JP2010540920A - 薬物モニタリングアッセイ - Google Patents

Abstract

化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を該親化合物の特別な誘導体の使用により得るための方法が記載される。本発明はまた各々創成された結合剤および誘導体に関係する。さらに該親化合物の医薬的に活性な形態をモニタリングするために該結合剤を使用する薬物モニタリングアッセイが提供される。

Description

ライフサイエンスの様々な分野において定性的および定量的アッセイは非常に重要である。本発明は一般的に生物学的液体中の薬物化合物の決定のための試薬および方法に関する。とりわけ、例えば試料中に存在する医薬用化合物のような活性成分の量または濃度を決定するための生物学的アッセイが提供される。さらに化合物の医薬的に活性な代謝体を認識する結合剤を得るための方法が提供される。各々の結合剤は薬物モニタリングアッセイにおいて貴重な手段である。

薬理学では、その投薬量は一般的に、患者が得るその物質に対する臨床応答に従って異なり得るので、血液レベルまたはその他の体液のモニタリングを伴わないで多くの薬物療法が用いられる。しかしながら薬物の不十分なレベルが処置不十分または抵抗性に至り、そして過剰なレベルが毒性および／または組織損傷性になり得るので、この研究法が不可能または少なくとも困難である薬物もある。治療用薬物モニタリングは、血液またはその他の生物学的試料中の薬物療法レベルの測定を専門とする化学物質化学(chemical chemistry)のうちの１つである。それは主に狭い治療指数を有する薬物、すなわち容易に過少または過剰投与され得る薬物に重点が置かれる。それ故に治療的処置の最適化を提供するために各々の薬物をモニタリングすることが有利である。通常薬物モニタリングを必要とする各薬物の例は、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンのような抗感染薬；アミノグリコシド抗生物質；シクロスポリン、エベロリムスのような免疫抑制剤；抗てんかん薬；クロザピンおよびリチウムのような抗精神病薬、抗癌薬、ジゴキシン等である。

治療効果を達成するために、酵素阻害剤として作用する特定の薬物を関与する酵素の十分な阻止を提供する投薬量で投与すべきである。しかしながら患者の代謝が異なるので、投薬量の要件もまた患者間で大きく異なり得る。ＡＥＢ０７１はｎＭ範囲のｋ_ｉ値を有する、古典的および新規タンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)アイソフォームの選択的な、および強力な阻害剤である。

プロドラッグは医薬的活性が少ないかまたは全く有さない形態で投与される医薬用化合物である。投与されると、プロドラッグはインビボで活性化合物に代謝される。プロドラッグの使用の背後にある理論的根拠は一般的には吸収、分配、代謝および排出(ＡＤＭＥ)最適化である。プロドラッグに関しては、治療効果を得るためにプロドラッグの十分な量が医薬的に活性な代謝体に変換されることをモニタリングすることがしばしば必要である。

薬物モニタリングの局面で「親薬物」なる用語は通常それが患者に投与される時点での薬物の分子構造を表す。一度吸収されると、親薬物は生体内変化(代謝)と称される化学変化に供され得て、それは代謝体と称される改変された分子をもたらす。腸壁および肝臓は最高濃度の代謝酵素を宿し、それは細胞の小胞体内の小胞で濃縮されるので、しばしばミクロソーム酵素として記載される。しかしながら酵素は遍在性であり、そして無数のさらなる部位で生体内変化を触媒する。

親薬物およびその代謝体の双方は活性または不活性と指定される種々の程度の薬理学的活性を有し得て、そして毒性に関するその潜在性においても異なり得る。例えば親薬物として活性である鎮静剤は３つの不活性な代謝体に、しかしまた活性でそして鎮静性である１つ、しかし活性でそして心毒性である別のものに変換され得る。さらにこれらの分子の形態は分布および排出の様々なパターンを呈し得る。不活性代謝体はモニタリングアッセイにおいて認識される場合、誤った結果に至り得るので、これらの代謝変化により薬物化合物の医薬的に活性な濃度の検出が困難になる。

とりわけ小型分子の検出のためのモニタリング／イムノアッセイを設計することは挑戦であり得る。かかる小型分子はしばしば抗原性を欠如し、そのために例えば小型分子に結合する抗体を作成することが困難になる。小型分子の免疫原性を増大させるために、タンパク質またはポリペプチドのようなより大きな抗原性化合物を薬物に抱合させることができる。

医薬用化合物をモニタリングするために、患者において特定の濃度での薬物の治療効果をモニタリングするための診断手段が開発されている。たいていの公知の薬物モニタリング方法が、患者試料中で検出／モニタリングすることになっている医薬用化合物に結合する抗体を利用する。しかしながら化合物の治療的に活性な濃度を決定するために薬物の活性形態と例えば不活性代謝体との間の適切な差別化が重要であるので、有効なモニタリングは非常に困難である。不活性代謝体に対する各々の交差反応性に関連する問題は先行技術において周知である(例えばRentsch et al, 2006：Therapeutic drug monitoring der Immunsuppressiva参照)。

薬物化合物の不活性代謝体を検出する確率が低い薬物モニタリングアッセイを提供することが本発明の目的である。各々の具体的な薬物モニタリングアッセイを開発するための、とりわけモニタリングされるべき化合物の活性形態を特異的に認識する抗体のような適切な結合剤を生成するための方法を提供することも本発明の目的である。化合物ＡＥＢ０７１の医薬的に活性な形態に特異的に結合する確率がより高い適切な結合剤を同定し、そして提供することが本発明のさらなる目的である。各々の結合剤をＡＥＢ０７１に関する薬物モニタリングアッセイにおいて使用できる。

本発明の第１の具体的態様によれば、親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性を有する、該親薬物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を得るための方法が提供され、方法は：
(ａ) 該親化合物の該医薬的に活性な形態の一部を遮蔽することにより該親化合物の該医薬的に活性な形態の少なくとも１つの誘導体を調製すること；
(ｂ) 該誘導体に結合する結合剤の群を得るために該誘導体を使用すること；
(ｃ) 該親化合物の誘導体および少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する結合剤の該群から少なくとも１つの結合剤を選択すること；
を含む。

