki ortami degistirilmis ve/veya baslangiçtaki ortamindan uzaklastirilmis anlamina gelir. Örnegin dogal olarak canli bir hayvanda dogal durumunda bulunan bir dogal yoldan meydana gelen antikor "izole" degildir, ancak ayni antikor, dogal ortamindar birlikte var oldugu materyallerden ayrildiginda, terimin burada kullanildigi anlamiyla "izole" edilmistir. Antikorlar, dogal yoldan meydana gelmeyen bilesimler olarak, bir bilesimin, örnegin bir immün analiz antikor moleküllerini ve antikor fragmanlarindan olusan multispesifik antikorlari kapsar. "Bispesifik" veya baglayici bölgesinin özdes oldugu anlasilmalidir.

Sonrasinda hapten ile tanimlanan bir "epitopu" taniyan bir antikor üretilir.

Bir antikor ile baglantili olarak kullanilan "izole" veya eliyle" degisiklige ugratilmis, yani dogada bulunmasi halinde baslangiçtaki ortami degistirilmis ve/veya baslangiçtaki ortamindan uzaklastirilmis anlamina gelir. Örnegin dogal olarak canli bir hayvanda dogal durumunda bulunan bir dogal yoldan meydana gelen antikor "izole" degildir, ancak ayni antikor, dogal ortamindar birlikte var oldugu materyallerden ayrildiginda, terimin burada kullanildigi anlamiyla "izole" edilmistir. Antikorlar, dogal yoldan meydana gelmeyen bilesimler olarak, bir bilesimin, örnegin bir immün analiz reaktifinin içinde bulunabilir ve burada, tarifnamede kullanildigi haliyle terimin anlami kapsaminda izole antikorlar olarak kalir. kullanilmayan bir antijen arasindaki reaksiyonu ifade eder.

Antikor tercihen ilaca ve arzu edilen farmakolojik olarak aktif herhangi bir metabolite baglanacaktir. Immünojenik tasiyicinin bilesiklere baglanma bölgesinin degistirilmesi yoluyla antikorlara seçicilik ve metabolitlerle çapraz reaktivite kazandirilabilir. Olanzapin söz konusu oldugunda ilgili klozapin ilaciyla çapraz reaktivite arzu edilebilir veya edilmeyebilir ve lO-N-gluronid veya 4-N-desmetil olanzapin gibi olanzapin metabolitleriyle çapraz reaktivite arzu edilebilir veya edilmeyebilir. Bu ilaçlarin ve/veya metabolitlerin birçogunu saptayan antikorlar ya da her birini ayri olarak saptayan antikorlar üretilebilir (dolayisiyla antikorun "spesifik baglanma" özellikleri tanimlanabilir). Bir antikor, bir veya daha fazla bilesige baglanimi esmolar veya büyük ölçüde esmolar oldugunda bir veya daha fazla bilesige spesifik olarak baglanir.

Bu tip antikorlarin üretim yöntemleri, bir konakçinin burada tarif edilen konjügat ile asilanmasini içerir. Uygun konakçilar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla fareler, siçanlar, hamsterler, kobaylar, tavsanlar, tavuklar, esekler, atlar, maymunlar, sempanzeler, orangutanlar, goriller, insanlar ve bir olgun immün yanit olusturma kapasitesine sahip türleri kapsar. Bagisiklama prosedürleri ilgili alanda layikiyla bilinir ve "The Immunoassay Handbook", 2nd Edition, edited by David Wild (Nature Publishing Group, 2000) ve içerisinde atif yapilan referanslar gibi çok sayida bilimsel eserde ve yayinda bildirilir. reaktifinin içinde bulunabilir ve burada, tarifnamede kullanildigi haliyle terimin anlami kapsaminda izole antikorlar olarak kalir. kullanilmayan bir antijen arasindaki reaksiyonu ifade eder.

Bu tip antikorlarin üretim yöntemleri, bir konakçinin burada tarif edilen konjügat ile asilanmasini içerir. Uygun konakçilar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla fareler, siçanlar, hamsterler, kobaylar, tavsanlar, tavuklar, esekler, atlar, maymunlar, sempanzeler, orangutanlar, goriller, insanlar ve bir olgun immün yanit olusturma kapasitesine sahip türleri kapsar. Bagisiklama prosedürleri ilgili alanda layikiyla bilinir ve "The Immunoassay Handbook", 2nd Edition, edited by David Wild (Nature Publishing Group, 2000) ve içerisinde atif yapilan referanslar gibi çok sayida bilimsel eserde ve yayinda bildirilir.

Tercihen, mevcut tarifnamenin özelliklerini tasiyan bir immünojen bir konakçi bireye, örnegin bir hayvana veya insana bir adjuvan ile birlikte verilir. Uygun adjuvanlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Freund adjuvani, toz alüminyum hidroksit (alum), Bordetella pertussis ile birlikte alüminyum hidroksit ve monofosforil lipit A-sentetik trehaloz dikorinomikolati (MPL-TDM) kapsar.

Tipik olarak, bir immünojen ya da bir immünojenin ve bir adjuvanin bir kombinasyonu bir memeli konakçiya bir veya daha fazla subkütanöz veya intraperitoneal enjeksiyon ile uygulanabilir. Bagisiklama programi tercihen en ;az bir hafta ve daha çok tercih edildigi haliyle iki veya daha fazla hafta boyunca uygulanir. Bu sekilde üretilen poliklonal antikorlar ilgili alanda iyi bilinen yöntemlerle izole edilebilir ve saflastirilabilir.

Monoklonal antikorlar örnegin Kohler ve Milstein, Nature bilinen hibridoma yöntemleriyle üretilebilir. Hibridoma yöntemleri tipik olarak bir konakçinin veya bir konakçidan alinan lenfositlerin bagisiklanmasini, monoklonal antikoru salgilayan veya salgilama potansiyeline sahip olan lenfositlerin toplanmasini, lenfositlerin ölümsüzlestirilmis hücrelerle kaynastirilmasini ve arzu edilen monoklonal antikoru salgilayan hücrelerin seleksiyona ugratilmasini Bir konakçi, bir immünojene spesifik antikorlari üreten veya üretme kapasitesine sahip olan lenfositleri uyaracak. sekilde bagisiklanabilir. Alternatif olarak lenfositler in vitro olarak bagisiklanabilir. Insan hücreleri arzu edildiginde, periferik kan lenfositleri kullanilabilir, ancak dalak hücreleri veya diger memeli kaynaklara ait lenfositler tercih Tercihen, mevcut tarifnamenin özelliklerini tasiyan bir immünojen bir konakçi bireye, örnegin bir hayvana veya insana bir adjuvan ile birlikte verilir. Uygun adjuvanlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Freund adjuvani, toz alüminyum hidroksit (alum), Bordetella pertussis ile birlikte alüminyum hidroksit ve monofosforil lipit A-sentetik trehaloz dikorinomikolati (MPL-TDM) kapsar.

Monoklonal antikorlar örnegin Kohler ve Milstein, Nature bilinen hibridoma yöntemleriyle üretilebilir. Hibridoma yöntemleri tipik olarak bir konakçinin veya bir konakçidan alinan lenfositlerin bagisiklanmasini, monoklonal antikoru salgilayan veya salgilama potansiyeline sahip olan lenfositlerin toplanmasini, lenfositlerin ölümsüzlestirilmis hücrelerle kaynastirilmasini ve arzu edilen monoklonal antikoru salgilayan hücrelerin seleksiyona ugratilmasini Bir konakçi, bir immünojene spesifik antikorlari üreten veya üretme kapasitesine sahip olan lenfositleri uyaracak. sekilde bagisiklanabilir. Alternatif olarak lenfositler in vitro olarak bagisiklanabilir. Insan hücreleri arzu edildiginde, periferik kan lenfositleri kullanilabilir, ancak dalak hücreleri veya diger memeli kaynaklara ait lenfositler tercih Lenfositler örnegin polietilen glikol gibi bir füzyon maddesinin kullanimiyla kolaylastirilabilen bir proses olarak hibridoma hücrelerini olusturmak üzere bir ölümsüzlestirilmis hücre dizisiyle kaynastirilabilir. Örnek olarak, transformasyon yoluyla ölümsüzlestirilmis mutant kemirgen, sigir veya insan miyelom hücreleri kullanilabilir.

Kaynastirilmis olmayan ölümsüzlestirilmis hücrelere kiyasla, hibridoma hücrelerinin büyük ölçüde saf popülasyonlari tercih edilir. Bu nedenle füzyondan sonra hücreler, örnegin hipoksantin guanin fosforibozil transferaz (HGPRT) enziminden yoksun mutant miyeloni hücreleri kullanilarak, kaynastirilmis olmayan ölümsüzlestirilmis hücrelerin büyümesini veya sagkalimini inhibe eden uygun bir ortamda büyütülebilir.

Böylesi bir durumda HGPRT'den yoksun hücrelerin büyümesini engellemek ve ayni zamanda hibridomalarin büyümesini saglamak için ortama (HAT ortami) hipoksantin, aminopterin ve timidin ilave edilebilir. Ölümsüzlestirilmis hücreler tercihen etkili bir sekilde kaynasir, HAT gibi bir ortamda seleksiyon yoluyla karisik popülasyonlardan izole edilebilir ve füzyondan sonra antikorun stabil ve yüksek düzeyli ekspresyonunu destekler. Tercih edilen ölümsüzlestirilmis hücre dizileri, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (Manassas, VA) temin edilebilen miyelom hücre dizilerini kapsar.

Hibridoma hücreleri antikoru genelde hücre disina salgiladigindan, kültür ortamlari, antipsikotik ilaca spesifik monoklonal antikorlarin varligi için analiz edilebilir.

Monoklonal antikorlarin baglanma spesifikligini ölçmek için radyo immün analiz (RIA) veya enzime bagli immünsorban analizi (ELISA) gibi in vitro baglanma analizlerinin immün presipitasyonu kullanilabilir.

Lenfositler örnegin polietilen glikol gibi bir füzyon maddesinin kullanimiyla kolaylastirilabilen bir proses olarak hibridoma hücrelerini olusturmak üzere bir ölümsüzlestirilmis hücre dizisiyle kaynastirilabilir. Örnek olarak, transformasyon yoluyla ölümsüzlestirilmis mutant kemirgen, sigir veya insan miyelom hücreleri kullanilabilir.

Monoklonal antikor salgilayici hibridoma hücreleri sinirli seyreltme prosedürleriyle tekli klonlar halinde izole edilebilir ve alt kültürlenebilir. Uygun kültür ortamlari, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Dulbecco'nun Degistirilmis Eagle Ortami, RPMI-l640 ve polipeptit içermeyen, polipeptidi azaltilmis veya serum içermeyen ortamlar, örnegin Ultra DOMA PF veya HL-l'i (Biowhittaker, Walkersville, MD) kapsar.

