BRPI0519354B1

BRPI0519354B1 - método para detecção de um anticorpo terapêutico e uso de um anticorpo

Info

Publication number: BRPI0519354B1
Application number: BRPI0519354A
Authority: BR
Inventors: Lenz Helmut; Stubenrauch Kay-Gunnar
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2020-06-09
Also published as: ATE503187T1; KR20070086642A; US7955806B2; BRPI0519354A2; CA2589054C; EP1853921A2; WO2006066912A9; JP4664377B2; MX2007006895A; EP1853921B1; WO2006066912A2; EP2237041A1; ES2360369T3; RU2393483C2; CA2589054A1; WO2006066912A3; EP1853921B2; ES2360369T5; DE602005027127D1; KR100950635B1

Abstract

método para detecção de um anticorpo terapêutico e uso de um anticorpo. a presente invenção refere-se ao campo dos anticorpos terapêuticos. refere-se especialmente ao estudo dos anticorpos terapêuticos em um animal experimental. a presente invenção descreve um método para a detecção de um anticorpo terapêutico em uma amostra obtida a partir de um animal experimental compreendendo as etapas de (a) provendo a amostra a ser analisada, (b) incubando a referida amostra com um anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga a imunoglobulina do referido animal experimental, (c) opcionalmente incubando a referida amostra com um reagente apropriado para a detecção seletiva do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno, e (d) correlacionando o complexo formado em (b) ou (c) com a concentração do referido anticorpo terapêutico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA DETECÇÃO DE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO E USO DE UM ANTICORPO.

A presente invenção refere-se ao campo dos anticorpos terapêuticos. Refere-se especialmente ao estudo dos anticorpos terapêuticos em um animal experimental. A presente invenção descreve um método para a detecção de um anticorpo terapêutico em uma amostra obtida a partir de um animal experimental compreendendo as etapas de (a) prover a amostra a ser analisada, (b) incubando a referida amostra com um anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga a imunoglobulina do referido animal experimental, (c) opcionalmente incubando a referida amostra com um reagente apropriado para a detecção seletiva do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno, e (d) correlacionando o complexo formado em (b) ou (c) com a concentração do referido anticorpo terapêutico e que não se liga a imunoglobulina do animal experimental para a medição da concentração anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno da amostra obtida a partir do animal experimental.

Desde o desenvolvimento dos primeiros anticorpos monoclonais por Koehler e Milstein em 1974, muitos esforços tem sido dedicados ao desenvolvimento de anticorpos que sejam apropriados para a terapia em seres humanos. Os primeiros anticorpos monoclonais que se tornaram disponíveis foram desenvolvidos em camundongos e ratos. Esses anticorpos quando usados para a terapia em um ser humano ocasionaram efeitos colaterais indesejados devido aos anticorpos anti-roedores. Muitos esforços têm sido dedicados a redução ou mesmo a eliminação de tais efeitos colaterais não desejados.

Nos últimos dez anos, um número sempre crescente de anticorpos monoclonais humanos ou de anticorpos monoclonais humanizados tem chegado ao mercado. Os exemplos bem conhecidos incluem, por exemplo, Herceptin® e MabThera® da Hoffmann-LaRoche da Basiléia.

Um número bastante significativo de anticorpos monoclonais humanos ou humanizados está sob investigação e necessita ser estudado em animais experimentais, antes que a entrada em seres humanos possa

Ιϋ ser considerada com relação às primeiras finalidades de teste.

Os critérios importantes tais como a biodisponibilidade e a liberação do anticorpo, somente para mencionar duas das mesmas têm que ser estudadas através do auxílio de animais experimentais. Muitos desses estudos necessitam a quantificação do anticorpo terapêutico nos fundamentos dos próprios anticorpos do hospedeiro. Na maioria dos casos são usados mamíferos como os animais experimentais. A toxidez é quase sempre avaliada em roedores tais como camundongos ou ratos. Nos estágios mais avançados do desenvolvimento de fármacos, especialmente antes da entrada das fármacos em seres humanos, mesmo macacos tem sido incluídos em tais estudos pré-clínicos.

Os mamíferos usualmente têm entre cerca de 10 até cerca de 30 miligramas de imunoglobulina por ml na circulação.

Os anticorpos monoclonais terapêuticos têm tipicamente de ser testados com níveis de soro que variam a partir de cerca de entre 1 nanograma por ml até cerca de 100 microgramas por ml. Por esse motivo, o anticorpo terapêutico tem que ser detectado contra um fundo de anticorpos do hospedeiro que está em um excesso de cerca de 100 vezes até 10 milhões de vezes. A detecção de um anticorpo terapêutico monoclonal humano ou humanizado em um fundo de imunoglobulina do hospedeiro representa uma tarefa bastante significativa para o farmacologista. Além disso, será observado que anticorpos terapêuticos diferentes podem exigir reagentes e formatos de análise diferentes. A detecção de um anticorpo monoclonal humano ou humanizado se torna mais e mais difícil, quanto mais próximo o animal de teste está relacionado com o H. sapiens.

Foi uma tarefa da presente invenção a de investigar se os métodos de detecção de um anticorpo terapêutico em uma amostra obtida a partir de um animal experimental podem ser aperfeiçoados. Também foi investigado se um anticorpo terapêutico monoclonal humano ou humanizado pode ser estudado nos soros de macacos, especialmente nos soros de macacos inferiores. Essa tarefa foi completada com bom êxito pela invenção, na forma descrita abaixo e na seção de exemplos e como reivindicada nas reivindica3 ções em anexo.

Em uma primeira modalidade a presente invenção se refere a um método para a detecção de um anticorpo terapêutico em uma amostra obtida a partir de um animal experimental compreendendo as etapas de (a) prover a amostra a ser analisada, (b) incubando a referida amostra com um anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina do referido animal experimental, (c) incubando opcionalmente a referida amostra com um reagente apropriado para a detecção seletiva do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno. e (d) correlacionando o complexo formado em (b) ou (c) à concentração do referido anticorpo terapêutico.

A expressão anticorpo terapêutico se refere a qualquer preparação de anticorpo que é destinada para ser usada em um ser humano. De preferência esse anticorpo terapêutico será um anticorpo monoclonal. De mais preferência, esse anticorpo monoclonal será obtido a partir de um macaco superior ou ser um anticorpo monoclonal humano. De preferência, ele será um anticorpo monoclonal humano. Também de preferência esse anticorpo terapêutico monoclonal será um anticorpo monoclonal humanizado.

