CN102656460B - 非交叉反应性抗IgG抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明报导了细胞系DSM？ACC3006，DSM？ACC3007和DSM？ACC3008，以及从所述细胞系得到的抗体，和从所述细胞系得到的抗体在免疫测定中的用途。还报导了结合人或黑猩猩IgG但不结合犬和绒猴IgG的抗体，和特异性结合包含κ轻链恒定结构域的IgG1的抗体。

Description

非交叉反应性抗IgG抗体
本发明报导了特异性结合人和黑猩猩IgG类抗体的IgG-Fab片段的恒定区的抗体及其在免疫测定中的用途。
发明背景
自从Koehler和Milstein在1974年开发了首例单克隆抗体以来，进行了许多努力以开发适用于治疗人的抗体。首例可获得的单克隆抗体已在小鼠和大鼠中被开发。在过去10年中，越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已进入市场。熟知的实例包括例如来自F.Hoffmann-LaRocheAG，Basel的Herceptin和MabThera
极大量的人或人源化抗体正在调查研究中，并在能够考虑进入人体进行初步试验以前需要在实验动物中研究。必须研究如生物可用性和抗体清除等(只提到其中2种)的重要标准。许多这些研究需要在实验动物自身抗体的背景下定量治疗抗体。在大多数情况下使用哺乳动物作为实验动物。通常最先在啮齿类如小鼠或大鼠中评估毒理学。在更高级的药物开发阶段，特别是在药物进入人体以前，甚至必须将猴子包括在这样的临床前研究中。
哺乳动物循环中通常具有约10至约30毫克/ml之间的抗体。治疗单克隆抗体一般必须以范围从约1纳克/ml至约100毫克/ml之间的血清水平进行检测。因此，必须在实验动物抗体的背景下检测治疗抗体，所述实验动物抗体为约100倍至1千万倍过量。
在实验动物抗体的背景下检测人或人源化治疗抗体是对药理学家的极为严峻的任务。检测动物与智人的亲缘关系越近，人或人源化抗体的检测就变得越来越困难。
在WO2008/031532中报导了一种抗药物抗体测定。在WO2006/066912中报导了在实验动物中检测治疗抗体。在US5,332,665中报导了物种特异性、高亲和力的单克隆抗体。
发明概述
本发明首先报导了在人和黑猩猩的G型免疫球蛋白的抗体上的构象表位，其不存在于通常使用的实验动物中。其次报导了与此表位结合的非交叉反应性抗人IgG抗体和抗黑猩猩IgG抗体。第三，报导了使用这些抗体的测定。
本发明报导的一个方面是结合人或黑猩猩IgG(G亚类的免疫球蛋白)但不结合犬和绒猴(marmoset)IgG的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体不结合犬、恒河猴(Rhesus-monkey)、绒猴、狒狒和食蟹猴(cynomolgus)IgG。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合人和黑猩猩IgG。在另外的实施方案中，通过表面等离子共振测定的结合人或黑猩猩IgG的KD值是10-9mol/l或更低，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴IgG的KD值是10-6mol/l或更高。在一个实施方案中，结合人或黑猩猩IgG的KD值是10-9mol/l至10-13mol/l。在另一个实施方案中，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴IgG的KD值不能通过表面等离子共振测定。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
本发明报导的另一个方面是特异性结合包含κ轻链恒定结构域的IgG1(G1亚类的免疫球蛋白)的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体还结合IgG2。在另一个实施方案中，所述抗体还结合IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体不结合IgG3。在一个实施方案中，所述抗体不结合包含λ轻链恒定结构域的IgG1。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
本发明报导的从细胞系DSMACC3006(M-1.3.2)，DSMACC3007(M-1.5.8)和DSMACC3008(M-1.7.10)得到的抗体与例如细胞系DSMACC2708产生的抗体M-R10Z8E9比较时显示了降低的交叉反应性，它们结合Fab区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，并可在免疫测定中混合用于测定Fab治疗抗体，因为每种抗体的结合位点在Fab片段中仅出现1次。
本发明报导的各方面是细胞系DSMACC3006，DSMACC3007和DSMACC3008，以及从所述细胞系得到的各个抗体和这些抗体在免疫测定中的用途。
另一个方面是一种试剂盒，其包含
a)从DSMACC3006，或DSMACC3007，或DSMACC3008，或DSMACC2708得到的抗体的生物素化形式，
b)从DSMACC3006，或DSMACC3007，或DSMACC3008，或DSMACC2708得到的抗体的地高辛化(digoxygenylated)形式。
本发明报导的另一个方面是检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤
a)提供待分析的样品，
b)将所述样品与和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体孵育，
c)任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的试剂孵育，和
d)任选地通过校准曲线将在(b)或(c)中形成的复合物与治疗抗体的浓度相关联。
本发明报导的另一个方面是使用包含捕获抗体和示踪抗体的抗原桥连免疫测定，进行免疫学测定从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其中所述捕获抗体和示踪抗体都独立地选自和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体。