本発明の１つの態様は医薬用化合物の医薬的に活性な形態に特異的に結合し、そして不活性な代謝体に結合する確率がより低い少なくとも１つの結合剤を提供することに関係する。
各々の特異的結合剤を得るために、本発明は各結合剤を得る／上昇させるための定義された方法を使用する。１つの重要な態様によれば、該結合剤を得るために親化合物ではなく、特異的に設計されたその誘導体を使用する。

親化合物の構造に基づいて、親化合物の医薬的に活性な形態を認識する可能性が最も高い結合動因を作製する確率が最も高いが、親化合物の医薬的に不活性な代謝体を認識する確率が最も低いように誘導体を設計する。その結果を達成するために、化合物の特定の部分を結合剤の結合から遮蔽する。各々の遮蔽構造を使用することにより、結合剤は分子の遮蔽された領域に接近できない。これは、分子の遮蔽されていない、そして故に接近可能な部分に指向する結合剤を得ることができるという効果を有する。本発明の１つの具体的態様では、分子の遮蔽されていない(複数の)部分は分子のこれらの部位に相当し、ここで代謝作用は化合物を不活化することができる。それにより、分子の活性な化学構造に相当する化学構造を認識する結合剤を得ることができる。よって代謝変化が結合剤により認識される分子の部分を改変／変化させる場合、結合剤の結合は少なくとも低下するか、または完全に防御される。この測定により、結合剤により認識される部位の活性な化学構造に対して結合剤がさらに特異的であることが確実になる。

分子の意図された部位が結合剤により少なくとも部分的に認識されることを確認するために、目的の代謝部位を遮蔽する遮蔽構造を含む誘導体を設計できる。本発明の方法により得られた特異的結合剤は、該代謝部位が遮蔽されている該誘導体と結合しないはずであるか、または結合しても特異性は低いであろうから、各誘導体を使用して、結合剤が意図される部位に関して高い特異性を有するかどうかを分析できる。かかる誘導体は非常に特異的な結合剤を選択するための貴重な手段の構成要素であり得る。

以後これらの結合剤は得られた結合剤の群から選択され、それは親化合物の誘導体および医薬的に活性な形態に結合する。例えば遮蔽された構造を認識し、そして故に分子に特異的でない結合剤を排除するために、この選択は重要である。各選択を例えば以下にさらに詳記されるような競合アッセイにより実施することができる。この方法により、標準的な手順を使用することにより、特定の化合物、とりわけ小型化合物に対して特異的である結合剤の作成を最適化することが可能になる。

親化合物の定義された活性代謝体に関して特異的である結合剤が生成されることが過程される場合(恐らくプロドラッグの場合のような)、検出されるべき活性代謝体の化学構造に極めて類似するように誘導体を設計する場合、親化合物の化学構造を改変できる。これにより、結合剤が意図される標的である活性代謝体の正確な化学構造を認識することが確実になる。体内で親化合物が活性代謝体に変換される場合、化学的に改変された分子のこの部を特異的に認識する／結合する結合剤が創成されることを確実にするために、活性代謝体の化学構造に類似するこの修飾された構造は各誘導体では遮蔽されないが暴露され、そして故に接近可能である。各誘導体で得られた結合剤の群を、活性代謝体の化学構造を特異的に認識するが、(不活性な)親化合物のものを認識しない結合剤に関して選択することができる。

一般的な序論で概要が示されたように、親化合物のいくつかは活性でよく、いくつかは不活性でよい、数個の異なる代謝体を有し得る。１つの態様によれば、選択された結合剤は親化合物の１を超える医薬的に活性な形態、例えば親化合物および少なくとも１つのさらなるその活性代謝体を認識する。しかしながら特定の薬物または使用に関して、親化合物の様々な医薬的に活性な形態の間で、そして故に例えば活性な親化合物と少なくとも１つのさらなる医薬的に活性なその代謝体との間で区別することが重要であり得る。この場合、結合剤はより高い特異性で望ましい標的(親化合物または活性代謝体のいずれか)に結合するように選択される。例えば親化合物および競合標的として活性代謝体を使用する競合結合アッセイを介してこれを達成することができる。それにより、意図される標的に関して望ましい選択性を表すこれらの結合剤を選択できる。

代謝作用を通して化合物を不活化できる１個所以上の部位を有する親化合物に関して、少なくとも２つの誘導体を創成でき、ここで各誘導体は分子の異なる部位で結合から遮蔽される。親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態に、該親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で結合する結合剤を得るために、可能性のある代謝部位の数に依存して、誘導体の数を分子の不活化に至り得る代謝部位の数に応じて調整できる。

「誘導体」とは、１つの原子を別の原子または原子の群と置き換えることにより親化合物から生じると想像され得る化学的化合物または分子を指す。誘導体を例えば親化合物の構造に基づいて１つまたはそれより多い化学反応(例えばリンカーの付着)により作成することができる。しかしながら修飾の型に依存して(例えば医薬的に活性な代謝体に類似するために親化合物の基本的な化学構造が修飾される場合)、異なる合成経路が必要とされ得る。本発明による誘導体は、親化合物の特定の部位が遮蔽された修飾を含み、それにより通常各々の結合を防御し、分子の遮蔽部を認識する結合剤を得る。

「親化合物の医薬的に活性な形態」なる用語は親化合物および医薬的に活性な代謝体を指す。これらのうちの少なくとも１つ、例えば親化合物またはその活性代謝体は結合剤により認識される必要がある。プロドラッグの活性がモニタリングされることになっている場合、プロドラッグは通常不活性(または有意に活性が低い)形態で投与され、次いでそれは治療的に活性な代謝体に代謝されるので、特異的に認識する結合剤を開発するために、活性代謝体はとりわけ有用であり得る。親化合物はまた分子のいくつかの異なる部位で不活化され得る。よって親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態が結合剤により認識される。結合剤は分子の一部のみを認識できるので(抗体の場合のエピトープ)、これは部位特異的であり得る。親分子が異なる代謝部位で不活化される(結合剤により認識／結合されない)場合、この不活化は各結合剤により認識され得ない。この場合、不活化が生じ得る分子の異なる部分を認識するいくつか結合剤を組み合わせて使用できる。しかしながらこれは親化合物およびそれがどのように代謝されるかに依存し、そしてそれ故に個々の症例に基づいて評価される必要がある。

「医薬的に活性な」とはとりわけ化合物の意図される治療効果を指す。しかしながらこの用語はまた例えば毒性効果のようなその他の重要な薬理学的活性をも含む。これは、例えば患者における毒性代謝体のモニタリングが意図され、それ故に、毒性代謝体を特異的に認識するこの特異的結合剤が有用であり得る場合である。

