KR20070086642A

KR20070086642A - 실험동물의 치료용 항체의 검출

Info

Publication number: KR20070086642A
Application number: KR1020077014471A
Authority: KR
Inventors: 헬무트 렌쯔; 카이-군나르 스투벤라우크
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2007-08-27
Also published as: ATE503187T1; US7955806B2; BRPI0519354A2; CA2589054C; EP1853921A2; WO2006066912A9; JP4664377B2; BRPI0519354B1; MX2007006895A; EP1853921B1; WO2006066912A2; EP2237041A1; ES2360369T3; RU2393483C2; CA2589054A1; WO2006066912A3; EP1853921B2; ES2360369T5; DE602005027127D1; KR100950635B1

Abstract

본 발명은 치료용 항체의 분야에 관한 것이다. 이는 특히 실험동물의 치료용 항체의 연구에 관한 것이다. 본 발명은 a) 분석될 표본을 제공하는 단계, b) 상기 표본을 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체와 함께 항온처리시키는 단계, c) 선택적으로 상기 표본을 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 선택적 검출에 적합한 시약과 함께 항온처리시키는 단계, 및 d) (b) 또는 (c) 단계에서 형성된 부합제를 상기 치료용 항체의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 실험동물로부터 수득한 표본에서 치료용 항체를 검출하는 방법을 개시한다. 모든 종류의 인간 G형 면역 글로불린에서 존재하나, 침팬지의 IgG에서는 제외하고 모든 실험동물의 면역 글로불린에서 존재하지 않는 특정 에피토프에 관한 모노클론 항체가 사용되었다(MAB-M-R10Z8E9).

Description

실험동물의 치료용 항체의 검출{DETECTION OF A THERAPEUTIC ANTIBODY IN AN EXPERIMENTAL ANIMAL}

본 발명은 치료용 항체 분야에 관한 것이다. 특히, 실험동물의 치료용 항체의 연구에 관한 것이다. 본 발명은 a) 분석될 표본을 제공하는 단계, b) 상기 표본을 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체와 함께 항온처리시키는 단계, c) 선택적으로 상기 표본을 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 선택적 검출에 적합한 시약과 함께 항온처리시키는 단계, 및 d) (b) 또는 (c) 단계에서 형성된 부합제를 상기 치료용 항체의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 실험동물로부터 수득한 표본에서 치료용 항체를 검출하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 실험동물로부터 수득한 표본에서 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 농도를 측정하기 위한, 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체의 용도에 관한 것이다.

1974년에 켈러(Koehler)와 밀스타인(Milstein)에 의해 최초의 모노클론(monoclonal) 항체가 개발된 이래로 인간 치료에 적합한 항체의 개발에 대하여 많은 노력이 경주되어왔다. 이용가능하게된 최초의 모노클론 항체는 마우스(mice)와 래트(rats)에서 개발되었다. 이들 항체는 인간 치료에 사용되는 경우 항-설치류(anti-rodent) 항체에 기인한 불필요한 부작용을 야기시켰다. 이런 불필요한 부작용을 줄이거나 심지어 없애기 위해 많은 노력이 있어왔다.

지난 10년 동안 점점 증가하는 수의 인간 모노클론 항체 또는 인간화된(humanized) 모노클론 항체가 시장에 나왔다. 잘 알려진 예는 예컨대 바젤 소재의 호프만-라 로슈(Hoffmann-La Roche, Basel)사의 허셉틴(Herceptin^®) 및 맵테라(MabThera^®)를 포함한다.

상당히 많은 수의 인간 또는 인간화된 모노클론 항체가 연구 중에 있고 첫 번째 시험 목적으로 인간에게 투여하는 것을 고려하기 전에 실험동물에서 연구될 필요가 있다.

생체이용률(bio-availability) 및 항체 클리어런스(clearance)와 같은 중요한 조건(criteria)은 실험동물의 도움으로 연구되어야 한다. 여러 이들 연구는 숙주 자신의 항체를 바탕값으로 한 치료용 항체의 수량화(quantification)를 요한다. 대부분의 경우 포유동물이 실험동물로 사용된다. 독물학(toxicology)은 종종 마우스 또는 래트와 같은 설치류에서 먼저 평가된다. 약물 개발의 더 진보된 단계에서, 특히 인간에게 약을 투여하기 전에, 심지어 원숭이도 이런 임상전(pre-clinical) 연구에 포함되어야 한다.

포유동물은 대개 순환혈액 ml당 약 10 내지 약 30mg의 면역 글로불린을 갖는 다.

치료용 모노클론 항체는 전형적으로 약 1ng/ml 내지 약 100㎍/ml 범위의 혈청 수준으로 시험되어야 한다. 따라서 상기 치료용 항체는 약 100-배 내지 천만-배의 과량으로 존재하는 숙주 항체의 바탕값에 대하여 검출되어야 한다. 숙주의 면역 글로불린의 바탕값 중에서 인간 항체 또는 인간화된 치료용 항체를 검출하는 것은 약리학자에게는 상당한 과업을 의미한다. 또한 다른 치료용 항체가 다른 시약 및 측정 포맷(format)을 요구할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 인간 또는 인간화된 항체의 검출은 시험 동물이 호모 사피엔스(H. sapiens)와 더 밀접하게 관련될수록 더욱더 어려워진다.

본 발명의 목적은 실험동물로부터 수득한 표본에서 치료용 항체를 검출하는 방법이 개선될 수 있는지 여부를 조사하는 것이었다. 또한 인간 또는 인간화된 치료용 항체가 원숭이 혈청, 특히 레서 에이프(lesser apes)의 혈청에서 연구될 수 있는지 여부도 조사되었다. 이러한 목적은 하기 및 실시예 및 첨부된 청구항에 개시된 바와 같은 본 발명에 의해 달성되었다.

