CN111727372A - 用于监测对核苷逆转录酶抑制剂疗法的遵守的产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测生物样品中与NRTI有关的代谢物的新化合物、试剂、系统和方法以及其在监测对暴露前预防或抗逆转录病毒治疗的遵守中的用途。此类试剂包括NRTI衍生物、类似物、NRTI衍生物缀合物以及针对它们的抗体，其可用于基于抗体的方法，例如侧向流免疫测定法和其他护理点装置。

Description

用于监测对核苷逆转录酶抑制剂疗法的遵守的产品和方法
发明背景
在美国有120万处于HIV感染的高风险的人，而在世界范围内有数千万人。在美国，明年估计有40,000人会感染HIV并且14,000人会死亡；全球超过200万人会受到感染并且120万人会死亡(1-4)。美国每年在HIV护理上花费约250亿美元，这将随着HIV治疗的改善增加寿命预期而急剧增加(5)。
用替诺福韦(tenofovir)(
Figure BDA0002539859150000013
Gilead Sciences，Inc.，Foster City，CA)和恩曲他滨(emtricitabine)(
Figure BDA0002539859150000012
Gilead Sciences，Inc.，Foster City，CA)的组合进行的暴露前预防(PrEP)有效地预防HIV感染。2010年，一项临床试验显示，与服用安慰剂的人相比，服用PrEP的2499名“男男性接触者”(MSM)的HIV获得降低44％。每天服用PrEP的患者减少99％(6，7)。PrEP在血液中的半衰期为17小时，并且完全有效性需要每天给药(8)。
仅自我报告的遵守(adherence)和药房补充数据未与实际的PrEP遵守充分相关(9)。在年轻有色男男性接触者(yMSMc)中，尽管有高的自我报告的遵守，但在开始PrEP后第24周时血浆可检测到的替诺福韦水平率下降至20％(10)。在女性试验中也发现了类似的结果，例如Fem-PrEP试验(11，12)。
用于监测PrEP遵守的测试(例如血浆、干血斑或毛发分析)可需要患者可能无法接受的侵入性收集程序，在报告上具有延迟，这阻止了及时干预的实施，并且提供了不能反映最近的PrEP使用的遵守信息。
因此，极需要一种用于监测PrEP遵守的护理点(POC)测试，该测试提供非侵入性、无痛、定量、负担得起且快速的结果，该结果可以在临床访视期间获得以提供同时的咨询并且改善遵守。
发明概述
本发明部分基于用于在临床环境或其他POC中快速测试对PreP疗法或抗逆转录病毒治疗(ART)的遵守的新产品和方法的开发。另外，所公开的产品和方法可用于确定病毒载量升高是否是由于不遵守或耐受性引起的，和/或确定药物是否含有实际的替诺福韦(例如，不是假药)，和/或用于测试乙肝治疗遵守。该方法涉及使用新的替诺福韦衍生物作为免疫原，针对替诺福韦开发的新抗体的使用。这些抗体可用于免疫诊断测定法(包括侧向流免疫诊断测定法)中，以检测患者样品(包括尿液样品)中替诺福韦的存在。
因此，一方面，本发明提供了特异性结合替诺福韦或替诺福韦衍生物的替诺福韦部分的抗体。在一些实施方案中，抗体具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，抗体是单链抗体、仅重链抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片段等。
在一些实施方案中，轻链具有CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：17、19、21和30的氨基酸序列；CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：25、27、29和31的氨基酸序列；和/或CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：33、35、37和32的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO：11、13、15或41所示的可变轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链包含CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：18、20、22和23的氨基酸序列；CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：26、28、30和31的氨基酸序列；和/或CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：34、36、38和39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含以SEQ ID NO：12、14、16或42所示的可变重链氨基酸序列。
还公开了包含本文公开的任何一种或多种抗体的抗体制剂。在一些实施方案中，制剂是单克隆抗体制剂。
还提供了编码本文公开的任何抗体的重链或轻链的分离的核酸分子。在一些实施方案中，核酸选自克隆载体、表达载体、异源重组载体和病毒整合载体。
另外，公开了用本文提供的任何核酸转化的细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的一些非限制性实例包括兔、仓鼠、小鼠、大鼠、鸡、山羊、猴、绵羊、猪、马、牛或人细胞。
在另一方面，本发明提供了用于生成特异性结合替诺福韦或替诺福韦衍生物或其他核苷逆转录酶抑制剂(“NRTI”)或NRTI衍生物的抗体的免疫原和免疫原性制剂。
在一些实施方案中，免疫原可用于产生特异性结合替诺福韦或替诺福韦衍生物的抗体。在一些实施方案中，免疫原选自：
Figure BDA0002539859150000031
或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，免疫原选自具有根据式(I)的结构的化合物；
Figure BDA0002539859150000032
或其药学可接受盐，其中：
A1、A2或A3之一是
Figure BDA0002539859150000033
A1、A2和A3中的两个是氢或NH2；
Y是键、NR3、O或S；
L是C1-C12-亚烃基、C3-C7-环亚烃基、C3-C7-杂环烯、亚芳基或杂亚芳基，它们各自可以是被一个或多个选自以下的取代基任选取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7或-C(O)X1；
R1、R2、R3和R4各自独立是氢、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基，其中C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基各自可以用一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7、或-C(O)X2；
R5、R8、和R11各自独立是C1-C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、C0-C4-烷基-P(O)(OH)2、或-C(O)X4；
R6、R7、R9、R10、R12、和R13各自独立是氢、C1-C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、或-C(O)X5；或
R6和R7、R9和R10、以及R12和R13与同它们附接的原子一起独立形成3至7元环，其可以被一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR11、-NR12R13、或-C(O)X6；并且
X1、X2、X3、X4、X5、和X6各自独立是氢、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、芳基、芳烷基、或杂芳基；
其中每个任选的取代基独立可以进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR8、-NR9R10、和-C(O)X3。
在一些实施方案中，本发明提供了免疫原性组合物，其包含：通过接头与(b)载体蛋白缀合的(a)任何上述化合物。
在免疫原性组合物的某些实施方案中，接头共价结合所述载体蛋白上的活性残基(例如半胱氨酸或赖氨酸)与化合物。
在免疫原性组合物的某些实施方案中，载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素交叉反应材料197(CRM197)、TT的片段C、钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白D、外膜蛋白(OMP)和肺炎球菌溶血素。
在免疫原性组合物的某些实施方案中，载体蛋白是KLH。
在免疫原性组合物的某些实施方案中，载体蛋白是BSA。
在另一方面，本发明提供了生成针对任何前述免疫原性组合物制备并选择性结合任何前述免疫原性组合物的抗体的方法，所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在另一方面，本发明提供了用于监测受试者对NRTI疗法(例如，替诺福韦或替诺福韦衍生物疗法)的遵守的方法或测定法，其通过检测来自受试者的生物样品中NRTI或NRTI的代谢物(例如，替诺福韦或替诺福韦代谢物)的存在和/或水平来进行。在一些实施方案中，本发明提供了用于进行测定法以检测来自患者的流体样品中的NRTI或NRTI代谢物的方法，其中已对患者开NRTI或施用NRTI，所述方法包括：
(a)将流体样品施加到样品垫；
(b)使所述样品沿着所述样品垫侧向流到缀合标记物垫；其中所述缀合标记物垫包含与可检测标记物缀合的第一试剂，并且其中所述缀合标记物垫的一部分和所述样品垫的一部分形成第一界面；
(c)使所述样品沿着所述缀合标记物垫侧向流到膜；其中所述膜的一部分和所述缀合标记物垫的一部分形成第二界面；其中所述膜包含至少一种第二试剂，所述第二试剂结合到所述膜以形成测试线；
(d)将所述第一试剂与所述第二试剂结合以在所述测试线处形成第二试剂-第一试剂复合物，并使所述可检测标记物在所述测试线处形成可检测信号，
(e)在存在可检测信号的情况下将所述患者诊断为不遵守治疗或预防方案；或在缺乏可检测信号的情况下诊断为遵守治疗或预防方案。
在另一方面，本发明提供了诊断系统和/或装置，用于通过检测来自受试者的生物样品中NRTI或NRTI的代谢物(替诺福韦或替诺福韦代谢物)的存在和/或水平来监测受试者对NRTI疗法(例如替诺福韦或替诺福韦衍生物疗法)的遵守。在一些实施方案中，本发明提供用于进行测定法以检测患者的流体样品中的NRTI或NRTI代谢物的装置，其中对所述患者开NRTI或施用NRTI，包括：
(a)用于接触所述流体样品的样品垫；
(b)缀合标记物垫，所述缀合标记物垫具有与可检测标记物缀合的第一试剂，该缀合标记物垫的一部分和所述样品垫的一部分形成第一界面；
(c)包含膜的测定法，所述膜的一部分和所述缀合标记物垫的一部分形成第二界面；和
(d)与膜结合以形成测试线的至少一种第二试剂，所述第一界面允许流体从所述样品垫流到所述缀合标记物垫并且接触所述可检测标记物，所述第二界面允许流体从所述缀合标记物垫流到所述膜，并接触所述至少一种膜结合的第二试剂以形成第二试剂-第一试剂复合物，并且引起所述可检测标记物在所述测试线处形成可检测信号，
其中可检测信号的存在指示所述患者不遵守治疗或预防方案，并且其中可检测信号的缺乏指示所述患者遵守治疗或预防方案。
在一些实施方案中，装置可以具有两条或更多条分开的测试线。例如，装置可以具有对应于不同分析物浓度下的分析截留的测试线。非限制性实例包括10ug/ml、1ug/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml。
在方法或装置的某些实施方案中，调控所述可检测信号以提供可检测信号的存在指示所述患者遵守治疗或预防方案。
在该方法或装置的某些实施方案中，方法或装置是侧向流测定法，例如侧向流免疫测定法。
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是任何上述化合物，或它们的缀合衍生物。
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000061
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000071
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000072
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000073
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000081
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000082
在方法或装置的某些实施方案中，缀合衍生物是缀合有HRP的衍生物。
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是任何上述抗体。在某些实施方案中，第二试剂抗体与可检测标记物缀合。
在方法或装置的某些实施方案中，第一试剂是任何上述抗体。在某些实施方案中，第一试剂抗体与可检测标记物缀合。
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是任何上述化合物，或它们的缀合衍生物。
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000083
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000091
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000092
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000093
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000101