在一个实施方案中，所述免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中，抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由抗体的氨基酸骨架的N-端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、羧基、巯基、羟基和/或酚官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基的化学结合进行。在另外的实施方案中，捕获抗体通过特异性结合对固定。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素缀合并通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。在另一个实施方案中，示踪抗体通过特异性结合对与可检测的标记物缀合。在一个实施方案中，示踪抗体与地高辛缀合并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。在另一个实施方案中，治疗抗体是Fab。在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴(tamarin)、旧大陆猴(oldworldmonkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarfandmouselemur)、长臂猿和小猿(lesserape)、美狐猴(truelemur)家族的成员，以及其杂种。在一个实施方案中，实验动物选自狗、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴。在一个实施方案中，实验动物是猕猴(Macacamonkey)。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体是本发明报导的抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人或人源化抗体。在另一个实施方案中，人或人源化抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，检测总治疗抗体，在另一个实施方案中检测活性治疗抗体，在另一个实施方案中检测与其抗原结合的治疗抗体。
本发明报导的另一个方面是结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和本发明报导的抗体结合相同的表位。在一个实施方案中，所述抗体是本发明报导的抗体。
本发明报导的另一个方面是抗体组合物，其包含由细胞系DSMACC3006、细胞系DSMACC3007、细胞系DSMACC3008和/或细胞系DSMACC2708产生的抗体的混合物。
另一个方面是本发明报导的抗体组合物在本发明报导的方法中的用途。
发明详述
名为M-R10Z8E9的非交叉反应性抗人IgG抗体(从细胞系DSMACC2708中获得)结合G型人免疫球蛋白的CH2结构域中的靠近糖基化位点Asn297的表位。本发明报导的抗体M-1.3.2，M-1.5.8和M-1.7.10与抗体M-R10Z8E9相比显示了降低的交叉反应性，结合Fab区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，且可在免疫测定中混合用于测定治疗抗体，特别是Fab治疗抗体，因为每种抗体的结合位点都在Fab片段中存在。
术语“治疗抗体”表示在临床研究中检测的被批准用作人治疗剂的抗体，且其可对个体施用用于治疗疾病。在一个实施方案中，治疗抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体选自从类人猿(greatape)得到的抗体，从用人抗体基因座转化的动物得到的抗体，人单克隆抗体，或人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体是人源化单克隆抗体。治疗抗体被广泛用于多种疾病的治疗，例如肿瘤疾病(例如血液和实体恶性肿瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和结肠直肠癌)，免疫疾病，中枢神经疾病，血管疾病或传染病。这样的抗体为，例如，针对CD20，CD22，HLA-DR，CD33，CD52，EGFR，G250，GD3，HER2，PSMA，CD56，VEGF，VEGF2，CEA，LevisY抗原，IL-6受体(IL6R)或IGF-1受体(IGF1R)的抗体。
术语“抗体”包含抗体结构的多种形式，包括整个抗体和抗体片段。本发明报导的抗体在一个实施方案中是人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或T细胞抗原耗尽的抗体(T-cellantigendepletedantibody)。例如在Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244；Riechmann，L.，等人，Nature332(1988)323-327；Neuberger，M.S.，等人，Nature314(1985)268-270；Lonberg，N.，Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125中描述了抗体的基因工程。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人抗体和来源于人抗体的部分序列的嵌合抗体。大部分人源化抗体来源于人抗体(接受体抗体)，其中高变区的残基被具有期望的特异性和亲和力的非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的的高变区(供体抗体)的残基替换。有时候，人抗体的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含另外的修饰，例如在接受体抗体或供体抗体中不存在的氨基酸残基。这样的修饰导致这样的接受体或供体抗体的变体，其与相应的亲本序列同源但不同一。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。
大体上，人源化抗体将包含至少一个、通常2个可变结构域的基本全部，其中高变环对应非人供体抗体的高变环，FR的全部或基本全部是人接受体抗体的FR。人源化抗体任选地也包含至少一部分抗体恒定区，通常是人抗体恒定区的一部分。