Alternatif olarak hibridoma hücreleri in vivo olarak assit halinde büyütülebilir.

Monoklonal antikorlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polipeptit A-SEPHAROSE, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz, amonyum sülfat presipitasyonu ve afinite kromatografisi de dahil olmak üzere konvansiyonel immünglobülin (Ig) saflastirma prosedürleriyle bir kültür ortamindan veya assit sivisindan izole edilebilir ve/veya saflastirilabilir.

Monoklonal antikorlar ayrica rekombinasyon yöntemleriyle, örnegin U.S. Patent No. 4,166,452'de açiklanan yöntemlerle üretilebilir. Monoklonal antikorlari kodlayan DNA konvansiyonel prosedürlerle, Örnegin murin agir ve hafif antikor zincir genlerine, tercihen antipsikotik ilaçlara spesifik antikorlari salgilayan monoklonal antikor hibridoma hücre dizilerinden izole edilmis prob DNA'ya spesifik olarak baglanan oligonükleotit problari kullanilarak izole edilebilir ve sekanslanabilir.

Antipsikotik ilaç için spesifik baglanma bölgeleri içeren antikor fragmanlari da üretilebilir. Bu tip fragmanlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, antikor molekülünün pepsin ile kesime ugratilmasi yoluyla üretilebilen F(ab')2 fragmanlarini ve F(ab')2 fragmanlarindaki disülfit köprülerinin azaltilmasi yoluyla üretilebilen Fab fragmanlarini kapsar.

Alternatif olarak, arzu edilen spesifiklige sahip Hmnoklonal Monoklonal antikor salgilayici hibridoma hücreleri sinirli seyreltme prosedürleriyle tekli klonlar halinde izole edilebilir ve alt kültürlenebilir. Uygun kültür ortamlari, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Dulbecco'nun Degistirilmis Eagle Ortami, RPMI-l640 ve polipeptit içermeyen, polipeptidi azaltilmis veya serum içermeyen ortamlar, örnegin Ultra DOMA PF veya HL-l'i (Biowhittaker, Walkersville, MD) kapsar.

Alternatif olarak, arzu edilen spesifiklige sahip Hmnoklonal Fab fragmanlarinin hizli ve kolay sekilde belirlenmesini saglayan Fab ekspresyon kütüphaneleri üretilebilir (Huse Vd., fragmanlarinin tümü E. coli bakterilerinde eksprese edilebilir veya bu bakterilerce salinabilir, böylece bu fragmanlarin büyük ölçekte üretimi saglanabilir. Alternatif olarak Fab'-SH fragmanlari dogrudan E. coli hücrelerinden elde edilebilir ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak üzere kimyasal olarak Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir. Tek zincirli FV fragmanlari (scFV) da öngörülür (bkz. U.S. Patent No. bölgelerden yoksun saglam birlesme bölgelerine sahip tek türdür; dolayisiyla bunlarin azalmis spesifik olmayan baglanma sergileme ihtimalleri yüksektir. Antikor fragmani, örnegin U.S. Patent No. 5,642,870'te tarif edildigi üzere bir "lineer antikor" da olabilir. Bu gibi lineer antikor fragmanlari monospesifik veya bispesifik olabilir.

ANALIZ KITLERI VE CIHAZLARI Yukarida tarif edilen bir antikoru içeren bir analiz kiti (bir reaktif kiti olarak da adlandirilir) de saglanabilir. Bir örnek reaktif kiti, antipsikotik ilaca (olanzapin) baglanan bir antikor, bir antipsikotik ilacin veya bir türevinin bir analogunu bir isaretleme grubuna kenetli halde içeren bir kompleks ihtiva edebilir ve istege bagli olarak ayrica bir antipsikotik ilaci veya ilgili bir standardi bilinen bir miktarda içeren bir veya daha fazla kalibratör ihtiva edebilir. kullanilan bir Kateryaller ve reaktifler grubunu ifade eder.

Reaktifler, çapraz reaktivitelerine ve stabilitelerine bagli Fab fragmanlarinin hizli ve kolay sekilde belirlenmesini saglayan Fab ekspresyon kütüphaneleri üretilebilir (Huse Vd., fragmanlarinin tümü E. coli bakterilerinde eksprese edilebilir veya bu bakterilerce salinabilir, böylece bu fragmanlarin büyük ölçekte üretimi saglanabilir. Alternatif olarak Fab'-SH fragmanlari dogrudan E. coli hücrelerinden elde edilebilir ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak üzere kimyasal olarak Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir. Tek zincirli FV fragmanlari (scFV) da öngörülür (bkz. U.S. Patent No. bölgelerden yoksun saglam birlesme bölgelerine sahip tek türdür; dolayisiyla bunlarin azalmis spesifik olmayan baglanma sergileme ihtimalleri yüksektir. Antikor fragmani, örnegin U.S. Patent No. 5,642,870'te tarif edildigi üzere bir "lineer antikor" da olabilir. Bu gibi lineer antikor fragmanlari monospesifik veya bispesifik olabilir.

Reaktifler, çapraz reaktivitelerine ve stabilitelerine bagli olarak ayni kapta veya ayri kaplarda ve sivi veya liyofilize formda ambalajli bir kombinasyon halinde sunulabilir. Kitte sunulan reaktiflerin miktarlari ve oranlari, belirli bir uygulama için optimum sonuçlar saglayacak sekilde seçilebilir.

Mevcut tarifnamenin özelliklerini tasiyan bir analiz kiti, olanzapine baglanan antikorlar içerir. Kit ilaveten olanzapin için rekabetçi baglanma partnerleri ve kalibrasyon ve kontrol materyalleri içerir. bir analit içeren herhangi bir standart veya referans materyal anlamina gelir. Bir analit içerdigi düsünülen bir numune ve karsilik. gelen kalibrasyon materyali benzer' kosullar altinda analiz edilir; Analit konsantrasyonu, bilinmeyen, numune için elde edilen sonuçlarin, standart için elde edilen sonuçlar ile karsilastirilmasi yoluyla hesaplanir. Bu mutat olarak bir kalibrasyon egrisinin olusturulmasi yoluyla gerçeklestirilir.

Antikorlar, bunlarin kullanimina yönelik talimatlar ile birlikte, bir kite, kaba, pakete veya dispensere dahil edilebilir. Antikorlar bir kitte sunuldugunda, immün analizin farkli bilesenleri ayri kaplarda ambalajlanabilir ve kullanimdan önce karistirilabilir. Bilesenlerin bu sekilde ayri olarak ambalajlanmasi, aktif bilesenlerin islevi büyük ölçüde azalmadan uzun süreli depolamayi mümkün kilabilir.

Reaktifler ayrica atil kosullar altinda, örnegin özellikle havaya ve/veya neme karsi duyarli olan reaktifler için tercih edildigi üzere bir pozitif basinçli azot atmosferi, argon atmosferi veya benzerleri altinda ambalajlanabilir.

Kitlere dahil edilen reaktifler, farkli bilesenlerin aktivitelerinin büyük ölçüde korunmasini ve ayni zamanda bilesenlerin kap Hateryalleri tarafindan büyük ölçüde adsorbe edilmemesi veya degisiklige ugratilmamasi kaydiyla tüm kap çesitlerinde sunulabilir. Uygun kaplar, bunlarla sinirli olarak ayni kapta veya ayri kaplarda ve sivi veya liyofilize formda ambalajli bir kombinasyon halinde sunulabilir. Kitte sunulan reaktiflerin miktarlari ve oranlari, belirli bir uygulama için optimum sonuçlar saglayacak sekilde seçilebilir.

Kitlere dahil edilen reaktifler, farkli bilesenlerin aktivitelerinin büyük ölçüde korunmasini ve ayni zamanda bilesenlerin kap Hateryalleri tarafindan büyük ölçüde adsorbe edilmemesi veya degisiklige ugratilmamasi kaydiyla tüm kap çesitlerinde sunulabilir. Uygun kaplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla ampuller, siseler, test tüpleri, flakonlar, yassi siseler, siringalar, zarflar, örnegin folyo astarli zarflar ve benzerlerini kapsar. Kaplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla cam, organik polimerler, örnegin polikarbonat, polistiren, polietilen vs., seramik, metal, örnegin alüminyum, metal alasimlari, örnegin çelik, mantar ve benzerleri de dahil olmak üzere uygun herhangi bir malzemeden olusabilir. Kaplar ayrica örnegin bir igne ile erisim için bir veya daha fazla steril erisim girisi içerebilir, örnegin bir septum ile donatili olabilir. Septumlar için tercih edilen materyaller, kauçugu ve DuPont (Wilmington, DE) tarafindan TEFLON markasi altinda pazarlanan politetrafloroetileni kapsar. Bunlarin. yani sira, kaplar, bilesenlerin. karismasini saglamak üzere çikarilabilen bölme duvarlari veya nembranlar ile ayrilmis iki veya daha fazla bölme içerebilir.

Reaktif kitleri ayrica talimat materyalleri ile birlikte sunulabilir. Talimatlar örnegin kagit üzerine basili halde bulunabilir ve/veya elektronik olarak okunabilir bir ortamda sunulabilir. Alternatif olarak. talimatlar, bir kullanicinin, Örnegin kitin imalatçi veya dagitici firmasi tarafindan belirtilen bir internet sitesine yönlendirilmesi yoluyla ve/Veya e-posta araciligiyla sunulabilir.

Antikor ayrica bir analiz cihazinin bir parçasi olarak saglanabilir. Bu analiz cihazlari, yanal akis analiz cihazlarini kapsar. Yaygin bir tek kullanimlik yanal akis analiz cihazi türü, sivi numunenin uygulandigi bir bölgeye veya alana, bir konjugat bölgesine ve bir reaksiyon bölgesine sahiptir. Bu analiz cihazlari, yanal akis test seritleri yaygin olarak bilinir. Burada, kilcal akisi destekleme kapasitesine sahip sivi akisi için bir yol tanimlayan gözenekli bir materyal, örnegin nitroselüloz kullanilir. 6,228'de gösterilenleri kapsar. olmamak kaydiyla ampuller, siseler, test tüpleri, flakonlar, yassi siseler, siringalar, zarflar, örnegin folyo astarli zarflar ve benzerlerini kapsar. Kaplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla cam, organik polimerler, örnegin polikarbonat, polistiren, polietilen vs., seramik, metal, örnegin alüminyum, metal alasimlari, örnegin çelik, mantar ve benzerleri de dahil olmak üzere uygun herhangi bir malzemeden olusabilir. Kaplar ayrica örnegin bir igne ile erisim için bir veya daha fazla steril erisim girisi içerebilir, örnegin bir septum ile donatili olabilir. Septumlar için tercih edilen materyaller, kauçugu ve DuPont (Wilmington, DE) tarafindan TEFLON markasi altinda pazarlanan politetrafloroetileni kapsar. Bunlarin. yani sira, kaplar, bilesenlerin. karismasini saglamak üzere çikarilabilen bölme duvarlari veya nembranlar ile ayrilmis iki veya daha fazla bölme içerebilir.