在方法或装置的某些实施方案中，第二试剂是化合物的缀合衍生物：
Figure BDA0002539859150000102
在方法或装置的某些实施方案中，缀合衍生物是缀合有HRP的衍生物。
在方法或装置的某些实施方案中，该方法或装置还包括在膜下游的吸收垫。
在方法或装置的某些实施方案中，膜是硝酸纤维素。
在某些实施方案中，该装置在壳体中提供。
在某些实施方案中，壳体还包括用于读取可检测信号的开口。
在方法或装置的某些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在方法或装置的某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是本文公开的单克隆抗体中的一种或多种。
在方法或装置的某些实施方案中，代谢物是TFV。
在方法或装置的某些实施方案中，膜还包含第三试剂，所述第三试剂与所述测试线下游或上游的膜结合以形成对照线。
在方法或装置的某些实施方案中，第三试剂结合所述第一试剂以在所述对照线处引起可检测信号，其中在所述对照线处所述可检测信号的存在指示所述侧向流测定法的适当性能。在一些实施方案中，在具有超过一条测试线的装置中，可以为每条测试线提供对照线。
在方法或装置的某些实施方案中，第三试剂是抗HRP抗体。
在方法或装置的某些实施方案中，第三试剂是抗兔IgG抗体。
在方法或装置的某些实施方案中，第三试剂是抗小鼠IgG抗体。
在某些实施方案中，第三试剂是抗山羊、抗大鼠、抗绵羊、抗骆驼(llama)或任何其他抗IgG抗体，其中该IgG不是人IgG。
在方法或装置的某些实施方案中，方法或装置是护理点测试。
在方法或装置的某些实施方案中，装置是筒。
在该方法或装置的某些实施例中，流体样品是尿液。
在方法或装置的某些实施方案中，预防方案是针对NRTI的PrEP。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI选自TDF、FTC和TAF，或其衍生物或组合。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TAF。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TDF。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是FTC。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TDF/FTC的组合。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TAF/FTC的组合。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TAF/FTC/TAF的组合。
在方法或装置的某些实施方案中，NRTI是TAF、FTC、TAF和任何其他NRTI的组合。
在另一方面，本发明提供了试剂盒，包含：
(a)用于接收生物样品的样品收集容器；和
(b)用于测定生物样品的本发明的装置。
在某些实施方案中，试剂盒进一步包含使用说明书。
在某些实施方案中，试剂盒还包括手持装置。
在某些实施方案中，试剂盒还包括滴管，以提供将样品放置在条上的手段。在某些实施方案中，条充当量油计(dipstick)。在某些实施方案中，条可以在塑料盒中。
在某些实施方案中，电子信号阅读器适合于接收任何前述装置并测量或检测由代谢物的存在或缺乏引起的反射率或分光光度信号。
在某些实施方案中，阅读器是反射率阅读器。
在某些实施方案中，生物样品是尿液。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方案，但是仅是通过举例说明的方式给出，因为从本详细说明出发，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
图1显示了可用于开发用于POC测定法的抗体的替诺福韦衍生物，所述POC测定法可以用于检测TDF和/或TAF和/或TFV。侧链T1-T6等按照基础分子合成(左)。
图2显示了本发明的替诺福韦衍生物(命名为靶物1或T1)的合成路线。
图3描绘了使用抗TFV衍生物缀合物多克隆抗体的竞争ELISA测定法。在该测定法中，将抗TFV衍生物缀合物多克隆抗体“312”和“313”包被在微板上，并且将TFV标准品与HRP-TFV缀合物混合，并且允许自由竞争板上的抗体。利用TMB底物检测溶液，然后停止与酸的反应。在450nm处测量吸光度，并与TFV标准曲线比较通过颜色强度确定药物浓度。抗体312和313能够产生可接受的校准曲线，并允许截留1,000ng/ml左右的分辨率。对于抗体313，在500和1,000ng/ml之间存在7.54标准偏差分离(CV＝12.0％)，并且在1,000和2,000ng/ml之间存在6.28标准偏差分离(CV＝4.4％)。这表明抗体312和313对替诺福韦具有足够的灵敏性。
图4显示了服用TAF的HIV+患者(分组1)中的尿液和血浆TFV浓度之间的关系。
图5显示了在10名HIV阴性受试者中，单剂FTC/TAF后的尿液/血浆TFV浓度，与给予一个单剂FTC/TDF的受试者的历史分组比较。
图6显示了在10名HIV阴性受试者中连续7剂FTC/TAF后的尿液TAF浓度(分组3)。
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方案的精确布置和手段。
发明详述
通用定义
除非下文另有定义，否则本文使用的所有科学和技术术语旨在具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在发生任何冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。对本文所采用的技术的引用旨在指本领域中通常理解的技术，包括那些技术的变化或等同或以后开发技术的替代，其对于本领域技术人员会是明显的。为了更清楚和简明地描述作为本发明的主题，针对在说明书和所附权利要求书中使用的某些术语提供了以下定义。
本文使用冠词“一种”和“一个”来指代该冠词的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“元件”是指一个元件或超过一个元件。
当涉及诸如量、时间持续时间等的可测量值时，如本文所使用的“约”意指包括自规定数值的±20％或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适合进行所公开的方法。
当在生物体、组织、细胞或其组成部分的上下文中使用时，术语“异常”是指在至少一种可观察或可检测的特征(例如年龄、治疗、感染时间)方面与显示“正常”(预期)相应特征的那些生物体、组织、细胞或其组成不同的那些生物体、组织、细胞或其组成。对于一种细胞或组织类型而言正常或预期的特征对于另一种细胞或组织类型而言可能是异常的。
如本文所用，术语“抗体”是指与抗原(例如，代谢物、代谢物衍生物或它们的缀合物)特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2、以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.，1999，In：Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow et al.，1989，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird et al.，1988，Science 242：423-426)。通常，完整或全长抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链均包含重链可变区(VH)和第一、第二和第三恒定区(CH1、CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。如本文所用，“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有哺乳动物抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用，“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有哺乳动物抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为alpha、delta、epsilon、gamma和mu。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。为了本发明的目的，抗体不必是任何特定类别或任何特定起源物种。术语“抗体”包括如本文所用的“合成抗体”。
如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为意指已经通过使用本领域中可用并且公知的合成DNA或氨基酸序列技术合成编码抗体的DNA分子并且表达重组DNA以生成抗体蛋白产生的任何抗体。
如本文所用，就抗体(例如，抗NRTI衍生物缀合物抗体，例如抗TFV抗体)而言，术语“特异性结合”是指识别特定小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物，或它们的衍生物或缀合物)，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合一个小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其衍生物或缀合物)的抗体也可以结合另一个小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其衍生物或缀合物)。但是，此类种间反应性本身并不改变将抗体分类为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用，以表示相互作用依赖于化学种类上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物，或它们的衍生物或缀合物)。若抗体对代谢物(例如，NRTI)具有特异性，则在含有标记的NRTI衍生物和抗体的反应中代谢物(例如，NRTI)的存在将减少与抗体结合的标记的NRTI衍生物的量。
术语“施用器”在术语在本文中所用时是指用于对受试者施用本发明的组合物的任何装置，包括但不限于皮下注射器、吸管、离子电渗疗法装置、贴剂等。
如本文所用，在本发明的上下文中，“代谢物”或“NRTI”包括但不限于小分子(例如，NRTI或本文所述的任何化合物，及其衍生物或缀合物)，以及降解产物、蛋白质-配体复合物、元件、相关代谢物以及其他小分子或样品衍生的测量。
术语“与NRTI有关的代谢物”和“NRTI”在本文可互换使用。因此，应当理解，对“NRTI”的引用应理解为指具体与“NRTI”相关的任何代谢物。作为非限制性实例，替诺福韦(TFV)是与NRTI富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir Disoproxil Fumarate，TDF)和替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir Alafenamide，TAF)有关的活性代谢物。
术语“NRTI衍生物”或“NRTI类似物”可互换使用，以描述式I、式II和式III的化合物的衍生物。在某些实施方案中，NRTI衍生物或NRTI类似物是“TFV衍生物”或“TFV类似物”。在某些实施方案中，NRTI衍生物或NRTI类似物是“TAF衍生物”或“TAF类似物”。在某些实施方案中，NRTI衍生物或NRTI类似物是“FTC衍生物”或“FTC类似物”。在某些实施方案中，NRTI衍生物或NRTI类似物是“TDF衍生物”或“TDF类似物”。
如本文所用，术语“替诺福韦”和缩写“TFV”指组成：
Figure BDA0002539859150000151
如本文所用，术语“替诺福韦二吡呋酯”和缩写“TD”指组成：
Figure BDA0002539859150000152
如本文所用，术语“富马酸替诺福韦二吡呋酯”和缩写“TDF”指组成：
Figure BDA0002539859150000161
如本文所用，术语“替诺福韦艾拉酚胺”和缩写“TA”指组成：
Figure BDA0002539859150000162
如本文所用，术语“富马酸替诺福韦艾拉酚胺”和缩写“TAF”指组成：
Figure BDA0002539859150000163
如本文所用，术语“恩曲他滨”和缩写“FTC”指组成：
Figure BDA0002539859150000171
术语“NRTI-衍生物缀合物”或“NRTI-类似物缀合物”可互换使用，以描述与载体蛋白(例如KLH，BSA等)缀合以产生本文所述的免疫原性组合物的NRTI衍生物。在某些实施方案中，NRTI-衍生物缀合物是“TFV-衍生物缀合物”。在某些实施方案中，NRTI-衍生物缀合物是“TAF-衍生物缀合物”。在某些实施方案中，NRTI-衍生物缀合物是“TDF-衍生物缀合物”。在某些实施方案中，NRTI-衍生物缀合物是“FTC-衍生物缀合物”。在某些实施方案中，“NRTI-衍生物缀合物”描述“HRP-NRTI衍生物”，其包含与HRP缀合的NRTI衍生物，用于本文所述的任何免疫测定法中。
术语“抗NRTI衍生物缀合物抗体”或“抗NRTI类似物缀合物抗体”是指针对NRTI衍生物缀合物制备的抗体(例如，多克隆，单克隆等)。此类“抗NRTI衍生物缀合物抗体”可以高特异性地与NRTI衍生物和/或其缀合物结合。在某些实施方案中，“抗-NRTI-衍生物缀合物抗体”是“抗-TFV-衍生物缀合物抗体”(或简称为“抗-TFV抗体”)。在某些实施方案中，“抗-NRTI-衍生物缀合物抗体”是“抗-TAF-衍生物缀合物抗体”(或简称为“抗-TAF抗体”)。在某些实施方案中，“抗-NRTI-衍生物缀合物抗体”是“抗-TDF-衍生物缀合物抗体”(或简称为“抗-TAF抗体”)。在某些实施方案中，“抗NRTI衍生物缀合物抗体”是“抗FTC衍生物缀合物抗体”(或简称为“抗FTC抗体”)。