도 1 : 전체 치료용 항체의 검출

도 2 : 완충액에 희석된 전체 치료용 항체의 검출

도 3 : 완충액에 희석되었으나 사이노몰거스(cynomolgus) 혈청을 또한 5%(v/v) 함유하는 전체 치료용 항체의 검출

도 4 : 고상(solid-phase) 항원을 통한 활성 치료용 항체의 검출

도 5 : 완충액에 희석된 활성 치료용 항체의 검출

도 6 : 추가적으로 5% 사이노몰거스 혈청을 포함하는 완충액에 희석된 활성 치료용 항체의 검출

도 7 : 샌드위치형 검출 포맷(sandwich assay format)에서 활성 치료용 항체의 검출

도 8 : 샌드위치형 검출을 통한 완충액에 희석된 활성 치료용 항체의 검출

도 9 : 샌드위치형 검출을 통한 추가적으로 5% 사이노몰거스 혈청을 포함하는 완충액에 희석된 활성 치료용 항체의 검출

제 1 실시 양태에서 본 발명은 a) 분석될 표본을 제공하는 단계, b) 상기 표본을 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체와 함께 항온처리시키는 단계, c) 선택적으로 상기 표본을 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 선택적 검출에 적합한 시약과 함께 항온처리시키는 단계, 및 d) (b) 또는 (c) 단계에서 형성된 부합제를 상기 치료용 항체의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는 실험동물로부터 수득한 표본에서 치료용 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 "치료용 항체"라는 용어는 인간에 사용하기 위한 목적의 임의의 항체 제제(preparation)에 관한 것이다. 바람직하게는 이런 치료용 항체는 모노클론 항체일 것이다. 또한 바람직한 상기 모노클론 항체는 유인원(great ape)으로부터 수득되거나 또는 인간 모노클론 항체일 것이다. 바람직하게는, 이는 인간 모노클론 항체일 것이다. 또한 이런 치료용 모노클론 항체는 인간화된 모노클론 항체일 것이다.

본원에서 사용된 "모노클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질(homogeneous) 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 변이(mutation)를 제외하고 개체군(population)이 동일한 개별 항체를 말한다. 모노클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원결합 부위(single antigenic site)에 대한 것이다. 또한 서로 다른 결정기(determinant)(에피토프(epitope))에 대한 서로 다른 항체를 포함하는 폴리클론 항체 제제와는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원에 대한 단일 결정기에 대한 것이다. 이들의 특이성뿐만 아니라, 상기 모노클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클론"은 실질적으로 균질한 개체군의 항체로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 제조할 필요가 있는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클론 항체는 켈러 등의 문헌[Koehler, G., et al., Nature 256(1975) 495-497]에 최초로 개시된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합(recombinant) DNA 방법(예컨대 미국특허 제 4,816,567 호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 상기 "모노클론 항체"는 또한 예컨대 클랙슨 등의 문헌[Clackson, T., et al., Nature 352(1991) 624-628] 및 막스 등의 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222(1991) 581-597]에 개시된 기술을 사용하여 파지(phage) 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.

"인간화된" 형태의 비-인간(예컨대 설치류) 항체는 비-인간 면역 글로불린으로부터 유래된 부분 서열 및 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 부분 서열을 함유하는 키메릭(chimaeric) 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수여자의 고도변이성 부위(hypervariable region)로부터의 잔기가 비-인간 종(공여 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 바람직한 특이성 및 친화력을 갖는 비-인간 영장류의 고도변이성 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 면역 글로불린(수여 항체)으로부터 유래된다. 일부의 예에서, 인간 면역 글로불린의 프레임워크 부위(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 추가적인 변형(modifications), 예컨대 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이런 변형은 균질하지만, 상응하는 모서열(parent sequence)과 일치하지 않는 이런 수여 또는 공여 항체의 변이체를 생성한다. 이들 변형은 항체의 성능을 추가적으로 개량하기 위해 가해진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 고도변이성 루프(hypervariable loop)의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 공여 항체의 고도변이성 루프에 상응하고, FRs의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 수여 항체의 FRs인, 실질적으로 하나 이상, 전형적으로 두개의 변이성 도메인(variable domain)의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 상기 인간화된 항체는 또한 선택적으로 적어도 일부의 면역 글로불린 불변영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역 글로불린의 불변영역을 포함할 것이다.

비-인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 개시되어 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비-인간 출처(source)로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 불리며, 이는 전형적으로 "수입" 변이성 도메인으로부터 선택된다. 인간화는 필수적으로 하기의 윈터(Winter) 및 공동-연구자[Jones, P.T., et al., Nature 321(1986) 522-525; Riechmann, L., et al., Nature, 332(1998) 323-327; Verhoeyen, M., et al., Science, 239(1988) 1534-1536 and Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol., 2(1992) 593-596]의 방법에 의해 고도변이성 부위 서열을 비-인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이런 "인간화된" 항체는 키메릭 항체(미국특허 제 4,816,567 호)이며, 여기서 손상되지 않는 인간 변이성 도메인의 일부가 비-인간 종(species)의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부의 고도변이성 부위 잔기 및 어쩌면 일부의 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체를 만드는 데 사용되는 경쇄 및 중연쇄 둘 모두의 인간 변이성 도메인의 선택은 항원성(antigenicity)을 줄이기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적의(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 변이성 도메인의 서열을 공지된 인간 변이성-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크린한다. 그런 다음, 상기 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열을 인간화된 항체(심스 등의 문헌[Sims, M.J., et al., J. Immunol., 151(1993) 2296-2308]; 초티아 등의 문헌[Chothia, C., et al., J. Mol. Biol. 196(1987) 901-917])를 위한 인간 프레임워크 부위(framework region, FR)로서 수용한다. 다른 방법은 경쇄 또는 중연쇄의 특정 하위군(subgroup)의 모든 인간 항체의 컨센서스 배열(consensus sequence)로부터 유래된 특정 프레임워크 부위를 사용한다. 동일한 프레임워크를 여러 다른 인간화된 항체에서 사용할 수 있다[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(1992) 4285-4289; Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151(1993) 2623-2632].