分子に連結された化学的遮蔽構造を使用することにより、誘導体を得るための親化合物の遮蔽を達成することができる。この遮蔽構造は遮蔽されるとことになっている分子のこれらの部分を遮断するのに適当な化学基でよい。かかる遮断基は、親化合物(アミノラクタム類、アミノラクトン類等のようなその中間物質を含む)の医薬的に活性な形態の１つまたはそれより多いヒドロキシル、アミノまたはカルボキシル基に結合する場合、これらの基で生じる反応を防御する任意の基でよい。結合剤を得るために該誘導体が使用される場合、とりわけ結合剤の結合はこれらの遮蔽された部位で防御されることになる。通常、各々の遮蔽構造が存在する場合、結合剤は基盤の化学構造ではなく、遮蔽構造を攻撃／認識するであろう。適当な遮蔽構造は遮蔽されるべき分子の部位に付着されたキャリアを含み得る。

リンカー構造を使用することにより該連結を実施できる。適当なリンカーを該キャリアのアミノ基と反応するアシル化基、該キャリア上のスルフヒドリル(メルカプト)、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、最も好ましくはマレイミド基、例えばタンパク質のカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基、該ペプチド単位上のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、例えば５,５'−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)基、オルトピリジルジスルフィド類およびアルキルメルカプタン基、ジカルボニル基例えばシクロヘキサンジオン基、並びにその他の１,２−ジケトン基；フェノール基と反応するジアゾ基からなる群から選択できる。例えば２から２０個のＣ原子、好ましくは２−１０個のＣ原子を有する適切なアルキル基によりリンカーを延長することができる。誘導体ＡおよびＢ(以下を参照)においてとりわけ適当なリンカーを使用し、それを異なる親化合物の誘導体を得るためにも使用できる。

親化合物は小型分子でよい。序論で概要が示されたように、小型分子の検出のための結合剤を得ることは、小型分子に対する結合剤を得ることが困難であるので、とりわけ挑戦的である。この理由のために、抗体を上昇される場合、キャリアを使用することが有利である。

親化合物を免疫抑制剤、抗感染薬、抗てんかん薬、抗精神病薬および抗癌薬からなる群から選択できる。これらの薬物はとりわけ投薬するのが困難であり、そして誤った投薬量からもたらされる影響は深刻であり得る。これはとりわけ移植において使用される免疫抑制剤に適用される。それ故に各化合物をモニタリングすることはとりわけ有利である。しかしながら一般的に本発明の方法による特異的な結合剤を得るために、任意の医薬用化合物をモニタリング／使用することができる。

１つの具体的態様によれば、親化合物は小型分子である。序論で概要が示されたように、小型分子はモニタリングするのが困難である。しかしながら本発明により、小型分子に関する特異的結合剤を得ることが可能になる。１つの具体的態様によれば、小型分子はタンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)阻害剤である。１つの具体的態様によれば、記載された実施例においても使用された親化合物ＡＥＢ０７１を、モニタリングされるとことになっている親化合物として使用する。この化合物は以下の化学構造を有する：

この化合物(ＰＫＣ阻害剤)は治療ウィンドウ／プロフィールが改善された免疫抑制剤である。

試料中のＡＥＢ０７１をモニタリングすることを可能にする適当な結合剤を得るために、以下の化学構造を有する少なくとも１つの誘導体を使用できる：

キャリアのような遮蔽構造を、例えばＸ_１および／またはＸ_２の位置に結合させることができる。遮蔽構造が結合していない場合、Ｘ_１および／またはＸ_２は水素でよい。Ｘ_１およびＸ_２のうちの少なくとも１つは各々の遮蔽構造を含む。上記の通り、リンカー構造を介して連結を生じることができる。

１つの具体的態様によれば、結合剤を作製するために誘導体Ａおよび／またはＢを誘導体として使用する：

本発明による方法を実施する場合、親化合物ＡＥＢ０７１に特異的である結合剤を得るためにこれらの誘導体はとりわけ有用である。

親化合物の医薬的に活性な形態に結合する確率が高いこれらの結合剤が選択される本方法による選択工程(ｃ)は、好ましくは親化合物の医薬的に活性な形態の存在が、結合剤の誘導体に対する結合を阻止するかどうかを分析することにより選択される。各分析を実施するための適当な方法は、該結合剤に関する標的としての親化合物の医薬的に活性な形態と競合する結合パートナーとして誘導体を使用する競合結合アッセイを実施することである。各競合結合アッセイを実施するための１つの具体的態様はＥＬＩＳＡアッセイのようなイムノアッセイである。しかしながらこの分析のためにその他のイムノアッセイ法を使用することもできる。よって本方法の１つの具体的態様によれば、結合剤の結合特異性を決定するためにイムノアッセイを実施する。

親化合物が１個所以上の代謝部位を有し、それを代謝作用により不活化できるか、または化合物が大きく、それにより結合剤に関するいくつかのエピトープを提供する場合にとりわけ適当である１つの具体的態様によれば、親化合物の医薬的に活性な形態、誘導体に対して結合剤が得られるその誘導体に特異的に結合し、そしてまた親化合物の少なくとも１つの異なる誘導体に結合し、第１誘導体とは異なる分子の部分を遮蔽するが、第１誘導体と同一の暴露された分子の部分を残す少なくとも１つの結合剤が工程(ｃ)において選択される。使用される各誘導体において親分子の異なる部分が結合から遮蔽されるので、様々な誘導体に対する結合剤の結合パターンの競合分析を実施することにより、親分子の医薬的に活性な形態の特異的な部分が結合剤により結合／認識されることを決定することができる。分子の意図される／想定される代謝部位が遮蔽されている誘導体を創成することにより、化合物の結合領域(すなわち抗体の場合、エピトープ)をさらに決定または分析することができる。該遮蔽された領域に特異的な結合剤は各誘導体に結合しないであろう。それ故に代謝部位が遮蔽されているかかる誘導体を使用して得られた結合剤の特異性を確認できる。