如本文所用，“生物传感器”是用于检测样品中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的分析装置。生物传感器可以包括识别元件和转换器，该识别元件可以识别或捕获特定的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)，该转换器将小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的存在或缺乏传输为可检测的信号。
如本文所用，就一种或多种代谢物而言术语“数据”或术语“代谢物数据”通常是指反映样品中代谢物的绝对和/或相对丰度(水平)的数据。如本文所用，就一种或多种代谢物而言的术语“数据集”是指代表受试者的参考群体中一组代谢物的一种或多种代谢物的每种的水平的一组数据。数据集可用于生成本发明的公式/分类器。根据一个实施方案，数据集不需要包括针对参考群体的每个个体的组的每个代谢物产物的数据。例如，“数据集”当在要应用于公式的数据集的上下文中使用时，可以指代表一个或多个群体中每个个体的每种代谢物水平的数据，但应理解，也可以指代表所述一个或多个群体中每个中99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或更小的每种代谢物的水平的数据，并且仍可用于应用于公式的目的。
术语“对照”或“参考标准”描述了材料不包含本发明的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其缀合物或衍生物)，或包含正常、低或高水平的一种或多种该小分子，以使对照或参考标准品可充当可与样品比较的比较器。
如本文所用，术语“检测试剂”是指包含特异性结合样品中待检测的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)或其他靶定分子的亲和部分的试剂。检测试剂可包括例如可检测部分，例如放射性同位素、荧光标记物、磁性标记物和酶，或化学部分如生物素或洋地黄毒苷。可检测部分可通过使用可检测部分的标记的特异性结合配偶体来直接或间接检测。或者，可将可检测部分的特异性结合配偶体偶联至产生可检测产物的酶系统。
如本文所用，“检测器分子”是可用于检测感兴趣的化合物的分子。检测器分子的非限制性实例是与感兴趣的化合物特异性结合的分子，所述感兴趣的化合物例如但不限于抗体、关联受体和小分子。
短语“测定小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物，或其缀合物或衍生物)的浓度水平”是指使用熟练技术人员可利用的技术检测任何小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或它们的缀合或衍生物)的足够部分来在样品中评估小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其缀合物或衍生物)的量。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物无法维持稳态，并且若疾病没有得到改善，则动物的健康状况将继续恶化。
如本文所用，“免疫测定法”是指一种生物化学测试，其使用抗体与其关联抗原的反应，例如抗体与小分子(例如，NRTI、本文所述的任何化合物、或其衍生物、缀合物和类似物)的特异性结合来测量样品如生物样品中物质的存在或浓度。可以测量小分子(例如，NRTI、本文所述的任何化合物、或其衍生物、缀合物和类似物)的存在或存在的小分子(例如，NRTI、本文所述的任何化合物、或其衍生物、缀合物和类似物)的量两者。
如本文所用，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他表达介质，其可用于在用于检测本文所公开的代谢物的试剂盒中传达本发明的组分的有用性。本发明的试剂盒的指导材料可以例如固定到含有本发明成分的容器，或者与含有该成分的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开运输，以使指导材料和组分由接收者协同使用。
当在本文中使用时，术语“标记物”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至探针以产生“标记的”探针。标记物可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化(例如，抗生物素蛋白-生物素)。在某些情况下，可以标记引物以检测PCR产物。在一些实施方案中，标记物是HRP。
一种或多种代谢物的“水平”是指样品中代谢物的绝对或相对量或浓度。
“测量”或备选地“检测”指评估临床样品或受试者衍生样品中给定物质的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包括推导此类物质的定性或定量浓度水平，或以其它方式评估受试者临床参数的值或分类。
如本文所用，术语“监测遵守”是指确定患者对规定治疗过程的顺从性。遵守包括遵守包括规定治疗过程的剂量和频率的方面。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文可互换使用，并且是指适合于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。
如本文所用，“多肽”是指聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，其中L-异构体是优选的。如本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”旨在涵盖任何氨基酸序列并包括经修饰的序列。术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”特别地旨在涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。应当注意，术语“多肽”或“蛋白质”包括蛋白质的天然存在的修饰形式或糖基化物形式。
如本文所用，术语“提供预后”是指提供疾病、病症或状况的可能进程和结果的预测，包括对严重性、持续时间、恢复机会等的预测。该方法也可用于制定适当的治疗计划，例如，通过指示状况是否仍处于早期阶段或状况是否已发展至攻击性疗法会无效的阶段。
代谢物的“参考水平”是指指示药物治疗水平的代谢物水平。
根据本发明的术语“风险”包括发现当前未被诊断为具有HIV的特定患者可能暴露于来自当前被诊断为具有HIV的个体或以其他方式暴露于HIV的个体的体液。
如本文所用，“样品”、“样本”或“生物样品”是指从个体分离的生物材料。生物样品可以包含适合于检测期望代谢物的任何生物材料，并且可以包含获自个体的细胞和/或非细胞材料。
如本文所用，术语“固体支持物”、“支持物”和“基底”可互换使用，并且是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的一种材料或一组材料。在一个实施方案中，固相支持体的至少一个表面将基本上是平坦的，尽管在一些实施方案中可以期望物理上分离具有例如孔、凸起区域、销、蚀刻的沟槽等的不同化合物的合成区域。根据其他实施方案，一种或多种固体支持物将采取珠、树脂、凝胶、微球或其他几何构造的形式。示例性基底，参见美国专利号5,744,305。
“治疗浓度”或“治疗水平”是指获得治疗益处的物质浓度。对于本发明的NRTI，例如在实施例中说明的NRTI，治疗浓度是约1,000ng/mL或更多。本发明可以应用于其他NRTI，并且设计为解决适当的治疗阈值，该阈值对于该药物而言可以酌情大于或小于1,000ng/mL。
如本文所用，术语“治疗方案”或“医学方案”至少涉及个体为了治疗或预防疾病或状况而服用的任何药剂的频率和剂量。
化学定义
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过将游离碱形式的纯化化合物与合适的有机或无机酸单独反应，并分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。参见例如Berge et al.(1977)，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66：1-19。
在其他情况下，可用于本发明方法的化合物可包含一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的无机和有机碱加成盐。同样地，这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过使游离酸形式的纯化的化合物与合适的碱，例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，与氨或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺分别反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人，同上)。
本领域技术人员可以对期望化合物进行化学修饰，以使该化合物的反应更方便地用于制备本发明的缀合物的目的。
本发明的某些化合物可以特定的几何或立体异构形式存在。本发明涵盖所有此类化合物，包括顺式和反式异构体、R-和S-对映体、非对映体、(d)-异构体、(l)-异构体、其外消旋混合物和它们的其他混合物，如落入本发明的范围内。另外的不对称碳原子可以存在于取代基例如烷基中。所有这些异构体及其混合物均旨在包括在本发明中。
例如，若期望本发明化合物的特定对映体，则可以通过不对称合成或通过用手性助剂的衍生来制备，其中将所得的非对映体混合物分离出来，并切割辅助基团以提供纯的期望的对映体。或者，在分子包含碱性官能团(例如氨基)或酸性官能团(例如羧基)的情况下，与适当的旋光性酸或碱形成非对映体盐，然后通过分级结晶或本领域熟知的层析手段解析由此形成的非对映体，以及随后回收纯的对映体。
“烷基”是指具有规定碳原子数或若未作说明则至多30个碳原子的完全饱和的环状或无环、支链或非支链碳链部分。例如，具有1至8个碳原子的烷基是指诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的部分，以及是这些部分的位置异构体的那些部分。10至30个碳原子的烷基包括癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C30，对于支链为C3-C30)，并且更优选为20或更少。
“环烷基”是指各具有3至12个碳原子的单环或双环或桥连的饱和碳环。同样，优选的环烷基在其环结构中具有5-12个碳原子，更优选在环结构中具有6-10个碳。
除非另外指定碳数目，否则如本文所用的“低级烷基”是指如上定义，但在其主链结构中具有1至10个碳，更优选地1至6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长。在整个申请中，优选的烷基是低级烷基。在某些实施方案中，本文指定为烷基的取代基是低级烷基。
如本文所用，术语“芳基”包括3至12元取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子为碳(即，碳环芳基)或其中一个或多个原子为杂原子(即，杂芳基)。优选地，芳基包括5至12元环，更优选6至10元环。在某些实施方案中，芳基包括(C6-C10)芳基。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环共用的，其中至少一个环是芳族的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。碳环芳基包括苯、萘、菲、酚、苯胺等。杂芳基包括取代或未取代的芳族3至12元环结构，更优选5至12元环，更优选6至10元环，其环结构包含1-4个杂原子。在某些实施方案中，杂芳基包括(C2-C9)杂芳基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
术语“芳烷基”是本领域公认的，并且是指被芳基取代的烷基。
术语“杂原子”是本领域公认的，是指除碳或氢以外的任何元素的原子。示例性的杂原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。
术语“杂环基”或“杂环基”是指3至12元的环结构，更优选5至12元的环，更优选6至10元的环，其环结构包括1-4个杂原子。杂环也可以是多环。在某些实施方案中，杂环基包括(C2-C9)杂环基。杂环基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、色烯、夹氧杂蒽(xanthene)、吩噻噁(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉(quinoxaline)、喹唑啉、噌啉(cinnoline)、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩吡嗪、吩噻嗪、呋咱(furazan)、吩噁嗪(phenoxazine)、吡咯烷、氧杂环戊烷(oxolane)、硫杂环戊烷(thiolane)、噁唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺(sultams)、磺酸内酯(sultones)等。杂环可在一个或多个位置被如上所述的此类取代基取代、例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸根、膦酸酯、亚膦酸酯(phosphinate)、羰基、羧基、甲硅烷基、氨磺酰基、亚磺酰基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF 3、-CN等。
术语“杂芳基”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5至7元环，更优选5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选1-4个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共有的，其中至少一个环是杂芳族的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