인간화된 치료용 항체의 잘 알려진 예는 본원에 참고문헌으로 첨부된 미국특허 제 5,821,337 호의 표 3에 개시된 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8(허셉틴(Herceptin^®)을 포함하는 소위 항-ErbB2 항체이며, 또한 인간화된 520C9(국제 공개공보 제 93/21319 호에 개시되어 있음) 및 미국출원 제 PCT/US03/21590 호에 개시되어 있는 인간화된 2C4 항체도 마찬가지이다.

"변이체(variant)"라는 용어는 천연 폴리펩타이드 서열과 어느 정도 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 보통, 변이체 아미노산 서열 변이체는 상응하는 모항체(parent antibody) 서열과 약 80% 이상의 동일성을 갖고, 바람직하게는, 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상이 모항체 서열과 동일하다. 상기 아미노산 서열 변형물은 특정 위치에서 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내에 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유하고 있다.

"동일성"은 아미노산 서열을 정렬하고 필요시 최대 퍼센트의 동일성을 획득하기 위해 갭(gap)을 채운 후에, 아미노산 서열 변형물에서 동일한 잔기의 퍼센트로 정의된다. 정렬 방법 및 정렬을 위한 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 컴퓨터 프로그램은 제넨텍(Genentech, Inc.)사의 "Align 2"이며, 이는 1991년 12월 미국 워싱턴 소재의 미국 저작권청[United States Copyright Office, Washington, DC 20559]에 사용자 문서(user documentation)로 등록되어 있다.

본원에서 사용되는 "실험동물"이라는 용어는 마모셋 및 타마린(marmosets and tamarins)(Callitrichidae과), 신대륙원숭이(new world monkeys)(Cebidae과), 구대륙원숭이(old world monkeys)(Cercopithecidae과), 작은쥐여우원숭이(dwarf and mouse lemurs)(Cheirogaleidae과), 다람쥐원숭이(aye-aye)(Daubentoniidae과), 갈라고원숭이(bushbabies and galagos)(Galagonidae과), 긴팔원숭이(gibbons and lesser apes)(Hylobatidae과), 인드리, 시파카 등(indris, sifakas and relatives)(Indridae과), 트루 레머(true lemurs)(Lemuridae과), 로리스(lorises)(Loridae과), 스포티브 레머(sportive lemurs)(Megaladapidae과), 안경원숭이(tarsiers)(Tarsiidae과) 및 이들의 교배종을 포함하는 영장류 순서의 과(family)의 구성원을 나타낸다.

본 발명에 따른 방법은 마모셋 및 타마린, 구대륙원숭이, 작은쥐여우원숭이, 긴팔원숭이, 트루 레머 및 이들의 교배종 과(family)의 구성원을 포함하는 군으로부터 선택된 실험동물에서 실행되는 것이 바람직할 것이다. 이러한 바람직한 실시 양태에서, 인류와 가장 가까운 친척인 유인원, 특히 침팬지(chimpanzees), 보노보(bonobos), 고릴라(gorillas) 및 오랑우탄(orangutans)의 군은 제외한다.

본 발명에 따른 "표본"은 실험동물로부터 제거된 임의의 조직 또는 액체 표본일 수 있다. 바람직하게는 표본은 타액, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 액체 표본일 것이다.

"치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체"는 10^-9몰/L 이상의 해리상수(=KDiss.), 더욱 바람직하게는 10^-10몰/L 이상의 KDiss.로 치료용 항체에 결합할 것이다. 동시에, 실험동물의 면역 글로불린에 결합하지 않는 특성은 10^-8몰/L 또는 더 낮은(worse) KDiss.에 의해 보증된다. 또한 바람직하게는, 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체는 각각의 실험동물의 IgG에 대한 반응성과 인간 IgG에 대한 반응성 사이에 100-배 이상의 KDiss.-간격을 가질 것이다.

항체의 결합 특성, 특히 KDiss.는 비아코어^®(Biacore^®) 기기에 의해 평가되는 것이 바람직하다. 이 방법에서 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)의 변화에 의해 평가된다. 조사 중 상기 항체를 고상('칩'이라 불림)에 결합시켜 모노클론 항체, 폴리클론(polyclonal) 항체 또는 심지어 IgG를 포함하는 혈청의 상기 코팅된 칩과의 결합을 평가하는 것이 편리하다.

치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체는 조사 중 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 이들 항체의 단편일 수 있으며, 뿐만 아니라 이들 항체의 결합 도메인을 포함하는 유전자 구조체(genetic constructs)일 수 있다. 치료용 항체에는 결합되어 있으나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합되어 있지 않는다는 상기 조건을 갖는 임의의 항체 단편이 사용될 수 있다. 항체 단편뿐만 아니라 항체는 최신 기술, 예컨대 티즈센에 개시되어 있는 절차로 제조될 수 있다[Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11(1990), the whole book, especially pages 43-78, Elevier, Amsterdam].

상기 추가적으로 지적한 대로, 실험동물에서의 치료용 항체의 적용에 관련된 다양한 면은 전임상 연구 동안 평가되어야 할 수 있다. 특정 세팅에서, 존재하는 치료용 항체의 총량을 분석하는 것이 적절할 수 있으며, 또는 치료용 항체의 특정 단편, 치료용 항체의 일부의 변형, 항원에 결합된 치료용 항체의 농도 또는 여전히 항원에 결합 가능한 치료용 항체의 단편을 분석하는 것이 중요할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체를 검출하기 위해 각각 사용되는 것이 바람직하다.