Antikor ayrica bir analiz cihazinin bir parçasi olarak saglanabilir. Bu analiz cihazlari, yanal akis analiz cihazlarini kapsar. Yaygin bir tek kullanimlik yanal akis analiz cihazi türü, sivi numunenin uygulandigi bir bölgeye veya alana, bir konjugat bölgesine ve bir reaksiyon bölgesine sahiptir. Bu analiz cihazlari, yanal akis test seritleri yaygin olarak bilinir. Burada, kilcal akisi destekleme kapasitesine sahip sivi akisi için bir yol tanimlayan gözenekli bir materyal, örnegin nitroselüloz kullanilir. 6,228'de gösterilenleri kapsar.

Baska bir analiz cihazi türü, kilcal akisi uyarmak için çikintilar içeren bir gözeneksiz analiz cihazidir. Bu tip analiz cihazlarinin örnekleri, PCT Uluslararasi Yayin No. WO Bir gözeneksiz analiz cihazinda, analiz cihazi genel olarak en az bir numune ekleme bölgesine, en az bir konjügat bölgesine, en. az bir reaksiyon bölgesine ve en az bir emme bölgesine sahiptir. Bölgeler, numunenin numune ekleme bölgesinden emme bölgesine dogru akmasini saglayan bir akis yolu olusturur.

Ayrica, reaksiyon bölgesinde istege bagli olarak cihazin üzerine uygulanan (örnegin kaplama yoluyla) analite baglanma kapasitesine sahip yakalama elemanlari, örnegin antikorlar ve konjügat bölgesinde cihazin üzerine uygulanan analit konsantrasyonunun belirlenmesini saglayacak reaksiyonlara katilma kapasitesine sahip bir isaretli konjügat materyali dahil edilir, burada isaretli konjügat materyali, reaksiyon bölgesinde tayin için bir isaret tasir. Numune konjügat bölgesinden geçerken konjügat materyali çözünerek, reaksiyon bölgesine dogru akis asagi akan çözünmüs isaretli konjügat materyalinin ve numunenin bir konjügat bulutunu meydana getirir. Konjügat bulutu reaksiyon bölgesine aktikça, konjüge materyal, örnegin bir konjüge materyal - analit kompleksi seklinde (bir "sandviç" tip analizde oldugu gibi) veya dogrudan (bir "rekabetçi" analizde oldugu gibi) yakalama elemanlari tarafindan yakalanir. Baglanmayan çözünmüs konjügat materyali sürüklenerek reaksiyon bölgesinden en az bir emme bölgesine geçer. Bu tip cihazlar akis yolunda çikintilar veya mikroayaklar içerebilir. cihaz, reaksiyon bölgesindeki bagli konjüge materyali Baska bir analiz cihazi türü, kilcal akisi uyarmak için çikintilar içeren bir gözeneksiz analiz cihazidir. Bu tip analiz cihazlarinin örnekleri, PCT Uluslararasi Yayin No. WO Bir gözeneksiz analiz cihazinda, analiz cihazi genel olarak en az bir numune ekleme bölgesine, en az bir konjügat bölgesine, en. az bir reaksiyon bölgesine ve en az bir emme bölgesine sahiptir. Bölgeler, numunenin numune ekleme bölgesinden emme bölgesine dogru akmasini saglayan bir akis yolu olusturur.

Ayrica, reaksiyon bölgesinde istege bagli olarak cihazin üzerine uygulanan (örnegin kaplama yoluyla) analite baglanma kapasitesine sahip yakalama elemanlari, örnegin antikorlar ve konjügat bölgesinde cihazin üzerine uygulanan analit konsantrasyonunun belirlenmesini saglayacak reaksiyonlara katilma kapasitesine sahip bir isaretli konjügat materyali dahil edilir, burada isaretli konjügat materyali, reaksiyon bölgesinde tayin için bir isaret tasir. Numune konjügat bölgesinden geçerken konjügat materyali çözünerek, reaksiyon bölgesine dogru akis asagi akan çözünmüs isaretli konjügat materyalinin ve numunenin bir konjügat bulutunu meydana getirir. Konjügat bulutu reaksiyon bölgesine aktikça, konjüge materyal, örnegin bir konjüge materyal - analit kompleksi seklinde (bir "sandviç" tip analizde oldugu gibi) veya dogrudan (bir "rekabetçi" analizde oldugu gibi) yakalama elemanlari tarafindan yakalanir. Baglanmayan çözünmüs konjügat materyali sürüklenerek reaksiyon bölgesinden en az bir emme bölgesine geçer. Bu tip cihazlar akis yolunda çikintilar veya mikroayaklar içerebilir. cihaz, reaksiyon bölgesindeki bagli konjüge materyali saptayabilir. Yaygin isaretler, floresan boyalari uyaran ve floresan boyalari saptama kapasitesine sahip bir detektör içeren cihazlarla saptanabilen floresan boyalari kapsar.

IMMÜN ANALIZLER Bu sekilde üretilen antikorlar immün analizlerde antipsikotik ilaci tanima/antipsikotik ilaca baglanma için kullanilabilir, böylece ilacin bir hasta numunesinde varligi ve/veya miktari saptanabilir. Analiz formati tercihen bir rekabetçi immün analiz formatidir. Bu tip bir analiz formati ve baska analizler, diger yerlerin yani sira, Hampton vd. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN 1990) ve Maddox vd. (J. Exp. Med. l58:12lll, 1983) tarafindan açiklanir. bir maddeyi veya madde grubunu ifade eder. Örnek antipsikotik ilaç analitleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, risperidon, paliperidon, olanzapin, aripiprazol ve ketiapini immün analizde kullanilabilecek, bir antikora yönelik baglanma afinitesi bakimindan bir analite benzer bir sekilde davranan bir maddeyi veya madde grubunu ifade eder. Örnek rekabetçi baglanma partnerleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, antipsikotik ilaç türevleri ve benzerlerini kapsar.

Bir analit ile baglantili olarak. kullanilan "saptamak” veya nitel yöntemi ve ayrica genel olarak bir analitin ve özellikle bir antipsikotik ilacin belirlenmesine yönelik tüm diger yöntemleri ifade eder. Örnegin antikor, antipsikotik ilacin numunedeki miktari veya konsantrasyonu ile ilgili veriler saptayabilir. Yaygin isaretler, floresan boyalari uyaran ve floresan boyalari saptama kapasitesine sahip bir detektör içeren cihazlarla saptanabilen floresan boyalari kapsar.

Bir analit ile baglantili olarak. kullanilan "saptamak” veya nitel yöntemi ve ayrica genel olarak bir analitin ve özellikle bir antipsikotik ilacin belirlenmesine yönelik tüm diger yöntemleri ifade eder. Örnegin antikor, antipsikotik ilacin numunedeki miktari veya konsantrasyonu ile ilgili veriler saglayan yöntemlere ek olarak, sadece bir antipsikotik ilacin bir numunedeki varligini veya yoklugunu saptamaya yönelik bir yöntemde kullanilabilir. "Saptamak", "tayin etmek", kullanilir.

Antikor, antipsikotik ilaca baglanan antikorlarin ya da ilaç veya bunun rekabetçi baglanma partnerinin bir kati destege (örnegin bir yanal akis analiz cihazinda reaksiyon bölgesine) baglandigi ve isaretli ilaç veya bunun rekabetçi baglanma partnerinin ya da isaretli antikorun ve konakçiya ait bir numunenin kati destek 'üzerinden geçirildigi ve kati destege baglanan isaretin saptanan miktarinin numunedeki ilaç miktari ile iliskilendirilebildigi bir rekabetçi immün analizde kullanilabilir.

Bir analit, örnegin bir antipsikotik ilaç içerdigi düsünülen herhangi bir numune, tercih edilen mevcut yapilanmalarin yöntemlerine göre analiz edilebilir. Numune arzu edildiginde ön isleme tabi tutulabilir ve analize müdahale etmeyen uygun herhangi bir ortamda hazirlanabilir. Numune tercihen bir sulu ortam, örnegin bir konakçiya ait bir vücut sivisi ve en çok tercih edildigi haliyle plazma veya serum içerir.

Antikorlarin kati fazlara baglandigi analizler ve antikorlarin sivi ortam içerisinde bulundugu analizler de dahil olmak üzere, antikorlarin kullanildigi tüm immün analizlerin simdilik tercih edilen yapilanmalara göre kullaniminin öngörüldügü anlasilmalidir. Analitlerin antikorlarla saptanmasi için kullanilabilecek immün analiz yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, isaretli analit (analit analogu) ile bir numunedeki analitin antikorlar için rekabet ettigi rekabetçi (reaktif ile sinirli) analizler ve antikorun isaretlendigi tek bölgeli immünometrik analizler ve benzerlerini kapsar. saglayan yöntemlere ek olarak, sadece bir antipsikotik ilacin bir numunedeki varligini veya yoklugunu saptamaya yönelik bir yöntemde kullanilabilir. "Saptamak", "tayin etmek", kullanilir.

Antikorlarin kati fazlara baglandigi analizler ve antikorlarin sivi ortam içerisinde bulundugu analizler de dahil olmak üzere, antikorlarin kullanildigi tüm immün analizlerin simdilik tercih edilen yapilanmalara göre kullaniminin öngörüldügü anlasilmalidir. Analitlerin antikorlarla saptanmasi için kullanilabilecek immün analiz yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, isaretli analit (analit analogu) ile bir numunedeki analitin antikorlar için rekabet ettigi rekabetçi (reaktif ile sinirli) analizler ve antikorun isaretlendigi tek bölgeli immünometrik analizler ve benzerlerini kapsar.

Mevcut bulus ilaveten asagidaki örnekler üzerinden tarif edilecektir. Örnekler sadece bulusu spesifik yapilanmalara basvurarak açiklamak için verilmistir. Bu örnekler bulusun belirli spesifik yönlerini açiklar ve öte yandan herhangi bir kisitlama olusturmaz ya da açiklanan bulusun kapsamini sinirlandirmaz.