如本文所用，术语“取代的”设想包括有机化合物的所有允许的取代基。在广义上，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。示例性的取代基包括例如上文所述的那些。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同的。为了本发明的目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的满足杂原子化合价的有机化合物的任何允许的取代基。本发明无意以任何方式受限于有机化合物的允许的取代基。应当理解，“取代”或“被......取代”包括隐含的条件，即此类取代是根据取代原子和取代基的允许化合价，并且该取代产生稳定的化合物，例如，其不是自发经历转化，例如通过重排、环化、消除等进行。
如本文所用，术语“卤素”表示-F、-Cl、-Br或-I。
术语“卤代烷基”是指通过如本文定义的烷基与母体分子部分连接的至少一种如本文定义的卤素。卤代烷基的代表性实例包括但不限于氯甲基、2-氟乙基、三氟甲基、五氟乙基和2-氯-3-氟戊基。
如本文所用，当在任何结构中超过一次出现时，每个表述，例如烷基、m、n等的定义旨在不依赖于其在同一结构中其他地方的定义。
发明原理
本发明部分地依赖于用于在临床环境、其他POC或家庭中快速测试对Prep疗法的遵守的新产品和方法的开发。该方法涉及使用新的替诺福韦衍生物作为免疫原，针对替诺福韦开发的新抗体的使用。这些抗体可用于免疫诊断测定法(包括侧向流免疫诊断测定法)，以检测患者样品(包括尿液样品)中替诺福韦的存在。
更一般地，本发明涉及用于方便地监测生物流体样品中NRTI的存在或缺乏的试剂(包括但不限于抗体和免疫原)。此类试剂可与WO2017147186A1(PCT/US17/018945)(通过引用整体并入本文)中所述的任何系统、装置、试剂盒和方法一起使用。
在一些实施方案中，本发明可用于评估开NRTI的患者对规定治疗计划的遵守的水平。在一些实施方案中，本发明可以用于评估来自个体的生物流体样品中的NRTI水平，该个体在事件前先前服用了NRTI的个体，其中该个体有感染HIV的风险。优选地，样品是尿液，并且患者尿液中的NRTI是患者已服用开的NRTI的指标。在一些实施方案中，样品是全血、血浆、血清或唾液。因此，本发明的方法提供了新的试剂(例如，NRTI衍生物、以及其缀合物和抗体)，用于监测对特定治疗的遵守和响应。
使用新的试剂，本发明提供了用于检测尿液中的NRTI的方法和系统，其中该系统还包括对照，以确保测试样品确实是尿液。NRTI和尿液的对照可以通过任何合适的测定法来鉴定。合适的测定法可以包括下列一种或多种：酶测定法、免疫测定法、质谱法、层析、电泳、生物传感器、抗体微阵列或其任何组合。若使用免疫测定法，则它可以是酶联免疫吸附免疫测定法(ELISA)、竞争测定法、放射免疫测定法(RIA)、侧向流免疫测定法、Western印迹、使用生物传感器的免疫测定法、免疫沉淀测定法、凝集测定法、浊度测定法或比浊测量测定法。优选的方法是利用快速免疫测定平台如侧向流的免疫测定法。
因此，本发明包括用于检测生物样品例如尿液中的NRTI的任何平台。在一个实施方案中，系统提供了一种方便的POC装置，其可以在家庭或临床环境中快速检测NRTI的存在或缺乏。护理点装置的一个非限制性实例是侧向流免疫测定法。
NRTI-衍生物免疫原
一方面，本发明提供了对目的NRTI或NRTI代谢物或其缀合物具有高特异性的抗体或结合配偶体的生成，以用于免疫测定法。抗体应当对靶标NRTI或NRTI代谢物具有高度特异性，以允许设计免疫测定法，其允许监测药物给药的顺从性。抗体的产生需要合成可用于免疫动物的衍生物(例如，NRTI衍生物缀合物，例如TFV衍生物缀合物)。以某种方式设计衍生物，以最大化靶分子的识别，而与可存在于样品中的其他物质的交叉反应性最小。衍生物与载体蛋白连接，以增强免疫识别并允许抗体的产生。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含具有根据式(I)的结构的化合物的NRTI-衍生物免疫原：
Figure BDA0002539859150000251
或其药学可接受盐，其中：
A1、A2或A3之一是
Figure BDA0002539859150000252
A1、A2和A3中的两个是氢或NH2；
Y是键、NR3、O或S；
L是C1-C12-亚烃基、C3-C7-环亚烃基、C3-C7-杂环烯、亚芳基或杂亚芳基，它们各自可以是被一个或多个选自以下的取代基任选取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7或-C(O)X1；
R1、R2、R3和R4各自独立是氢、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基，其中C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基各自可以用一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7、或-C(O)X2；
R5、R8、和R11各自独立是C1-C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、C0-C4-烷基-P(O)(OH)2、或-C(O)X4；
R6、R7、R9、R10、R12、和R13各自独立是氢、C1-C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、或-C(O)X5；或
R6和R7、R9和R10、以及R12和R13与同它们附接的原子一起独立形成3至7元环，其可以被一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR11、-NR12R13、或-C(O)X6；并且
X1、X2、X3、X4、X5、和X6各自独立是氢、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、芳基、芳烷基、或杂芳基；
其中每个任选的取代基独立可以进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1-C4-烷基、-C1-C4-卤代烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR8、-NR9R10、和-C(O)X3。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有根据式(II)的结构：
Figure BDA0002539859150000261
或其药学可接受盐，其中R15是C1-C4-烷基。优选地，R15是甲基。
在一些实施方案中，式(I)或(II)的化合物具有根据式(IIa)的结构：
Figure BDA0002539859150000262
或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，式(I)、(II)或(IIa)的化合物具有根据式(III)的结构：
Figure BDA0002539859150000263
Figure BDA0002539859150000271
或其药学可接受盐。优选地，A1和A2是氢。
在一些实施方案中，式(I)、(II)或(IIa)的化合物具有根据式(IV)的结构：
Figure BDA0002539859150000272
或其药学可接受盐。优选地，A2和A3是氢。
在一些实施方案中，式(I)、(II)或(IIa)的化合物具有根据式(V)的结构：
Figure BDA0002539859150000273
或其药学可接受盐。优选地，A1和A3是氢。
在一些实施方案中，本文中提供了式(I)、(II)、(IIa)、(III)、(IV)或(V)的化合物或其药学可接受盐，其中Y是NR3。优选地，R3是氢。
在其它实施方案中，本文中提供了式(I)、(II)、(IIa)、(III)、(IV)或(V)的化合物或其药学可接受盐，其中L是(CH2)n，其中n是1-6。优选地，n是2。
在某些实施方案中，本文中提供了式(I)、(II)、(IIa)、(III)、(IV)或(V)的化合物或其药学可接受盐，其中R1是任选用一个或多个选自以下的取代基取代的C1-C6-烷基：卤素、＝O、-OH、-SH、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基和杂芳基。在一些此类实施方案中，每个任选取代基独立可以被一个或多个选自以下的取代基进一步取代：-OH、-SH、-C1-C4-烷基、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基和杂芳基。
在某些实施方案中，本文中提供了式(I)、(II)、(IIa)、(III)、(IV)或(V)的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure BDA0002539859150000274
其中R16是C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基或芳基，它们各自可以被-SH、C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基或杂芳基任选取代。在一些此类实施方案中，R1是
Figure BDA0002539859150000281
在某些实施方案中，本文中提供了式(I)、(II)、(IIa)、(III)、(IV)或(V)的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure BDA0002539859150000282
其中m是1-6；且R17是C3-C7-环烷基、C3-C7-杂环基、芳基或杂芳基。在一些此类实施方案中，R1是
Figure BDA0002539859150000283
在具体的实施方案中，NRTI是替诺福韦衍生物，并且免疫原包含选自以下的化合物：
Figure BDA0002539859150000284
Figure BDA0002539859150000291
或其药学可接受盐。
本文所述的任何代谢物均可用于产生代谢物衍生物。在某些实施方案中，产生TFV代谢物(或TFV类似物)。在某些实施方案中，产生TAF代谢物(或TAF类似物)。在某些实施方案中，产生TDF代谢物(或TDF类似物)。在某些实施方案中，产生了FTC代谢物(或TFV类似物)。
用于抗体产生的免疫原性缀合物
可以将任何前述化合物(例如，NRTI衍生物)缀合至免疫原性组合物以产生用于抗体产生的合适的免疫原。此类免疫原可以包含载体蛋白。载体可以是蛋白质、脂质、脂化蛋白质、病毒、肽或糖肽的树枝状聚合物。
载体蛋白的实例是破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素交叉反应材料197(CRM197)、TT的片段C。钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白D、外膜蛋白(OMP)和肺炎球菌溶血素、白喉毒素交叉反应物质197(CRM197)或其他DT点突变体，例如CRM176，CRM228，CRM45(Uchida et al J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)，CRM 9，CRM45，CRM102，CRM 103和CRM107以及本领域中描述的其他突变。
在某些实施方案中，载体蛋白是KLH。在某些实施方案中，载体蛋白是BSA。
可以使用许多接头化合物将本发明的化合物与载体蛋白缀合。接头仅需要使载体蛋白上的反应性残基(例如半胱氨酸或赖氨酸)与所选化合物结合。因此，与载体蛋白残基反应并且可用于提供本发明的相对稳定的缀合物(位点特异性或以其它方式)的任何接头与本文的教导相容。
许多相容的接头可以有利地结合亲核的还原半胱氨酸和赖氨酸。涉及还原的半胱氨酸和赖氨酸的缀合反应包括但不限于硫醇-马来酰亚胺、硫醇-卤代(酰基卤化物)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基砜、硫醇-双砜、硫醇-硫代磺酸盐、硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-对氟反应。如本文进一步讨论的，硫醇-马来酰亚胺生物缀合由于其快速的反应速率和温和的缀合条件而成为最广泛使用的方法之一。
本发明的接头可与半胱氨酸(包括游离半胱氨酸)上的反应性硫醇亲核试剂连接。为此，可通过用各种还原剂如DTT或TCEP或如本文所述的轻度还原剂处理使半胱氨酸变为反应性以与接头试剂缀合。在其他实施方案中，本发明的接头可以与赖氨酸连接。
在一些实施方案中，接头含有用于与载体蛋白上的亲核官能团反应的亲电子官能团。载体蛋白上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基、(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中载体蛋白被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核性的，并且能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键：(i)马来酰亚胺基团，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯，例如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤甲酸酯和酰卤(acid halide)；(iv)烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(v)醛、酮、羧基，以及其中的一些示例如下：
Figure BDA0002539859150000301
本发明的抗体
