JP2013508700A - 非交差反応性抗IgG抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
1974年にKoehlerとMilsteinが最初のモノクローナル抗体を開発して以来、ヒトの治療に適した抗体の開発に多くの努力が注がれてきた。利用可能になった最初のモノクローナル抗体はマウスとラットで開発されたものであった。過去10年間で、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体は数が増え続けており、市販されるに至っている。よく知られた例として、例えば、F. Hoffmann-La Roche AG (バーゼル)からのHerceptin(登録商標)およびMabThera(登録商標)が挙げられる。
a)ビオチン化形態の、細胞株DSM ACC3006、またはDSM ACC3007、またはDSM ACC3008、またはDSM ACC2708から得られる抗体;
b)ジゴキシゲニン化形態の、細胞株DSM ACC3006、またはDSM ACC3007、またはDSM ACC3008、またはDSM ACC2708から得られる抗体。
a)分析されるサンプルを提供する工程;
b)前記サンプルを、本明細書で報告する抗体と同じエピトープに結合する抗体と共にインキュベートする工程;
c)任意で、前記サンプルを、総治療用抗体、活性な治療用抗体、または抗原に結合した治療用抗体の選択的検出に適する試薬と共にインキュベートする工程;および
d)(b)または(c)で形成された複合体を、任意で検量線を用いて、治療用抗体の濃度に相関させる工程。
M-R10Z8E9と称される非交差反応性の抗ヒトIgG抗体(細胞株DSM ACC2708から得られる)は、グリコシル化部位Asn297の近くにある、クラスGのヒト免疫グロブリンのCH2ドメイン中のエピトープと結合する。本明細書で報告する抗体M-1.3.2、M-1.5.8およびM-1.7.10は、抗体M-R10Z8E9と比較して、低減した交差反応性を示し、Fab領域中の異なるエピトープに結合し、隣接するグリコシル化部位によって影響されず、かつ抗体のそれぞれの結合部位がFabフラグメント中に存在するので、治療用抗体、特にFab治療用抗体を決定するためのイムノアッセイにおいて混在させることができる。
ヒトIgGのF(ab')2フラグメント(免疫原)の調製
100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH3.7中のクラスGの全長ヒト抗体(ヒトIgG)をペプシン(IgG 1mgあたり1μgのペプシン)と共にインキュベートした。フラグメント化は、分析用ゲル濾過により分析し、リン酸カリウムの添加によりpH値を6.5に調整することによって90分後に停止させた。その混合物を、10mM塩化ナトリウムを含む10mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH5.5に対して透析した後、その溶液をSP-セファロースクロマトグラフィーカラムにアプライし、塩勾配で溶出された分離画分を分析用ゲル濾過で個別に分析した。抗体F(ab')2フラグメントを含有するプールは、微量のFcγフラグメントを除くために、ヒトFcγに対するポリクローナル抗体を固定化させたアフィニティーマトリックスにアプライした。フロースルー画分をプールし、約16mg/mlに濃縮し、最後にゲル濾過カラム(Superdex 200)にアプライした。
モノクローナル抗ヒトIgG抗体の作製
a)マウスの免疫化
8〜12週齢の雌NMRIマウスに、実施例1に従って調製した100μgの抗体F(ab')2フラグメントをCFA(完全フロイントアジュバント)と混合して用いて、腹腔内一次免疫をそれぞれ施した。さらに2回の腹腔内免疫化ステップを6週間および10週間後に行ったが、それぞれ、マウスあたり100μgの抗体F(ab')2フラグメントをIFA(不完全フロイントアジュバント)と混合して用いた。続いて、静脈内追加免疫を、それぞれPBS(リン酸緩衝生理食塩水)中の50μgの抗体F(ab')2フラグメントを用いて、融合の3日前に行った。
a)に従って免疫したマウスの脾細胞をGalfreおよびMilstein(Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46)に従ってミエローマ細胞と融合させた。約2.1×108個の脾細胞を4.2×107個のミエローマ細胞(P3x63-Ag8.653、ATCC CRL1580)と混合して遠心分離した(300×g、4℃で10分)。その後、細胞をFCS(ウシ胎児血清)不含の培養培地RPMI 1640で1回洗浄し、先の尖った50mlバイアル中で400×gで再度遠心分離した。その後、1mlのPEG(ポリ(エチレングリコール)、分子量4,000g/mol)を加えて、ピペッティングにより混合を行った。37℃の水浴中で1分後、5mlのFCS不含RPMI 1640を滴下し、その懸濁液を混合し、10%(v/v)FCS含有RPMI 1640を加えて最終容量50mlとし、その後遠心分離した。沈降した細胞を10%FCS含有RPMI 1640中に再懸濁し、増殖因子である組換えマウスインターロイキン6(Peprotech社、0.5ng/ml)を含むヒポキサンチン-アザセリン選択培地(10%FCS含有RPMI 1640中の100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリン)にまいた。11日後、一次培養物を特異的抗体の合成についてアッセイした(実施例3参照)。ビオチン化ヒトノーマルIgGへの結合だけでなくビオチン化抗体F(ab')2フラグメントへの結合を示す一次培養物は、増殖因子組換えマウスインターロイキン6(Peprotech社、0.5ng/ml)を含む培地中でフローサイトメーター(FACSAria、BD Biosciences社)を使って、96ウェル細胞培養プレートへの単一細胞の沈着によって個別化した。このプロトコルに従うことによって、細胞株DSM ACC3006、DSM ACC3007およびDSM ACC3008が得られた。抗体M-1.7.10はIgG2aクラスのものであり、抗体M-1.5.8およびM-1.3.2はIgG1クラスのものである。