１つの具体的態様によれば、工程(ｃ)において分子ＡＥＢ０７１とその活性代謝体との間で差別化する結合剤が選択され、それは以下の構造を有する：

見ることができる通り、ＡＥＢ０７１に存在するピペラジン環のメチル基が、化合物Ｃでは欠けている。親化合物ＡＥＢ０７１と化合物Ｃとの間で本明細書において記載される競合アッセイを実施することにより、本明細書において記載される適切な結合剤を選択することができる。

本発明の教示に従って調製された(複数の)誘導体に結合する結合剤を同定する／得るために、結合剤ライブラリーをスクリーニングすることにより適当な結合剤を得ることができる。各結合剤ライブラリーに関する例は、例えば結合剤を表示するファージまたはファージミドライブラリーである。例えばインビトロで抗体を得るための方法はまたHudson, PJ and Souriau, C. , Engineered antibodies. Nat. Med. 9：129−134(2003)(出典明示により本明細書の一部とする)にも記載される。

結合剤は標的を特異的に認識し、そして結合することができる限り、任意の構造を有し得る。抗体、抗体フラグメントまたは結合機能を有するそのバリアントからなる群から結合剤を選択でき、結合剤は例えばアンチカリン類のような結合機能を提供する足場タンパク質を有する。抗体と類似の結合機能を有する結合剤の概説は、Hey, et al：Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial application, Trends in Biotechnology, Vol 23 No. 10， October 2005 page 514-522(出典明示により本明細書の一部とする)において与えられる。抗体フラグメントは依然結合能を有する、該全抗体からの少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む抗体の任意のフラグメントである。好ましい具体的態様では、抗体フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ)２フラグメント、ダイアボディー、トリアボディーもしくはテトラボディーのような複数の結合ドメインを含むマルチボディー、単一ドメイン抗体またはアフィボディー(affibodies)のような抗体の結合領域を含む。抗体バリアントは同一の結合機能を有するが、例えば改変されたアミノ酸配列を有する抗体または抗体フラグメントの誘導体である。

１つの具体的態様によれば、結合剤は抗体である。抗体の使用は、例えば前記された該誘導体を動物に投与して該誘導体に対する特異的免疫原性応答を起こすことにより抗体を容易に作成できるという利点を有する。

動物をマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、モルモット、ヤギおよびヒツジからなる群から選択できる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体でよい。各抗体を得るための適当な方法はEd Harlow and David Lane, Antibodies - A laboratory Manual(1988)および／またはW. C. Davies, Monoclonal antibody protocols(1995)(出典明示により本明細書の一部とする)に記載される。モノクローナル抗体のより高い特異性のために、通常モノクローナル抗体が好ましい。誘導体で免疫された動物から少なくとも１つの抗体産生細胞を回収し、該抗体産生細胞を不死化し、そして不死化抗体産生細胞からモノクローナル抗体を単離することによりモノクローナル抗体を得ることができる。

本発明の局面で使用できる適当なキャリアには、タンパク質、糖タンパク質、複合多糖類および粒子が含まれる。種々のタンパク質をキャリアとして用いることができる。これらのタンパク質には、限定するものではないがアルブミン類および血清タンパク質、例えばグロブリン類、水晶体タンパク質(ocular lens proteins)、リポタンパク質等が含まれる。例証されるタンパク質にはウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、卵白アルブミン(ｏｖａ)、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および類似のタンパク質が含まれる。合成キャリアを使用することもできる。適当な多糖類は、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースまたは炭水化物ガムであり、キャリアとして使用できる。動物を小型分子で免疫することになっている場合、キャリアは化合物の免疫原性を増大させるので、遮蔽のためのキャリアの使用はとりわけ好ましい。

本明細書に記載される方法で、該親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する適当な結合剤を得ることができる。本発明の重要な要素は前記で詳記される、使用される誘導体の設計にある。それ故に各々の結合剤は高度に鋭敏で、そして信頼性のある薬物モニタリングアッセイにおける使用に非常に適当である。本発明による結合剤は親化合物の活性な形態に優勢的に結合するように設計／選択される。いくつかの具体的態様では、活性代謝体の異なる形態間で区別さえできるようにそれらを設計する。親化合物の不活性代謝体が偶然検出され、それが得られた薬物モニタリング結果を偽り得ることが防御されるので、この特異性は重要な利点である。

加えて本発明は設計された誘導体、および得られた結合剤を各々提供する。親分子のこれらの部分が遮蔽され、ここで親化合物を不活化する代謝作用が起こらないか、または関連性のある代謝作用が起こらないように親化合物を修飾することにより、記載されるような誘導体を得ることができる。これは結合剤を化合物の関連性のある部分に対して上昇させる効果を有する。様々な誘導体を創成することにより親化合物の全ての部分を連続的に遮蔽するために、親化合物の大きさに依存して、いくつかの誘導体を創成することもできる。代謝体不活化が生じる部分は通常遮蔽されずに残る。該結合剤の該誘導体に対する交差反応性を試験することにより、全ての誘導体において接近可能である(遮蔽されていない)分子の部に対して特異的に結合する結合剤を選択することができる。

とりわけ本発明は以下の基本構造を有するＡＥＢ０７１の誘導体を提供する：

(式中、Ｘ_１および／またはＸ_２は遮蔽構造または水素の連結部位を模倣する)。Ｘ_１またはＸ_２部位のうちの少なくとも１つは遮蔽構造を担持する。例えば、前記の通り、キャリアを遮蔽構造として化学的骨格にリンカー構造を介して連結できる。Ｘ_１および／またはＸ_２部位での親分子ＡＥＢ０７１の遮蔽により、親化合物に非常に特異的である結合剤の作成を可能にする誘導体、そして故に医薬的に活性な化合物に至ることが見出された。潜在的な代謝部位を接近可能なままにするためにリンカー構造のための付着点が注意深く選択されているこれらの誘導体の定義された遮蔽パターンのために、これらの誘導体は親化合物に特異的な結合剤を作成するための貴重な手段である。

各誘導体の定義された実例は誘導体Ａおよび誘導体Ｂである：

本発明の教示により以下の構造を有するＡＥＢ０７１のバリアントもまた提供される：

前記の通り、活性代謝体化合物Ｃよりも高い特異性で親化合物ＡＥＢ０７１に結合する抗体を選択するために、このバリアントを使用することができる。各々の試験を実施するために、この化合物を例えば検出可能な標識またはキャリアと共に提供することができる。