A expressão anticorpo monoclonal na forma usada aqui, neste pedido de patente, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto com relação a possíveis mutações que ocorram naturalmente que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra uma única determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como senso obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anti corpos, e não é considerado como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma descrito primeiro por Koehler, G., et al., Nature 256 (1975) 495 a 497, ou podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente U.S. N^Q 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de coleções de anticorpos fagos com a utilização das técnicas descritas por Clackson, T„ et al., Nature 352 (1991) 624 a 628 e Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581 e 597, por exemplo.

As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüências parciais derivadas a partir de imunoglobulina não humana e a partir de uma imunoglobulina humana. Em sua maior parte, os anticorpos humanizados dão derivados a partir de uma imunoglobulina humana (anticorpo recebedor) na qual resíduos a partir de regiões hipervariáveis do recebedor são substituídas por resíduos a partir de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tenha a especificidade e a afinidade desejadas. Em alguns casos, resíduos das regiões de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender outras modificações, como por exemplo, resíduos de aminoácidos que não sejam encontrados no anticorpo recebedor ou no anticorpo doador. Essas modificações resultam em variantes tais como anticorpo recebedor ou doador que são homólogos podem não idênticos a sequência de origem correspondente. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aquelas de um anticorpo doador não humano e todas ou substancialmente todas das FR são aquelas de um anticorpo recebedor humano. O anticorpo humanizado também irá compreender pelo menos uma parte de uma região constante da imunoglobulina (Fc) tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos têm sido descritos na técnica. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos dentro do mesmo a partir de uma fonte que seja não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são quase sempre referidos como resíduos importados, que são tipicamente tomados a partir de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones, P.T., et al., Nature 321 (1986) 522 a 525; Riechmann, L., et al., Nature, 332 (1988) 323 a 327; Verhoeyen, M., et al., Science, 239 (1988) 1534 e 1536 e Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992) 593 a 596), através da substituição das seqüências das regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de um anticorpo não humano. Por conseqüência, esses anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U. S. N^s 4.816.567), nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano tenha sido substituído pela seqüência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos FR, são substituídos por resíduos a partir de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a capacidade antigênica. De acordo com o chamado método de melhor ajuste, a seqüência de um domínio variável de um anticorpo de um roedor é varrida contra toda a coleção das seqüências de domínios variáveis humanos conhecidas. A seqüência humana que seja mais aproximada aquela do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims, M.J., et al., J. Immunol., 151 (1993) 2296 a 2308; Chothia, C, et al., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901 a 917). Um outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada a partir da seqüência de consenso de todos ao anticorpos humanos de um

subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285 a 4289; Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623 a 2632).

Os exemplos bem conhecidos de anticorpos terapêuticos humanizados são os chamados anticorpos anti ErbB2 incluindo huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como descritos na tabela 3 da Patente U.S. 5.821.337, expressamente incorporada aqui, neste pedido de patente por referência, bem como o 520C9 humanizado (descrito no WO 93/21319) e ao anticorpos humanizados 2C4 como descritos no PCT/US 03/21590.

O termo variante se refere a polipeptídios que tenham seqüências de aminoácidos que sejam diferentes em algum grau de uma sequência de polipeptídio natural. Comumente, uma seqüência variante de aminoácidos possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia com a seqüência do anticorpo de origem correspondente, e de preferência, elas terão, pelo menos, cerca de 90%, de mais preferência pelo menos cerca de 95% de homologia com tal seqüência do anticorpo de origem correspondente. As variantes de seqüência de aminoácidos possuem substituições, cancelamentos e/ou inserções em determinadas posições no interior da seqüência de aminoácido da seqüência de aminoácido natural.

Homologia é definida como a percentagem de resíduos na variante da seqüência de aminoácido que sejam idênticas depois do alinhamento das seqüências e da introdução dos intervalos, se necessário, para ser com seguida a maior percentagem de homologia. Os métodos e os programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um de tais programas de computador é o Align 2, autorizado pela Genetech Inc., que foi depositado com a documentação de usuário no United States Copyright Office, Washington, DC 20559, em 10 de dezembro de 1991.

A expressão animal experimental como usada aqui, neste pedido de patente indica os membros das famílias da ordem dos primatas compreendendo os sagüis e tamarins (família Callitrichidae), macacos do novo mundo (família Cebidae), macacos do velho mundo (família Cercopithecidae), lêmures anões e tipo camundongo (família Cheirogaleidae), ayeaye (família Daubentoniidae), bushbabies e galagos (família Galagonidae), gibões e monos inferiores (família Hylobatidae), indris, sifakas, e parentes (família Indridae), lêmures verdadeiros (família Lemuridae), lóris (família Loridae), lêmures esportivos (família Megaladapidae), társios (família Tarsiidae), bem como cruzamentos dos mesmos.

De preferência os métodos de acordo com a presente invenção será praticado em animais experimentais selecionados a partir do grupo que compreende os membros das famílias dos sagüis e tamarins, macacos do velho mundo, lêmures anões e tipo camundongo, gibões e monos inferiores, lêmures verdadeiros, bem como os cruzamentos dos mesmos. Em uma modalidade de preferência os mais próximos com relação ao gênero humano, especialmente o grupo de chimpanzés, bonobos, gorilas e orangotangos está excluído.

Uma amostra de acordo com a presente invenção pode ser uma amostra de qualquer tecido ou líquido removido do animal experimental. De preferência a amostra será uma amostra líquida tal como a saliva, sangue total, plasma ou soro. De preferência a amostra será o sangue total, plasma ou soro.

O anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina de um animal experimental irá se ligar a um anticorpo terapêutico com uma constante de dissociação (= KDiss) de pelo menos 10‘⁹ mol/l, de mais preferência com um KDiss, de pelo menos 1O'¹⁰ mol/l. Ao mesmo tempo a propriedade de não se ligar a imunoglobulina do animal experimental é assegurada através de um KDiss de 10’⁸ mol/l,ou pior. Também de preferência, o anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina de um animal experimental terá um intervalo-KDiss de pelo menos 100 vezes entre a sua reatividade com relação à IgG de um animam experimental e com relação ao IgG humana, respectivamente.