人源化非人抗体的方法已在领域中描述。在一个实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其一般来自“输入”可变结构域。可基本上遵照Winter及其同事的方法，通过将高变区序列取代为相应的非人抗体的序列进行人源化。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体，其中实质上少于完整的人可变结构域的序列被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些高变区残基和可能有一些框架区残基被来自啮齿类或非人灵长类抗体的类似位点中的残基取代。
本发明使用的术语“单克隆抗体”指从基本均质的抗体群体中得到的抗体，即组成群体的个体抗体是同一的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同抗原位点(决定簇或表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原位点。除了其特异性以外，单克隆抗体的优势在于其合成可不被其他抗体污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得，而不应被视为需要通过任何特定方法产生所述抗体。
本发明使用的术语“实验动物”表示以下灵长目的各科成员，即包含绒猴和绢毛猴(绒猴(Callitrichidae)科)，新大陆猴(卷尾猴(Cebidae)科)，旧大陆猴(猕猴(Cercopithecidae)科，例如猕猴(Macacamonkey))，侏儒狐猴和鼠狐猴(鼠狐猴(Cheirogaleidae)科)，指狐猴(aye-aye)(指猴(Daubentoniidae)科)，婴猴(bushbaby)和夜猴(galago)(婴猴(Galagonidae)科)，长臂猿和小猿(长臂猿(Hylobatidae)科)，马达加斯加大狐猴(indris)，马达加斯加狐猴(sifaka)，和其亲属(大狐猴(Indridae)科)，美狐猴(狐猴(Lemuridae)科)，懒猴(lorise)(懒猴(Loridae)科)，嬉猴(sportivelemur)(嬉猴(Megaladapidae)科)，眼镜猴(tarsier)(眼镜猴(Tarsiidae)科)，及其杂种。
在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、美狐猴各科的成员，及其杂种。在此实施方案中，排除了离人类最近的亲属，类人猿，特别是黑猩猩、倭黑猩猩(bonobo)、大猩猩(gorilla)和猩猩(orangutan)的组。
术语“样品”表示从实验动物移取的任意组织或液体样品。在一个实施方案中，样品可为液体样品如唾液、尿、全血、血浆或血清。在另一个实施方案中，样品将为全血、血浆或血清。
“结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体”将以至少10-9mol/l的解离常数(＝KDiss)，在另一个实施方案中以至少10-10mol/l的KDiss结合治疗抗体。同时通过10-7mol/l或更差的KDiss确保不结合实验动物抗体的性能。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在分别针对实验动物的G型免疫球蛋白和针对人或黑猩猩的G型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少100倍的KDiss差距。
大体上，术语“结合”表示抗体以10-9mol/l或更低的解离常数(＝KD＝KDiss.)，在另一个实施方案中以至少10-10mol/l的KD结合其抗原或相应的抗体受体(看相应的上下文而定)。同时通过10-7mol/l或更高(例如10-5mol/l)的KD确保不结合的性能。在另一个实施方案中，结合第一抗体但不结合第二抗体的抗体在分别针对第一种G型免疫球蛋白和针对第二种G型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少100倍的KD差距。
在一个实施方案中通过在BIAcore仪器上的表面等离子共振评估抗体的结合性能，特别是KDiss。在此方法中，通过表面等离子共振(SPR)的变化评估结合性能。可便利地将研究中的抗体与固相(称为芯片)结合并用于评估单克隆抗体、多克隆抗体或甚至包含IgG的血清与此包被的芯片的结合。
研究中的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体可为单克隆抗体，这样的抗体的片段，以及包含这样的抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保留上述结合治疗抗体但不结合实验动物的抗体的标准的任意抗体片段。
可能必须在临床前研究期间评估与治疗抗体在实验动物中的应用相关的多个方面。在特定设置下，可能与分析存在的治疗抗体的总量相关，或分析治疗抗体的特定片段，或治疗抗体的特定修饰，或与抗原结合的治疗抗体的浓度，或仍然能够结合抗原的治疗抗体的部分(fraction)可能是重要的。在一个实施方案中，本发明报导的抗体和方法可用于分别检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。
术语“总治疗抗体”表示检测的任意抗体，与抗体是否有活性(即仍然可与其抗原反应)、无活性和/或结合抗原无关。
术语“活性治疗抗体”表示在实验动物中存在的仍然能够结合其抗原的治疗抗体。例如，这样的抗体在其抗原结合位点上还未结合其抗原或任意其他分子。
术语“结合抗原的治疗抗体”表示在实验动物的循环中存在的与其抗原结合的治疗抗体。
可使用本发明报导的抗体和方法直接检测如上定义的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。另外，可以检测无活性的治疗抗体的其他形式，例如被抗药物抗体或抗个体基因型抗体或特别是中和抗药物抗体结合的治疗抗体。
另外，也可以间接评估任意“无活性的治疗抗体”。这样的无活性的治疗抗体可为，例如与其抗原结合的治疗抗体，或与交叉反应性抗原结合的治疗抗体，或被针对治疗抗体的自身或抗个体基因型抗体阻断的治疗抗体。如果总抗体量大于活性抗体和结合抗原的抗体的和，将存在包含未与其相应抗原结合的无活性抗体的另外一部分抗体。