"전체" 치료용 항체라는 용어는 항체가 활성(즉, 항원에 여전히 반응성이 있음), 비활성 및/또는 항원-결합 여부에 관계없이 검출된 임의의 항체를 말한다.

"활성" 치료용 항체라는 용어는 여전히 자신의 항원과 결합가능한, 실험동물에 존재하는 치료용 항체를 말한다. 예컨대 이런 항체는 자신의 항원과 또는 자신의 항원 결합 부위에 임의의 다른 분자와 결합하지 않은 것이다.

"항원-결합된" 치료용 항체라는 용어는 자신의 항원에 결합된 실험동물의 순환혈액에서 존재하는 치료용 항체를 가리키는 데 사용된다.

상기 정의된 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체는 본 발명에 따른 방법으로 직접 검출된다.

또한, 임의의 "비활성" 치료용 항체를 간접적으로 평가하는 것도 가능하다. 상기 비활성 치료용 항체는, 예컨대 자신의 항원에 결합된 치료용 항체, 교차-반응성 항원에 결합된 치료용 항체 또는 치료용 항체에 대하여 자기 항체(auto antibody)에 의해 블로킹된 치료용 항체일 수 있다. 숙련된 기술자가 이해하는 바와 같이, 개시된 본 발명을 바탕으로 비활성 항체의 단편을 평가하는 것이 가능하다. 전체 항체의 양이 활성 항체 및 항원-결합된 항체의 합계를 초과하는 경우, 자신의 상응하는 항원에 결합되지 않은 비활성 항체를 포함하는 항체의 추가 단편이 존재할 것이다.

다양한 검출 시스템으로 예컨대 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체를 바로 분석할 수 있다.

예를 들면 전체 항체는 소위 경합 면역측정 시스템(competitive immunoassay system) 또는 소위 샌드위치형 측정 시스템으로 검출될 수 있다.

상기 검출은 세척 단계 없이(균질 면역측정법) 또는 세척 단계를 갖고(비균질 면역측정법) 수행될 수 있다.

전체 치료용 항체는 샌드위치형 면역측정법으로 검출되는 것이 바람직하며, 여기서 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체는 상기 샌드위치 측정의 양면에서 모두 사용된다. 상기 샌드위치의 한 면에서 사용되는 항체는 고상에 결합되어 있거나 결합가능한 반면에(종종 포획 항체로 불림), 상기 샌드위치의 다른 한 면의 항체는 직접 또는 간접 검출이 용이한(소위 검출 항체) 방식으로 표지되어 있다. 상기 샌드위치 분석 절차에서 결합된 검출 항체의 양은 조사된 표본 중의 치료용 항체의 양에 직접 관련된다.

활성 치료용 항체를 검출하게 하는 검출 시스템은 당업계에 공지되어 있다(예컨대 미국 특허출원 제 2003/0068664 호). 상기 시스템은 항원을 고상에 결합시키는 단계, 치료용 항체를 상기 결합된 항원에 결합시키는 단계 및 항원을 통하여 고상에 결합된 치료용 항체를 검출하는 단계를 요한다.

표본에서 활성 치료용 항체의 검출은 종래 기술의 절차에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 전체 치료용 항체 또는 자신의 항원에 결합된 치료용 항체의 단편의 검출은 다소 복잡하고 상당히 다른 분석 설정(set-ups)을 요하며 특히 각각의 다른 분석을 위한 맞춤 시약을 요한다. 치료용 항체에는 결합되나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 항체를 이용하여, 서로 유사한 시험 시스템에서 활성 치료용 항체, 전체 치료용 항체 또는 항원-결합된 치료용 항체의 단편을 평가하는 것이 가능하다. 바로 그러한 본성에 의해 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 이러한 종류의 비교 평가는 한번의 양적 비교가 치료용 항체의 다양한 단편 사이에 이루어진다는 커다란 장점을 가져야 한다.

바람직하게는 샌드위치형 분석 포맷이 (또한) 활성 치료용 항체를 검출하기 위해 설정된다. 바람직하게는 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체는 포획 항체로 사용되고, 상기 샌드위치 측정의 검출부는 표지된 형태의 항원을 이용하거나, 또는 항원의 결합 후 치료용 항체에 의해 인식된 에피토프에 결합되거나 경합하지 않는 제 2 항체를 이용하며, 여기서 상기 제 2 항체는 직접 또는 간접 검출이 용이한 방식으로 특이적으로 검출가능하고/검출가능하거나 표지되어 있다.

상기 항원-결합된 치료용 항체는 샌드위치형 분석 포맷에서 포획 시약으로서 바람직하게는 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체를 다시 사용하여 검출되는 것이 바람직하다. 검출에서 바람직하게는 상기 치료용 항체의 에피토프와 경합하지 않는 에피토프에서 상기 항원에 결합하는 제 2 항체가 사용된다. 상기 제 2 항체는 직접 또는 간접 측정이 용이한 방식으로 표지되는 것이 바람직하다.

직접 검출의 경우, 상기 표지기(labeling group)는 임의의 공지된 검출 표지인자(marker group), 예컨대 염료, 화학발광표지기(chemiluminescent labeling group)와 같은 발광 표지기, 예컨대 아크리디늄 에스터 또는 다이옥세테인, 또는 형광(fluorescent) 염료, 예컨대 플루오리세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 옥사진(oxazine), 레조루핀(resorufin), 사이아닌(cyanine) 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지기의 다른 예는 발광 금속 복합체, 예컨대 루테늄(ruthenium) 또는 유로퓸(europium) 복합체, 효소, 예컨대 ELISA 또는 CEDIA(클로닝된 효소 공여 면역측정법, 예컨대 EP-A-0 061 888)에 사용된 효소, 및 방사성동위원소가 있다.