As propriedades de ligação de um anticorpo, especialmente o

KDiss, são avaliadas, de preferência, através de um instrumento Biacore®. Nesse método as propriedades de ligação são avaliadas através de mudanças na ressonância de plasmônio de superfície (SPR). É conveniente ligar o anticorpo sob investigação à fase sólida (denominada de chip) e avaliar a ligação de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal ou mesmo um soro compreendendo a IgG a esse chip revestido.

A ligação do anticorpo a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina do animal experimental sob investigação pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, fragmentos de tais anticorpos, bem como construtos genéticos que compreendem o domínio de ligação de tal anticorpo. Qualquer fragmento de anticorpo que retenha os critérios de ligação acima ao anticorpo terapêutico e de não ligação à imunoglobulina do referido animal experimental pode ser usado. Os anticorpos, bem como os fragmentos de anticorpos são gerados através de procedimentos do estado da técnica, como por exemplo descritos em Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990), todo o livro, especialmente as páginas de 43 a 78, Elsevier, Amsterdã).

Como ainda indicado acima, diversos aspectos ligados a aplicação de um anticorpo terapêutico em um animal experimental poder ter que ser avaliado durante os estudos pré-clínicos. Em determinadas colocações pode ser relevante analisar a quantidade total do anticorpo terapêutico presente, ou pode ser importante a análise de determinados fragmentos de enzima de um anticorpo terapêutico, determinadas modificações de um anticorpo terapêutico, a concentração do anticorpo terapêutico ligado a um antígeno ou a fração do anticorpo terapêutico ainda capaz de se ligar a um antígeno. De preferência o método de acordo com a presente invenção é usado para detectar o anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno, respectivamente.

O termo anticorpo terapêutico total se refere a qualquer anticorpo detectado sem levar em conta se o anticorpo é ativo (isto é, ainda reativo com o antígeno), inativo e/ou ligado ao antígeno.

O termo anticorpo terapêutico ativo se refere ao anticorpo tera9 pêutico presente em um animal experimental que ainda é capaz de se ligar ao seu antígeno. Esses anticorpos, por exemplo não se ligaram ao antígeno ou a qualquer outra molécula em seu sítio de ligação com antígeno.

O termo anticorpo terapêutico ligado ao antígeno é usado para indicar que o anticorpo terapêutico está presente na circulação de um animal experimental que está ligado ao seu antígeno.

O anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno como definido acima pode ser detectado de modo direto em um método de acordo com a presente invenção.

Além disso, também é possível avaliar de modo indireto qualquer anticorpo terapêutico inativo. Esse anticorpo terapêutico inativo pode, por exemplo, ser um anticorpo terapêutico ligado a um antígeno de reação cruzada ou o anticorpo terapêutico bloqueado por um auto-anticorpo contra o anticorpo terapêutico. Como o artesão versado irá observar, é possível através do auxílio da presente descrição avaliar a fração de anticorpo inativo. No caso de quantidades totais de anticorpos de mais do que a soma do anticorpo ativo e do anticorpo ligado ao antígeno, uma fração adicional de anticorpo compreendendo o anticorpo inativo não ligado ao seu antígeno correspondente estará presente.

Diversos sistemas de análise estão à disposição para analisar, por exemplo, o anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno.

O anticorpo total, por exemplo, pode ser detectado em um sistema de imunoensaio chamado de competitivo ou em um sistema de ensaio do tipo de sanduíche.

Esses ensaios podem ser realizados sem as etapas de lavagem (imunoensaio homogêneos) ou com etapas de lavagens (imunoensaio heterogêneos).

De preferência, o anticorpo terapêutico total é detectado em um imunoensaio do tipo de sanduíche, no qual o anticorpo que está se ligando a um anticorpo terapêutico e não está se ligando a imunoglobulina do animal experimental é usado em ambos os lados de tal ensaio do tipo sanduíche. O anticorpo usado em um lado do referido sanduíche está ligado ou é capaz de

se ligar a uma fase sólida (quase sempre referida como anticorpo de captura), enquanto que o anticorpo do outro lado de tal sanduíche é marcado de uma tal maneira que a detecção direta ou indireta é facilitada (o chamado anticorpo de detecção). A quantidade de anticorpo de detecção ligada nesse procedimento de ensaio de sanduíche está correlacionada diretamente à quantidade de anticorpo terapêutico na amostra investigada.

São conhecidos sistemas de ensaio na técnica (como por exemplo, a US 2003/0068664), que permitem a detecção de anticorpos terapêuticos ativos. Esses sistemas exigem a ligação do anticorpo a uma fase sólida, a ligação do anticorpo terapêutico a este antígeno ligado e a detecção do anticorpo terapêutico ligado através do antígeno à fase sólida.

A detecção do anticorpo terapêutico ativo em uma amostra pode der conseguida de procedimentos convenientes do estado da técnica. No entanto, a detecção do anticorpo terapêutico total ou da fração do anticorpo terapêutico ligada ao seu antígeno é bastante complicada, e requer arranjos de ensaio diferentes e especialmente requer reagentes feitos de acordo para cada um dos ensaios diferentes. Com o anticorpo de acordo com a presente invenção que está se ligando a um anticorpo terapêutico e não está se ligando a imunoglobulina do animal experimental é possível avaliar a fração do anticorpo terapêutico ativo, o anticorpo terapêutico total ou o anticorpo terapêutico ligado ao antígeno em sistemas de teste que são análogos um com o outro. Através de sua própria natureza este tipo de avaliação comparativa do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno, deve ter grandes vantagens uma vez que as comparações quantitativas são feitas entre essas diversas frações do anticorpo terapêutico.

De preferência um formato de ensaio do tipo de sanduíche é (também) colocado para detectar o anticorpo terapêutico ativo. De preferência, o anticorpo que está se ligando a um anticorpo terapêutico e não está se ligando a imunoglobulina do animal experimental é usado como um anticorpo de captura e o lado da detecção de tal ensaio sanduíche tanto fazem uso do antígeno em uma forma marcada ou depois da ligação do antígeno faz uso de um segundo anticorpo não se ligando ou competindo com o epítopo

reconhecido pelo anticorpo terapêutico, em que o referido segundo anticorpo é especificamente detectável e ou é marcado de tal maneira que a detecção direta ou indireta é facilitada.