可在例如所谓的竞争免疫测定系统或在所谓的夹心型测定系统中检测总治疗抗体。这样的测定可在一个不含洗涤步骤的实施方案(均质免疫测定)中进行，或在含有洗涤步骤的另一个实施方案(异质免疫测定)中进行。
在一个实施方案中，在夹心型免疫测定中检测总治疗抗体，其中结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在这样的夹心测定的两侧使用。在这样的夹心的一侧使用的抗体与固相结合或能够与固相结合(通常被称为捕获抗体)，而在这样的夹心的另一侧的抗体以便于直接或间接检测的方式被标记(所谓的检测抗体)。在这样的夹心测定程序中结合的检测抗体的量与所研究的样品中的治疗抗体的量直接相关。
可通过方便的现有技术程序实现样品中的活性治疗抗体的检测。然而，总治疗抗体或与其抗原结合的治疗抗体的部分的检测相当复杂，并且需要相当不同的测定设置，特别是需要定制的试剂用于每个不同的测定。使用本发明报导的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，可以在彼此类似的检测系统中评估活性治疗抗体、总治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的部分。当在这些治疗抗体的不同部分之间进行定量比较时，此类总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的比较测定应当具有优势。
在一个实施方案中，设置夹心型测定形式用于检测活性治疗抗体。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体被用作捕获抗体，且这样的夹心测定的检测侧使用标记形式的抗原，或在结合抗原后使用不结合或不竞争结合治疗抗体识别的表位的第二抗体，其中所述第二抗体是可特异性检测的和/或以便于直接或间接检测的方式被标记。
在一个实施方案中以夹心型测定的形式检测结合抗原的治疗抗体，使用结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体作为捕获试剂。在一个实施方案中在检测中使用在不与治疗抗体的表位竞争的表位上结合抗原的第二抗体。在一个实施方案中以便于直接或间接检测的方式标记第二抗体。
为了直接检测，标记组可选自任意已知的可检测的标记组，例如染料、发光标记组如化学发光组，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetane)，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵(resorufin)、青色素及其衍生物。标记组的另外实例是发光金属复合物，例如钌或铕复合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定)，和放射性同位素。在信号发射组的一个实施方案中也使用可通过电子化学发光检测的金属螯合物作为可检测的标记物，特别优选钌螯合物。在一个实施方案中，标记组是钌(联吡啶)3 2+螯合物。
间接检测系统包含，例如检测试剂，例如用结合对的第一配偶体标记的检测抗体。合适的结合对的实例是半抗原或抗原/抗体，生物素或生物素类似物例如氨基生物素、亚氨基生物素(iminobiotin)或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素，糖/凝集素，核酸或核酸类似物/互补核酸，和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。在一个实施方案中，第一结合对成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，半抗原选自地高辛和生物素及其类似物。这样的结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉抗生物素等通常被标记以允许直接检测，例如通过如上所述的标记物标记。
在所有上述免疫检测方法中，选择允许使用的试剂结合的试剂条件，例如用于抗体与其相应抗原的结合。熟练技术人员使用术语复合物表示这样的结合的结果。通过现有技术程序将在本发明报导的测定方法中形成的复合物与治疗抗体的相应浓度相关联。可通过例如使用本发明报导的方法在相应的复合物的稀释系列中制备和测定复合物，并将得到的结果与各个复合物成分的浓度相关联进行这样的关联。取决于使用的检测试剂，此关联步骤将得到总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度。
熟练技术人员将理解，本发明报导的方法将不仅仅显示总治疗抗体、结合抗原的治疗抗体、活性治疗抗体或甚至无活性治疗抗体的浓度。由于使用一种相同试剂，即结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，在不同测定中得到的值可容易地彼此比较并甚至评估其比率。在另一个实施方案中，本发明涉及活性治疗抗体与总治疗抗体的比率。此比率将作为治疗抗体效力的指示。
在实验过程中发现，在所有类型的人和黑猩猩G型抗体上存在的一个或多个表位在任何实验动物的抗体上都不存在。此表位的特征在于，其结合由保藏的细胞系DSMACC3006，DSMACC3007，DSMACC3008产生的抗体。因此，本发明报导的一个方面是由细胞系DSMACC3006，DSMACC3007或DSMACC3008产生的抗体。
由于3种保藏的细胞系识别的表位在抗体的Fab区中是唯一的，本发明报导的另一个方面是与从保藏的细胞系DSMACC3006，DSMACC3007，DSMACC3008得到的抗体结合的表位。在本发明报导的一个方面中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体的特征在于，所述抗体是与由细胞系DSMACC3006，DSMACC3007，DSMACC3008产生的抗体之一结合相同表位的抗体。
例如，可使用如下方法，其中在竞争检测系统的帮助下测定结合相同靶抗原的2种抗体的表位重叠。为此，例如在酶免疫测定的帮助下，检测研究中的抗体与已知抗体竞争结合固定的靶抗原的程度，例如使用由本发明报导的细胞系之一产生的抗体。为此，适当固定的靶抗原与标记形式的已知抗体和过量的所检测的抗体孵育。通过检测结合的标记可容易地确定所研究的抗体可在多大程度上置换结合的已知抗体。如果在相同的浓度下存在超过20％的置换，在另一个实施方案中超过30％的置换，或在更高的浓度下，在一个实施方案中在研究中的抗体相对已知抗体过量103-105-倍的情况下，存在超过70％的置换，在另一个实施方案中超过80％的置换，则存在表位重叠且两种抗体结合相同的表位或相同表位的重叠部分。