b)で得られたハイブリドーマ細胞株は、10%FCSおよびよく用いられる栄養補助剤を添加したRPMI 1640中に1.0×105〜2.2×105個/mlの初期細胞密度(生細胞)で接種し、T-フラスコ(Celline、IBS社)で約3週間かけて増やした。回収した培養上清中に、0.7mg/ml〜1.5mg/mlの濃度のモノクローナル抗体が得られた。培養上清からの抗体の精製は、例えばBruck, C, et al, Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596に報告されるような、標準的なタンパク質化学的方法により行った。
抗ヒトIgG抗体を検出するためのスクリーニングアッセイ
a)ヒトIgGに結合する抗体の一次スクリーニング
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を調べるため、組換えストレプトアビジンをプレコートしたMTP(マイクロタイタープレート)(MicroCoat社、Bernried、ロットMC 1098)に、1%(w/v)BSA IIを添加したPBS中の、免疫化の過程で用いた250ng/mlのビオチン化ヒト化IgG、または250ng/mlのビオチン化ヒトIgGをコートし(100μl/ウェル、振とうしながら周囲温度で60分インキュベーション)、その後0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20を用いて3回洗浄した。次のステップで、ウェルあたり100μlのアッセイすべき抗体溶液(培養上清)を添加し、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20を用いた3回の洗浄ステップ後、結合したサンプル抗体の検出のために、ウェルあたり100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、ポリクローナルヒツジ抗マウスFcγ抗体のF(ab')2フラグメントを添加して、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。続いて、洗浄を上記のように行った。最後に、ウェルあたり100μlのABTS(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ;カタログ番号1684302)を加えた。周囲温度で30分のインキュベーション後、吸光度(OD)を市販のマイクロタイタープレートELISAリーダーで405および492nm[405/492]にて測定した。このスクリーニングは、ヒトIgGにだけでなくヒト化IgGにも結合する抗体の選択につながった。この抗体選択物をアッセイb)にさらに供した。
ビオチン化ヒトIgGを、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート(SA-MTP)のウェルに最初のステップで結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄により除去した。その後、サンプルおよび参照基準(例えば、実施例2で得られた抗ヒトIgG抗体)を緩衝液および10%カニクイザル血清で希釈した。希釈サンプルをプレートに添加して、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。未結合物質を洗い流した後、ジゴキシゲニン化形態の最初のステップのヒトIgGをプレートのウェルに添加して、さらに60分間インキュベートした。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化抗体を抗ジゴキシゲニン抗体-HRPコンジュゲートで検出した。抗体-酵素コンジュゲートのHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)はABTS基質の呈色反応を触媒する。そのシグナルはELISAリーダーで波長405nm(参照波長:490nm)にて測定される。各血清サンプルの吸光度値を3回反復して決定した。
表面プラズモン共鳴による抗体結合/特異性の評価
すべての測定は、CM5チップを使用して、BIAcore(登録商標)T100装置で行った。このチップへの抗体のコーティングは標準的なアミンカップリングによって達成された。他に指定のない限り、すべてのインキュベーションはHBS-緩衝液(HEPES, NaCl, pH7.4)中25℃で行った。飽和量のポリクローナルヤギ抗マウスFcγ抗体をアミンカップリングによってCM5チップの1つのフローセル上に固定化した。続いて、ヒトIgGに対する異なるモノクローナルマウス抗体を30μl/分の流量で60秒間注入し、抗マウスFc抗体によって結合させた。すべての動物血清はHBS緩衝液で希釈した。結合は、1:100に希釈した血清の注入および30μl/分の流量での60秒間のインキュベーションにより分析した。解離は、チップ表面をHBS緩衝液で180秒間洗浄することによって測定した。BIAcore(登録商標)からのBIAevaluation Softwareを用いて、解離定数値(=KD)を1:1 Langmuir適合性モデルにより計算した。すべての動物血清の場合、この計算は、IgGレベルが15mg/mlであるという仮定に基づいていた。試験抗体の注入を開始してから80秒後のシグナル値が、結合したIgG量の比較のために選ばれた(表1参照)。