O anticorpo terapêutico ligado ao antígeno é detectado de preferência em um formato de ensaio do tipo sanduíche usando de novo, de preferência o anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina do animal experimental como o reagente de captura. Na detecção é usado de preferência um segundo anticorpo se ligando ao antígeno em um epítopo que não compete com o epítopo do anticorpo terapêutico. O referido segundo anticorpo é marcado de preferência de tal maneira que a detecção direta ou indireta é facilitada.

Para a detecção direta o grupo de marcação pode ser selecionado a partir de quaisquer grupos de marcadores detectáveis conhecidos, tais como corantes, grupos de marcação luminescente tais como os grupos de luminescência química, como por exemplo, os ésteres de acrinídio ou dioxetanos, ou corantes fluorescentes, como por exemplo a fluorceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorrufina, cianina e derivados dos mesmos. Outros exemplos de grupos de marcadores são os complexos de metal luminescentes, tais como os complexos de rutênio ou európio, enzimas, com o por exemplo, como usadas para ELISA ou para CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay, por exemplo, a EP-A-0 061 888), e radioisotopos.

Os sistemas de detecção indireta compreendem, por exemplo, aqueles que o reagente de detecção, por exemplo, o anticorpo de detecção é marcado com um primeiro parceiro de um par de ligação de valor biológico finito.

Os exemplos de pares de ligação adequados são hapteno ou antígeno/anticorpo, biotina ou análogos da biotina tais como aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotiba/ avidina ou espeptavidina, açúcar/lecitina, ácido nucléico ou análogo de ácido nucléico/ ácido nucléico complementar e receptor/ligante, como por exemplo, receptor de hormônio esteróide/ hormônio esteróide. Os primeiros membros do par lê ligação de preferência compreendem o hapteno, antígeno e hormônio. São de preferência especial os haptenos tais como digoxina e biotina e os análogos dos mesmos. O segundo parceiro de tal par de ligação, por exemplo, um anticorpo, estreptavidina, etc., é usualmente marcado para permitir detecção direta, por exemplo, pelos marcadores como mencionados acima.

Os imunoensaios são bem conhecidos dos versados na técnica. Os métodos para a execução de tais ensaios bem como as aplicações práticas e procedimentos estão resumidos em manuais relacionados. Os exemplos de manuais relacionados são are Tijssen, P., Preparation of enzymeantibody or other enzyme-macromolecule conjugates (in: Practice and theory of enzyme immunoassays (1990), pp. 221 a 278, Eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) e diversos volumes do Methods in Enzymology (Eds. S. P. CoIowick, N. O. Caplan, Academic Press), que dizem respeito aos métodos de detecção imunológicos, especialmente os volumes 70, 73, 74, 84, 92 e 121.

Em todos os métodos de detecção imunológica acima, são escolhidas condições do reagente que permitam a ligação do reagente empregado, por exemplo, para a ligação e um anticorpo ao seu antígeno correspondente. O artesão versado se refere ao resultado desse evento de ligação através da utilização do termo complexo. O complexo formado em um método de ensaio de acordo com a presente invenção está correlacionado com os procedimentos da técnica com relação á concentração correspondente do referido anticorpo terapêutico. Dependendo do reagente de detecção empregado essa etapa de correlação irá resultar na concentração do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno.

Como o artesão versado irá observar os métodos de acordo com a presente invenção irão não somente revelar as concentrações do anticorpo terapêutico total, ligado ao antígeno, ativo ou mesmo inativo. Devido ao uso de preferência de um e do mesmo reagente, o anticorpo se ligando a um anticorpo e não se ligando a imunoglobulina do referido animal experimental, em ensaios diferentes os valores obtidos podem ser comparados com facilidade um com o outro e mesmo as proporções dos mesmos avaliadas. Em outra modalidade de preferência, a presente invenção se refere à proporção do anticorpo terapêutico ativo para o total. Esta proporção pode servir bem como um indicador para a eficácia de um anticorpo terapêutico.

Durante o decorrer dos experimentos que levaram a presente invenção, foi descoberto que um determinado epítopo quer está presente em todas as classes de imunoglobulina humana da classe G parece não estar presente na imunoglobulina de nenhum animal experimental, exceto no IgG dos chimpanzés. Este epítopo é caracterizado pela sua ligação a MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9, também denominado de MAB<h-Fc gama>M-R10Z8E9, ou resumidamente MAB M-R10Z8E9. Em uma modalidade de preferência de acordo com a presente invenção o anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a ligando a imunoglobulina de um animal experimental é também caracterizado em que o referido anticorpo é um anticorpo se ligando ao mesmo epítopo como MAB M-R10Z8E9. MAB M-R10Z8E9 foi depositado com a DSMZ em 22 de dezembro de 2004 como DSM ACC2708..

De preferência a presente invenção se refere a um anticorpo monoclonal que se liga a um anticorpo terapêutico, aquele anticorpo monoclonal tendo um sítio de combinação de antígeno que inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal MAB M- R10Z8E9 como produzido por este hibridoma depositado com a DSMZ. A expressão inibe competitivamente significa sendo capaz de reconhecer e ligar o epítopo na forma reconhecida pelo anticorpo monoclonal M-R10Z8E9. Essa ligação é avaliada com facilidade com a utilização de ensaios recíprocos convencionais de competição de anticorpos.

Em resumo, em um experimento de competição recíproca é investigado se dois (ou mais) agentes de ligação específicos inibem a ligação de um outro anticorpo ao mesmo antígeno ou epítopo. Diga-se que os referidos anticorpos A e B são investigados com relação à ligação ao mesmo epítopo. Ambos anticorpos irão competir com relação á ligação se eles se ligam ao mesmo epítopo. A ligação ao mesmo epítopo está presente se o anticorpo A em concentração equimolar reduz a ligação de B de pelo menos 20% e vice-versa.

Como o artesão versado observa, a competição pode ser avaliada em condições de análise diferentes.

De preferência, o sistema Biacore®, vide acima, é usado. A ligação de um anticorpo sob investigação ao mesmo epítopo como ligado por MAB M-R10Z8E9 está presente se o anticorpo sob investigação em concentrações equimolares reduz a ligação do MAB M-R10Z8E9 ao IgG humano em 20% ou mais e se o MAB M-R10Z8E9 reduz a ligação do referido anticorpo à IgG humana por 20% ou mais.