記載されたスクリーニング方法により得られた結合剤もまた本発明で提供される。特に親化合物ＡＥＢ０７１をモニタリング／検出するために特に適当である１つの具体的態様によれば、前記で定義されたＡＥＢ０７１の誘導体の１つ、とりわけ誘導体Ａおよび／または誘導体Ｂを使用することにより結合剤を選択する。１つの具体的態様によれば、親化合物ＡＥＢ０７１は化合物Ｃよりも高い特異性で該結合剤により結合される。好ましくは該結合剤は２Ｇ８、４Ｇ４、３Ａ３または６Ｂ１１からなる群から選択される抗体である。本発明による好ましい抗体は４Ｇ４、３Ａ３である。

本発明のさらなる態様によれば：
親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態を含むと考えられる試料を少なくとも１つの結合剤と接触させること；
該化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で該親化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することにより、該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度を決定すること；
を含む薬物モニタリングアッセイが提供される。

前記された方法により各々のアッセイにおいて使用することができる適切な結合剤を得ることができる。前記で詳記された方法の重要な要素は、不活化が生じ得る分子の代謝的に重大な(複数の)部分を認識する結合剤を作成する、適当な誘導体のインシリコでの経験的な設計、競合実験を使用し、それにより親化合物の医薬的に活性な形態を認識する結合剤を得ることによる誘導体および親化合物の医薬的に活性な形態に結合する結合剤の選択である。

本発明による薬物モニタリングアッセイでは、生物学的試料中に存在する(存在するならば)親化合物の医薬的に活性な形態に対する該結合剤の結合に競合する結合剤のための結合パートナーとして標的化合物を使用して、濃度を決定するために競合アッセイを実施できる。医薬的に活性な形態が試料中に存在しない場合、関連する結合は生じない。該試料はモニタリングされるべき患者から、例えばＡＥＢ０７１を摂取している移植患者から得られた生物学的試料でよい。

１つの具体的態様によれば、結合アッセイから得られた結果を標準較正曲線と比較することにより、試料中の親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態の濃度を決定する。親化合物またはその活性形態の希釈系列を使用して較正曲線を作成することにより各々の標準曲線を得ることができる。生物学的試料に関して得られた値を、次いで標準曲線と比較し、それにより試料中に存在する親化合物の医薬的に活性な形態の濃度を決定することを可能にできる。

１つの具体的態様によれば、結合剤により認識される親化合物の医薬的に活性な形態またはその誘導体を検出可能な標識と抱合させ、そしてかかる抱合体は試料中に存在する該親化合物の医薬的に活性な形態と結合剤による結合に関して競合するように構成される。該化合物が治療用薬物モニタリング濃度で存在する場合、該標識は被験試料中の該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度のシグナルの指標を提供する。各々のテクノロジーの実例は例えば蛍光偏光免疫測定法(ＦＰＩＡ)、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ(cloned enzyme donor immunoassay)(ＣＥＤＩＡ(登録商標))、化学発光異種イムノアッセイ(chemiluminescence heterogenous immunoassay)(ＣＭＩＡ)である。もちろんこの試料中の親化合物の濃度を決定するためにその他の同種または異種イムノアッセイを使用することもできる。それ故に本明細書にて挙げられた例は非限定的である。

１つの具体的態様によれば標的は、結合剤または同じ特異性で結合剤により認識されるそのバリアントを得るために使用された誘導体である。故に分析されるべき試料中の親化合物の医薬的に活性な形態と競合するために使用される標的は、各結合剤を得るために使用された誘導体でよい。これは、該競合標的が最も高い特異性で結合剤により結合されることを確実にする。しかしながら、好ましくは同じ特異性で結合剤により認識される該誘導体のバリアントを使用することも可能である。バリアントの使用は、例えばそれがアッセイを容易にする場合(例えば異なるキャリアを使用することにより)、実行可能であり得る。

１つの具体的態様によれば、競合アッセイを実施するために使用される結合剤は検出可能な標識を担持する。次いで例えばそこに試料を添加するとすぐに、および適切なインキュベーションおよび洗浄工程が実施された後、試料中の標識の減少を測定することにより試料中の親化合物の医薬的に活性な形態の濃度を決定できる。

さらなる具体的態様によると、結合剤による結合に関して親化合物と競合する標的をマトリックス上に固定する。該マトリックスは例えばチップ、複数のウェルを含むプレート、カラムまたは任意のその他の適当なマトリックスのような任意の種類のものでよい。例えば結合剤または結合剤により依然結合され、そして故に認識されるそのバリアントを得るために使用される誘導体を該マトリックス上に固定できる。各々調製されたマトリックスを、親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態を含むと考えられる試料の存在下で結合剤と接触させる。あるいは、アッセイを逆行させ、そして結合剤をマトリックス上に固定できる。

次いで試料の存在下で該結合剤の、マトリックス上に固定された誘導体／標的に対する結合を検出する。検出のために、第１結合剤を認識し、そして検出可能な標識を担持する第２結合剤を添加できる。誘導体／標的の代わりに結合剤を固定する場合、誘導体／標的をアッセイに添加し、そして各々を検出する。該第２結合剤の該検出可能な標識を検出することにより検出を行う。

それ故に、具体的態様によれば、薬物モニタリングアッセイは標識された結合剤を含み、そして／またはここで第１結合剤を認識する第２結合剤を添加し、そしてここで第２結合剤は検出可能な標識を担持する。
イムノアッセイを介して検出を行うことができる。各々のイムノアッセイを実施するための適当な形態はＥＬＩＳＡである。

薬物モニタリングアッセイでモニタリングすることができる適当な親化合物は前記され、そして免疫抑制剤、抗感染薬、抗てんかん薬、抗精神病薬および抗癌薬からなる群から選択され得る。
本発明による薬物モニタリングアッセイで小型分子をモニタリングすることもできる。各々モニタリングすることができる適当な小型分子およびこの目的のために適当な結合剤は前記され；前記の開示を参照する。

本発明の１つの具体的態様によれば、モニタリングされるべき親化合物は小型分子ＰＫＣ阻害剤ＡＥＢ０７１である。生物学的試料中の該親化合物を検出するために、前記で一般的に記載されたＡＥＢ０７１の誘導体、とりわけ誘導体Ａおよび／または誘導体Ｂを使用できる。誘導体を本明細書に記載の通りマトリックス上に固定することができる。誘導体はキャリア分子を含み得る。各アッセイは好ましくは１から５００もしくは１から３００ｎｇ／ｍｌ、または２から２５０ｎｇ／ｍｌの作動範囲を有する。