a)マウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体の精製
実施例2で得られた細胞株の発酵上清を約10倍濃縮し、20mM TRIS、1M硫酸アンモニウムを含む緩衝液pH9.0に移して、プロテインA-セファロースクロマトグラフィーカラムにアプライした。0.2Mクエン酸ナトリウム、0.2M硫酸アンモニウム、pH5.0で得られた溶出液をリン酸緩衝液pH7.5に対して透析した。ウシIgGの混入物質(発酵ブロス中のFCS由来)は、固定化したウシIgGに対する抗体を用いて、免疫吸着により分離した。
リン酸緩衝液pH8.5中のa)で得られた抗ヒトIgG抗体を約5mg/mlのタンパク質濃度に調整した。D-ビオチノイル-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドをDMSOに溶解し、1:5のモル比で抗体溶液に添加した。この反応をL-リシンの添加により60分後に停止させ、余剰の標識試薬を、150mM NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5に対する透析により除去した。
リン酸緩衝液pH8.5中のa)で得られた抗ヒトIgG抗体を約5mg/mlのタンパク質濃度に調整した。ジゴキシゲニン3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドをDMSOに溶解し、1:4のモル比で抗体溶液に添加した。この反応をL-リシンの添加により60分後に停止させ、余剰の標識試薬を、150mM NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5に対する透析により除去した。
実験動物から得られたサンプル中のヒト抗体(ヒトIgG)を定量化するための完全に一般的なアッセイ
ビオチン化した抗体M-R10Z8E9(プレート1)または抗体M-1.7.10(プレート2)を、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に最初のステップで結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄により除去した。カニクイザル血清中にスパイクしたサンプル/標準、例えば抗IL1R抗体、抗IL13Rα1抗体、抗Aβ抗体および抗IL6R抗体、を濃度系列でプレートに添加し、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。未結合抗体を洗い流した後、100μlのジゴキシゲニン化した抗体M-R10Z8E9(プレート1)または抗体M-1.7.10(プレート2)をプレートに添加した。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化抗体を抗ジゴキシゲニン抗体-HRPコンジュゲートにより検出した。各血清サンプルの吸光度値を3回反復して決定した(図1参照)。
実験動物から得られたサンプル中のヒト抗体誘導体(例えばFabフラグメント)を定量化するためのアッセイ
ビオチン化抗体M-1.7.10を、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に最初のステップで結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄により除去した。カニクイザル血清中にスパイクしたサンプル/標準、例えば抗IGF1R抗体Fabフラグメント、をウェルに添加し、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。未結合抗体を洗い流した後、100μlのジゴキシゲニン化抗体M-1.3.2をプレートの各ウェルに添加した。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化抗体を抗ジゴキシゲニン抗体-HRPコンジュゲートにより検出した。各血清サンプルの吸光度値を3回反復して決定した(図5参照)。
実験動物から得られたサンプル中のヒトIgGの構造的完全性を証明するためのアッセイ
ヒトFcに対するビオチン化抗体M-R10Z8E9を、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に最初のステップで結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄により除去した。カニクイザル血清中にスパイクしたサンプル/標準、例えば抗IL13Rα1抗体、をプレートに添加し、振とうしながら周囲温度で60分間インキュベートした。未結合抗体を洗い流した後、100μlのジゴキシゲニン化抗体M-1.3.2をプレートに添加した。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化抗体を抗ジゴキシゲニン抗体-HRPコンジュゲートにより検出した。各血清サンプルの吸光度値を3回反復して決定した(図3参照)。
本明細書で報告する抗ヒトIgG抗体と組み合わせたFc融合タンパク質(抗原)を用いる、実験動物から得られたサンプル中のヒト抗体(ヒトIgG)を定量化するためのアッセイ
ヒト受容体Xの可溶性細胞外ドメインをヒトIgG1クラスのFcフラグメントに融合させる。ビオチン化した融合タンパク質(Bi-X-Fc)を、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に最初のステップで結合させた。過剰の未結合受容体を洗浄により除去した。その後、カニクイザル血清中にスパイクした抗X抗体を固定化ヒト受容体Xに結合させた。未結合物質を洗い流した後、結合した抗X抗体を、a)ジゴキシゲニン化した、ヒトFcフラグメントに対するモノクローナル抗体(抗体M-R10Z8E9)で、またはb)ジゴキシゲニン化した、ヒトFabフラグメントに対するモノクローナル抗体(抗体M-1.7.10)で検出し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体とインキュベートした。各血清サンプルの吸光度値を3回反復して決定した。