Em ainda outra modalidade de preferência o MAB M-R10Z8E9 é usado como o anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina do animal experimental em um método de acordo com a presente invenção.

Como mencionado acima, o anticorpo terapêutico detectado em um método de acordo com a presente invenção é de preferência um anticorpo monoclonal humano ou humanizado. De preferência, o anticorpo terapêutico usado em um método de acordo com a presente invenção compreende o epítopo como estando ligado através do MAB M-R10Z8E9.

Em outra modalidade de preferência, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligando a imunoglobulina do animal experimental para a medição da concentração do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno em uma amostra obtida de um animal experimental. De preferência o anticorpo usado nesse método é um anticorpo que se liga ao epítopo como reconhecido pelo MAB M-R10Z8E9.

Os exemplos, referências e figuras que se seguem são providos para auxiliar o entendimento da presente invenção, o escopo verdadeiro da qual é mostrado nas reivindicações em anexo. Fica entendido que podem ser feitas modificações nos procedimentos mostrados sem que se afastem do espírito da invenção.

Descrição das figuras.

Figura 1 - Detecção do anticorpo terapêutico total.

O anticorpo monoclonal biotinilado (MAB<H-Fcy pan>-M- R1OZ8E9 -Bi) é ligado a uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina (SAMTP). O anticorpo terapêutico MAB<IGF-1R> está ligado e detectado indire15 tamente através de MAB<H-Fcy pan> M-R10Z8E9-DIG marcado com digoxigenina e um conjugado de antidigoxigenina de peroxidase de rábano silvestre (PAB<DIG>HRP).

Figura 2 - Detecção do anticorpo terapêutico total diluído em tampão.

As densidades óticas (as OD) são dadas com relação às diversas concentrações de anticorpo terapêutico como diluído em PBS-T, 0,5% de BSA (p/v).

Figura 3 - Detecção do anticorpo terapêutico total diluído em tampão, porém também contendo 5% (em v/v) de soro cynomolgus.

As densidades óticas (as OD) são dadas com relação às diversas concentrações de anticorpo terapêutico como diluído em PBS-T, 0,5% de BSA com 5% (v/v) de soro cynomolgus.

Figura 4 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo através antígeno em fase sólida.

Este desenho mostra os reagentes usados na detecção do anticorpo terapêutico ativo através de um antígeno ligado em fase sólida. No exemplo específico dado, o receptor da interleucina I solúvel biotinilado (s-ILIR-Bi)está ligado às cavidades de uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina (SA-MTP). O anticorpo terapêutico ativo se liga ao antígeno e é detectado indiretamente através do anticorpo anti-humano digoxigenilado (MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9-DIG) e anti-DIG-HRP (PAB<DIG>HRP).

Figura 5 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo diluído em tampão.

As densidades óticas (as ÕD) são dadas com relação às diversas concentrações de anticorpo terapêutico como diluído em PBS-T, 0,5% de BSA (p/v).

Figura 6 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo diluído em tampão, compreendendo adicionalmente 5% de soro cynomolgus.

Figura 7 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo em um ensaio no formato de sanduíche.

O anticorpo monoclonal biotinilado (MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 -Bi) está ligado a uma placa de microtitulação revestida com estreptavidína (SAMTP). A detecção é indireta empregando antígeno marcado com digoxigenina (s-IL- IR-DIG) e o conjugado de peroxidase do rábano silvestre antidigoxigenina (PAB<DIG>HRP).

Figura 8 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo diluído em tampão através de um ensaio do tipo sanduíche.

As densidades óticas (as OD) são dadas com relação às diversas concentrações de anticorpo terapêutico como diluído em PBS-T, 0,5% de BSA.

Figura 9 - Detecção do anticorpo terapêutico ativo diluído em tampão, compreendendo adicionalmente 5% de soro cynomolgus, através de um ensaio do tipo sanduíche.

As densidades óticas (as OD) são dadas com relação ás diversas concentrações de anticorpo terapêutico como diluído em PBS-T, 0,5% de BSA com 5% de soro cynomolgus.

Abreviaturas

ABTS	sal diamônio do sulfonato de 2,2'-Azino-di-[3-etilbenztiazolina (6)]
BSA	albumina do soro bovino
ELISA	ensaio imunoabsorvente ligado à enzima
Fcy	=Fcy = Fcg = Fcgama = Fc gama - fragmento de uma imunoglobulina
POD (=HRP)	peroxidase do rábano silvestre
igG	imunoglobulina G
DIG	(Dig) digoxigenina
MTP	placa de microtitulação
OD	densidade ótica
PBS	solução salina tamponada com fosfato
SDS	dodecil sulfato de sódio
MAK (=Mab)	anticorpo monoclonal

PAK (=Pab) anticorpo policlonal RT temperatura ambiente

SA estreptavidin a

T Tween®20 <lgG humano> anticorpo contra IgG humano

Exemplo 1

Avaliação da especificidade

a) Uso de diversos anticorpos IgG anti-humano em um MTP-ELISA

Uma placa de micro titulação (MTP) (Maxisorb®, Nunc) foi revestida com soro de macaco (por exemplo, cynomolgus) e soro humano diluído para 20% em tampão de carbonato (pH 9,6) em temperatura ambiente (RT) durante uma hora, respectiva mente. Depois de lavagem em 3 vezes com PBS- Tween®20, todas as cavidades dos MTP foram bloqueados com PBS/30% de BSA em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida as cavidades com os MTP foram incubadas (1 h; RT) com anticorpos IgG antihumanos diferentes (não conjugados ou conjugados de anticorpo IgG antihumano e peroxidase de rábano silvestre (POD) (vide a tabela 1)). Os diversos anticorpos anti-humanos foram usados na forma recomendada pelo correspondente fabricante.