Tüm örnekler, aksi açikça belirtilmedikçe, ilgili alanin uzmanlarinca iyi bilinen ve rutin olarak kullanilan standart tekniklerle gerçeklestirilmistir. Asagidaki örneklerde rutin moleküler biyoloji teknikleri standart laboratuar el kitaplarinda, örnegin Sambrook vd., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) referansli yayinda tarif edildigi gibi uygulanabilir. il)piperazin-Z-il)metanamin tert-Bütil 3-siyanopiperazin-l-karboksilat Mevcut bulus ilaveten asagidaki örnekler üzerinden tarif edilecektir. Örnekler sadece bulusu spesifik yapilanmalara basvurarak açiklamak için verilmistir. Bu örnekler bulusun belirli spesifik yönlerini açiklar ve öte yandan herhangi bir kisitlama olusturmaz ya da açiklanan bulusun kapsamini sinirlandirmaz.

Tüm örnekler, aksi açikça belirtilmedikçe, ilgili alanin uzmanlarinca iyi bilinen ve rutin olarak kullanilan standart tekniklerle gerçeklestirilmistir. Asagidaki örneklerde rutin moleküler biyoloji teknikleri standart laboratuar el kitaplarinda, örnegin Sambrook vd., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) referansli yayinda tarif edildigi gibi uygulanabilir. il)piperazin-Z-il)metanamin tert-Bütil 3-siyanopiperazin-l-karboksilat THF içindeki tert-bütil 3-siyanopiperazin-1-karboksi1at (21.1 g, 0.1 mol) ve sulu formaldehit (24 g, su içinde %37) solüsyonuna kisimlar halinde sodyum siyanoborohidrür (31.5 g, 0.5 mol) ilave edilmistir. Reaksiyon karisimi gece boyunca ortam sicakliginda bekletilmistir ve akabinde su ile seyreltilmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Organik faz doymus sulu sodyum klorür ile yikanmisti, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve vakum altinda konsantre edilmistir. Ham ürün, baslik bilesigini vermek üzere kolon kromatografisiyle saflastirilmistir. lH NMR (400MHZ, tert-Bütil 3-(aminometil)-4-meti1piperazin-l-karboksilat HzN/TJÄO/k Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3-siyano- 4-metilpiperazin-l-karboksilat (10.5 g, 47 mmol) bilesiginin metanol ( ve trietilamin (5 mL) ilave edilmistir. Karisim gece boyunca hidrojen atmosferi (50 psi) altinda ortam sicakliginda karistirilmistir. tert-Bütil 3-siyano-4-metilpiperazin-l- karboksilat tükendikten sonra karisim filtrelenmistir ve süzüntünün vakum altinda konsantre edilmesi sonucunda elde edilen ham tert-bütil 3-(aminometil)-4-meti1piperazin-1- karboksilat bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir.

THF içindeki tert-bütil 3-siyanopiperazin-1-karboksi1at (21.1 g, 0.1 mol) ve sulu formaldehit (24 g, su içinde %37) solüsyonuna kisimlar halinde sodyum siyanoborohidrür (31.5 g, 0.5 mol) ilave edilmistir. Reaksiyon karisimi gece boyunca ortam sicakliginda bekletilmistir ve akabinde su ile seyreltilmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Organik faz doymus sulu sodyum klorür ile yikanmisti, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve vakum altinda konsantre edilmistir. Ham ürün, baslik bilesigini vermek üzere kolon kromatografisiyle saflastirilmistir. lH NMR (400MHZ, tert-Bütil 3-(aminometil)-4-meti1piperazin-l-karboksilat HzN/TJÄO/k Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3-siyano- 4-metilpiperazin-l-karboksilat (10.5 g, 47 mmol) bilesiginin metanol ( ve trietilamin (5 mL) ilave edilmistir. Karisim gece boyunca hidrojen atmosferi (50 psi) altinda ortam sicakliginda karistirilmistir. tert-Bütil 3-siyano-4-metilpiperazin-l- karboksilat tükendikten sonra karisim filtrelenmistir ve süzüntünün vakum altinda konsantre edilmesi sonucunda elde edilen ham tert-bütil 3-(aminometil)-4-meti1piperazin-1- karboksilat bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. tert-Bütil 3-((1,3-dioksoizoindolin-2-il)metil)-4- Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3- metilpiperazin-l-karboksilat (aminometil)-4-metilpiperazin-l-karboksilat (5.5 g, ham) ve sodyum bikarbonat (2.52 g, 30 mmol) bilesiklerinin tetrahidrofuran ( içindeki karisimina ortam sicakliginda tetrahidrofuran (20 mL) içindeki 2H-izoindol-2- karboksilik asit, 1,3-dihidro-l,3-diokso-etil ester (6.59 g, mmol) solüsyonu ilave edilmistir. 30 dakika karistirildiktan sonra süspansiyonun filtrelenmesi ve süzüntünün konsantre edilmesi sonucunda elde edilen ham ürün, baslik bilesigini vermek üzere kolon kromatografisiyle saflastirilmistir. lH NMR (4OOMHZ, MeOD) ö 7.87-7.85 (m, 2H), 2-((1-Metilpiperazin-2-il)metil)izoindolin-1,3-dion Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3- ((l,3-dioksoizoindolin-2-il)metil)-4-metilpiperazin-l-10 tert-Bütil 3-((1,3-dioksoizoindolin-2-il)metil)-4- Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3- metilpiperazin-l-karboksilat (aminometil)-4-metilpiperazin-l-karboksilat (5.5 g, ham) ve sodyum bikarbonat (2.52 g, 30 mmol) bilesiklerinin tetrahidrofuran ( içindeki karisimina ortam sicakliginda tetrahidrofuran (20 mL) içindeki 2H-izoindol-2- karboksilik asit, 1,3-dihidro-l,3-diokso-etil ester (6.59 g, mmol) solüsyonu ilave edilmistir. 30 dakika karistirildiktan sonra süspansiyonun filtrelenmesi ve süzüntünün konsantre edilmesi sonucunda elde edilen ham ürün, baslik bilesigini vermek üzere kolon kromatografisiyle saflastirilmistir. lH NMR (4OOMHZ, MeOD) ö 7.87-7.85 (m, 2H), 2-((1-Metilpiperazin-2-il)metil)izoindolin-1,3-dion Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan tert-bütil 3- ((l,3-dioksoizoindolin-2-il)metil)-4-metilpiperazin-l-10 karboksilat (8.6 9) bilesiginin metanolik hidrojen klorür (20 mL) içindeki solüsyonu oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Solventin vakum altinda uzaklastirilmasi sonucunda elde edilen 2-((1-metilpiperazin-2- il)metil)izoindolin-1,3-dion bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. 1H NMR (4OOMH2, MeOD) 5 7.88- 2.40 (m, lH).

-Metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitri1 Dimetilsülfoksit içindeki 2-amino-5-metiltiofen-3-karbonitril mmol) solüsyonuna potasyum hidroksit (11.2 9, 200 mmol) ilave edilmistir. Reaksiyon karisimi gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Karisim. su ile seyreltilmistir ve meydana gelen süspansiyon filtrelenmistir. Filtre kekinin kurutulmasi sonucunda bir kirmizi kati olarak elde edilen 5-metil-2-((2- nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitril tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. 1H NMR: (, 8.27- karboksilat (8.6 9) bilesiginin metanolik hidrojen klorür (20 mL) içindeki solüsyonu oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Solventin vakum altinda uzaklastirilmasi sonucunda elde edilen 2-((1-metilpiperazin-2- il)metil)izoindolin-1,3-dion bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. 1H NMR (4OOMH2, MeOD) 5 7.88- 2.40 (m, lH).

-Metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitri1 Dimetilsülfoksit içindeki 2-amino-5-metiltiofen-3-karbonitril mmol) solüsyonuna potasyum hidroksit (11.2 9, 200 mmol) ilave edilmistir. Reaksiyon karisimi gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Karisim. su ile seyreltilmistir ve meydana gelen süspansiyon filtrelenmistir. Filtre kekinin kurutulmasi sonucunda bir kirmizi kati olarak elde edilen 5-metil-2-((2- nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitril tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. 1H NMR: (, 8.27- 2-((2-Aminofenil)amino)-5-metiltiofen-3-karbonitril Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 5-metil-2-((2- nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitril, , (43.3 g, 0.157 mol) bilesiginin etil asetat ( içindeki solüsyonuna %10'luk karbon üstü paladyuni (8 g) ilave edilmistir. Siyah karisim gece boyunca oda sicakliginda bir hidrojen atmosferi altinda karistirilmistir. 5-Metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiofen-3- karbonitril bilesiginin büyük bir bölümünün tamamen tükendigi LCMS ile dogrulandiktan sonra karisim filtrelenmistir ve süzüntü, 2-((2-aminofenil)amino)-5-metiltiofen-3-karbonitril bilesigini vermek üzere konsantre edilmistir. 1H NMR (4OOMHZ, 2.28 (8, 3H). 2-Metil-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-amin Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((2- aminofenil)amino)-5-metiltiofen-S-karbonitril (22.9 g, 100 mmol) bilesiginin izopropanol ( ve sulu hidroklorik asit (50 mL, %18) içindeki karisimi 80°C'de 3 sa isitilmistir.

Meydana gelen süspansiyon filtrelenmistir ve filtre keki, baslik bilesigini bir kirmizi kati olarak vermek üzere 2-((2-Aminofenil)amino)-5-metiltiofen-3-karbonitril Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 5-metil-2-((2- nitrofenil)amino)tiofen-3-karbonitril, , (43.3 g, 0.157 mol) bilesiginin etil asetat ( içindeki solüsyonuna %10'luk karbon üstü paladyuni (8 g) ilave edilmistir. Siyah karisim gece boyunca oda sicakliginda bir hidrojen atmosferi altinda karistirilmistir. 5-Metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiofen-3- karbonitril bilesiginin büyük bir bölümünün tamamen tükendigi LCMS ile dogrulandiktan sonra karisim filtrelenmistir ve süzüntü, 2-((2-aminofenil)amino)-5-metiltiofen-3-karbonitril bilesigini vermek üzere konsantre edilmistir. 1H NMR (4OOMHZ, 2.28 (8, 3H). 2-Metil-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-amin Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((2- aminofenil)amino)-5-metiltiofen-S-karbonitril (22.9 g, 100 mmol) bilesiginin izopropanol ( ve sulu hidroklorik asit (50 mL, %18) içindeki karisimi 80°C'de 3 sa isitilmistir.