可以使用与本文所述的任何一种NRTI衍生物或它们的缀合物反应性(例如针对它们制备和/或特异性结合它们)的抗体。在某些实施方案中，抗体可以结合本文所述的任何化合物(例如，NRTI衍生物)和/或它们的免疫原性缀合物。抗体可以是多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单克隆抗体，并且术语抗体旨在涵盖多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单克隆抗体及其功能片段。术语多克隆和单克隆是指抗体制剂的同质度，并且不旨在限于特定的产生方法。
可以针对合适的免疫原，例如本发明的免疫原性化合物、其类似物或衍生物以及它们的缀合物，制备抗NRTI衍生物缀合物抗体。
包含本文所述的任何化合物(例如，NRTI衍生物或类似物)的免疫原性组合物通常用于通过用免疫原免疫合适的受试者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如缀合至载体蛋白的化学合成的NRTI衍生物。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用包含本文所述的任何化合物(例如，NRTI衍生物或类似物)的免疫原性组合物对合适的受试者进行免疫诱导多克隆抗NRTI衍生物缀合物抗体应答。
本发明的另一方面涉及抗NRTI衍生物缀合物抗体的用途。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，包含与NRTI衍生物或其缀合物特异性结合(与之免疫反应)的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab′)2片段，它们可以通过用诸如胃蛋白酶的酶处理抗体来产生。本发明提供了结合NRTI衍生物或其缀合物的多克隆和单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”可以指仅含一种抗原结合位点的抗体分子群体，所述抗原结合位点能够与NRTI衍生物或其缀合物的特定化学基团免疫反应。因此，单克隆抗体组合物通常表现出与其特异性反应的特定NRTI衍生物或其缀合物的单结合亲和力。
如上所述，可以通过用包含NRTI衍生物缀合物的免疫原性组合物免疫合适的受试者来制备多克隆抗NRTI衍生物缀合物抗体。可以从哺乳动物(例如，从血液)分离针对NRTI衍生物缀合物的抗体分子，并通过公知的技术，例如蛋白A层析进一步纯化以获得IgG级份。在免疫后的适当时间，即，当抗NRTI衍生物缀合物抗体的效价最高时，可以从受试者获得产生抗体的细胞，并通过标准技术制备单克隆抗体，所述标准技术如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495-497)最初描述的杂交瘤技术)(另见Brown et al.(1981)J.Immunol.127：539-46；Brown et al.(1980)J.Biol.Chem.255：4980-83；Yeh et al.(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：2927-31；和Yeh et al.(1982)Int.J.Cancer 29：269-75)，新近的人B细胞杂交瘤技术(Cole et al.(1985)，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)或三源杂交瘤(trioma)技术。产生单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的(通常参见R.H.Kenneth，in Monoclonal Antibodies：ANew Dimension In Biological Analyset，Plenum Publishing Corp.，New York，NewYork(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402；M.L.Gefter et al.(1977)Somatic Cell Genet.3：231-36)。简而言之，将永生细胞系(通常为骨髓瘤)与如上所述用免疫原性组合物免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，并筛选所得杂交瘤细胞的培养上清液以鉴定产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体结合NRTI衍生物或其缀合物。
可以将许多用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的公知方案中的任何一种应用于产生抗NRTI衍生物缀合物单克隆抗体的目的(参见，例如G.Galfre et al.(1977)Nature266：550-52；Gefter et al.Somatic Cell Genet.，上文引用；Lerner，Yale J.Biol.Med.，上文引用；Kenneth，Monoclonal Antibodies，上文引用)。此外，普通技术人员将理解，此类方法有许多变型，它们也是有用的。通常，永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)源自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，鼠杂交瘤可以通过将来自用本发明的免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生化小鼠细胞系融合而制成。优选的永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其对含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)灵敏。根据标准技术，许多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以用作融合配偶体，即P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可从ATCC获得。通常，使用聚乙二醇(“PEG”)将HAT灵敏的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后，使用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，该培养基杀死未融合和非生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞会在几天后死亡，因为它们没有被转化)。通过对杂交瘤培养上清液筛选结合NRTI衍生物或其缀合物的抗体，即，使用如本文所述的ELISA测定法，检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方法，可以通过用NRTI衍生物缀合物筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离单克隆抗NRTI衍生物缀合物抗体，从而分离出免疫球蛋白文库成员，其结合NRTI衍生物或其缀合物。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，产品目录编号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM Phage DisplayKit，产品目录编号240612)。另外，特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以参见例如Ladner et al.美国专利No.5,223,409；Kang et al.PCT国际公开文本No.WO 92/18619；Dower et al.PCT国际公开文本No.WO 91/17271；Winter et al.PCT国际公开文本WO 92/20791；Markland et al.PCT国际公开文本No.WO 92/15679；Breitling etal.PCT国际公开文本WO 93/01288；McCafferty et al.PCT国际公开文本No.WO 92/01047；Garrard et al.PCT国际公开文本No.WO 92/09690；Ladner et al.PCT国际公开文本No.WO90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9：1369-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths et al.(1993)EMBO J.12：725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Garrard et al.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137；Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982；和McCafferty et al.Nature(1990)348：552-554。
另外，可以使用标准重组DNA技术制备的重组抗NRTI衍生物缀合物抗体，如嵌合和人源化单克隆抗体(包含人和非人部分两者)都在本发明的范围内。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来产生，例如使用Robinson et al.国际申请No.PCT/US86/02269；Akira，et al.欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison et al.欧洲专利申请173,494；Neuberger et al.PCT国际公开文本No.WO 86/01533；Cabilly et al.美国专利No.4,816,567；Cabilly et al.欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988)Science 240：1041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu et al.(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura et al.(1987)Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314：446-449；和Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison，S.L.(1985)Science 229：1202-1207；Oiet al.(1986)BioTechniques 4：214；Winter美国专利5,225,539；Jones et al.(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534；和Beidler et al.(1988)J.Immunol.141：4053-4060中描述的方法。
可以使用标准药物-抗体接头如二硫键，将任何上述抗体或其缀合物连接(参见下文的某些实施方案)。
Figure BDA0002539859150000341
在另一方面，本发明提供了特异性结合替诺福韦或替诺福韦衍生物的替诺福韦部分的抗体。在一些实施方案中，抗体具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，抗体是单链抗体、仅重链的抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片段等。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体或优选单克隆抗体。抗体的设计和产生是本领域技术人员众所周知的。
如以下实施例所述，已经开发出多克隆抗体和单克隆抗体，用于检测替诺福韦衍生物NRTI的代谢物。单克隆抗体包含以下氨基酸序列：
表1
抗体序列
Figure BDA0002539859150000342
Figure BDA0002539859150000351
Figure BDA0002539859150000361
Figure BDA0002539859150000371
Figure BDA0002539859150000381
Figure BDA0002539859150000391
在一些实施方案中，轻链具有CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO：17、19、21和30的氨基酸序列；CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：25、27、29和31的氨基酸序列；和/或CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：33、35、37和32的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO：11、13、15或41所示的可变轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO：18、20、22和23；CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：26、28、30和31的氨基酸序列；和/或CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：34、36、38和39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO：12、14、16或42所示的可变重链氨基酸序列。
还公开了包含本文公开的任何一种或多种抗体的抗体制剂。在一些实施方案中，制剂是单克隆抗体制剂。
还提供了编码本文公开的任何抗体的重链或轻链的分离的核酸分子。在一些实施方案中，核酸选自克隆载体、表达载体、异源重组载体和病毒整合载体。
另外，公开了用本文提供的任何核酸转化的细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的一些非限制性实例包括兔、仓鼠、小鼠、大鼠、鸡、山羊、猴、绵羊、猪、马、牛或人细胞。