예를 들면 간접 검출 시스템은 상기 검출 시약을 포함하며, 예컨대 상기 검출 항체가 바이오아핀 결합쌍(bioaffine binding pair)의 제 1 파트너로 표지된다. 적합한 결합쌍의 예는 합텐(hapten) 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사물질(biotin analogues), 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스싸이오바이오틴(desthiobiotin)/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당(sugar)/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사물질/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예컨대 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합쌍 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 합텐, 예컨대 다이곡신(digoxin) 및 바이오틴 및 이들의 유사물질이 특히 바람직하다. 상기 결합쌍의 제 2 파트너, 예컨대 항체, 스트렙타비딘 등은 대개 직접 검출을 위해, 예컨대 상기 언급된 표지에 의해 표지된다.

면역측정법은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 실질적인 적용 및 절차뿐만 아니라 상기 측정을 수행하기 위한 방법은 관련 문헌에 요약되어 있다. 관련 문헌의 예는 티즈센의 "효소-항체 또는 다른 효소-거대분자 컨쥬게이트의 제조(Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates)"["Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), pp. 221-278, Eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsvier, Amsterdam] 및 면역학적 검출 방법을 다루는 여러 권의 "효소학 방법론(Methods in Enzymology)"[Eds. S.P. Colowick, N.O. Caplan, Academic Press], 특히 제 70 권, 제 37 권, 제 74 권, 제 84 권, 제 92 권 및 제 121 권이다.

상기 모든 면역학적 검출 방법에서, 시약 조건은 사용된 시약의 결합, 예컨대 항체의 자신의 상응하는 항원과의 결합을 고려하여 선택된다. 숙련된 기술자는 복합체라는 용어를 사용하여 상기 결합의 결과를 말한다. 본 발명에 따른 분석법에서 형성된 복합체는 최신 기술의 절차에 의해 상기 치료용 항체의 상응하는 농도에 관련된다. 사용된 검출 시약에 따라, 상기 관련시키는 단계는 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 농도를 생성할 것이다.

숙련된 기술자가 이해하는 바에 따라, 본 발명에 따른 방법은 전체, 항원-결합된, 활성 또는 심지어 비활성 치료용 항체의 농도만을 나타내지는 않을 것이다. 서로 다른 측정법에서 바람직한 하나의 동일한 시약, 즉 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체를 사용하기 때문에, 수득된 값은 서로 쉽게 비교될 수 있고 심지어 이들의 비율도 쉽게 평가될 수 있다. 또한 바람직한 실시 양태에서 본 발명은 활성 대 전체 치료용 항체의 비율에 관한 것이다. 이 비율은 당연히 치료용 항체의 효능에 대한 척도로서 작용한다.

본 발명에 이르는 실험의 과정 중 모든 종류의 인간 G형 면역 글로불린에서 존재하는 특정 에피토프가 침팬지의 IgG에서는 제외하고 모든 실험동물의 면역 글로불린에서 존재하지 않는다는 것이 발견되었다. 상기 에피토프는 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9에 결합함을 특징으로 하며, 이는 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9는 MAB<h-Fc gamma>M-R10Z8E9 또는 짧게는 MAB M-R10Z8E9라고 불린다. 본 발명에 따른 바람직한 실시 양태에서 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체는 또한 상기 항체가 MAB M-R10Z8E9라는 동일한 에피토프에 결합되어 있음을 특징으로 한다. MAB M-R10Z8E9는 2004년 12월 22일 DSM ACC2708로 DSMZ에 기탁되었다.

바람직하게는 본 발명은 DSMZ에 기탁된 하이브리도마(hybridoma)에 의해 제조된 모노클론 항체 MAB M-R10Z8E9의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항원 결합 부위를 갖는 치료용 항체에 결합하는 모노클론 항체에 관한 것이다. 용어 "경쟁적으로 억제"는 모노클론 항체 M-R10Z8E9에 의해 인식되는 에피토프를 인식하여 결합할 수 있음을 의미한다. 이런 결합은 종래의 상호 항체 경쟁 분석을 이용하여 쉽게 평가된다.

간단히 말해서, 상호 경쟁 실험에서 2개(또는 이상)의 특정 결합제가 서로 동일한 항원 또는 에피토프에 대한 결합을 억제하는지 여부가 조사되었다. 말하자면 항체 A 및 B가 동일한 에피토프에 결합하는 지가 조사되었다. 만일 이들이 동일한 에피토프에 결합한다면 이들 항체는 결합하기 위해 경쟁할 것이다. 만일 등가의 몰의 농도에서 항체 A가 B의 결합을 20% 이상 감소시킨다면 동일한 에피토프에의 결합이 존재하는 것이며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.

숙련된 기술자가 이해하는 바에 따라, 경쟁은 다른 검출 설정에서 평가될 수 있다.

바람직하게는 비아코어^®(Biacore^®) 시스템(상기 참조)이 사용된다. 만일 조사되는 항체가 등가의 몰에서 MAB M-R10Z8E9가 인간 IgG에 결합하는 것을 20% 이상 감소시키고 MAB M-R10Z8E9가 상기 항체가 인간 IgG와 결합하는 것을 20% 이상 감소시킨다면, MAB M-R10Z8E9가 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 대한 조사되는 항체의 결합이 존재하는 것이다.

또한 추가적인 바람직한 실시 양태에서 MAB M-R10Z8E9는 본 발명에 따른 방법에서 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체로 사용된다.

상기 언급된 바에 따라, 본 발명에 따른 방법으로 검출되는 치료용 항체는 인간 또는 인간화된 모노클론 항체가 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 치료용 항체는 바람직하게는 MAB M-R10Z8E9가 결합되는 에피토프를 포함한다.