可在使用各个抗体的生物素化和地高辛化变体和来自不同物种的血清的夹心ELISA中显示从保藏的细胞系DSMACC3006，DSMACC3007，和DSMACC3008得到的抗体的特异性。在测定中(见图1)，从相同的细胞系得到结合同一表位的捕获和检测抗体。为了作为通用测定用于检测和定量实验动物血清中的人IgG，这样的测定需要抗人IgG抗体，其结合位点独立于任何次级抗体修饰，例如糖基化或脱酰胺。否则，必须对每种待检测和定量的治疗抗体优化测定。此外，本发明报导的每种抗人IgG抗体也不同于分析的治疗抗体并可被用作参考标准和阳性对照。用此测定得到的特异性结果显示在图2中。
可以看到，本发明报导的抗体对人和黑猩猩G型免疫球蛋白的免疫球蛋白高度特异，并显示了比抗体M-R10Z8E9更好的特异性，且不结合实验动物的G型免疫球蛋白。实验动物的所有值都远低于用不存在过氧化物酶的ABTS得到的空白值。
也可在使用BIAcore技术的表面等离子共振实验中显示本发明报导的抗体的特异性。在图3a)至c)中显示了抗体M-1.7.10(从DSMACC3008得到)、M-1.3.2(从DSMACC3006得到)和M-1.5.8(从DSMACC3007得到)的BIAcore图表，从中可以看出抗体对人和黑猩猩G型免疫球蛋白是特异的。
通过使用点印迹实验显示，本发明报导的抗体结合的表位是构象表位，因为在变性的人免疫球蛋白上结合消失(图4)。
本发明报导的另一个方面是用于定量从实验动物获得的样品中的人抗体或其衍生物例如Fab片段的测定，所述测定包括本发明报导的生物素化抗体作为捕获抗体和本发明报导的地高辛化抗体作为示踪抗体。在图5中，显示了使用本发明报导的代表性抗体的此测定的图解测定设置和校准曲线(捕获抗体：生物素化M-1.7.10，分析物：人抗IL13Rα1抗体的Fab片段，示踪抗体：地高辛化M-1.3.2)。此测定需要在2个不同的表位上结合人IgG的Fab片段的捕获和示踪抗体。本发明报导的抗体至少部分结合人或黑猩猩的G型免疫球蛋白抗体的轻链恒定区，并因此适用于此测定。
本发明报导的另一个方面是一种测定，其包括特异性结合人IgG的不同结构域上的表位的捕获和示踪抗体。在此测定中，只有完整的治疗抗体将导致阳性测定结果和可检测的信号。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体一方面独立地选自本发明报导的抗体，另一方面独立地选自抗体M-R10Z8E9。在根据用于证明在实验动物中的人IgG的结构完整性的此方面的代表性测定中，使用生物素化M-R10Z8E9作为捕获抗体，抗IL13Rα1抗体作为分析物，地高辛化M-1.3.2作为示踪抗体(在图6中显示了此测定的图解测定设置和校准曲线)。
本发明报导的另一个方面是一种测定，其中使用抗人IgG抗体作为参考标准和/或阳性对照，以模拟抗药物抗体(ADA)。这在找出最佳测定条件和检测测定的稳健性，即用不同的标准试剂/阳性对照检查测定性能的测定开发中可能有用。考虑到ADA将是多克隆的并可能针对Fab片段和Fc部分二者的事实，此设置特别有利。
在本发明报导的另一个方面，在本发明报导的方法中使用从细胞系DSMACC3006，DSMACC3007和DSMACC3008得到的抗体之一作为结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体。
本发明报导的另一个方面涉及结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途。在一个实施方案中，在这样的方法中使用的抗体结合选自与从细胞系DSMACC3006，DSMACC3007或DSMACC3008得到的抗体之一所识别的相同表位或重叠的表位。
本发明报导的另一个方面涉及2种都结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途，其中一种抗体是捕获抗体，另一种抗体是示踪抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是Fab片段。
可选地，本发明报导的抗体可在包含单个免疫球蛋白类型的参考免疫球蛋白作为一部分的缀合物中使用。参考免疫球蛋白提供免疫球蛋白类型特异性恒定区，其可被抗免疫球蛋白类型抗体，例如抗人免疫球蛋白G抗体特异性结合。因此，参考免疫球蛋白提供了例如具有免疫球蛋白类型特异性标签的缀合物，其可被标签特异性抗体特异性识别。例如，如果标签是免疫球蛋白G恒定区，标签特异性抗体则是抗免疫球蛋白G抗体。这样的缀合物可在免疫测定中用作标准物或在免疫测定中用作阳性对照。
在本发明报导的方法中，也可使用不同的捕获分子，例如完整抗体、F(ab’)2片段、Fab片段或甚至单链抗体。
本发明报导的分别表达抗体M-1.3.2，M-1.5.8和M-1.7.10的优选的杂交瘤细胞系MAK<H-IgG>M-1.3.2，MAK<H-IgG>M-1.5.8，MAK<H-IgG>M-1.7.10在用于专利程序目的的国际认可的微生物保藏的布达佩斯条约下保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)，Germany)：
细胞系 保藏号 保藏日期
MAB<h-Fcγ>M-R10Z8E9 DSM ACC2708 22.12.2004
MAK<H-IgG>M-1.3.2 DSM ACC3006 24.09.2009
MAK<H-IgG>M-1.5.8 DSM ACC3007 24.09.2009
MAK<H-IgG>M-1.7.10 DSM ACC3008 24.09.2009
细胞系和从所述细胞系得到的抗体是本发明报导的方面。
如WO2006/072564中报导的针对IL13受体α1蛋白的抗体(抗IL13Rα1抗体)，如WO2005/023872中报导的针对IL-1R受体的抗体(抗IL-1R抗体)，如WO2003/070760或US2005/0169925中报导的针对淀粉样蛋白β-A4肽的抗体(抗Aβ抗体)，如WO2005/100402或US2005/0226876中报导的针对人P-选择素糖蛋白的抗体(抗P-选择素抗体)，如WO2004/096274报导的针对IL-6受体的抗体(抗IL6R受体)，和如WO2004/087756或WO2005/005635中报导的针对IGF-1受体的抗体(抗IGF-1R抗体)(都引入本发明作为参考)示例了本发明报导的方法。