Meydana gelen süspansiyon filtrelenmistir ve filtre keki, baslik bilesigini bir kirmizi kati olarak vermek üzere kurutulmusturu lH NMR (, 4-il)piperazin-Z-il)metil)izoindolin-1,3-dion Adim D'de tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((l-metilpiperazin- 2-il)metil)izoindolin-l,3-dion (100 mg, 0.38 mmol), adim G'de tarif edildigi gibi hazirlanan 2-metil-10H-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-4-amin (150 mg, 0.52 mmol) ve diizopropiletilamin (0.49 g, 3.8 mmol) bilesiklerinin dimetilsülfoksit ( içindeki solüsyon 170°C'de 2 sa karistirilmistir. Reaksiyon su ile seyreltilmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Organik faz konsantre edilmistir ve kalinti, 15 mg 2-((l-metil-4-(2-metil-10H-benzo[b]tieno[2,3- e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metil)izoindolin-l,3-dion vermek üzere kolonla saflastirilmistir. lH NMR (400 MHZ, CDC1Q kurutulmusturu lH NMR (, 4-il)piperazin-Z-il)metil)izoindolin-1,3-dion Adim D'de tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((l-metilpiperazin- 2-il)metil)izoindolin-l,3-dion (100 mg, 0.38 mmol), adim G'de tarif edildigi gibi hazirlanan 2-metil-10H-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-4-amin (150 mg, 0.52 mmol) ve diizopropiletilamin (0.49 g, 3.8 mmol) bilesiklerinin dimetilsülfoksit ( içindeki solüsyon 170°C'de 2 sa karistirilmistir. Reaksiyon su ile seyreltilmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Organik faz konsantre edilmistir ve kalinti, 15 mg 2-((l-metil-4-(2-metil-10H-benzo[b]tieno[2,3- e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metil)izoindolin-l,3-dion vermek üzere kolonla saflastirilmistir. lH NMR (400 MHZ, CDC1Q il)piperazin-Z-il)metanamin Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((1-metil-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- i1)meti1)izoindolin-1,3-dion (1.0 g) bilesiginin etanolik metilamin (20 mL) içindeki solüsyonu gece boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Solvent vakum altinda uzaklastirilmistir ve kalinti, (1-metil-4-(2-metil-1OH- benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)metananûli bilesiginin, hidroklorür tuzunu bir kirmizi kati olarak vermek üzere HPLC ile saflastirilmistir. lH NMR (, 7.19-7.15 hesaplanan ESI-MS (M+1): 342, Kesin Kütle: 341.17. metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- i1)metil)asetamid dk 24%? il)piperazin-Z-il)metanamin Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-((1-metil-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- i1)meti1)izoindolin-1,3-dion (1.0 g) bilesiginin etanolik metilamin (20 mL) içindeki solüsyonu gece boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Solvent vakum altinda uzaklastirilmistir ve kalinti, (1-metil-4-(2-metil-1OH- benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)metananûli bilesiginin, hidroklorür tuzunu bir kirmizi kati olarak vermek üzere HPLC ile saflastirilmistir. lH NMR (, 7.19-7.15 hesaplanan ESI-MS (M+1): 342, Kesin Kütle: 341.17. metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- i1)metil)asetamid dk 24%? Örnek 1'de tarif edildigi gibi hazirlanan (1-metil-4-(2-metil- 10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)metanamin (10.3 mg, 30.2 umol) bilesiginin 570 uL DMF ve 13.3 uL tribütilamin içindeki solüsyonuna, DMF içindeki N-(d- maleimidoasetoksi) süksinimid ester (AMAS, 10 mg/mL, 7.6 mg, .2 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon 20°C'de 18 saat karismaya birakilmistir, akabinde tiol ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonlarinda oldugu gibi kullanilmistir. (2-Meti1-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3- 2-(4-Siyano-2-nitro-fenilamino)-5-metil-tiofen-3-karbonitri1 THF (2 mL) içindeki sodyum hidrür (%60, 0-58 9) süspansiyonuna damlalar halinde THF (10 mL) içinde 4-floro-3-nitro- benzonitril (1.33 g, 8.0 mmol) ve 2-amino-5-metiltiofen-3- karbonitril (1.10 g, 8.0 mmol) ilave edilmistir. Karisim gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Sonraki 6 saat10 Örnek 1'de tarif edildigi gibi hazirlanan (1-metil-4-(2-metil- 10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)metanamin (10.3 mg, 30.2 umol) bilesiginin 570 uL DMF ve 13.3 uL tribütilamin içindeki solüsyonuna, DMF içindeki N-(d- maleimidoasetoksi) süksinimid ester (AMAS, 10 mg/mL, 7.6 mg, .2 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon 20°C'de 18 saat karismaya birakilmistir, akabinde tiol ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonlarinda oldugu gibi kullanilmistir. (2-Meti1-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3- 2-(4-Siyano-2-nitro-fenilamino)-5-metil-tiofen-3-karbonitri1 THF (2 mL) içindeki sodyum hidrür (%60, 0-58 9) süspansiyonuna damlalar halinde THF (10 mL) içinde 4-floro-3-nitro- benzonitril (1.33 g, 8.0 mmol) ve 2-amino-5-metiltiofen-3- karbonitril (1.10 g, 8.0 mmol) ilave edilmistir. Karisim gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Sonraki 6 saat10 içerisinde iki parti daha sodyum hidrür (%60, 0.50 g ve 0.4 g) ilave edilmistir. 3 gün karistirildiktan sonra karisim buzlu su (20 mL) içerisine bosaltilmistir ve 6 N hidroklorik asit (7 mL) ile pH 3 seviyesine asitlestirilmistir. Çökelti filtrelenmistir ve su ile yikanmistir. Kati ürün diklorometan (35 mL) ile özütlenmistir. Solüsyon bir kati halinde konsantre edilmistir ve bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z . lH NMR -Amino-2-meti1-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- karbonitril hidroklorür Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-(4-Siyano-2- nitro-fenilamino)-5-metil-tiofen-3-karbonitril (0.52 g) bilesiginin etanol (5 mL) içindeki süspansiyonuna 6 N HCl içinde kalay klorür (1.36 g, 7.2 mmol) ilave edilmistir.

Karisim 85°C'lik yag banyosunda 3 saat isitilmistir ve akabinde buz banyosunda sogutulmustur. Kati ürünün filtrelenmesi, su ile yikanmasi ve rengi kahverengi olana kadar kurutulmasi sonucunda inorganik tuz içeren bir kahverengi kati olarak elde edilen baslik bilesigi bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z 11.18 içerisinde iki parti daha sodyum hidrür (%60, 0.50 g ve 0.4 g) ilave edilmistir. 3 gün karistirildiktan sonra karisim buzlu su (20 mL) içerisine bosaltilmistir ve 6 N hidroklorik asit (7 mL) ile pH 3 seviyesine asitlestirilmistir. Çökelti filtrelenmistir ve su ile yikanmistir. Kati ürün diklorometan (35 mL) ile özütlenmistir. Solüsyon bir kati halinde konsantre edilmistir ve bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z . lH NMR -Amino-2-meti1-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- karbonitril hidroklorür Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-(4-Siyano-2- nitro-fenilamino)-5-metil-tiofen-3-karbonitril (0.52 g) bilesiginin etanol (5 mL) içindeki süspansiyonuna 6 N HCl içinde kalay klorür (1.36 g, 7.2 mmol) ilave edilmistir.

Karisim 85°C'lik yag banyosunda 3 saat isitilmistir ve akabinde buz banyosunda sogutulmustur. Kati ürünün filtrelenmesi, su ile yikanmasi ve rengi kahverengi olana kadar kurutulmasi sonucunda inorganik tuz içeren bir kahverengi kati olarak elde edilen baslik bilesigi bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z 11.18 2-Metil-10-(4-metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza- benzo[f]azu1en-7-karbonitril Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan lO-amino-Z-metil- 4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7-karbonitril hidroklorür ( içindeki solüsyonuna 1-metilpiperazin (4 mL) ilave edilmistir. Karisim l30°C'lik yag banyosunda 17 saat isitilmistir. Solüsyon konsantre edilmistir, etil asetat (50 mL) ile seyreltilmistir, su (20 mL) ve tuzlu su (20 mL) ile yikanmistir ve akabinde konsantre edilmistir. Kati ürün diklorometan (10 mL) içinde çözülmüstür ve doymus sodyum bikarbonat solüsyonu ile muamele edilmistir. Baslik bilesigi bir açik sari çökelti olarak toplanmistir, su ve diklorometan ile yikanmistir, kurutulmustur ve bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z : (2-Metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3- 2-Metil-10-(4-metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza- benzo[f]azu1en-7-karbonitril Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan lO-amino-Z-metil- 4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7-karbonitril hidroklorür ( içindeki solüsyonuna 1-metilpiperazin (4 mL) ilave edilmistir. Karisim l30°C'lik yag banyosunda 17 saat isitilmistir. Solüsyon konsantre edilmistir, etil asetat (50 mL) ile seyreltilmistir, su (20 mL) ve tuzlu su (20 mL) ile yikanmistir ve akabinde konsantre edilmistir. Kati ürün diklorometan (10 mL) içinde çözülmüstür ve doymus sodyum bikarbonat solüsyonu ile muamele edilmistir. Baslik bilesigi bir açik sari çökelti olarak toplanmistir, su ve diklorometan ile yikanmistir, kurutulmustur ve bir sonraki adimda tekrar saflastirilmadan kullanilmistir. LC-MS: m/z : (2-Metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3- Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-metil-lO-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- karbonitril (0.25 9) bilesiginin metanol (90 mL) içindeki solüsyonuna derisik HCl ( ilave edilmistir. 50 psi altinda 1 sa hidrojenleme yapilmistir.

Tekrar` Pd siyahi (147 mg) ilave edilmistir. Karisimi 50 psi altinda 22 sa çalkalanmistir. Katalizör filtrelenmistir ve metanol ile yikanmistir. Süzüntü konsantre edilmistir, doymus sodyum bikarbonat solüsyonu (5 mL) ile muamele edilmistir ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. Ürün silika kolonuyla saflastirilmistir. LC-MS: m/z . lH NMR (CD3OD, , 2-(2,5-Diokso-2,S-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-meti1-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- i1)meti1)asetamid Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-1OH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- pL tribütilamin içindeki solüsyonuna DMF içindeki N-(d- maleimidoasetoksi) süksinimid ester (AMAS, 10 mg/mL, 2.6 mg, .2 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon 20°C'de 90 dakika karismaya. birakilmistir, akabinde Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan 2-metil-lO-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- karbonitril (0.25 9) bilesiginin metanol (90 mL) içindeki solüsyonuna derisik HCl ( ilave edilmistir. 50 psi altinda 1 sa hidrojenleme yapilmistir.

Tekrar` Pd siyahi (147 mg) ilave edilmistir. Karisimi 50 psi altinda 22 sa çalkalanmistir. Katalizör filtrelenmistir ve metanol ile yikanmistir. Süzüntü konsantre edilmistir, doymus sodyum bikarbonat solüsyonu (5 mL) ile muamele edilmistir ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. Ürün silika kolonuyla saflastirilmistir. LC-MS: m/z . lH NMR (CD3OD, , 2-(2,5-Diokso-2,S-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-meti1-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- i1)meti1)asetamid Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-1OH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- pL tribütilamin içindeki solüsyonuna DMF içindeki N-(d- maleimidoasetoksi) süksinimid ester (AMAS, 10 mg/mL, 2.6 mg, .2 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon 20°C'de 90 dakika karismaya. birakilmistir, akabinde tiol ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)meti1)heksanamid /OfîLu/ÜN-/Iy Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][l,4]diazepin-7- il)metanamin (59 mg, 0.17 mmol) bilesiginin diklorometan (4 mL) içindeki solüsyonuna diklorometan (l mL) içinde 6- maleimidoheksanoik N-hidroksisüksinimid ester (53 mg, 0.17 mmol) ve trietilamin ( ilave edilmistir.