好ましくは前記された方法により得ることができ、そして本発明のアッセイにおいて使用される該結合剤は２Ｇ８、４Ｇ４、３Ａ３または６Ｂ１１からなる群から選択される抗体である。

親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で親化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤および所望により該試料中の該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度を決定するための試薬を含む、試料中の親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態の濃度を決定するための診断キットもまた本発明で提供される。

適当な結合剤を前記および請求の範囲において記載する。該診断キットはマトリックスを含むこともでき、ここで該結合剤の標的または結合剤は該マトリックス上に固定されている。前記および請求の範囲において記載されるＡＥＢ０７１の誘導体または同じ特異性で結合剤により認識されるそのバリアントを該マトリックス上に固定に固定することができる。

診断キットにおいて使用される該結合剤および／または競合標的は検出可能な標識を担持できる。しかしながら検出可能な標識を担持する該結合剤または競合標的に結合する第２結合剤もまた使用できる。

固定された、請求の範囲において定義される誘導体または請求の範囲にて定義される結合剤を有するマトリックスもまた提供される。各マトリックスは記載された薬物モニタリングアッセイに有用である。

本発明の教示に従って使用することができる標識は、検出可能なシグナルを生成するかまたは生成するように誘導することができる任意の分子である。標識を分析物、免疫原、結合剤、例証的には前記された方法により生成された結合剤もしくはそれ故に特異性を有する第２結合剤に、または受容体もしくはリガンド、とりわけハプテンのような受容体に結合することができる分子のような別の分子に抱合させることができる。標識の非限定例には放射性同位元素、酵素、酵素フラグメント、酵素基質、酵素阻害剤、コエンザイム、触媒、フルオロフォア、色素化学発光物質、発光物質、増感剤、非磁性または磁性粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体およびハプテン放射性同位元素が含まれる。

「試料」または「生物学的試料」なる用語は親化合物の医薬的に活性な形態を含むと考えられる試料を指す。それには限定するものではないが、生存しているもの、またはかつては生存していたものからの任意の量の物質が含まれる。かかる生存しているものには、限定するものではないがヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、ウマおよびその他の動物が含まれる。かかる物質には、限定するものではないが血液、血清、尿、涙液、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞および皮膚が含まれる。

試料中の親化合物の医薬的に活性な形態の濃度を決定するための、親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で親化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を含む、該試料中の該親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態の濃度を決定するための診断キットもまた本発明で提供される。

前記された方法により結合剤を得ることができる。適当な結合剤はまた請求項９から１２において記載される。診断キットはまた適切なバッファー、試薬および使用のための説明書をも含み得る。

１つの具体的態様によれば、診断キットはマトリックスを含み、ここで該結合剤に関する標的または結合剤自体のいずれかが該マトリックス上に固定される。前記の通り、結合剤を得るために使用された誘導体を標的として使用できる。あるいは、同じ特異性で結合剤により認識されるそのバリアントを使用できる。

生物学的試料中の親化合物の濃度を検出するためのいくつかの適当な方法が前記された。使用される検出方法に依存して、結合剤、競合標的および／または結合剤もしくは競合標的のいずれかを認識する第２結合剤は検出可能な標識を担持する。診断キットはとりわけＡＥＢ０７１をモニタリングするために有用である。適当な具体的態様が前記され、そして診断キットにおいて使用することもできる。

ＡＥＢ０７１の前記された誘導体ならびにとりわけ誘導体Ａ(ＢＪＣ)および／もしくは誘導体Ｂ(ＢＪＣ)または前記されたスクリーニング方法により得られた結合剤のいずれかを担持するマトリックスもまた本発明で提供される。適当な実例が前記された。誘導体は所望により適当なキャリアを担持できる。

ここで薬物モニタリングアッセイを確立するためのＡＥＢ０７１に対する適切な結合剤の作成を用いる実施例により本発明をさらに詳細に記載する。

１．誘導体の設計
適当な結合剤を得るために、本明細書では親化合物ＡＥＢ０７１の活性形態に特異的に結合する抗体、２つの誘導体、誘導体Ａ(ＢＪＣ)および誘導体Ｂ(ＢＪＡ)を創成した(前記の構造を参照)。これらの２つの誘導体は、２つの異なる位置で活性化されたリンカーを伴うＡＥＢ０７１の修飾体である。親化合物ＡＥＢ０７１を認識する抗体を作成する可能性が最も高く、そしてＡＥＢ０７１の薬理学的に不活性な代謝体を認識する可能性が最も低いことに関して双方の誘導体は選択された。各々の抗体を得るために、ＫＬＨキャリアタンパク質を各々の部位に抱合させることにより分子の特定の部分を遮蔽した。該キャリアは遮蔽された部分に対する抗体の創成を防御し、そして免疫原性を増大させる。この原理を用いることにより、化合物の潜在的な決定的部位に先だって、抗体の特異性を設計することができ、誘導体を適切に設計することにより、ここで関連性のある代謝作用が生じる。誘導体の設計が親化合物上の接近可能な、利用可能な抗原結合部位を決定する。

２．誘導体に特異的な抗体の生成
誘導体の各々の抱合体を使用して、標準的な手順に従ってウサギおよびマウスを個々に免疫した(前記参照)。
ウサギにおいてポリクローナル抗血清(ｐＡｂ)を作成し、そして個々のブーストの後、誘導体抱合体に対する反応性に関して試験した。最後のブーストもまた固定された化合物上でのアフィニティー精製に供した。

同様に、抱合体に対するモノクローナルマウス抗体(ｍＡｂ)を作成した。選択された、クローン化されたハイブリドーマ細胞系から抗体を作成した。双方の誘導体に対するｐＡｂおよびｍＡｂを作成した。
ｐＡｂ血清、ハイブリドーマ上澄ならびに精製されたｐＡｂおよびｍＡｂを直接ＥＬＩＳＡ法により抗原に対する特異的結合の分析に供した。

３．ＡＥＢ０７１特異的抗体の選択
親化合物ＡＥＢ０７１の抱合誘導体に対して、および親化合物自体に対して高希釈で特異的に結合するこれらの抗体をさらに試験するために選択した。得られたデータにより、ｍＡｂおよびｐＡｂは、これらの化合物に関する結合アッセイのための、とりわけＡＥＢ０７１の薬物モニタリングアッセイにおいて使用するための高度に強力な、特異的手段であることが示される。