提供了以下实施例和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在随附的权利要求书中陈述。应当理解，可以在陈述的程序中进行修改而不背离本发明的精神。
附图描述
图1定量实验动物中的人抗体(人IgG)的完全通用测定：a)测定形式；b)捕获和检测试剂：抗体M-R10Z8E9；c)捕获和检测试剂抗体M-1.7.10；治疗抗体：空心三角形：抗IL13Rα1抗体，空心方块：抗Aβ抗体，实心方块：抗IL1R抗体，实心三角形：抗IL6R抗体。
图2使用本发明报导的抗体的测定得到的结果：使用的抗体从左到右为：M-R10Z8E9，M-1.3.2，M-1.5.8，M-1.7.10。
图3本发明报导的抗体a)M-1.3.2，b)M-1.5.8，和c)M-1.7.10的代表性表面等离子共振图。
图4抗人IgG抗体的点印迹；选择针对P-选择素的抗体作为代表性参考抗体；在硝酸纤维素膜上点上天然(左栏)和变性形式(右栏)的参考抗体并通过相应的地高辛化抗-人IgG抗体检测；a)M-R10Z8E9，b)M-1.3.2，c)M-1.5.8，d)M-1.7.10。
图5定量从实验动物获得的样品中的人抗体衍生物的测定：a)图解测定设置，b)校准曲线。
图6用于证明在实验动物中的人IgG的结构完整性的测定：a)图解测定设置，b)校准曲线。
图7选择对食蟹猴血清无可检测的交叉反应性的抗体。
实施例1
人IgG的F(ab’)2片段(免疫原)的制备
将在100mM柠檬酸钠缓冲液，pH3.7中的全长人G型抗体(人IgG)与胃蛋白酶孵育(1μg胃蛋白酶/mgIgG)。通过分析型凝胶过滤分析片段化并在90分钟后通过加入磷酸钾将pH值调节为6.5终止反应。将混合物对10mM含10mM氯化钠的柠檬酸钠缓冲液，pH5.5透析后，将溶液应用于SP-琼脂糖层析柱，并通过分析型凝胶过滤分别分析在盐梯度中洗脱的分离的组分。将包含抗体F(ab’)2片段的合并组分应用于具有固定的针对人Fcγ的多克隆抗体的亲和基质，以去除痕量Fcγ片段。合并流出液，浓缩至约16mg/ml和最终应用于凝胶过滤柱(Superdex200)。
实施例2
单克隆抗人IgG抗体的产生
a)小鼠的免疫
用混合CFA(完全弗氏佐剂)的根据实施例1制备的100μg抗体F(ab’)2片段腹膜内分别初次免疫8-12周龄的雌性NMRI小鼠。在6和10周后进行另外2次腹膜内免疫步骤，每次使用混合IFA(不完全弗氏佐剂)的100μg抗体F(ab’)2片段/小鼠。之后，在融合前3天进行静脉内加强免疫，每次使用50μg在PBS(磷酸缓冲液)中的抗体F(ab’)2片段。
b)融合和克隆
根据Galfré和Milstein(Galfré，G.和Milstein，C，MethodsEnzymol.73(1981)3-46)融合根据a)免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞。将约2.1x108脾细胞与4.2x107骨髓瘤细胞(P3x63-Ag8.653，ATCCCRL1580)混合并离心(300xg和4℃下10分钟)。然后用不含FCS(胎牛血清)的RPMI1640培养基洗1次细胞，然后在50ml尖底瓶中以400xg再次离心。然后，加入1mlPEG(聚乙二醇，分子量4,000g/mol)，通过吹吸进行混合。在37℃水浴1分钟后，逐滴加入5ml不含FCS的RPMI1640，混合悬浮液，加入含有10％(v/v)FCS的RPMI1640至50ml的终体积，然后离心。在含有10％FCS的RPMI1640中重悬沉淀的细胞，然后置于含有生长因子重组鼠白介素6(Peprotech，0.5ng/ml)的次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(100mmol/l次黄嘌呤，1μg/ml重氮丝氨酸，在含有10％FCS的RPMI1640中)中。11天后，测定原代培养物的特异性抗体合成(见实施例3)。通过使用流式细胞仪(FACSAria，BDBiosciences)在含有生长因子重组鼠白介素6(Peprotech，0.5ng/ml)的培养基中将单细胞置于96孔细胞培养板中将展示结合生物素化抗体F(ab′)2片段以及生物素化人正常IgG的原代培养物个体化。按照此方案，得到细胞系DSMACC3006，DSMACC3007和DSMACC3008。抗体M-1.7.10是IgG2a类，抗体M-1.5.8和M-1.3.2是IgG1类。
c)免疫球蛋白的产生
以1.0x105和2.2x105细胞/ml的初始细胞密度(活细胞)在补充10％FCS和通常使用的补充物的RPMI1640中接种在b)中得到的杂交瘤细胞系，并在细胞培养瓶(T-flask)(Celline，IBS)中扩增约3周的时间。在收获的培养上清中得到浓度在0.7mg/ml和1.5mg/ml之间的单克隆抗体。根据标准蛋白质化学方法，例如在Bruck，C.，等人，MethodsEnzymol.121(1986)587-596中报导的方法从培养上清中进行抗体的纯化。
实施例3
用于检测抗人IgG抗体的筛选测定
a)初次筛选与人IgG结合的抗体
为了测定杂交瘤细胞培养上清中的抗体的特异性，分别用在补充1％(w/v)BSAII的PBS中生物素化人源化IgG(用于免疫过程，250ng/ml)或生物素化人IgG(250ng/ml)包被用重组链霉抗生物素(MicroCoat，Bernried，lotMC1098)预包被的MTP(微滴定板)(100μl/孔，在室温孵育60分钟，同时摇晃)，随后用0.9％(w/v)NaCl/0.05％Tween20洗三次。下一步，每孔加入100μl待测定的抗体溶液(培养上清)，并在室温孵育60分钟，同时摇晃。在每孔用0.9％(w/v)NaCl/0.05％Tween20洗三次的步骤后，加入100μl辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗小鼠Fcγ抗体的F(ab′)2片段以检测结合的样品抗体，并在室温孵育60分钟，同时摇晃。之后，如上进行洗涤。最后，每孔加入100μlABTS(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany；货号1684302)。在室温孵育30分钟后，在市售的微滴定板ELISA读取器中在405和492nm[405/492]处测量消光(OD)。此筛选得到与人源化IgG以及人IgG结合良好的抗体的选择。对这样选择的抗体进一步进行测定b)。