ドットブロット - 立体構造エピトープ対線状エピトープ
抗ヒトIgG抗体が立体構造エピトープを検出するのか、それとも線状エピトープを検出するのか、を決定するために、ドットブロット解析を行った。
ブリッジングELISAアッセイによる抗体結合/特異性の評価
どの種類のヒトIgGサブクラスが検討中の抗ヒト抗体によって結合されるかを調べるため、ブリッジングELISA解析を行った。
Claims (26)
- 細胞株DSM ACC3006、またはDSM ACC3007、またはDSM ACC3008。
- 請求項1記載の細胞株のいずれか1つから得られる抗体。
- イムノアッセイにおける請求項2記載の抗体の使用。
- a)捕捉試薬として、細胞株DSM ACC2708、またはDSM ACC3006、またはDSM ACC3007、またはDSM ACC3008から得られる抗体;
b)検出試薬として、細胞株DSM ACC2708、またはDSM ACC3006、またはDSM ACC3007、またはDSM ACC3008から得られる抗体
を含むキット。 - 以下の工程を含む、実験動物から得られたサンプル中の治療用抗体の検出方法:
a)分析されるサンプルを提供する工程;
b)前記サンプルを、請求項2記載の抗体と同じエピトープに結合する抗体と共にインキュベートする工程;
c)任意で、前記サンプルを、総治療用抗体、活性な治療用抗体、または抗原に結合した治療用抗体の選択的検出に適する試薬と共にインキュベートする工程;および
d)(b)または(c)で形成された複合体を治療用抗体の濃度に相関させる工程。 - 捕捉抗体とトレーサー抗体とを含む抗原ブリッジングイムノアッセイを用いて、実験動物から得られたサンプル中の治療用抗体を免疫学的に決定する方法であって、前記捕捉抗体と前記トレーサー抗体が、ともに独立して、請求項2記載の抗体と同じエピトープに結合する抗体から選択されることを特徴とする、方法。
- 前記イムノアッセイがサンドイッチイムノアッセイであることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 捕捉抗体がビオチンにコンジュゲートされ、かつ固定化が固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して行われることを特徴とする、請求項6または7記載の方法。
- トレーサー抗体がジゴキシゲニンにコンジュゲートされ、かつ検出可能な標識への連結がジゴキシゲニンに対する抗体を介して行われることを特徴とする、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記治療用抗体がFabであることを特徴とする、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記実験動物が、以下の科のメンバー:マーモセットおよびタマリン、旧世界ザル、コビトキツネザルおよびネズミキツネザル、テナガザルおよび小型類人猿、キツネザル属、ならびにそれらの交雑を含む群から選択されることを特徴とする、請求項5〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記治療用抗体がヒト抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項5〜11のいずれか一項記載の方法。
- 実験動物から得られたサンプル中の総治療用抗体、活性な治療用抗体、または抗原に結合した治療用抗体の濃度を測定するための、治療用抗体に結合しかつ実験動物の免疫グロブリンに結合しない抗体の使用であって、前記抗体が請求項2記載の抗体と同じエピトープに結合する、使用。
- 細胞株DSM ACC3006、細胞株DSM ACC3007、細胞株DSM ACC3008によって産生された抗体の混合物を含むことを特徴とする、抗体組成物。
- 請求項5〜12のいずれか一項記載の方法における請求項14記載の抗体組成物の使用。
- ヒトまたはチンパンジーIgGに結合しかつイヌおよびマーモセットIgGに結合しない抗体。
- イヌ、アカゲザル、マーモセット、ヒヒ、およびカニクイザルIgGに結合しないことを特徴とする、請求項16記載の抗体。
- ヒトまたはチンパンジーIgGに結合するためのKD値が10-9mol/l以下であり、かつイヌ、アカゲザル、マーモセット、ヒヒおよびカニクイザルIgGに結合するためのKD値が10-6mol/l以上であることを特徴とする、請求項16〜17のいずれか一項記載の抗体。
- モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項16〜18のいずれか一項記載の抗体。
- κ軽鎖定常ドメインを含むIgG1に特異的に結合する抗体。
- IgG2にさらに結合することを特徴とする、請求項20記載の抗体。
- IgG4にさらに結合することを特徴とする、請求項20〜21のいずれか一項記載の抗体。
- IgG3に結合しないことを特徴とする、請求項20〜22のいずれか一項記載の抗体。
- λ軽鎖定常ドメインを含むIgG1に結合しないことを特徴とする、請求項20〜23のいずれか一項記載の抗体。
- モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項20〜24のいずれか一項記載の抗体。
- 請求項5〜12のいずれか一項記載の方法における請求項16〜25のいずれか一項記載の抗体の使用。
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