具有以上针对抗体所讨论的靶表位的结合特异性的寡核苷酸或肽(即适体)也可以用于本文所述的抗体。
侧向流免疫测定法
侧向流免疫测定法利用膜条，优选纤维素膜如硝酸纤维素膜，作为免疫测定法的固体支持物，其上可以应用试剂(例如抗NRTI衍生物缀合物抗体，如抗TFV衍生物缀合物或抗-TFV抗体)线。可以通过在空间上分开试剂施加区域的位置来测定多个小分子(例如NRTI，例如TFV、TAF或TDF)。测试线下方可以使用其他试剂垫，用于其他关键试剂和样品调理材料。当将样品添加到测试装置时，溶液将流过测试线下方的垫，并且再水合用于测定法的样品调理化合物和关键试剂(例如，NRTI衍生物缀合物，例如HRP-NRTI衍生物或HRP-TFV衍生物，或针对此类NRTI衍生物的抗体，与检测标记物偶联，例如本文公开的那些抗体)，然后通过特定的测试线并沉积检测标记物，该标记物可以是视觉指示(胶体金、彩色乳胶或本领域技术人员已知的其他标记物)或需要仪器来测量信号(荧光，化学发光)的标记物。可以在测试线上方添加其他材料，以吸收通过测试线的流体。
最终结果是出现或不存在色线或斑点，其可以与对照线进行比较。在某些情况下，对照线可用于检测尿液标记物，以确保所测试的样品确实是尿液。优选地，尿液的标志物以与其它常见基质(即血液)中的量相比在尿液中显著不同的浓度存在，以证实所测试的样品是尿液。
在一个实施方案中，该系统可以包括基层或支持层以及包含至少一个吸收层的吸收基质，液体样品可以通过力或通过毛细作用沿流动路径流动通过该吸收层。基底层也可以是吸收性的并且与吸收性基质流体连通，使得液体样品的流动路径既通过吸收性基质又通过基底层。流动路径包括至少两个区域，其中第一区域是样品施加区域，而第二区域是检测区域。
可以使用竞争形式检测较小的分子，其中仅一种抗体或结合配偶体可用于检测感兴趣的药物。可以在提供当存在药物时出现线的阳性读数或者提供存在药物时线消失的阴性读数的方法中使测定法格式化。
在本发明的一个实施方案中，测试装置是一种竞争性免疫测定法，其利用具有测量单个药物物质的阴性读出的侧向流形式。侧向流条具有样品垫，其含有缓冲和样品处理材料。使样品垫与缀合物垫接触，所述缀合物垫含有与药物物质衍生物连接的标记物。使缀合物垫与固体支持物(例如硝酸纤维素)接触，所述固体支持物已经具有其上呈条的抗体，并且还具有对照线，该对照线具有在存在和不存在靶药物的情况下都会结合缀合物的抗体或结合配偶体。测试装置可在测试区的下游具有吸收垫，以促进流过装置。装置可以可选地具有装置壳体，以容纳条并形成用于将样品添加到装置的开口。在测试区和对照区中的线的存在会指示该受试者一直未常规服用靶药物，并且线的缺乏指示他们正在服用该药物。
在本发明的一个实施方案中，测试装置是一种竞争性免疫测定法，其利用具有测量单个药物物质的阴性读出的侧向流形式。侧向流条具有样品垫，其含有缓冲和样品处理材料。使样品垫与缀合物垫接触，该缀合物垫含有与针对药物物质制备的抗体相连的标记物。使缀合物垫与固体支持物(例如硝酸纤维素)接触，所述固体支持物已经具有其上呈条的靶药物的衍生物，并且还具有对照线，该对照线具有在存在和不存在靶药物的情况下都会结合缀合物的抗体或结合配偶体。该测试装置可在测试区的下游具有吸收垫，以促进流过该装置。装置可以可选地具有装置壳体，以容纳条并形成用于将样品添加到装置的开口。在测试区和对照区中的线的存在会指示该受试者一直未常规服用靶药物，并且线的缺乏指示他们正在服用该药物。
在本发明的一个实施方案中，测试装置是一种竞争性免疫测定法，其利用具有测量单个药物物质的阳性读出的侧向流形式。侧向流条具有样品垫，其含有缓冲和样品处理材料。使样品垫与缀合物垫接触，该缀合物垫含有与针对药物物质制备的抗体相连的标记物。使缀合物垫与固体支持物(例如硝酸纤维素)接触，所述固体支持物已经具有在对用户不可见的位置处的其上呈条的靶药物的衍生物和在测试线处与药物无关的缀合物的结合配偶体(例如抗生物素蛋白/生物素)。固体支持物还具有对照线，所述对照线具有会结合二级缀合物以指示已经运行装置的抗体或结合配偶体。该测试装置可在测试区的下游具有吸收垫，以促进流过该装置。装置可以可选地具有装置壳体，以容纳条并形成用于将样品添加到装置的开口。在测试区和对照区中的线的存在会指示该受试者已经常规服用靶药物，并且线的缺乏指示他们一直未服用该药物。
在本发明的一个实施方案中，测试装置是一种竞争性免疫测定法，其利用具有测量药物物质组合的阴性读出的侧向流形式。侧向流动条具有样品垫，其含有缓冲和样品处理材料。使样品垫与缀合物垫接触，所述缀合物垫包含与2种或更多种药物物质衍生物连接的标记物。使缀合物垫与固体支持物(例如硝酸纤维素)接触，该固体支持物已经具有在2个或更多个测试位置处的其上呈条的抗体，并且还具有对照线，该对照线具有会在存在和不存在靶药物的情况下都会结合缀合物的抗体或结合配偶体。该测试装置可在测试区的下游具有吸收垫，以促进流过该装置。装置可以可选地具有装置壳体，以容纳条并形成用于将样品添加到装置的开口。在该实施方案中，2种或更多种药物的反应性模式可以指示遵守药物的推荐给药。在一个潜在的结果中，两条阳性测试线或斑点的侧向流测试读出可以指示提供样品的个体正在按照规定的剂量时间表服用NRTI，而一条阳性测试线或斑点的侧向流测试读出可以指示提供样品的个体正在服用NRTI，但未按照规定的剂量时间表进行，并且零阳性测试线或斑点的侧向流测试读出可以指示提供样品的个体未服用NRTI。
在一个实施方案中，本发明的NRTI可以在采用实验室测试形式的系统中进行检测，例如一类编号的孔板(例如96孔板)。在一个实施方案中，侧向流装置可以为可以由机器读取的筒的形式。优选地，机器是自动化的。
在一个实施方案中，本发明的系统包括(i)POCT和(ii)数字装置。在一个实施方案中，数字装置与POCT交互。在一个实施方案中，数字装置分析来自POCT的结果。在一个实施方案中，数字装置记录来自POCT的结果。在一个实施方案中，数字装置报告来自POCT的结果。在一个实施方案中，数字装置分析、记录和/或报告来自多个POCT的结果。
在一些实施方案中，数字装置是配备相机的智能手机或平板电脑。在一些实施方案中，使用本发明的系统包括智能电话相机和应用。例如，在侧向流测试上方将智能手机相机握住，然后相机会根据线的强度对尿液中的药物含量进行定量。然后，该数字可以与电子病历、其他应用共享或托管到数据库中。在一些实施方案中，可以在免疫测定平台上进行测试。非限制性实例包括Alere阅读器等(http://www.clpmag.com/2017/04/fda-clears-alere-immunoassay-analyzer)或Abbott I-Stat(https://www.pointofcare.abbott/us/en/offerings/istat)。
公开的本发明不限于选择用于测量NRTI浓度的平台。快速测试是众所周知的，并且可以格式化为侧向流、流通、毛细管、生物传感器和许多其他形式。
生物样品
使用本发明要分析的生物样品可以是含有NRTI的任何生物组织或流体。通常，样品将是“临床样品”，其是源自患者的样品。用于分析的典型样品包括但不限于生物液体样品，例如痰(又称唾液)、血液、血浆、乳、精液和尿液。
从患者收集生物流体的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，用于侧向流快速视觉NRTI测试的生物流体的收集用样品杯或其他容器进行。在一个实施方案中，本发明的侧向流装置插入到含有生物流体样本的样品杯或其他容器中。适用于收集与本发明一起使用的生物流体样品的容器不一定受到限制并且在本领域中是众所周知的。在一个实施方案中，患者将本发明的侧向流装置的吸收芯放入他们的尿流中以收集生物流体用于分析。在一实施方案中，本发明的侧向流装置被插入口腔中并接触口腔粘膜以收集生物流体用于分析。
在一个实施方案中，将生物样品或生物样品的等分试样运送到实验室以使用基于实验室的测试进行分析。在一个实施方案中，将生物样品或生物样品的等分试样冷冻以运输到实验室以使用基于实验室的测试进行分析。
测试结果
在一些实施方案中，侧向流装置在1至40分钟内提供结果。在一些实施方案中，侧向流装置在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或40分钟内提供结果。在这些实施方案中，结果可以由患者或提供者读取并解释。在一个实施方案中，使用基于实验室的测试来分析患者样品，并且通过机密电子记录或通过机密传真将结果发送回患者或提供者。向提供者和患者提供结果的其他方法是众所周知的。
在一个实施方案中，提供者使用结果来监视患者对规定给药时间表的遵守。在一个实施方案中，测试结果由提供者解释，并用于亲自或通过电话、电子邮件、文本消息或其他通信介质向患者告知咨询策略。这包括但不限于与患者进行讨论、制定护理计划、调整保险范围、解决药物遵守障碍、指派个人检查顺从性、使用数字解决方案(例如文本消息)来改善遵守、或机械解决方案，例如药丸分配器，其记录和/或传输有关药丸消耗的数据。此外，提供者可以使用此信息来标记患者，其中根据他们最近的尿液TFV水平，尿液检查显示他们未得到保护(例如，若使用基于LC-MS/MS的测定法，则尿液TFV浓度＜10ng/mL)或未得到完全保护(例如，若使用基于LC-MS/MS的测定法，尿液TFV浓度在10到1000ng/mL之间)而免于HIV获得的患者。
使用任何免疫测定法(例如侧向流测定法)的TFV的另外的截留可以使用如Koeniget al.HIV Med.2017Jul；18(6)：412-418中描述的方法来确定。同样，在本文所述的任何测定法(例如，侧向流测定法)中，对于其他代谢物(例如TAF)的截留可以使用Koenig etal.HIV Med.2017Jul；18(6)：412-418中描述的方法来确定。
在一个实施方案中，患者可以在临床环境之外使用该系统。在一个实施方案中，患者可以在提供者的指导下使用该系统。在一个实施方案中，患者可将其结果告知其提供者。这可以包括但不限于在通过电话、消息传递或数字应用程序进行每个单独的测试之后通知提供者，或者执行多次测试，并在间歇访视时将结果提供给提供者。
在备选实施方案中，患者可以独立于提供者的监督来使用系统。在该实施方案中，患者可以使用结果以在他们有感染HIV的风险的邂逅之前确认NRTI的存在。
在一个实施方案中，可以每天进行测试。在一个实施方案中，测试可以在患者有被HIV感染的风险的高风险邂逅前进行。在一个实施方案中，可以以提供者或研究主管确定的频率进行测试。
在一个实施方案中，本发明的护理点测试(POCT)可以与手持装置一起使用。在一个实施方案中，与本发明的POCT一起使用的手持装置分析POCT的结果。在一个实施方案中，使用结合到手持装置中的电子检测方法来进行分析。在一个实施方案中，本发明的手持装置与计算机程序接口。在一个实施方案中，计算机程序是应用程序或基于网络的评估工具。在一个实施方案中，用户访视计算机程序以分析、跟踪或可视化测试结果。在一个实施方案中，用于分析、跟踪或可视化来自POCT的测试结果的计算机程序还用于向内科医生或另一方报告测试结果。
代谢物
在一些实施方案中，本文公开的系统包括将从测试样品获得的生物流体施加至用于检测与药物相关的一种或多种代谢物的系统。在一个实施方案中，药物用于治疗疾病。在一个实施方案中，药物用作预防措施。此类代谢物包括但不限于一种或多种NRTI(例如TFV、TAF、TDF、FTC)的小分子、代谢物、降解产物或相关代谢物。
在一些实施方案中，药物包含一种或多种NRTI。在一个实施方案中，药物用于治疗HIV感染。在一个实施方案中，药物用于预防HIV感染。在一些实施方案中，药物用于治疗或预防乙型肝炎感染。此类代谢物包括但不限于一种或多种NRTI(例如TFV、TAF、TDF、FTC)的小分子、代谢物、降解产物或相关代谢物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及用于评估(例如，检测或定量)测试样品中的至少一种感兴趣的NRTI的免疫测定法。在一个实施方案中，本发明涉及检测TFV的免疫测定法。在一个实施方案中，本发明涉及检测FTC的免疫测定法。在一个实施方案中，本发明涉及检测TFV和FTC两者的免疫测定法。
关于存在或不存在NRTI或NRTI浓度的对照可以是在待测样品中丰富的代谢物。在一个实施方案中，对照可以针对在尿液、唾液、血液或血浆中的至少一种中丰富的标志物。如本文其他地方所描述的，待测试的NRTI的测试模式与对照的测试模式的比较可用于鉴定NRTI的存在。在本背景中，对照或对照组用于建立本发明的系统和测定法的适当用途和功能的目的。因此，仅检测本发明的NRTI而不需要与对照组进行比较就可以用来鉴定NRTI的存在。以这种方式，根据本发明的系统可以用于定性、半定量或定量答案。
尿液中NRTI的浓度或水平与NRTI的血浆浓度水平相关。因此，尿液中NRTI的浓度水平充当NRTI提供的暴露后HIV感染风险增加或降低的标志。例如，使用基于LC-MS/MS的测定法，尿液TFV浓度＜10ng/mL可以指示患者在暴露事件后有感染HIV的高风险，而尿液TFV浓度在10至1000ng/mL之间可以指示患者在暴露事件后有感染HIV的某种风险，并且尿液TFV浓度＞1000ng/mL可以指示患者在暴露事件后有感染HIV的低风险。
使用任何免疫测定法(例如，侧向流测定法)的TFV的另外的截留可以使用如Koenig et al.HIV Med.2017 Jul；18(6)：412-418中描述的方法来确定。同样，在本文所述的任何测定法(例如，侧向流测定法)中，对于其他代谢物(例如TAF)的截留可以使用Koeniget al.HIV Med.2017 Jul；18(6)：412-418中描述的方法来测定。
检测小分子
样品中小分子(例如，代谢物，NRTI或本文所述的任何化合物，或它们的衍生物或缀合物)的浓度可以通过任何合适的测定法确定。合适的测定法可以包括以下一种或多种方法，酶测定法，免疫测定法，质谱法，色谱法，电泳法或抗体微阵列法或其任意组合。因此，如本领域技术人员将理解的，本发明的系统和方法可以包括本领域已知的用于检测样品中的代谢物的任何方法。
在一个实施方案中，本发明的样品是生物样品。生物样品可以源自固体或流体样品。优选地，样品是流体样品。本发明的样品可以包含尿液，全血，血清，血浆，汗液，粘液，唾液，牛奶，精液等。
免疫测定法