b)选择对其他物种的IgG具有最低交叉反应性的抗体
第一步，使生物素化人IgG结合用链霉抗生物素包被的微滴定板(SA-MTP)的孔。通过洗涤去除过量的未结合的抗体。然后在缓冲液和10％食蟹猴血清中稀释样品和参考标准(例如，实施例2中得到的抗人IgG抗体)。将稀释的样品加入板并在室温孵育60分钟，同时摇晃。在洗去未结合的物质后，对板中的孔加入地高辛形式的第一步中的人IgG并再孵育60分钟。在洗涤后，用抗地高辛抗体-HRP缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体-酶缀合物的HRP(辣根过氧化物酶)催化ABTS底物的显色反应。通过ELISA读取器在405nm波长处测量信号(参考波长：490nm)。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
选择了在食蟹猴血清和缓冲液中具有高测定反应的抗体(见图7)。此第二次筛选得到对其他物种的IgG具有最低交叉反应性的与人IgG结合良好的抗体的选择。
实施例4
通过表面等离子共振评估抗体结合/特异性
用BIAcoreT100仪器使用CM5芯片进行所有测量。通过标准胺偶联实现抗体对此芯片的包被。除非另外指出，在HBS缓冲液(HEPES，NaCl，pH7.4)中在25℃下进行所有孵育。通过胺偶联在CM-5芯片的一个流动池上固定饱和量的多克隆山羊抗小鼠Fcγ抗体。随后，以30μl/分钟的流速注入不同的针对人IgG的单克隆小鼠抗体60秒并与抗小鼠Fc抗体结合。在HBS缓冲液中稀释所有动物血清。通过以30μl/分钟的流速注入1∶100稀释的血清并孵育60秒分析结合。通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面180秒测量解离。使用来自BIAcore的BIA评估软件用1∶1的Langmuir拟合模型计算解离常数值(＝KD)。用于所有动物血清，此计算基于IgG水平是15mg/ml的假设。选择开始注入检测抗体后80秒的信号值用于比较结合的IgG的量(见表1)。
表1：动物血清结合不同单克隆抗人IgG抗体的结合信号[RU]和KD值
表1显示，3种抗人IgG抗体不与除了黑猩猩以外的其他物种的血清交叉反应。相反地，对M-R10Z8E9检测到与狗和绒猴的另外的相互作用。
实施例5
a)小鼠单克隆抗人IgG抗体的纯化
将在实施例2中得到的细胞系的发酵上清浓缩约10倍并转移至含有20mMTRIS，1M硫酸铵，pH9.0的缓冲液中，然后应用于蛋白质A-琼脂糖凝胶层析柱。用0.2M柠檬酸钠，0.2M硫酸铵在pH5.0得到的洗脱液针对磷酸缓冲液，pH7.5透析。使用针对牛IgG的固定的抗体通过免疫吸附分离牛IgG污染物(来自发酵液中的FCS)。
b)生物素化抗人IgG抗体的制备
将在磷酸缓冲液，pH8.5中的a)中得到的抗人IgG抗体调整为约5mg/ml的蛋白质浓度。在DMSO中溶解D-生物素-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺并以1∶5的摩尔比例加入抗体溶液。在60分钟后通过加入L-赖氨酸终止反应，并通过对50mM具有150mMNaCl的pH7.5的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
c)地高辛化抗人IgG抗体的制备
将在磷酸缓冲液，pH8.5中的a)中得到的抗人IgG抗体调整为约5mg/ml的蛋白质浓度。在DMSO中溶解地高辛3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺并以1∶4的摩尔比例加入抗体溶液。在60分钟后通过加入L-赖氨酸终止反应，并通过对50mM具有150mMNaCl的pH7.5的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
实施例6
用于定量来自实验动物的样品中的人抗体(人IgG)的完全通用测定
在第一步中，生物素化抗体M-R10Z8E9(板1)或抗体M-1.7.10(板2)与链霉抗生物素包被的微滴定板(SA-MTP)结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入浓度系列的掺在食蟹猴血清中的样品/标准物，例如抗IL1R抗体、抗IL13Rα1抗体、抗Aβ抗体和抗-IL6R抗体并在室温下孵育60分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入100μl地高辛化抗体M-R10Z8E9(板1)或抗体M-1.7.10(板2)。洗涤后，用抗地高辛抗体-HRP缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值(见图1)。
表2：捕获和检测试剂抗体M-R10Z8E9的OD数据
表3：捕获和检测试剂抗体M-1.7.10的OD数据
实施例7
用于定量来自实验动物的样品中的人抗体衍生物(例如Fab片段)的测定
在第一步中，生物素化抗体M-1.7.10与链霉抗生物素包被的微滴定板(SA-MTP)结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对孔加入掺在食蟹猴血清中的样品/标准物，例如抗IGF1R抗体Fab片段并在室温下孵育60分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板的每个孔加入100μl地高辛化抗体M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体-HRP缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值(见图5)。
表4：OD数据
ng/ml OD 405nm SD
0.00 0.042 0.000
1.56 0.047 0.000
3.13 0.057 0.002
6.25 0.103 0.001
12.50 0.247 0.016
25.00 0.694 0.007
50.00 1.535 0.043
100.00 1.882 0.013
实施例8
证明来自实验动物的样品中的人IgG的结构完整性的测定