選択および精製工程の間に、親化合物ＡＥＢ０７１に対する結合を試験した。これはＡＥＢ０７１遊離薬物によるＢＪＣまたはＢＪＡ抱合体に対する抗体結合の阻止を試験することにより行われた。ＡＥＢ０７１遊離薬物による高パーセンテージの阻止を表示する抗体が見出され、そして各々選択された。ｍＡｂに関して様々な結合、それぞれの阻止の特徴を有する一連の抗体をさらなる評価のために選択した。

ＡＥＢ０７１遊離薬物による阻止により、抗体が誘導体またはキャリアを含むその抱合体のみならず、遊離薬物、および故に活性親化合物をも認識することが示される。これは活性化合物に特異的であるＡＥＢ０７１モニタリングアッセイ、とりわけイムノアッセイを開発するために重要である。

遊離薬物により結合がほぼ完全に阻止されるこれらの抗体を選択することにより、ほとんどの抗体がリンカーまたは誘導体のキャリアタンパク質よりもむしろ親化合物を認識することが確実になった。それ故にＡＥＢ０７１により差次的に抱合または標識されたＢＪＣまたはＢＪＡ誘導体に対する結合の競合に基づくモニタリングアッセイが実行可能である。各々の競合法の適当な実例は前記に記載され、そしてまた周知である。

様々な阻止特徴を有する抗体の作成により、広範なＡＥＢ０７１濃度の分析が可能になるアッセイの開発のための抗体の選択が可能になる。さらに種々の各抗体を上昇させることにより、親化合物と様々な活性代謝体とを区別できるこれらの抗体を選択することも可能になる。

実施され、遊離薬物により観察された阻止と組み合わされた直接抱合結合アッセイにより、ＡＥＢ０７１の公知の濃度に基づく較正曲線に対して定量されるべき、動物または患者からの試料中の遊離薬物または密接に関係する化合物による、抗ＢＪＣまたは抗ＢＪＡ抗体の結合の阻止に基づくアッセイの実行可能性が示される。試料中の化合物の実際の濃度はこの方式で信頼性をもって決定され得る。

実施された抱合計画および抗体に関する選択計画と共に、ＡＥＢ０７１誘導体の選択により、試料中の問題の化合物により競合される標的に対する抗体の結合に基づく新しいモニタリングアッセイ(とりわけイムノアッセイ)の開発のための貴重なアッセイ手段が得られた。もちろん多くが当分野において公知であるその他の競合アッセイ形式をも使用できる。

モノクローナルおよびポリクローナル抗ＡＥＢ０７１抗体に関する特異性試験
抗体を上昇させるために使用される誘導体がプレートの空のウェルに定置されたイムノアッセイを創成した。その後、選択された抗体を親分子ＡＥＢ０７１と一緒に添加した。適切な洗浄工程の後、抗種ＰＯ(ペルオキシダーゼ)抗体を使用し、そして各々の基質ＯＰＤ(オルトフェニルジアミン)を添加することにより、固定された誘導体に対する抗体の結合を検出した。実験の設定は以下のとおりであった：

卵白アルブミン(ｏｖａ)キャリアを担持する誘導体ＢＪＡを定置するために、NUNC MaxiSorb74981プレートを使用した。ｏｖａ−ＢＪＡを１μｇ／ｍｌ ＰＢＳバッファー(ｐＨ７.４)と混合することによりこれを行った。混合物を４℃で一晩休ませた。混合物をプレートの空のウェルに添加した。Pierce PBS SuperBlock ２００μｌを添加し、そして各プレートを暗中、室温で１時間振盪した。次いでプレートを洗浄溶液３００μｌで３回洗浄した。

抗体およびＡＥＢ０７１と組み合わされた抗体をウェルに添加し(１００μｌ)、そして１５から３０分間インキュベートした。以下の抗体を使用した：ポリ抗体(ウサギ)：抗ＢＪＡおよび抗ＢＪＣ。モノ抗体(マウス)：抗ＢＪＡ(２Ｇ８および４Ｇ４)および抗ＢＪＣ(３Ａ３、６Ｂ１１)。次いで暗中で振盪しながら、室温で２時間インキュベーションを実施した。その後、抗種ＰＯ抗体１００μｌを添加し、そして暗中で振盪しながら、室温で１時間インキュベートした。その後、試料を洗浄溶液３００μｌで３回洗浄した。その後、試料を洗浄溶液３００μｌで３回洗浄した。

その後、基質ＯＰＤ(１００μｌ)を添加した。錠剤１個を蒸留水２０ｍｌに溶解した。
暗中で振盪しながら、室温で２０分間インキュベーションを行った。
その後、停止溶液Ｈ_２ＳＯ_４２Ｎ １００μｌを添加した。
溶液のＯＤを４９０ｎｍで測定した。

以下の設定を使用した：

以下の結果が得られた：

アッセイの結果を図１に示し、ここでＡＥＢ０７１による阻止をＯＤ％で示す(ＡＥＢ０７１なし＝ＯＤ１００％)。小型分子ＡＥＢ０７１はプレートに適切に接着しないので、その化合物でのコーティングは実行不能であることが見出された(データは示していない)。しかしながらキャリア(例えば卵白アルブミン)を担持する元来の誘導体でのコーティングは作動する。それ故に誘導体、本明細書ではｏｖａ−ＢＪＡはプレートに付着した。
コーティングなし(ＮＳ１)を使用する場合、有意なシグナルは得られない。それ故にバックグラウンドは低い。抗種抱合抗体(Ｂ０およびＮＳ２)もまたアッセイに非特異的に結合しない。これはまたバックグラウンドを回避するためにも重要である。

ＡＥＢ０７１が添加された場合、固定された誘導体に対する全ての選択された抗体の結合が阻止された。これにより、使用された抗体が全てＡＥＢ０７１に関して特異的であることが実証された。抗体４Ｇ４で最良の特異性が得られた。
未知試料(例えば生物学的試料)中のＡＥＢ０７１濃度を決定するための標準として使用することができる較正曲線を確立するために、以下の表により記載されるような希釈系列を実施した(ウェル中の最終濃度)。バッファー中の４Ｇ４および３Ａ３に対するＡＥＢ０７１の阻止曲線を以下のように準備した：