在一个实施方案中，本发明的系统和方法可以以各种免疫测定法型式的形式进行，所述型式是本领域众所周知的。在最简单和直接的意义上，免疫测定法是结合测定法，其涉及抗体和抗原之间的结合。免疫测定法的许多类型和型式是已知的，并且都适用于检测公开的代谢物。免疫测定法的例子包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶联免疫斑点测定法(ELISPOT)、放射免疫测定法(RIA)、放射免疫沉淀测定法(RIPA)、免疫珠捕获测定法、蛋白质印迹法、斑点印迹法、凝胶移位测定法、流式细胞仪、蛋白质阵列、多重磁珠阵列、磁捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)、光漂白后的荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)、竞争测定法、使用生物传感器的免疫测定法、免疫沉淀测定法、凝集测定法、浊度测定法、比浊测量测定法等。
通常，免疫测定法涉及在有效允许免疫复合物形成的条件下使怀疑含有目标分子(例如所公开的代谢物)的样品与针对目标分子的抗体接触，或使针对目标分子的抗体(例如，本文所述的抗NRTI衍生物缀合物抗体)与分子接触，视情况而定。在允许形成免疫复合物(一级免疫复合物)的有效条件下且持续足够的时间段，使样品与针对目标分子的抗体或与可以被针对目标分子的抗体结合的分子接触通常是如下的事件，即仅使分子或抗体与样品接触，然后将混合物温育足够长的时间段，以形成免疫复合物，即结合抗体可以结合的存在的任何分子(例如代谢物)。在许多形式的免疫测定法中，然后可以洗涤样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA板、点印迹或Western印迹，以除去任何非特异性结合的抗体种类，仅允许检测一级免疫复合物内特异性结合的那些抗体。
免疫测定法可包括用于检测或定量样品中目标分子(例如所公开的代谢物或其抗体)的量的方法，该方法通常涉及对结合过程期间形成的任何免疫复合物的检测或定量。通常，免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的，并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记物的检测，例如任何放射性、荧光、生物或酶标签或任何其他已知标记物。参见例如，美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，每篇通过引用整体并入本文，并且特别是关于免疫检测方法和标记物的教导。
如本文所用，标记物可以包括荧光染料，结合对的成员，例如生物素/链霉抗生物素蛋白，金属(例如金)或可以与通过例如产生有色底物或荧光可检测的分子特异性相互作用的表位标签。适用于可检测地标记抗体或NRTI衍生物或其缀合物和衍生物的物质包括荧光染料(在本文中也称为荧光染料和荧光团)和与比色底物反应的酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))。在本发明的实践中，通常优选使用荧光染料，因为可以以非常低的量检测到它们。此外，在多个小分子(例如，代谢物或NRTI)与单个阵列反应的情况下，可以用不同的荧光化合物标记每个小分子(例如，代谢物或NRTI)以同时检测。使用荧光计检测阵列上的标记斑点，信号的存在指示与特定抗体结合的标记小分子(例如，代谢物或NRTI)。
荧光团是发光的化合物或分子。通常，荧光团吸收一个波长的电磁能并发射第二波长的电磁能。
免疫测定法有两种主要类型，即同质和异质。在同质免疫测定法中，抗原和抗体之间的免疫反应和检测均在同质反应中进行。异质免疫测定法包括至少一个分离步骤，其允许将反应产物与未反应的试剂区分开。多种免疫测定法可用于检测一个或多个公开(例如，NRTI、本文所述的任何化合物、或其衍生物、缀合物和类似物)或通过引用并入本文的小分子。
ELISA是一种异质免疫测定法，其可用于本文公开的方法。该测定法可以用于以各种形式检测。
ELISA也可以用作竞争性测定法。在竞争性测定法形式中，将含有待测定抗原(例如代谢物，例如TFV)的测试样本与精确量的酶标记抗原(例如HRP-TFV或HRP-TFV衍生物)混合，并且两者竞争与附着于固体表面的抗抗原抗体(例如抗NRTI衍生物缀合物抗体)结合。在添加酶底物之前，将多余的游离的酶标记的抗原洗掉。由酶-底物相互作用产生的颜色强度的量是所测试样品中抗原量的量度。异质免疫测定法(例如ELISA)可用于检测任何公开(例如，NRTI、本文所述的任何化合物、或其衍生物、缀合物和类似物)或通过引用并入本文的小分子。
同质免疫测定法包括例如酶放大免疫测定技术(Enzyme MultipliedImmunoassay Technique，EMIT)，其通常包括包含待测量代谢物的生物样品、待测量代谢物的酶标记分子、结合待测量代谢物的一种或多种特异性抗体、以及特异性酶显色底物。在典型的EMIT中，将过量的特异性抗体添加到生物样品。若生物样品含有要检测的小分子(例如，代谢物或NRTI)，则该小分子(例如，代谢物或NRTI)与抗体结合。然后，将测量量的相应的酶标记的小分子(例如，代谢物或NRTI-缀合物衍生物)添加到混合物。样品中未被此类小分子(例如，代谢物或NRTI)占据的抗体结合位点被添加的酶标记的小分子(例如，代谢物或NRTI-缀合物衍生物)的分子占据。样品中要检测的高浓度的小分子(例如代谢物或NRTI)导致较低的吸光度读数。样品中较少的小分子(例如，代谢物或NRTI)导致更多的酶活性，因此导致更高的吸光度读数。同质免疫测定法(例如EMIT)可以用于检测公开或者通过引用并入本文的任何小分子(例如，代谢物或NRTI)。
在许多免疫测定法中，如本文其他地方所述，通过使用抗原特异性抗体作为检测器分子来进行抗原检测。但是，本发明的免疫测定法以及系统和方法不限于使用抗体作为检测器分子。可以使用可以结合或捕获给定样品内的抗原的任何物质。除抗体外，也可用作检测器分子的合适物质包括但不限于酶、肽、蛋白质和核酸。此外，本领域已知许多检测方法，其中可以检测捕获的抗原。在某些测定法中，酶联抗体产生颜色变化。在其他测定法中，通过检测荧光、发光、化学发光或放射性信号来检测捕获的抗原。本发明的系统和方法不限于在免疫测定中产生的可检测信号的特定类型。
免疫测定法试剂盒也包括在本发明中。这些试剂盒在单独的容器中包括对本发明化合物或其类似物或衍生物具有结合特异性的单克隆或多克隆抗体。该免疫测定法试剂盒可用于实施本文提供的各种方法。单克隆抗体和抗抗体免疫球蛋白可以以约0.001mg至100克，更优选为约0.01mg至1克的量提供。抗抗体免疫球蛋白可以是多克隆免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G或其功能片段，其可以在使用前通过本领域已知的方法进行标记。在几个实施方案中，免疫测定试剂盒包含以下中的两种、三种或四种：特异性结合本文公开或并入的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的抗体。
在一个实施方案中，本发明的免疫测定试剂盒可包括(a)样品垫、(b)缀合标记物垫，缀合标记物垫具有可检测的标记物、缀合标记物垫的部分和样品垫的部分，形成第一界面，(c)侧向流测定法，其包含膜、膜的部分和缀合标记物垫的部分，形成第二界面，以及(d)至少一种与膜结合的抗体，第一界面允许流体从样品垫流到缀合标记物垫并接触可检测的标记物，其中样品中存在的代谢物形成代谢物-缀合标记物复合物，所述第二界面使流体从缀合标记物垫流到膜并且接触至少一种与膜结合的抗体以形成代谢物-抗体复合物，并使可检测标记物形成可检测信号。
在一个实施方案中，本发明的免疫测定试剂盒包括另外的成分，其包括但不限于指导材料和样品收集容器中的一个或多个。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括单个免疫测定系统。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含超过一个免疫测定系统。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含手持装置。在一个实施方案中，试剂盒包含用于或访视计算机软件的系统、该计算机软件用于分析、记录、监视、跟踪和/或报告本发明的POCT的结果。
使用点装置
已开发出使用点分析测试，用于使用各种生物样品(例如尿液、血清、血浆、血液、唾液)检测健康相关状况(诸如妊娠、癌症、内分泌病症、传染病或药物滥用)。一些使用点测定法基于特异性结合对之间的高度特异性相互作用，例如小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物、或其衍生物和缀合物)/抗体、抗原/抗体、半抗原/抗体、凝集素/碳水化合物、载脂蛋白/辅因子和生物素/(链霉)抗生物素蛋白。在某些使用点装置中，使用试纸条进行测定法，其中将特异性结合对成员附着至可移动的材料(例如由胶乳或玻璃制成的金属溶胶或珠)或固定的基底(例如玻璃纤维、纤维素条或硝酸纤维素膜)。其他使用点装置可以包括光学生物传感器、光测生物传感器、电化学生物传感器或其他类型的生物传感器。用于进行本发明的方法的使用点装置中的合适的生物传感器包括具有光学或声学阅读器的“卡”或“芯片”。生物传感器可以配置为允许将收集到的数据以电子方式传输给医生以进行解释，因此可以形成电子医学的基础，其中可以进行诊断和监控，而无需患者接近医生或诊所。
样品中代谢物的检测可以使用样品捕获装置进行，例如允许检测一种或多种代谢物的侧向流装置(例如侧向流动测试条)，例如本文所述的那些。
本发明的测试条包含从上游样品施加区域到测试部位的流动路径。例如，流动路径可以是从样品施加区域穿过动员区到捕获区域的路径。动员区可以包含与小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)相互作用的可动员抗体，并且捕获区含有与小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)结合的试剂以检测样品中小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)的存在(或不存在)。
本文公开的试纸条不限于NRTI遵守监测，而是可以与其他测试组合在单个侧向试条或免疫测定筒中。在非限制性实例中，本文公开的测试条可以与其他测试组合在单个侧向流条或免疫测定筒中以测量TFV遵守并实施另一临床相关性测试，例如HIV感染状态。
迁移测定法装置的实例(其通常在其内掺入已附着到有色标记物的试剂，从而允许在不添加其他物质的情况下对测定结果进行可见检测)参见例如美国专利号4,770,853(通过引用并入本文)。多区侧向流测试条公开于美国专利号5,451,504，5,451,507和美国专利号5,798,273(通过引用并入本文)。美国专利号6,656,744(其通过引用并入)公开了侧向流测试条，其中标记物通过链霉亲合素-生物素相互作用与抗体结合。
流通型测定装置部分设计为消除与量油计测定法相关的温育和洗涤步骤的需要。流通式免疫测定装置涉及捕获试剂(例如一种或多种抗体)，该捕获试剂结合到添加有液体样品的多孔膜或滤器。当液体流过膜时，目标小分子(例如代谢物。NRTI或本文所述的任何化合物)与捕获试剂结合。在添加样品之后(或同时)添加检测剂，例如标记的抗体(例如，金缀合或着色的乳胶颗粒缀合的抗体)。或者，可以以允许检测器与样品混合从而标记小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的方式将检测剂放置在膜上。检测器试剂的视觉检测提供了样品中不存在目标小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)的指示。代表性的流通分析装置描述于美国专利号4,246,339；4,277,560；4,632,901；4,812,293；4,920,046；和5,279,935；美国专利申请公开号20030049857和20040241876；和WO 08/030,546。迁移测定装置通常在其中掺入已附着到有色标记物的试剂，从而可以在不添加其他物质的情况下对测定结果进行可见检测。参见例如，美国专利号4,770,853；PCT公开号WO 88/08534。
本文所述的装置通常包含吸收材料条(例如微孔膜)，在某些情况下，该吸收材料条可以由各自在区域中彼此连接的不同物质构成，所述区域可以邻接和/或重叠。在一些实例中，吸收条可以固定在支持的非交互性材料(例如非织造聚酯)上，例如，以为条提供增加的刚性。每个条内的区域可以差异含有特异性结合配偶体和/或检测和/或定量针对例如本文公开的一种或多种分子(例如，代谢物或NRTI)测试的特定小分子(例如代谢物或NRTI)需要的其他试剂。因此，这些区域可以看作测试装置内的功能扇区或功能区域。
通常，例如通过浸入或点样将流体样品在条带的近端引入条带。使用本领域技术人员众所周知的方法收集或获得样品。含有要检测的特定代谢物或NRTI的样品可以从任何生物学来源获得。在特定的例子中，生物来源是尿液。在测定法之前可以将样品稀释、纯化、浓缩、过滤、溶解、悬浮或以其他方式处理以优化免疫测定结果。流体向远侧迁移通过条的所有功能区域。流体在各个功能区域中的最终分布取决于吸附能力和所用材料的尺寸。
在一些实施方案中，本文其他地方所述的多孔固体支持物，例如硝酸纤维素优选为片或条的形式。此类片或条的厚度可以在宽限度内变化，例如，从约0.01至0.5mm、从约0.02至0.45mm、从约0.05至0.3mm、从约0.075至0.25mm、从约0.1至0.2mm、或从约0.11至0.15mm。此类片或条的孔径可类似地在宽限度内变化，例如从约0.025至15微米，或更特别地约0.1至3微米；然而，孔径不旨在成为选择固体支持物的限制因素。在适用时，固体支持物的流速也可以在宽限度内变化，例如从约12.5至90sec/cm(即50至300sec/4cm)、约22.5至62.5sec/cm(即90至250sec/4cm)、约25至62.5sec/cm(即100至250sec/4cm)、约37.5至62.5sec/cm(即150至250sec/4cm)、或约50至62.5sec/cm(即200至250sec/4cm)。
使用测定装置时要考虑的另一个常见特征是检测小分子(例如一种或多种代谢物、NRTI或本文所述的化合物)与捕获剂(例如一种或多种抗体)之间的复合物形成的手段。检测器(也称为检测器试剂)用于此目的。检测器可以集成到测定装置中(例如，包括在缀合物垫中)，或者可以从外部来源应用于该装置。