在第一步中，针对人Fc的生物素化抗体M-R10Z8E9与链霉抗生物素包被的微滴定板(SA-MTP)结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入掺在食蟹猴血清中的样品/标准物，例如抗IL13Rα1抗体，并在室温下孵育60分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入100μl地高辛化抗体M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体-HRP缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值(见图3)。
表5：OD数据
实施例9
用于定量来自实验动物的样品中的人抗体(人IgG)的测定，使用Fc融合蛋白(抗原)组合本发明报导的抗人IgG抗体
人受体X的可溶性胞外结构域与人IgG1型的Fc片段融合。在第一步中，生物素化融合蛋白(Bi-X-Fc)与链霉抗生物素包被的微滴定板(SA-MTP)结合。通过洗涤去除过量的未结合受体。之后，掺在食蟹猴血清中的抗X抗体与固定的人受体X结合。在洗掉未结合的物质后，用a)针对人Fc片段的地高辛化的单克隆抗体(抗体M-R10Z8E9)或用b)针对人Fab片段的地高辛化的单克隆抗体(抗体M-1.7.10)检测结合的抗X抗体，然后与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
实施例10
点印迹——构象对线性表位
为了测定抗人IgG抗体检测的是构象表位还是线性表位，进行了点印迹分析。
在此试验中，将天然或变性形式的抗原-蛋白(人IgG)点在硝酸纤维素膜上。为了得到变性形式，在振动器上在37℃下过夜孵育抗原-蛋白与SDS。将2种形式以浓度系列点在膜上。在膜完全干燥后，用封闭缓冲液(Roti-Block，Roth，Germany)在室温封闭表面60分钟，同时摇晃。在洗涤膜后，将其与包含地高辛化抗体M-R10Z8E9或3种不同抗体M-1.3.2，M-1.5.8或M-1.7.10之一的溶液孵育。洗涤后，用抗地高辛抗体-HRP缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体-酶缀合物的HRP催化BM-BLUE底物的显色反应。可直接目测控制信号并用扫描仪捕获。
实施例11
通过桥连ELISA测定评估抗体结合/特异性
为了测定研究的抗人抗体结合的是哪类人IgG亚类，进行桥连ELISA分析。
在第一步中，生物素化抗体M-R10Z8E9，M-1.3.2，M-1.5.8和M-1.7.10与链霉抗生物素微滴定板结合。在第二步中，孵育不同亚类的人IgG抗体。制备稀释系列的人IgG1κ；人IgG1λ；人IgG4；嵌合人IgG1；人IgG2(多克隆纯化的人IgG2)和人IgG3(多克隆纯化的人IgG3)，并在用生物素化抗人抗体包被的链霉抗生物素微滴定板上孵育。在洗涤步骤后，以地高辛化形式使用用于包被的相同抗体作为检测抗体。这表示使用相同的抗人抗体克隆用于包被和检测。例如，用M-1.7.10Bi包被一块板并使用M-1.7.10Dig检测。在孵育和洗涤步骤后，此步骤之后是与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
表6：桥连ELISA分析的总结

Claims (16)

1.细胞系DSMACC3008。
2.从根据权利要求1的细胞系得到的抗体。
3.根据权利要求2的抗体在免疫测定中的用途，其中所述用途不用于治疗或诊断目的。
4.试剂盒，其包含
a)从细胞系DSMACC3008得到的抗体作为捕获试剂，
b)从细胞系DSMACC3008得到的抗体作为检测试剂。
5.检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤
a)提供待分析的样品，
b)将所述样品与根据权利要求2的抗体进行孵育，和
c)将在b)中形成的复合物与所述治疗抗体的浓度相关联，
其中所述方法不用于治疗或诊断目的。
6.检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤
a)提供待分析的样品，
b)将所述样品与根据权利要求2的抗体进行孵育，
c)将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的试剂孵育，和
d)将在c)中形成的复合物与所述治疗抗体的浓度相关联，
其中所述方法不用于治疗或诊断目的。
7.使用抗原桥连免疫测定对从实验动物得到的样品中的治疗抗体进行免疫学测定的方法，所述抗原桥连免疫测定包含捕获抗体和示踪抗体，特征在于所述捕获抗体和所述示踪抗体都独立地选自根据权利要求2的抗体，其中所述方法不用于治疗或诊断目的。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述免疫测定是夹心免疫测定。
9.根据权利要求7或8中任一项的方法，其特征在于所述捕获抗体与生物素缀合，并通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。
10.根据权利要求7或8中任一项的方法，其特征在于所述示踪抗体与地高辛缀合，并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。
11.根据权利要求5至8中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是Fab。
12.根据权利要求5至8中任一项的方法，其特征在于所述实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、美狐猴家族的成员，以及其杂种。
13.根据权利要求5至8中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是人或人源化抗体。
14.结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体为根据权利要求2的抗体，其中所述用途不用于治疗或诊断目的。
15.抗体组合物，其特征在于包含由细胞系DSMACC3008产生的抗体的混合物。
16.根据权利要求15的抗体组合物在根据权利要求5至13中任一项的方法中的用途，其中用权利要求15的抗体组合物代替权利要求2的抗体，其中所述用途不用于治疗或诊断目的。
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