ウェル中の最終濃度は以下のとおりであった：

この希釈系列を使用することにより、ＯＤを測定した場合、図２に記載されるような較正曲線が得られた。
曲線Ａは抗体４Ｇ４対ＡＥＢ０７１に関して得られた結果を表す。曲線Ｂは抗体３Ａ３対ＡＥＢ０７１に関して得られた結果を表す。

この図２に対する説明文は以下の通りである：

結果により、本発明の方法で得られた抗体は試料中のＡＥＢ０７１を特異的に検出するのに適当である。抗体４Ｇ４は、依然許容される特異性を示す３Ａ３よりもなおさらに特異的であるように見える。

(原文に記載なし)

Claims (20)

1. 親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性を有する、該親薬物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を得るための；
   (ａ) 該親化合物の該医薬的に活性な形態の一部を遮蔽することにより該親化合物の該医薬的に活性な形態の少なくとも１つの誘導体を調製すること；
   (ｂ) 該誘導体に結合する結合剤の群を得るために該誘導体を使用すること；
   (ｃ) 該親化合物の誘導体および少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する結合剤の該群から少なくとも１つの結合剤を選択すること；
   を含む方法。
2. 該親化合物の該医薬的に活性な形態の少なくとも１つの部分が結合剤と接近可能であるように誘導体の一部が遮蔽構造で修飾されており、ここで該親化合物の該医薬的に活性な形態は哺乳動物において代謝される、請求項１に記載される方法。
3. 結合剤を得るために各誘導体が分子のその他の誘導体とは異なる部位で遮蔽構造を担持する少なくとも２つの誘導体を調製する、請求項１または２に記載の方法。
4. 親化合物がＡＥＢ０７１である、請求項１から３の少なくとも１つに記載の方法。
5. 以下の化合物の群：
   (ａ)
   

   

   (式中、Ｘ_１および／またはＸ_２は別個に遮蔽構造または水素の連結部位を表し、そしてＸ_１またはＸ_２のうちの少なくとも１つは遮蔽構造を担持する)；
   (ｂ)ＢＪＣ
   

   

   (ｃ)ＢＪＡ
   

   

   から選択される誘導体を使用することにより結合剤が得られる、請求項４に記載の方法。
6. 親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態の存在が結合剤の該誘導体に対する結合を競合的に阻止するかどうかを分析することにより選択工程(ｃ)を実施する、請求項１から５の少なくとも１つに記載の方法。
7. 選択工程(ｃ)で少なくとも１つの結合剤が以下の群：
   (ａ)親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態；
   誘導体に対してそれが得られるその誘導体；および
   親化合物から創成された親化合物の異なる部分が遮蔽されている少なくとも１つの第２誘導体；
   に結合する結合剤；
   (ｂ)親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態；
   誘導体に対してそれが得られるその誘導体；に結合するが
   親化合物から創成された親化合物の異なる部分が遮蔽されている少なくとも１つの第２誘導体；
   に結合しない結合剤；
   から選択される、請求項１から６の少なくとも１つに記載の方法。
8. 親化合物を不活化し得る親化合物の各潜在的代謝部位に関して誘導体が創成される、請求項１から７の少なくとも１つに記載の方法。
9. 請求項１から８の少なくとも１つに記載の方法により得られた結合剤。
10. 試料中のＡＥＢ０７１の医薬的に活性な形態をモニタリングするための以下の工程：
    (ａ)該誘導体に結合する結合剤の群を得るために請求項１３にて定義されるような少なくとも１つの誘導体を使用すること；
    (ｂ)該誘導体およびＡＥＢ０７１の少なくとも１つの医薬的に活性な形態に結合する結合剤の該群から結合剤を選択すること；
    により得られる結合剤。
11. 該結合剤が親化合物ＡＥＢ０７１：
    

    

    および代謝体化合物Ｃ：
    

    

    ならびに所望により請求項１３において定義した少なくとも１つの誘導体に結合する、請求項１０に記載の結合剤。
12. 該結合剤が同一のエピトープを認識する２Ｇ８、４Ｇ４、３Ａ３もしくは６Ｂ１１からなる群から選択される抗体またはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項１０または１１に記載の結合剤。
13. (ａ)
    

    

    (式中、Ｘ_１および／またはＸ_２は別個に遮蔽構造または水素の連結部位を表し、そしてＸ_１またはＸ_２のうちの少なくとも１つは遮蔽構造を担持する)；
    (ｂ)ＢＪＣ
    

    

    (ｃ)ＢＪＡ
    

    

    からなる群から選択される、ＡＥＢ０７１の誘導体。
14. 親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態を含むと考えられる試料を少なくとも１つの結合剤と接触させること；
    該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度を決定すること；
    を含み、該濃度を決定するために該親化合物の医薬的に不活性な形態よりもよりも高い特異性で該親化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤を使用する薬物モニタリングアッセイ。
15. 請求項９から１２の少なくとも１つに記載の結合剤を含む、請求項１４に記載の薬物モニタリングアッセイ。
16. 結合剤により認識される該親化合物の誘導体または親化合物が検出可能な標識に抱合され、ここで該抱合された親化合物またはその誘導体は試料中に存在する該親化合物の該医薬的に活性な形態と結合剤による結合に関して競合するように構成され、そして標識が該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度のシグナルの指標を提供する、請求項１４または１５に記載の薬物モニタリングアッセイ。
17. 親化合物がＡＥＢ０７１である、請求項１４から１６に記載の薬物モニタリングアッセイ。
18. 競合標的として使用される誘導体が請求項１３に記載の誘導体または同じ特異性で結合剤により認識されるそのバリアントである、請求項１７に記載の薬物モニタリングアッセイ。
19. 親化合物ＡＥＢ０７１および／またはその医薬的に活性な形態を認識する結合剤を使用し、そして該アッセイが１から５００または１から２５０ｎｇ／ｍｌの作動範囲を有する、請求項１７または１８に記載の薬物モニタリングアッセイ。
20. 親化合物の医薬的に不活性な形態よりも高い特異性で親化合物の医薬的に活性な形態に結合する少なくとも１つの結合剤および所望により該試料中の該親化合物の該医薬的に活性な形態の濃度を決定するための試薬を含む、試料中の親化合物の少なくとも１つの医薬的に活性な形態の濃度を決定するための診断キット。

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