As cavidades foram lavadas três vezes como acima. As cavidades incubadas com os conjugados-POD foram processadas diretamente com relação à reação enzimática/ detecção de imunoglobulina anti-humana ligada. Outras cavidades foram incubadas (1 h; RT) como apropriado com anti-Dig, IgG anticamundongo; ou conjugados de estreptavidina-POD (todos os reagentes da Roche Diagnostics, Alemanha) seguidas por uma etapa de lavagem. O POD compreendido nos conjugados-POD catalisa a reação de cor do substrato ABTS. O sinal foi medido através de um leitor de ELISA em um comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm). Para cada um dos anticorpos IgG anti-humanos a proporção do sinal contra os anticorpos humanos para o sinal dos soros dos cynomolgus foi calculada. Esses valores foram usados para a avaliação da especificidade aos anticorpos IgG anti-humanos. Uma proporção elevada traduz com relação a uma forte reatividade com a imunoglobulina humana e ao mesmo tempo a uma baixa reatividade (cruzada) com a imunoglobulina do macaco. Tabela 1

Reatividade de anticorpos anti-humanos com o soro humano e de macaco 5 cynomolgus

Anticorpo	Sinal em 10% de soro humano (v/v)	Sinal em 10% de soro cynomolgus (v/v)	Proporção de sinal Humano/Cynomolgus.
MAK< Humano lgG> MK1A6 // Chemicon n⁹ CBL101C)	0,743	0,895	0,83
PAK< Humano lgG> Bi //Dako η’ E0428 (**)	2,066	1,815	1,14
MAK<H-Fcy pan> M- R10Z8E9 - Dig (***)	1,847	0,032	58,63
MAK<H-Fcy pan> M-R 10Z8E9 (*)	1,779	0,199	8,96
MAK <Humano Agg-lgG >lgM-Dig (***)	1,541	0,700	2,20
MAK <Humano Kappa> R12Z6H9-Dig (***)	1,566	0,720	2,17
MAK <Hu-lgG>F(ab’) 2- HRP // Dianova n^B 109- 066-098	1,401	0,953	1,47
MAK <Humano lgG> HRP // Chemicon n⁹ AP113P	0,973	0,574	1,70
PAK<Humano lgG>F (ab)' 2-HRP // Dako n⁹0406	0,513	0,431	1,19
MAK<Humano lgG>- HRP // Boehringer Mannheim (alt)	1,383	0,796	1,74

Tabela 1 -continuação-

Anticorpo	Sinal em 10% de soro humano (v/v)	Sinal em 10% de soro cynomolgus (v/v)	Proporção de sinal Humano/Cynomolgus.
Controles
<camundongo> - HRP	0,139	0,131	1,07
<Dig> - HRP	0,029	0,031	0,94
SA- HRP	0,193	0,288	0,67

(*) = Detecção com <camundongo>-HRP (**) = Detecção com SA-HRP (***) = Detecção com <Dig>-HRP

A proporção alta de sinal para o soro humano quando comparado ao soro do cynomolgus observado com relação à MAB<H-Fcy pan>MR10Z8E9 indica a alta especificidade humana do MAB<H-Fcy pan>MR10Z8E9. Em contraste ao MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 todos os outros anticorpos testados mostraram uma alta reatividade cruzada.

Com base nos dados encorajadores acima a reatividade cruzada do MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 contra outra imunoglobulina a partir de outros animais experimentais relevantes foi investigada.

Cavidades de uma placa de microtitulação foram revestidas com soro de diversos animais experimentais. O ensaio foi realizado como descrito acima com a utilização de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 como o reagente específico de detecção de IgG anti-humana.

Como pode ser observado a partir da Tabela 2 o MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 reage exclusivamente com a imunoglobulina do IgG humano do soro humano ou do soro do chimpanzé, respectivamente.

A reatividade do MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 com soro de camundongo, rato, cão, macaco e humano é mostrada nas Tabelas 2a e b respectivamente.

Tabela 2a.

Detecção com MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9-Diq//<Diq>PQD

Soro (10% (v/v)	Sinal	Proporção do sinal Humano/Animal
Cão	0,096	19,24
Rato	0,034	54,32
Camundongo CDI	0,028	65,96
Camundongo NMRI	0,065	28,42
Cynomolgus	0,032	58,63
Babuíno	0,029	63,69
Macaco Rhesus	0,031	60,56
Sagüi	0,128	14,43
Chimpanzé	1,865	0,99
Humano	1,847	1,00
IgG humano (5 pg/ml)	1,821	1,01

Tabela 2.

Detecção com conjugados IgG anticamundongo POP

Soro (10% (v/v)	Sinal	Proporção do sinal Humano/Animal
Cynomolgus	0,199	8,96
Babuíno	0,131	13,63
Macaco Rhesus	0,186	9,59
Sagüi	0,239	7,46
Chimpanzé	1,893	0,94
Humano	1,779	1,00
IgG humano (5 μο/πιΙ)	__2,105	0,85

É interessante observar que nos sistemas de detecção indireta acima a qualidade do reagente final <DIG>-POD ou <camundongo>-POD usado na detecção indireta também influencia o sinal com relação à proporção de ruído. O artesão versado irá escolher um reagente de detecção com pouca ou nenhuma ligação do IgG de um animal experimental.

b) Avaliando a liqação/especificidade do anticorpo através do sistema Biacore®.

Todas as medições foram realizadas com o instrumento Biacore® 2000 com a utilização de um chip CM5. O revestimento do anticorpo neste chip foi conseguido por acoplamento de amina padrão. A não ser que indicado de outro modo todas as incubações foram executadas em tampão HBS (HEPES, NaCl, pH 7,4) à 25°C.

Uma quantidade de saturação de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 e anti-soro Fcy policlonal anti-humano (Dianova), respectivamente, foi imobilizada em acoplamento de amina em canais diferentes do mesmo chip CM5. Todos os soros dos animais foram diluídos em tampão HBS que continha 1 mg/ml de CM-dextrano em uma concentração final de 1%. A ligação foi analisada através da injeção de soro diluído 1 em 100 e incubação durante 60 segundos. A dissociação foi medida através da lavagem da superfície do chip com tampão HBS durante 180 segundos. Com a utilização do Biaevaluation Software de Biacore® os valores da constante de dissociação (= KDiss.) foram calculados com um modelo Langmuir 1:1. Para todos os soros dos animais este calculo foi baseado na presunção de que o nível da IgG é de 15 mg/ml. Os valores do sinal 80 segundos depois do início da injeção do anticorpo em teste foram escolhidos com relação à comparação da quantidade de IgG ligado (RU na tabela 2c e 2d).

Tabela 2c:

Sinais de ligação [RU] de soros de animais com relaçao ao de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 e um anti-soro Fcy policlonal anti-humano.