Solüsyon oda sicakliginda 40 dk karistirilmistir, akabinde bir silika kolonuna yüklenmistir ve trietilamin içeren %3-5 metanol/diklorometan ile ayristirilmistir. Baslik bilesigi bir sari kati olarak elde edilmistir. LC-MS: m/z . benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit tiol ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)meti1)heksanamid /OfîLu/ÜN-/Iy Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][l,4]diazepin-7- il)metanamin (59 mg, 0.17 mmol) bilesiginin diklorometan (4 mL) içindeki solüsyonuna diklorometan (l mL) içinde 6- maleimidoheksanoik N-hidroksisüksinimid ester (53 mg, 0.17 mmol) ve trietilamin ( ilave edilmistir.

Solüsyon oda sicakliginda 40 dk karistirilmistir, akabinde bir silika kolonuna yüklenmistir ve trietilamin içeren %3-5 metanol/diklorometan ile ayristirilmistir. Baslik bilesigi bir sari kati olarak elde edilmistir. LC-MS: m/z . benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit Howm/ÜH/h Süksinik asit 2,5-diokso-pirrolidin-1-il ester metil ester Etil asetat (50 mL) içindeki 1-hidroksi-pirrolidin-2,5-dion ( solüsyonuna 3-klorokarbonil-propionik asit metil ester (1.15 g, 10 mmol) ilave edilmistir. Karisim bir buz banyosunda sogutulmustur. Buraya damlalar halinde trietilamin ( ilave edilmistir. Meydana gelen süspansiyon bir buz banyosunda 10 dk ve buz banyosu olmadan 5 dk karistirilmistir. Beyaz kati filtreleme yoluyla toplanmistir ve etil asetat (3 x 3 mL) ile yikanmistir.

Süzüntü, bir beyaz kati (2.32 g) vermek üzere konsantre edilmistir. benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit metil ester Howm/ÜH/h Süksinik asit 2,5-diokso-pirrolidin-1-il ester metil ester Etil asetat (50 mL) içindeki 1-hidroksi-pirrolidin-2,5-dion ( solüsyonuna 3-klorokarbonil-propionik asit metil ester (1.15 g, 10 mmol) ilave edilmistir. Karisim bir buz banyosunda sogutulmustur. Buraya damlalar halinde trietilamin ( ilave edilmistir. Meydana gelen süspansiyon bir buz banyosunda 10 dk ve buz banyosu olmadan 5 dk karistirilmistir. Beyaz kati filtreleme yoluyla toplanmistir ve etil asetat (3 x 3 mL) ile yikanmistir.

Süzüntü, bir beyaz kati (2.32 g) vermek üzere konsantre edilmistir. benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit metil ester Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metanamin (40 mg, 0.12 mmol) bilesiginin diklorometan (2 mL) içindeki solüsyonuna trietilamin ( ve önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan süksinik asit 2,5-diokso-pirrolidin-1-il ester metil ester (31 mg, 0.13 mmol) ilave edilmistir. Solüsyon oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir ve konsantre edilmistir. Ham ürün bir silika kolonuna yüklenmistir ve baslik bilesigini bir sari kati olarak vermek üzere amonyum hidroksit içeren %3-5 metanol/diklorometan ile ayristirilmistir. LC-MS: m/z . benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan N-[2-metil-10-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- ilmetil]-süksinamik asit metil ester (80 mg, 0.18 mmol) in THF edilmistir. Solüsyon oda sicakliginda 3 sa karistirilmistir, seyreltik HCl ile asitlestirilmistir` ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. LC-MS: m/z . Örnek 3'te tarif edildigi gibi hazirlanan (2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metanamin (40 mg, 0.12 mmol) bilesiginin diklorometan (2 mL) içindeki solüsyonuna trietilamin ( ve önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan süksinik asit 2,5-diokso-pirrolidin-1-il ester metil ester (31 mg, 0.13 mmol) ilave edilmistir. Solüsyon oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir ve konsantre edilmistir. Ham ürün bir silika kolonuna yüklenmistir ve baslik bilesigini bir sari kati olarak vermek üzere amonyum hidroksit içeren %3-5 metanol/diklorometan ile ayristirilmistir. LC-MS: m/z . benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan N-[2-metil-10-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azulen-7- ilmetil]-süksinamik asit metil ester (80 mg, 0.18 mmol) in THF edilmistir. Solüsyon oda sicakliginda 3 sa karistirilmistir, seyreltik HCl ile asitlestirilmistir` ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. LC-MS: m/z . 2-(2,5-Diokso-2,S-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((1-metil-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-2- i1)metil)asetamid-keyhole limpet hemosiyanin konjügati içindeki keyhole limpet hemosiyanin (KLH, 15-2 mg, 0.152 umol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-S- asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 1.75 mg, 7.60 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 319 uL 2.5 M'lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir ve meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 25 dk inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan KLH-SH'ye bir örnegi ( ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde °C'de 2 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 20 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.46 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((1-meti1-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)meti1)asetamid-sigir tiroglobülini konjügati 2-(2,5-Diokso-2,S-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((1-metil-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-2- i1)metil)asetamid-keyhole limpet hemosiyanin konjügati içindeki keyhole limpet hemosiyanin (KLH, 15-2 mg, 0.152 umol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-S- asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 1.75 mg, 7.60 umol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 319 uL 2.5 M'lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir ve meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 25 dk inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan KLH-SH'ye bir örnegi ( ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde °C'de 2 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 20 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.46 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((1-meti1-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-Z- il)meti1)asetamid-sigir tiroglobülini konjügati içindeki sigir' tiroglobülini (BTG, 20.0 mg, 0.03 pmol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-S-asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 6.9 mg, 30.0 pmol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 230 pL 2.5 M`lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 15 dakika inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 5 mM EDTA (pH 6.0) ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan BTG-SH'ye bir örnegi ( ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde °C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 pm'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-2- il)meti1)asetamid-ovalbümin konjügati içindeki ovalbümin (12.0 mg, 0.27 pmol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-10 içindeki sigir' tiroglobülini (BTG, 20.0 mg, 0.03 pmol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-S-asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 6.9 mg, 30.0 pmol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 230 pL 2.5 M`lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 15 dakika inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 5 mM EDTA (pH 6.0) ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan BTG-SH'ye bir örnegi ( ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde °C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 pm'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. metil-lOH-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-4-i1)piperazin-2- il)meti1)asetamid-ovalbümin konjügati içindeki ovalbümin (12.0 mg, 0.27 pmol) solüsyonuna (, DMF içindeki N-süksinimidil-10 S-asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 1.25 mg, 5.42 pmol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 120 uL 2.5 M'lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 15 dakika inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 5 mM EDTA (pH 6.0) ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan ovalbümin-SH'ye (4.2mL, 8.0mg, 0.18 pmol), Örnek. 2'de hazirlanan solüsyonun bir örnegin ( ilave edilmistir. Meydana gelen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-meti1-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- i1)meti1)asetamid-keyhole limpet hemosiyanin konjügati Örnek 7, Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan KLH-SH'ye hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((2- metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-lOH-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-7-il)metil)asetamid solüsyonunun (6.9 pmol) 300 pL'lik bir örnegin ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 2.5 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.2 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 S-asetiltioasetat (SATA, 25 mg/mL, 1.25 mg, 5.42 pmol) solüsyonu ( ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyona 120 uL 2.5 M'lik hidroksilamin, 50 mM EDTA (pH 7.0) ilave edilmistir. Meydana gelen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 15 dakika inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 5 mM EDTA (pH 6.0) ile saflastirilmistir. Önceki adimda tarif edildigi gibi hazirlanan ovalbümin-SH'ye (4.2mL, 8.0mg, 0.18 pmol), Örnek. 2'de hazirlanan solüsyonun bir örnegin ( ilave edilmistir. Meydana gelen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-meti1-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- i1)meti1)asetamid-keyhole limpet hemosiyanin konjügati Örnek 7, Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan KLH-SH'ye hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((2- metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-lOH-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-7-il)metil)asetamid solüsyonunun (6.9 pmol) 300 pL'lik bir örnegin ilave edilmistir. Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 2.5 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.2 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)meti1)asetamid-ovalbümin konjügati Örnek 9, Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan ovalbümin- gibi hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-1-il)-N- ((2-meti1-4-(4-metilpiperazin-1-il)-1OH-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-7-il)metil)asetamid solüsyonunun (10.2 pmol) 200 pL'lik bir örnegin ilave edilmistir. Meydana gelen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 pm'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit-sigir tiroglobülini konjügati Örnek 6'da tarif edildigi gibi hazirlanan N-[2-Metil-10-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azu1en-7- ilmetil]-süksinamik asit (7.9 mg, 18.0 umol), N- hidroksisüksinimid (NHS, 8.3 mg, 72.0 pmol) ve N,N- disikloheksilkarbodiimid (14.9 mg, 72.0 umol) bilesiklerinin kolonunda ile saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)meti1)asetamid-ovalbümin konjügati Örnek 9, Adim A'da tarif edildigi gibi hazirlanan ovalbümin- gibi hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-1-il)-N- ((2-meti1-4-(4-metilpiperazin-1-il)-1OH-benzo[b]tieno[2,3- e][1,4]diazepin-7-il)metil)asetamid solüsyonunun (10.2 pmol) 200 pL'lik bir örnegin ilave edilmistir. Meydana gelen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 3 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 pm'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit-sigir tiroglobülini konjügati Örnek 6'da tarif edildigi gibi hazirlanan N-[2-Metil-10-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tia-4,9-diaza-benzo[f]azu1en-7- ilmetil]-süksinamik asit (7.9 mg, 18.0 umol), N- hidroksisüksinimid (NHS, 8.3 mg, 72.0 pmol) ve N,N- disikloheksilkarbodiimid (14.9 mg, 72.0 umol) bilesiklerinin saat karismaya birakilmistir, akabinde protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. içindeki sigir *tiroglobülini (BTG, 14.9 mg, 0.023 umol) solüsyonuna (, Adim A'da hazirlanan ilave edilmistir.

Meydana gelen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20°C'de 2.5 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 pm'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir.