추가적인 바람직한 실시 양태에서 본 발명은 실험동물로부터 수득한 표본에서 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 농도를 측정하기 위하여 치료용 항체에는 결합하나 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체의 용도에 관한 것이다. 상기 방법에서 사용되는 항체는 MAB M-R10Z8E9가 인식하는 에피토프에 결합되는 항체가 바람직하다.

하기의 실시예 및 도면은 본 발명(이의 진실한 범위는 첨부된 청구항에서 설명된다)의 이해를 돕기 위해 제공되었다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않는 한 상기 절차에서 변형이 가해질 수 있음은 물론이다.

도면의 설명

도 1 : 전체 치료용 항체의 검출

바이오틴이 부착된(biotinylated) 모노클론 항체(MAB<H-Fcγ pan>-M- R10Z8E9-Bi)는 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합되어 있다. 치료용 항체 MAB<IGF-1R>가 결합되고 디그옥시게닌(digoxigenin)-표지된 MAB<H-Fcγ pan> M-R10Z8E9-DIG 및 항-디그옥시게닌 호스-래디쉬(horse-radish) 퍼록시다아제 컨쥬게이트(PAB<DIG>HRP)를 통해 간접적으로 검출된다.

도 2 : 완충액에 희석된 전체 치료용 항체의 검출

광학 밀도(ODs)는 PBS-T, 0.5% BSA(w/v)로 희석된 여러 농도의 치료용 항체에 대해 주어진다.

광학 밀도(ODs)는 PBS-T, 0.5% BSA로 희석된 5%(v/v) 사이노몰거스 혈청을 갖는 여러 농도의 치료용 항체에 대해 주어진다.

도 4 : 고상(solid-phase) 항원을 통한 활성 치료용 항체의 검출

이 그림은 고상 결합된 항원을 통한 활성 치료용 항체의 검출시 사용된 시약을 보여준다. 구체적인 실시예에서, 주어진 바이오틴이 부착된 용해성 인터루킨 1(interleukin 1) 수용체(s-1L-1R-Bi)가 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합되어 있다. 활성 치료용 항체가 항원과 결합하고 디그옥시게닌이 부착된 항-인간 항체(MAB<H-Fcγ pan> M-R10Z8E9-DIG) 및 항-DIG-HRP (PAB<DIG>HRP)를 통해 간접적으로 검출된다.

도 5 : 완충액에 희석된 활성 치료용 항체의 검출

광학 밀도(ODs)는 PBS-T, 0.5% BSA로 희석된 여러 농도의 치료용 항체에 대해 주어진다.

광학 밀도(ODs)는 PBS-T, 0.5% BSA로 희석된 5% 사이노몰거스 혈청을 갖는 여러 농도의 치료용 항체에 대해 주어진다.

바이오틴이 부착된 모노클론 항체(MAB<H-Fcγ pan>-M-R10Z8E9-Bi)가 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합되어 있다. 디그옥시게닌-표지된 항원 (s-1L-1R-Bi) 및 항-디그옥시게닌 호스-래디쉬 퍼록시다아제 컨쥬게이트(PAB<DIG>HRP)를 사용하여 간접적으로 검출된다.

광학 밀도(ODs)는 5% 사이노몰거스 혈청을 갖는 PBS-T, 0.5% BSA로 희석된 여러 농도의 치료용 항체에 대해 주어진다.

약어

ABTS 2,2′-아지노-다이-[3-에틸벤즈싸이아졸린 설포네이트(6)] 다이암모늄염

BSA 소(bovine) 혈청 알부민

ELISA 효소-연결된 면역흡착 분석

FCγ =FCγ= Fcg= Fcgamma= 면역 글로불린의 Fcgamma-단편

POD(=HRP) 호스-래디쉬 페록시다아제

IgG 면역 글로불린 G

DIG(Dig) 디그옥시게닌

MTP 마이크로타이터 플레이트

OD 광학 밀도

PBS 포스페이트 완충된 염수

SDS 나트륨 도데실 설페이트

MAK(=Mab) 단일클론 항체

PAK(=Pab) 폴리클론 항체

RT 상온

SA 스트렙타비딘

T 트윈^®20

<인간 IgG> 인간 IgG에 대한 항체

실시예 1

특이성의 평가

a) MTP-ELISA에서의 다양한 항-인간 IgG 항체의 사용

마이크로타이터 플레이트(microtiter plate, MTP)(맥시소브^®(Maxisorb^®, Nunc))를 상온(RT)에서 1시간 동안 카보네이트 완충액으로(pH 9.6) 20% 희석된 원숭이(예컨대 사이노몰거스) 및 인간 혈청으로 각각 코팅시켰다. PBS-트윈^®20(PBS- Tween^®20)으로 세번 세척한 후, 상온에서 1시간 동안 MTP의 모든 웰을 PBS/3%BSA로 블로킹했다. 이후 상기 MTP의 웰을 다른 항-인간 IgG 항체(컨쥬게이트 되지 않거나 또는 항-인간 IgG 항체 호스래디쉬 페록시다아제(POD) 컨쥬게이트(표 1 참조)와 함께 항온처리했다(1시간; 상온). 상응하는 제조사에 의해 추천받은 대로 다양한 항-인간 항체를 사용하였다.

웰을 상기와 같이 세 번 세척하였다. POD-컨쥬게이트와 함께 항온처리된 웰을 결합된 항-인간 면역 글로불린 효소 반응/검출을 위해 직접 처리하였다. 다른 웰은 항-Dig-, 항-마우스 IgG- 또는 스트렙타비딘-POD-컨쥬게이트(모든 시약은 독일 소재의 로슈 다이애그노틱스사(Roche Diagnotics)의 시약임)와 함께 적합하게 항온처리하고(1시간; 상온), 세척 단계를 수행하였다. 상기 POD-컨쥬게이트에 포함된 POD는 ABTS 기질의 발색 반응(color reaction)을 촉매화하였다. 상기 신호는 405nm 파장(기준 파장: 490nm)에서 엘리사 리더(ELISA reader)로 측정했다. 모든 항-인간 IgG 항체에 대하여 인간 항체에 대한 신호 대 사이노몰거스 혈청의 신호의 비율을 계산하였다. 이들 값을 상기 항-인간 IgG 항체의 특이성을 평가하기 위해 사용하였다. 높은 비율은 인간 면역 글로불린과의 강한 반응성으로 해석되고 동시에 원숭이 면역 글로불린과의 낮은 (교차-) 반응성으로 해석된다.

MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9에 대해 관찰된 사이노몰거스 혈청과 비교된 인간 혈청에 대한 높은 신호 비율은 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 높은 인간-특이성을 가리킨다. MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9과는 대조적으로, 모든 다른 시험된 항체는 높은 교차-반응성을 보인다.

상기의 고무적인 데이터에 기초하여 다른 관련된 실험동물에서 나온 다른 면역 글로불린에 대한 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 교차-반응성을 조사하였다.

마이크로타이터 플레이트의 웰을 다양한 실험동물의 혈청으로 코팅하였다. 상기 설명된 대로 특정 항-인간 IgG 검출 시약으로서 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9를 사용하여 분석을 수행하였다.

표 2에서 볼 수 있듯이 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9는 오직 각각 인간 혈청 인간 IgG 또는 침팬지 혈청의 면역 글로불린과만 반응한다.

MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 마우스, 래트, 개, 원숭이 및 인간 혈청과의 반응성은 표 2a 및 b에 각각 나와있다.

상기의 간접적인 검출 시스템에서 간접 검출에 사용된 최종 시약 <DIG>-POD 또는 <마우스>-POD의 특질은 또한 신호 대 잡음비에 영향을 준다. 숙련된 기술자는 실험동물의 IgG에 거의 또는 전혀 결합되지 않는 검출 시약을 선택할 것이다.

b) 비아코어^®(Biacore^®) 시스템에 의한 항체 결합/특이성 평가

모든 측정은 CM5-칩을 사용한 비아코어^®(Biacore^®) 2000 기기로 수행하였다. 표준 아민 커플링에 의해 항체를 상기 칩에 코팅하였다. 달리 말하지 않으면, 모든 항온처리는 25℃에서 HBS-완충액(HEPES, NaCl, pH 7.4)에서 수행되었다.

포화량의 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9 및 폴리클론 항-인간 Fcγ 항체(디아노바) 각각을 동일한 CM5-칩의 서로 다른 채널에서 아민 커플링으로 고정시켰다. 모든 동물 혈청을 1%의 최종 농도에서 1mg/ml의 CM-덱스트란(dextran)을 함유하는 HBS 완충액 중에 희석시켰다. 결합은 1/100 희석된 혈청을 주입하고 60초 동안 항온처리하여 분석되었다. 해리는 상기 칩의 표면을 HBS 완충액으로 180초 동안 세척하여 측정하였다. 비아코어^®(Biacore^®)사의 비아이벨류에이션 소프트웨어(Biaevaluation Software)를 사용하여 1:1 랭뮤어 피팅 모델(Langmuir fitting model)로 해리상수 값(=KDiss.)을 계산하였다. 모든 동물 혈청에 대하여 상기 계산은 IgG 수준이 15mg/ml라는 가정에 기초하였다. 결합된 IgG의 양을 비교하기 위하여 시험 항체를 주입한지 80초 후의 신호 값을 선택하였다.

(서로 다른 원숭이 혈청의) 상기 SPR-분석은 MTP ELISA에서 나타난 결과를 확인시켜준다. MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9는 어떤 원숭이 종과도 교차-반응하지 않는다. 오직 인간 및 침팬지(유인원 이상) 혈청에 포함된 IgG만이 검출된다. MTP ELISA와는 대조적으로 개 혈청의 일부는 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9에 결합한다. 100-배 초과의 KDiss.-갭을 갖는 인간 IgG와 비교되는, 개의 IgG(하위 결합과 관련한)에 대한 상대적으로 높은 KDiss.는 이러한 낮은 상호작용이 면역측정법에서 유의하게 방해하지 않는다는 것을 가리킨다. 이는 실제로 실시예 1a)의 MTP ELISA에서 발견되었던 것이다.

MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9과는 대조적으로 상기 폴리클론 항-인간 Fc 항체는 개 및 모든 실험된 원숭이 종과의 높은 교차-반응성을 보여준다.

실시예 2

전체 치료용 항체의 정량화를 위한 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 사용

첫 단계에서 인간 Fc에 대한 바이오틴이 부착된 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9 또는 폴리클론 항체를 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합시켰다. 결합되지 않은 과량의 항체는 세척에 의해 제거하였다. 표본/기준, 예컨대 사이노몰거스 혈청에서 스파이크된 MAB <IGF-1R>은 동시에 디그옥시겐이 부착된 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9-DIG와 함께 1시간 동안 미리 항온처리시켰다. 이후 상기 혼합물을 바이오틴이 부착된 <인간 IgG> 항체로 코팅된 SA-MTP의 웰에 첨가하여 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 결합된 디그옥시겐이 부착된 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9을 항-디그옥시게닌-항체로 검출하였다. 상기 항체-효소 컨쥬게이트의 POD는 ABTS 기질의 발색 반응을 촉매화한다. 상기 신호는 엘리사 리더로 405nm 파장(기준 파장: 490nm)에서 측정하였다. 각 혈청 표본의 흡수값은 트라이플리케이트(triplicate)에서 측정하였다.

표 3 및 도 2에서 볼 수 있듯이, 항-인간 Fc-감마(gamma) 항체는 완충액으로 스파이크 된다면 인간 항체(MAB <IGF-1R>)의 정량화에 적합하다. 그러나 원숭이 IgGs(5% 사이노몰거스 혈청)가 존재하면 폴리클론 AB<H-FCγ>를 갖는 엘리사의 성능은 상당히 나빠진다(표 4 및 도 3).