Amostra (soro)	MAB<H- Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB<H-Fcv> (Dianova)
	RU ligado	KD em M	RU ligado	KD em M
Humano	2377	1,83 x 10’¹°	2399	5,64 x 10¹¹
Cynomolgus	8	Sem ligação	1929	6,24 x 10’¹¹
Camundongo CDI	2	Sem ligação	0	Sem ligação
Camundongo NMRI	5	Sem ligação	3	Sem ligação
Rato	25	Sem ligação	92	5,28 x 10’⁸
Cão	634	8,12 x W⁸	925	6,21 x 10’¹°

Tabela 2d:

Sinais de ligação [RUI de soros de macacos diferentes com relação ao de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 e um anti-soro Fcy policlonal anti-humano.

Amostra (soro)	MAB<H- Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB<H-Fcy> (Dianova)
	RU ligado	KDiss em M	RU ligado	KDiss em M
Humano	1274,0	1,77 x IO'¹⁰	1854,2	2,81 x10¹¹
Cynomolgus 1	2,9	Sem ligação	1591,9	6,64 x 10'¹¹
Cynomolgus 2	2,8	Sem ligação	1413,1	5,21 x 10'¹¹
Cynomolgus 3	6,3	Sem ligação	1899,0	1,15 x 10'¹⁰
babuíno	0	Sem ligação	1209,8	7,33 x 10’¹¹
Sagüi	5,1	Sem ligação	433,9	1,02 x 10⁹
Chimpanzé	1077,5	2,21 x IO’¹⁰	1967,5	1,21 x 10’¹²
Macaco Rhesus	-2,9	Sem ligação	1409,9	4,86 x 10’¹¹

A análise SPR (dos soros de macacos diferentes) confirma os resultados observados no MTP ELISA. O MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 não tem reação cruzada com qualquer espécie de macaco. Somente o IgG compreendido nos soros humano e do chimpanzé (grande macaco) é detectado. Em contraste com o MTP ELISA alguma ligação do soro de cão ao MAB<HFcy pan>M-R10Z8E9. O KDiss. relativamente elevado para a IgG do cão (correlacionado a ligação inferior) quando comparado com a IgG humana com um intervalo de KDiss. de mais do que 100 vezes indica que essa baixa interação não interfere de forma significativa em uma imunoensaio. Isso é realmente o que foi encontrado no MTP ELISA do Exemplo 1 (a).

Em contraste ao MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 o anticorpo policlonal Fc anti-humano mostra uma elevada reatividade cruzada com o soro do cão e com os de todas as espécies de macacos testados.

Exemplo 2.

O uso de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 para a quantificação do anticorpo terapêutico total.

O MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 biotinilado ou o anticorpo policlonal direcionado contra o Fc humano foi ligado a placas de micro titulação revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido através de lavagem. Amostras/padrões, como por exemplo, MAB <IGF-IR> salpicados em soro de cynomolgus, foram simultaneamente incubadas com o MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9-DIG digoxigenilado durante uma hora. Em seguida a mistura foi adicionada a cavidades em uma SA-MTP revestida com os anticorpos <lgG humano> bioti5 nilados e incubados durante uma hora. Depois da lavagem, o MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9-DIG digoxigenilado foi detectado com um anticorpo antidigoxigenina. O POD dos conjugados de anticorpo-enzima catalisa a reação de cor do substrato ABTS. O sinal é medido pelo leitor de Elisa em um comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm).

Os valores de absorção para cada amostra de soro foram determinados em triplicatas.

Tabela 3:

Comparação da curva padrão em tampão (PBS-T, 0,5% BSA)

Concentração de MAB <IGF-IR> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
10	2,039	1,937
5	1,109	1,094
2,5	0,586	0,593
1,25	0,296	0,326
0,625	0,170	0,176
0,313	0,108	0,106
0,156	0,075	0,068
0	0,046	0,027

Como pode ser observado a partir da Tabela 3 e da Figura 2 15 ambos os anticorpos anti-humano Fc-gama são adequados para a qualificação de anticorpos humanos (MAB <IGF-IR>), se salpicados dentro do tampão. N^e entanto, na presença das IgG de macacos (5% de soro de cynomolgus) o desempenho do ELISA com o AB<H-Fcy> se tornou significativamente pior (Tabela 4 e figura 3)

Tabela 4:

Comparação de curvas padrão em 5% de soro de cynomolqus

Concentração de MAB <IGF-IR> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
10	1,990	1,5230
5	1,057	1,4335
2,5	0,559	1,4410
1,25	0,289	1,3840
0,625	0,166	1,3610
0,313	0,108	1,3780
0,156	0,091	1,3170
0	0,054	1,3870

Ocasionado pela reatividade cruzada do PAB <H- Fcy> (Dianova) com a IgG de macaco uma verdadeira ou correta quantificação de IgG humana em soro de macaco não é possível.

Exemplo 3.

O uso de MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 na quantificação do anticorpo humano ativo MAB <IL-1R>.

O receptor humano solúvel IL-1 biotinilado (h-IL-1 R-Bi) foi ligado a placas de microtitulação revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido através de lavagem. Em seguida o MAB <IL-1R> salpicado em soro de cynomolgus, foi ligado ao receptor IL-1 humano imobilizado. Depois da lavagem das substâncias não ligadas o MAB <IL-1R> foi detectado com a) anticorpo monoclonal digoxigenilado contra as cadeias de IgG humana (MAB<H-Fcy pan>MR10Z8E9-DIG) seguido pela incubação com um anticorpo antidigoxigenina marcado com a peroxidase do rábano silvestre; ou com b) anticorpos FC policlonal anti-humanos (Dianova) seguido por uma etapa de lavagem. O POD compreendido nos conjugados de anticorpo-enzima catalisa a reação de cor do substrato ABTS. □ sinal é medido pelo leitor de Elisa em um comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm).