Olanzapin için Rekabetçi immün Analizler ve Aripiprazol, Olanzapin, Ketiapin ve Risperidon/Paliperidon için Çoklu Rekabetçi immün Analiz Formüller* II ve IIl`e sahip Olanzapin immünojenleri ile bir dizi bagisiklamadan sonra, fare kuyrugundan alinan kan numuneleri reaktiVite için ELISA ile test edilmistir.

Hibridoma süpernatanlari da test edilmistir ve asagidaki Tablo 8'de (Formül Il'ye sahip bir Olanzapin immünojenine karsi üretilen hibridomalar) ve Tablo 9'da (Formül Ill'e sahip bir Olanzapin immünojenine karsi üretilen hibridomalar) gösterilen ELISA verileri birkaç hibridomanin reaktivitesini gösterir (füzyon partneri olarak NSO hücreleri kullanilmistir). saat karismaya birakilmistir, akabinde protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. içindeki sigir *tiroglobülini (BTG, 14.9 mg, 0.023 umol) solüsyonuna (, Adim A'da hazirlanan ilave edilmistir.

Hibridoma süpernatanlari da test edilmistir ve asagidaki Tablo 8'de (Formül Il'ye sahip bir Olanzapin immünojenine karsi üretilen hibridomalar) ve Tablo 9'da (Formül Ill'e sahip bir Olanzapin immünojenine karsi üretilen hibridomalar) gösterilen ELISA verileri birkaç hibridomanin reaktivitesini gösterir (füzyon partneri olarak NSO hücreleri kullanilmistir).

Seyrelt 1/400 1/1200 .îî 1/3600 3 1/10300 'En' H 1/400 5 o' 1/10800 i i i i i i i i i i I Seyrelt 1/400 1/1200 .îî 1/3600 3 1/10300 'En' H 1/400 5 o' 1/10800 i i i i i i i i i i I .0527 .0527 Süpernatanlar, sinyallerin olanzapine spesifik olup olmadigini belirlemek için rekabetçi ELISA ile test edilmistir. Sekiller 1-3, fare füzyonu 11.1 (Formül II'ye sahip olanzapin immünojeni) ile saglanan üç örnek hibridomadan elde edilen sonuçlari gösterir. Veriler, klozapine yönelik degisken reaktivite ile birlikte olanzapine yönelik spesifik reaktiviteyi gösterir.

Sekil 4, bir yanal akis analiz cihazinda kullanilan rekabetçi immün analiz formatini gösterir, burada yakalama antikoru, yani bir olanzapin klonu, bir florofor ile konjüge olanzapinden olusan bir tayin konjügati ile birlikte bir çipin üzerine uygulanmistir. Sekil 4'te gösterilen bu rekabet formatinda, düsük bir analit (olanzapin) düzeyi yüksek sinyal ile sonuçlanir, yüksek bir analit (olanzapin) düzeyi ise düsük sinyal ile sonuçlanir. Numunedeki olanzapin miktari, herhangi bir ilaç içermeyen bir kontrol numunesine kiyasla floresans kaybindan hesaplanabilir. Olanzapin klonu 35 ile elde edilen tipik bir doz yanit egrisi Sekil 5'te gösterilir, olanzapin klonu 61 ile elde edilen tipik bir doz yanit egrisi Sekil 6'da gösterilir ve olanzapin klonu 3F11 ile elde edilen tipik bir doz yanit egrisi Sekil 7'de gösterilir.

Sekil 8, bir yanal akis analiz cihazinin çip tasarimini gösterir. Cihaz, numunenin uygulandigi bir bölgeye veya alana, bir konjügat bölgesine (arzu edilen isaretli rekabetçi baglanma partnerini (partnerlerini) içerir) ve bir reaksiyon bölgesine (reaksiyon bölgesinde sekiz alan gösterilir; her bir alan, arzu edilen ayri bir antikoru içerebilir). Numune, numune bölgesinden akmaya baslar, konjügat bölgesinden geçer Sekiller 9-12, reaksiyon bölgesi Z'ye uygulanmis antikor 5C7 ve konjügat bölgesinde aripiprazola yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir aripiprazol Süpernatanlar, sinyallerin olanzapine spesifik olup olmadigini belirlemek için rekabetçi ELISA ile test edilmistir. Sekiller 1-3, fare füzyonu 11.1 (Formül II'ye sahip olanzapin immünojeni) ile saglanan üç örnek hibridomadan elde edilen sonuçlari gösterir. Veriler, klozapine yönelik degisken reaktivite ile birlikte olanzapine yönelik spesifik reaktiviteyi gösterir.

Sekil 8, bir yanal akis analiz cihazinin çip tasarimini gösterir. Cihaz, numunenin uygulandigi bir bölgeye veya alana, bir konjügat bölgesine (arzu edilen isaretli rekabetçi baglanma partnerini (partnerlerini) içerir) ve bir reaksiyon bölgesine (reaksiyon bölgesinde sekiz alan gösterilir; her bir alan, arzu edilen ayri bir antikoru içerebilir). Numune, numune bölgesinden akmaya baslar, konjügat bölgesinden geçer Sekiller 9-12, reaksiyon bölgesi Z'ye uygulanmis antikor 5C7 ve konjügat bölgesinde aripiprazola yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir aripiprazol pozitif kontrol (aripiprazol içeren numune) (Sekil 9), reaksiyon bölgesi 4'e uygulanmis antikor 4G9-1 ve konjügat bölgesinde olanzapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir olanzapin pozitif kontrol (olanzapin içeren numune) (Sekil 10), reaksiyon bölgesi 6'ya uygulanmis antikor ll ve konjügat bölgesinde ketiapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir ketiapin pozitif kontrol (ketiapin içeren numune) (Sekil 11) ve reaksiyon bölgesi 8'e uygulanmis antikor 5-9 ve konjügat bölgesinde risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir risperidon pozitif kontrol (risperidon içeren numune) (Sekil 12) için tipik doz yanit egrilerini gösterir. Konjügat bölgesindeki isaretli rekabetçi baglanma partnerleri, antikorlara baglanma için numunelerde bulunan ilaçlar ile rekabet eder. Isaret miktari saptanir ve numunede bulunan ilaç miktarinin bir göstergesidir (sinyal miktari, numunedeki ilaç miktari ile ters orantilidir - bkz.

Isaretli rekabetçi baglanma partnerlerinin konjügatlarinin, reaksiyon bölgelerine uygulanan antikorlara baglanmadigini dogrulamak amaciyla, herhangi bir ilaç içermeyen numuneler kullanilarak negatif kontroller saglanmistir. Tablo 10 itibariyla, numune bölgesine aripiprazol içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir, ancak isaretli aripiprazol içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) içerir. Asagidaki Tablo lO'da gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen olanzapin, ketiapin ve risperidon konjügatlarinin aripiprazol antikoruna baglanmadigini dogrular.

Aripiprazol Klonu 5C7-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) pozitif kontrol (aripiprazol içeren numune) (Sekil 9), reaksiyon bölgesi 4'e uygulanmis antikor 4G9-1 ve konjügat bölgesinde olanzapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir olanzapin pozitif kontrol (olanzapin içeren numune) (Sekil 10), reaksiyon bölgesi 6'ya uygulanmis antikor ll ve konjügat bölgesinde ketiapine yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir ketiapin pozitif kontrol (ketiapin içeren numune) (Sekil 11) ve reaksiyon bölgesi 8'e uygulanmis antikor 5-9 ve konjügat bölgesinde risperidona yönelik bir isaretli rekabetçi baglanma partneri ile üretilen bir risperidon pozitif kontrol (risperidon içeren numune) (Sekil 12) için tipik doz yanit egrilerini gösterir. Konjügat bölgesindeki isaretli rekabetçi baglanma partnerleri, antikorlara baglanma için numunelerde bulunan ilaçlar ile rekabet eder. Isaret miktari saptanir ve numunede bulunan ilaç miktarinin bir göstergesidir (sinyal miktari, numunedeki ilaç miktari ile ters orantilidir - bkz.

Aripiprazol Klonu 5C7-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan ARIP-MMl OLAN, QUET, ARIP 2 0.77 1.56 ARIP-MMI OLAN, QUET, -0.02 0.06 ARIP-MMl OLAN, QUET, 6 0.09 0.10 Tablo 11 itibariyla, numune bölgesine olanzapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir, ancak isaretli olanzapin içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l) içerir. Asagidaki Tablo ll'de gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen aripiprazol, ketiapin ve risperidon konjügatlarinin olanzapin antikoruna baglanmadigini dogrular.

OLAN Klonu 4G9-1-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan OLAN-mi ARIP, QU'ET, RISP 0.74 1.10 4.56 OLAN-MMI ARIP, QUET, RISP 0.11 0.13 5.17 Tablo 12 itibariyla, numune bölgesine ketiapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin ve isaretli risperidon içerir, ancak isaretli ketiapin içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (ll) içerir. Asagidaki Tablo lZ'de gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen aripiprazol, olanzapin ve risperidon konjügatlarinin ketiapin antikoruna baglanmadigini dogrular.

Ketiapin Klonu ll-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: O ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan ARIP-MMl OLAN, QUET, ARIP 2 0.77 1.56 ARIP-MMI OLAN, QUET, -0.02 0.06 ARIP-MMl OLAN, QUET, 6 0.09 0.10 Tablo 11 itibariyla, numune bölgesine olanzapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir, ancak isaretli olanzapin içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l) içerir. Asagidaki Tablo ll'de gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen aripiprazol, ketiapin ve risperidon konjügatlarinin olanzapin antikoruna baglanmadigini dogrular.

Ketiapin Klonu ll-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: O ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan QUET-MMI QUET-MMI QUET-MMI QUET-MMI Tablo 13 itibariyla, numune bölgesine risperidon içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin ve isaretli ketiapin içerir, ancak isaretli risperidon içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 13'te gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen aripiprazol, olanzapin ve ketiapin konjügatlarinin risperidon antikoruna baglanmadigini dogrular.

Risperidon Klonu 5-9-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan RISP-MMl ARIP, OLAN, QUET 0.05 0.14 7.73 RISP-MMl ARIP, OLAN, QUET 1.97 3.23 8.85 Isaretli rekabetçi baglanma partnerlerinin konjügatlarinin, sadece reaksiyon bölgelerine uygulanan ilgili antikorlarina baglandigini dogrulamak amaciyla, yine herhangi bir ilaç içermeyen numuneler kullanilarak ilave negatif kontroller saglanmistir. Tablo 14 itibariyla, numune bölgesine aripiprazol içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-1), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 14'de gösterilen sonuçlar, aripiprazol antikoru 5C7'ye QUET-MMI QUET-MMI QUET-MMI QUET-MMI Tablo 13 itibariyla, numune bölgesine risperidon içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin ve isaretli ketiapin içerir, ancak isaretli risperidon içermez) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 13'te gösterilen sonuçlar, herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini ve kilcal etki altinda reaksiyon bölgesinden geçen aripiprazol, olanzapin ve ketiapin konjügatlarinin risperidon antikoruna baglanmadigini dogrular.