PAB<H-FCγ>(디아노바)의 원숭이 IgG와의 교차-반응성 때문에 원숭이 혈청에서의 인간 IgG의 정확한 정량화는 불가능하다.

실시예 3

활성 인간 항체 MAB(IL-1R>의 정량화에 있어서 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 사용

첫 단계에서 바이오틴이 부착된 용해성 인간 IL-1 수용체(h-IL-1R-Bi)를 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합시켰다. 결합되지 않은 과량의 수용체는 세척하여 제거하였다. 이후 사이노몰거스 혈청에 스파이크된 MAB<IL-1R>을 고정된 인간 IL-1 수용체에 결합시켰다. 결합되지 않은 물질을 세척하여 버린 후 상기 결합된 MAB<IL-1R>을 a) 인간 IgG 쇄(MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9-DIG)에 대한 디그옥시겐이 부착된 모노클론 항체로 검출하고 호스-래디쉬 페록시다아제로 표지된 항-디그옥시게닌-항체와 함께 항온처리하거나, 또는 b) 폴리클론 항-인간 Fc 항체(디아노바)로 검출하고 세척 단계를 수행하였다. 상기 항체-효소 컨쥬게이트에 포함된 POD는 ABTS 기질의 발색 반응을 촉매화한다. 상기 신호는 엘리사 리더로 405nm 파장(기준 파장: 490nm)에서 측정하였다. 각 혈청 표본의 흡수값은 세벌씩(triplicate) 측정하였다.

표 5 및 6에서 주어지고 도 5 및 6에서 도시된 데이터는 항-인간 Fc-감마 항체 둘 모두가 완충액으로 스파이크된 활성 인간 항체(MAB<IL-1R>)의 정량화에 적합하다는 것을 나타낸다. 그러나 원숭이 IgG(5% (v/v) 사이노몰거스 혈청)의 존재 하에서는 폴리클론 AB<H-FCγ>를 이용한 ELISA의 성능이 상당히 나빠진다. 원숭이 IgG와의 교차-반응성 때문에 감도는 감소하고 가변성(variability)은 증가한다.

실시예 4

원숭이 혈청에서의 활성 MAB<IL-1R>의 정량화에 있어서 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9의 사용

첫 단계에서 인간 Fc(b)에 대한 바이오틴이 부착된 MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9 또는 바이오틴이 부착된 폴리클론 항-인간 IgG를 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합시켰다. 결합되지 않은 과량의 수용체는 세척하여 제거하였다. 이후 사이노멀거스 혈청에 스파이크된 MAB<IL-1R>을 고정된 항-인간 항체에 결합시켰다. 결합되지 않은 물질을 세척하여 버린 후 상기 결합된 MAB<IL-1R>을 디그옥시겐이 부착된 용해성 인간 IL-1 수용체(h-IL-1R-Dig)로 검출하고 호스-래디쉬 페록시다아제로 표지된 항-디그옥시게닌-항체와 함께 항온처리하였다. 상기 항체-효소 컨쥬게이트는 ABTS 기질의 발색 반응을 촉매화한다. 상기 신호는 엘리사 리더로 405nm 파장(기준 파장: 490nm)에서 측정하였다. 각 혈청 표본의 흡수값은 세벌씩(triplicate) 측정하였다.

이 실험 시스템을 예시하는 그림은 도 7에 나와 있다.

만일 상기 치료용 항체가 5% BSA를 갖는 PBS-T에 희석되면 항-인간 항체 둘 모두가 작용한다(표 7 및 도 8과 비교). 그러나 원숭이 IgG(5% 사이노몰거스 혈청)의 존재 하에는 폴리클론 AB<H-FCγ>를 사용하는 ELISA의 성능이 좋지 않다. 표 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이 동일한 양의 치료용 항체가 존재함에도 불구하고 신호 출력이 상당히 낮다. 원숭이 IgG와의 교차-반응성 때문에 상기 분석 성능은 원숭이 IgG의 전체 양 및 조성에 의존하고, 이는 동물마다, 그리고 시점마다 따라 달라질 수 있다.

Claims

a) 분석될 표본을 제공하는 단계,

b) 상기 표본을 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체와 함께 항온처리시키는 단계,

c) 선택적으로 상기 표본을 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 선택적 검출에 적합한 시약과 함께 항온처리시키는 단계, 및

d) (b) 또는 (c) 단계에서 형성된 부합제를 상기 치료용 항체의 농도에 관련시키는 단계를 포함하는, 실험동물로부터 수득한 표본에서 치료용 항체를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 실험동물이 마모셋 및 타마린, 구대륙원숭이, 작은쥐여우원숭이, 긴팔원숭이 및 레서 에이프, 트루 레머과(family)의 구성원 및 이들의 교배종을 포함하는 군으로부터 선택됨을 추가적인 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체가 MAB M-R10Z8E9와 동일한 에피토프에 결합하는 항체임을 추가적인 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 치료용 항체가 인간 항체 또는 인간화된 항체임을 추가적인 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서,

인간 항체 또는 인간화된 항체가 모노클론 항체임을 추가적인 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

전체 치료용 항체가 검출되는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

활성 치료용 항체가 검출되는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

자신의 항원에 결합된 치료용 항체가 검출되는 방법.
실험동물로부터 수득한 표본에서 전체, 활성 또는 항원-결합된 치료용 항체의 농도를 측정하기 위한, 상기 치료용 항체에는 결합하나 상기 실험동물의 면역 글로불린에는 결합하지 않는 항체의 용도.
제 9 항에 있어서,

상기 항체가 MAB M-R10Z8E9와 동일한 에피토프에 결합하는 용도.