Tabela 5:

Detecção do anticorpo terapêutico total

Concentração de MAB <IL-1R> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
10	1,921	1,682
5	1,307	0,933
2,5	0,770	0,489
1,25	0,424	0,262
0,625	0,231	0,143
0,313	0,125	0,084
0,156	0,074	0,057
0	0,020	0,031

Tabela 6:

Detecção do anticorpo terapêutico total no soro de cynomolgus

Concentração de MAB <IGF-IR> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
10	1,642	1,789
5	1,637	1,608
2,5	1,272	1,400
1,25	0,755	1,228
0,625	0,435	1,419
0,313	0,236	1,331
0,156	0,128	1,315
0	0,027	1,332

Os dados fornecidos nas Tabelas 5 e 6 e mostrados nas Figuras e 6 demonstram que ambos os anticorpos anti-humano Fc-gama são adequados para a qualificação de anticorpos humanos (MAB <IL-1R>), se salpi26 cados dentro do tampão. No entanto, na presença das IgG de macacos (5% de soro de cynomolgus (v/v) o desempenho do ELISA com o AB<H-Fcy> policlonal se tomou significativamente pior. Ocasionado pela reatividade cruzada com a IgG de macaco a sensibilidade diminuiu e a variabilidade aumentou. Exemplo 4.

O uso do MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 na quantificação do MAB<IL-1 R> ativo no soro de macaco.

O MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9 biotinilado ou o anticorpo policlonal de IgG anti-humano direcionado contra o Fc (b) humano foi ligado sobre placas de micro-titulação revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido através de lavagem. Em seguida o MAB <IL-1R> salpicado em soro de cynomolgus, foi ligado ao anticorpo anti-humano imobilizado. Depois da lavagem das substâncias não ligadas o MAB <IL-1R> foi detectado com o receptor IL-1 humano solúvel digoxigenilado (h-IL-1 R-Dig) seguido pela incubação com um anticorpo antidigoxigenina marcado com a peroxidase do rábano silvestre. O conjugado de anticorpo-enzima catalisa a reação de cor do substrato ABTS. O sinal é medido pelo leitor de Elisa em um comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm). Os valores de absorção para cada amostra de soro foram determinados em triplicatas.

Um desenho exemplificando esse sistema de teste é mostrado na Figura 7.

Tabela 7:

Comparação das curvas padrão em tampão (PBS-T, 0,5% BSA)

Concentração de MAB <IGF-IR> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
5	1,824	1,685
2,5	1,319	1,112
1,25	0,837	0,702
0,625	0,497	0,413

Tabela 7: - continuação-

Concentração de MAB <IGF-IR> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
0,313	0,277	0,229
0,156	0,159	0,132
0	0,025	0,032

Tabela 8:

Comparação das curvas padrão em 5% do soro de cynomolgus

Concentração de MAB <IL-1R> [ng/ml]	Sinal OD 405 nm
	MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9	PAB <H- Fcy> (Dianova)
5	1,635	0,805
2,5	1,179	0,460
1,25	0,707	0,278
0,625	0,421	0,163
0,313	0,231	0,101
0,156	0,136	0,070
0	0,026	0,04

Se o anticorpo terapêutico for diluído em PBS-T com 5% de

BSA ambos os anticorpos anti-humanos funcionam (conforme a Tabela 7 e a Figura 8). No entanto, na presença das IgG de macaco (5% de soro de cynomolgus) o desempenho do ELISA utilizando o AB<H-Fcy> policlonal é fraco. A saída do sinal é muito mais baixa a despeito da mesma quantidade de anticorpo terapêutico presente, como mostrado na Tabela 8 e na Figura 9.

Ocasionado pela reatividade cruzada com a IgG de macaco o desempenho do ensaio depende da quantidade total e da composição da IgG de macaco, que pode variar de animal para animal e a partir de ponto de tempo para ponto de tempo.

Relação de referências.

Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289

Chothia, C„ et al., J. Mol. Biol. 796(1987) 901-917

Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628

CoIowick, S.P., Caplan, N.O. (eds.), Methods in Enzymology, Academic Press

Computer program Align 2 by Genentech, inc., United States Copyright

Office, Washington, DC 20559, December 10, 1991

EP-A 0 061 888

Jones, P.T., et al., Nature 321 (1986) 522-525

Koehler, G., et al., Nature 256 (1975) 495-497

Marks, J.D., etal., J. Mol. Biol. 222 (1991)581-597

Presta, L.G., etal., J. Immunol. 151 (1993)2623-2632

Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596

Riechmann, L„ et al., Nature 332 (1988) 323-327

Sims, M.J., et al., J. ImmunoL 151 (1993) 2296-2308

Tijssen, P.» Practice and theory of enzyme immunoassays”, R.H. Burdon and v.

P.H. Knippenberg (eds.), Elsevier, Amsterdam, 1990, pp. 221-278; especially pp. 43-78

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detectar um anticorpo monoclonal terapêutico humano ou humanizado, que se destina ao uso em um humano, em uma amostra obtida a partir de um animal experimental, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) prover a amostra a ser analisada, (b) incubar a referida amostra com um anticorpo que se liga somente ao referido anticorpo terapêutico na presença da imunoglobulina do referido animal experimental, (c) opcionalmente incubar a referida amostra com um reagente apropriado para a detecção seletiva do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno, e (d) correlacionar o complexo formado em (b) ou (c) com a concentração do referido anticorpo terapêutico, em que o referido animal experimental é selecionado a partir do grupo que compreende os membros das famílias de saguis e tamarins, macacos do velho mundo, lêmures anões e tipo camundongo, gibões e monos inferiores, lêmures verdadeiros, bem como os cruzamentos dos mesmos, e em que o referido anticorpo que se liga ao anticorpo terapêutico e que não se liga à imunoglobulina do animal experimental é o anticorpo depositado em DSM ACC 2708.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo terapêutico total é detectado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo terapêutico ativo é detectado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo terapêutico que está ligado ao seu antígeno é detectado.
5. Uso de um anticorpo que se liga a um anticorpo monoclonal terapêutico humano ou humanizado que se destina ao uso em um humano e não se liga à imunoglobulina de um animal experimental, caracterizado

Petição 870190072836, de 30/07/2019, pág. 4/14 pelo fato de que é para a medição da concentração do anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado ao antígeno em uma amostra obtida a partir de um animal experimental, em que o referido animal experimental é selecionado a partir do

5 grupo que compreende os membros das famílias de saguis e tamarins, macacos do velho mundo, lêmures anões e tipo camundongo, gibões e monos inferiores, lêmures verdadeiros, bem como os cruzamentos dos mesmos, e em que o referido anticorpo que se liga ao anticorpo terapêutico e que não se liga à imunoglobulina do animal experimental é o anticorpo depositado em 10 DSM ACC 2708.