Risperidon Klonu 5-9-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan RISP-MMl ARIP, OLAN, QUET 0.05 0.14 7.73 RISP-MMl ARIP, OLAN, QUET 1.97 3.23 8.85 Isaretli rekabetçi baglanma partnerlerinin konjügatlarinin, sadece reaksiyon bölgelerine uygulanan ilgili antikorlarina baglandigini dogrulamak amaciyla, yine herhangi bir ilaç içermeyen numuneler kullanilarak ilave negatif kontroller saglanmistir. Tablo 14 itibariyla, numune bölgesine aripiprazol içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-1), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 14'de gösterilen sonuçlar, aripiprazol antikoru 5C7'ye (reaksiyon bölgesi 2) yönelik doz yaniti disinda herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini dogrular.

Aripiprazol Klonu 5C7-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan ARIP-MMI ARI?, OLAN, Tablo 15 itibariyla, numune bölgesine olanzapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli olanzapin içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 15'te gösterilen sonuçlar, olanzapin antikoru 4G9-l'e (reaksiyon bölgesi 4) yönelik doz yaniti disinda herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini dogrular.

OLAN Klonu 4G9-1-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan Tablo 16 itibariyla, numune bölgesine ketiapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli ketiapin içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo l6'da gösterilen (reaksiyon bölgesi 2) yönelik doz yaniti disinda herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini dogrular.

OLAN Klonu 4G9-1-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan Tablo 16 itibariyla, numune bölgesine ketiapin içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli ketiapin içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo l6'da gösterilen sonuçlar, ketiapin antikoru 11'e (reaksiyon bölgesi 6) yönelik doz yaniti disinda. herhangi bir doz yanitinin. mevcut olmadigini dogrular.

Ketiapin Klonu ll-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan QUET-MMI OLAN, QUET, Tablo 17 itibariyla, numune bölgesine risperidon içermeyen bir numune uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-1), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru UJJ ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Asagidaki Tablo 17'de gösterilen sonuçlar, risperidon antikoru 5-9'a (reaksiyon bölgesi 8) yönelik doz yaniti disinda herhangi bir doz yanitinin mevcut olmadigini dogrular.

Risperidon Klonu 5-9-Matematik Modeli 1 (Konsantrasyon: 0 ng/mL) Reaksiyon Okuma Pik Ortalama Pik Ortalama Ortalama Analiz-MM Konjügat Bölgesi Pozisyonu Alan Yükseklik Arkaplan Yukarida gösterilen sonuçlar, isaretli rekabetçi baglanma partnerlerinin konjügatlarinin reaksiyon bölgesinde sadece ilgili antikorlarina baglandigini dogrular.

Sekiller 13-16, spesifik antikor reaksiyon bölgelerinde tipik doz yanit egrilerini ve diger konjügatlarin varliginda her spesifik analiz için doz yanit düsük/yüksek konsantrasyon sonuçlar, ketiapin antikoru 11'e (reaksiyon bölgesi 6) yönelik doz yaniti disinda. herhangi bir doz yanitinin. mevcut olmadigini dogrular.

Sekiller 13-16, spesifik antikor reaksiyon bölgelerinde tipik doz yanit egrilerini ve diger konjügatlarin varliginda her spesifik analiz için doz yanit düsük/yüksek konsantrasyon kanitini gösterir. Sekil l3'te, aripiprazol içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjugat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) içerir.

Sekil l3'te gösterildigi üzere sadece aripiprazol için tipik bir` doz yanit egrisi elde edilmistir` ve olanzapin, ketiapin veya risperidon için elde edilmemistir.

Sekil l4'te, olanzapin içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 4'te olanzapin antikoru (4G9-l) içerir. Sekil l4'te gösterildigi üzere sadece olanzapin için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir ve aripiprazol, ketiapin veya risperidon için elde edilmemistir.

Sekil 15'te, ketiapin içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) içerir. Sekil 15'te gösterildigi üzere sadece ketiapin için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir ve aripiprazol, olanzapin veya risperidon için elde edilmemistir.

Sekil l6'da, risperidon içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 8'de kanitini gösterir. Sekil l3'te, aripiprazol içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjugat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) içerir.

Sekil l6'da, risperidon içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (bu sefer isaretli aripiprazol, isaretli olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi, reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Sekil l6'da gösterildigi üzere sadece risperidon için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir ve aripiprazol, Olanzapin veya ketiapin için elde edilmemistir.

Sekiller 17-20, diger konjügatlarin ve antikorlarin varliginda her analiz için tipik doz yanit egrilerini gösterir. Sekil 17'de, aripiprazol içeren bir numune, numune bölgesine uygulanir* ve kilcal etki altinda konjügat bölgesinden (yine isaretli aripiprazol, isaretli Olanzapin, isaretli ketiapin ve isaretli risperidon içerir) geçerek reaksiyon bölgesine ulasir. Reaksiyon bölgesi yine reaksiyon bölgesi 2'de aripiprazol antikoru (5C7) ve ayrica reaksiyon. bölgesi 4'te Olanzapin. antikoru (4G9-1), reaksiyon bölgesi 6'da ketiapin antikoru (11) ve reaksiyon bölgesi 8'de risperidon antikoru (5-9) içerir. Sekil 17'de gösterildigi üzere aripiprazol için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir. Olanzapin içeren bir numune bu çipin numune bölgesine uygulandiginda, Sekil 18'de gösterildigi üzere Olanzapin için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir. Ketiapin içeren bir numune bu çipin numune bölgesine uygulandiginda, Sekil 19'da gösterildigi üzere ketiapin için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir. Risperidon içeren bir numune bu çipin numune bölgesine uygulandiginda, Sekil 20'de gösterildigi üzere risperidon için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir.

Sekiller 21-24, pozitif kontrol olarak üretilen doz yanit egrileri (Sekiller 9-12) ile çoklu formatta üretilen doz yanit egrileri (Sekiller 17-20) arasindaki karsilastirmayi gösterir.

Aripiprazol için karsilastirma Sekil 21'de gösterilir; Olanzapin için karsilastirma Sekil 22'de gösterilir; ketiapin için karsilastirma Sekil 23'te gösterilir ve risperidon için karsilastirma Sekil 24'te gösterilir. Bu sekiller, pozitif kontrol egrilerinin çoklu format egrileriyle benzer oldugunu gösterir. risperidon antikoru (5-9) içerir. Sekil l6'da gösterildigi üzere sadece risperidon için tipik bir doz yanit egrisi elde edilmistir ve aripiprazol, Olanzapin veya ketiapin için elde edilmemistir.

Aripiprazol için karsilastirma Sekil 21'de gösterilir; Olanzapin için karsilastirma Sekil 22'de gösterilir; ketiapin için karsilastirma Sekil 23'te gösterilir ve risperidon için karsilastirma Sekil 24'te gösterilir. Bu sekiller, pozitif kontrol egrilerinin çoklu format egrileriyle benzer oldugunu gösterir.

Bu veriler, bir yanal akis analiz cihazinin, bir tasinabilir hasta basi cihazinda bir hastadan alinan tek bir numune ile çok sayida antipsikotik ilaci tayin etmek için kullanilabilecegini gösterir.

Claims

ISTEMLER Olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik› bir yöntem olup, Özelligi; sunlari içermesidir: (i) antikor* üretimi için bir insan harici konakçinin seçilmesi ve (ii) konakçinin, bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi, burada konakçinin olanzapine baglanan bir antikor üretmesi, Formül II R1 degiskeni H, î^NîivîQm W:) CHüHb veya CH2NHC(O) (CHnnC02H' dir; R2 degiskeni H, CHZNHZ veya CHgNHC (O) (CH2)mC02H dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak R1 ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica R1 ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni 1, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir. ISTEMLER Olanzapine baglanan bir antikorun üretimine yönelik› bir yöntem olup, Özelligi; sunlari içermesidir: (i) antikor* üretimi için bir insan harici konakçinin seçilmesi ve (ii) konakçinin, bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi, burada konakçinin olanzapine baglanan bir antikor üretmesi, Formül II R1 degiskeni H, î^NîivîQm W:) CHüHb veya CH2NHC(O) (CHnnC02H' dir; R2 degiskeni H, CHZNHZ veya CHgNHC (O) (CH2)mC02H dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak R1 ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica R1 ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni 1, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir. Olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik bir yöntem olup, Özelligi; sunlari içermesidir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi; (ii) konakçinin, bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi; (iii) bahsedilen asilanmis konakçidan elde edilen bir lenfositin, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir kaynasik hücre olusturmak üzere bir ölümsüzlestirilmis hücre dizisi ile kaynastirilmasi ve (iv) kaynasik hücrenin, bir hibridoma hücre dizisi elde etmek için klonlanmasi, Fonnülk R1 degiskeni H, 0 O \ Â“uwû o CH2NH2 veya CH2NHC(O) (CH2)mCO2H'dir; R2 degiskeni H, CH2NH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mCOzH'dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak R1 ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica R1 ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir. Olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir hibridoma hücre dizisinin üretimine yönelik bir yöntem olup, Özelligi; sunlari içermesidir: (i) antikor üretimi için bir konakçinin seçilmesi; (ii) konakçinin, bir Formül I bilesigi ve bir immünojenik tasiyicinin bir konjügati ile asilanmasi; (iii) bahsedilen asilanmis konakçidan elde edilen bir lenfositin, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretme kapasitesine sahip bir kaynasik hücre olusturmak üzere bir ölümsüzlestirilmis hücre dizisi ile kaynastirilmasi ve (iv) kaynasik hücrenin, bir hibridoma hücre dizisi elde etmek için klonlanmasi, Fonnülk R1 degiskeni H, 0 O \ Â“uwû o CH2NH2 veya CH2NHC(O) (CH2)mCO2H'dir; R2 degiskeni H, CH2NH2 veya CH2NHC(O)(CH2)mCOzH'dir; R3 degiskeni H'dir; burada kosul olarak R1 ve R2 degiskenlerinden birinin H olmasi ve ayrica R1 ve R2 degiskenlerinin ikisinin birden H olmamasi m degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir ve n degiskeni l, 2, 3, 4 veya 5 degerini alir. 3. Istem 2'de tanimlanan yöntem olup, özelligi; hibridoma hücre dizisinin, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretmesidir. 3. Istem 2'de tanimlanan yöntem olup, özelligi; hibridoma hücre dizisinin, olanzapine baglanan bir monoklonal antikor üretmesidir.