检测器可以是单一试剂或者共同用于检测目的的一系列试剂。在某些情况下，检测器试剂是对小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物，或其缀合物或衍生物)具有特异性的标记的结合配偶体(例如针对目标的特定代谢物或NRTI的金缀合抗体)。
在其他情况下，检测器试剂共同包括对小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)具有特异性的未标记的第一结合配偶体以及对第一结合配偶体具有特异性的标记的第二结合配偶体等等。因此，检测器可以是对小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)具有特异性的标记抗体。检测器也可以是对目标小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)具有特异性的未标记的第一抗体和与未标记的第一抗体特异性结合的标记的第二抗体。在每种情况下，检测器试剂特异性检测小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物或其缀合物或衍生物)-捕获试剂复合物的结合小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物或其缀合物或衍生物)，因此检测器试剂优选基本上不与捕获试剂或小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的化合物或其缀合物或衍生物)捕获区域中定位的其他组分结合或反应。检测器的此类非特异性结合或反应可提供假阳性结果。任选地，检测器试剂可以特异性识别存在于二级捕获区域中的阳性对照分子(例如标记的蛋白A检测器、标记的蛋白G检测器或标记的抗人Ab(Fc)的非特异性人IgG)。
流通装置构建与设计
流通装置涉及固定化在固体支持物上的捕获试剂(例如一种或多种抗体)，该支持物通常是微量滴定板或膜(例如硝酸纤维素、尼龙或PVDF)。以简单的代表性形式，将流通装置的膜放置成与吸收层功能或物理接触，该吸收层作用为将流体样品抽吸通过膜的贮存器。任选地，在固定化捕获试剂之后，可以阻断膜上任何剩余的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)结合位点(在样品施用之前或同时)以最小化非特异性相互作用。
在流通装置的操作中，将流体样品放置成与膜接触。通常，流通装置还包含样品施加区域(或贮存器)，以接收并临时保留期望体积的流体样品。样品通过膜基质。在此过程中，样品中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)可以与固定化的捕获试剂(例如一种或多种抗体)特异性结合。当期望检测小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)-捕获试剂复合物时，可以将检测器试剂(例如特异性结合一种或多种小分子(例如代谢物、NRTI、或本文所述的任何化合物)的标记抗体)与样品一起添加，或者可以在施加样品后添加含有检测器试剂的溶液。若小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)被捕获剂特异性结合，则可在膜表面上观察到可归因于特定检测器试剂的特性。可以在过程中的任何时间添加任选的洗涤步骤，例如，在施加样品之后和/或在施加检测器试剂之后。
侧向流装置构建和设计
侧向流装置是本领域公知的。简而言之，侧向流装置是一种分析装置，其本质上具有测试条，怀疑含有目标小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述化合物或其缀合物或衍生物)的测试样品流体流经该测试条。测试流体和任何悬浮的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的化合物、或其缀合物或衍生物)可以沿着条流到检测区域，其中小分子(例如，代谢物、NRTI或本文描述的化合物、或其缀合物或衍生物)(若存在的话)与捕获剂和检测剂相互作用以指示该小分子(例如，代谢物、NRTI或本文描述的化合物或其缀合物或衍生物)的存在、不存在和/或数量。
已经公开了许多侧向流分析装置，包括美国专利号4,313,734；4,435,504；4,775,636；4,703,017；4,740,468；4,806,311；4,806,312；4,861,711；4,855,240；4,857,453；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,001,049；5,075,078；5,126,241；5,451,504；5,424,193；5,712,172；6,555,390；6,258,548；6,699,722；6,368,876和7,517,699(每篇通过引用并入)中显示的那些装置。
许多侧向流装置是一步式侧向流测定法，其中将生物流体置于吸水条上的样品区域中(尽管可以使用非吸水材料，并通过例如向材料施加表面活性剂而变得吸水)，并允许沿着条迁移，直到液体与特异性结合配偶体(例如抗体)接触，所述特异性结合配偶体与液体中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)相互作用。一旦标记的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)与结合配偶体相互作用，信号(例如荧光或其他方式可见染料)指示发生了相互作用。可以将多个离散的结合配偶体(例如抗体)放在条上(例如在平行线中)，以检测液体中的多个小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)。测试条还可以掺入对照指示剂，其提供已经充分进行测试的信号，即使在条上看不到指示小分子(例如代谢物、NRTI或本文中描述的任何化合物)的存在(或不存在)的阳性信号。
侧向流装置具有本领域中同样众所周知的极其多种物理形式。本公开内容考虑以适当的功能关系支持和/或容纳侧向流装置的基本组分的任何物理形式。
侧向流装置的特定实施方案的基本组分是样品垫、缀合物垫、迁移膜和吸收垫。
样品垫是最初接收样品的侧向流装置的组分，并且可以用来从样品中去除颗粒。若较大的床体积是特定应用中的因素，则可用于构建样品垫(例如玻璃纤维、编织纤维、筛、非编织纤维、纤维素纤维或纸)或纤维素样品垫的各种材料之一可以是有益的。样品垫可用一种或多种脱模剂处理，例如缓冲剂、盐、蛋白质、清洁剂和表面活性剂。此类脱模剂可用于例如促进缀合物-垫成分的再溶解，以及阻断侧向流装置的其他组分，例如硝酸纤维素膜中的非特异性结合位点。代表性的脱模剂包括例如海藻糖或葡萄糖(1％-5％)、PVP或PVA(0.5％-2％)、Tween 20或Triton X-100(0.1％-1％)、酪蛋白(1％-2％)、SDS(0.02％-5％)和PEG(0.02％-5％)。
就迁移膜而言，可用于侧向流装置的膜的类型包括但不限于硝酸纤维素(包括纯硝酸纤维素和改性硝酸纤维素)和聚酯支持物、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)或尼龙上的硝酸纤维素直接铸塑。
缀合物垫尤其用于保持检测器试剂。用于缀合物垫的合适材料包括玻璃纤维、聚酯、纸或表面改性的聚丙烯。
缀合物垫中含有的检测器试剂通常在施加测试样品后释放到溶液中。缀合物垫可以用各种物质处理以影响检测试剂向溶液中的释放。例如，可以用PVA或PVP(0.5％至2％)和/或Triton X-100(0.5％)处理缀合物垫。其他脱模剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、SDS、Brij和β-乳糖。在任何给定的应用中可以使用两种或更多种脱模剂的混合物。
就吸收垫而言，吸收垫的作用为增加进入装置的样品的总体积。此增加的体积可用于例如从膜上洗去未结合的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物、或其缀合物或衍生物)。多种材料中的任一种可用于制备吸收垫，例如，纤维素滤器或纸。在一些装置的实施方案中，吸收垫可以是纸(即，纤维素纤维)。本领域技术人员可以例如基于其厚度、可压缩性、可制造性和床体积的均匀性来选择纸吸收垫。可以通过改变吸收垫的尺寸(通常是长度)来调节制成的吸收剂的体积吸收。
在侧向流装置的具体实施方案的操作中，将流体样品应用于样品垫，所述流体样品包含目标小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)，例如一种或多种本文所述的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)。在一些示例中，可以通过将含有样品垫的装置的末端浸入样品(例如尿液)中或者通过将样品直接施加到样品垫上来将样品施加到样品垫上。
样品例如通过毛细管作用从样品垫到达缀合物垫。在缀合物垫中，小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)可以结合动员或可动员的检测器试剂(或者被该检测器试剂结合)，例如抗体(例如识别本文所述的一种或多种小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的抗体)。例如，小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)可以结合缀合物垫中含有的标记的(例如，金缀合的或有色的乳胶颗粒缀合的)抗体。与检测器试剂复合的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)可随后流向测试线，其中复合物可进一步与近端测试线处固定化的小分子(例如代谢物、NRTI或本文中所述的任何化合物)-特异性结合配偶体(例如结合特定蛋白质的抗体，抗半抗原抗体或链霉抗生物素蛋白)相互作用。在一些示例中，与检测器试剂(例如金缀合抗体)复合的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)可进一步结合近端测试线处固定化的未标记的氧化抗体。检测到复合物的形成，所述复合物的形成源自标记物(例如，金或有色乳胶)在近端测试线的局部区域中的积累。对照线可以含有固定化的检测器-试剂特异性的结合配偶体，其可以在存在或不存在小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的情况下结合检测器试剂。即使在不存在目标小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)的情况下，在对照线处的此类结合指示测试的正确进行。
在一个实施方案中，对照线检测IgG、IgD、IgA之一或尿液的另一种成分的存在。在一个实施方案中，对照线检测糖蛋白、分泌性IgA、乳铁蛋白、溶菌酶和过氧化物酶之一或唾液的另一种成分的存在。
测试结果可以直接可视化，或者可以使用阅读器(例如扫描仪)进行测量。阅读器装置可以从读取区域(例如，测试线和/或对照线)检测颜色、荧光、发光、放射性或源自标记试剂的任何其他可检测标志物。
在侧向流装置的另一个实施方案中，在测试结果中可以存在定位为与测试线平行或垂直(或呈任何其他空间关系)的第二(或第三、第四或更多)测试线。该具体实施方案的操作与本文其他地方描述的操作类似，另外考虑以下因素：(i)缀合物垫中也可以含有对第二小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)具有特异性的第二检测器试剂，例如另一种抗体，并且(ii)第二测试线将含有对第二小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)，例如样品中的第二小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)具有亲和力的第二特异性结合配偶体。类似地，若包括第三(或更多)测试线，则该测试线会含有对第三(或更多)小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物)具有亲和力的第三(或更多)特异性结合配偶体。
在一个实施方案中，对照线与测试线的比较产生来自本发明的诊断系统的测试结果。在某些情况下，当以比测试线更高的强度水平检测对照线时，出现有效结果。例如，当对照线比测试线暗至少5％或更多(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)时出现有效结果。在某些情况下，当对照线比测试线暗至少0.5倍或更多倍，例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多时出现有效结果。
护理点诊断和风险评估系统
本发明的系统可以应用于护理点场景。美国专利号6,267,722、6,394,952和6,867,051公开并描述了用于诊断和评估某些医学风险的系统，其内容并入本文。该系统设计用于检查和测试患者的护理点现场使用以及用于远离现场的操作。该系统设计为接受患者数据形式的输入，包括但不限于生化测试数据、物理测试数据、历史数据和其他此类数据，并处理和输出信息，例如与医学诊断有关的数据或疾病风险指标。患者数据可以包含在系统中，例如病历或病史，或者可以作为来自医学测试或程序的信号或图像输入，例如免疫分析测试数据、血压读数、超声、X射线或MRI，或以任何其他形式引入。可以将特定的测试数据数字化，处理并输入到医学诊断专家系统中，在此它可以与其他患者信息集成在一起。自系统的输出是疾病风险指数或医学诊断。
护理点测试是指可以在快速时间范围内完成的实时诊断测试，因此与不使用此系统的可比较测试相比，所得的测试进行得更快。例如，本文公开和描述的示例性免疫测定法可以比相应的ELISA测定法在显著更少的时间中进行，例如在少于半小时中。另外，护理点测试是指可以在现场快速进行的测试，例如在诊室、床旁、统计实验室、急诊室或其他此类场所，特别是在需要快速准确结果的地方。
在示例性实施方案中，护理点诊断和风险评估系统包括用于读取患者数据的阅读器、被设计为在阅读器中读取的测试装置以及用于数据分析的软件。塑料壳体中的测试条装置设计为与阅读器一起使用，任选包含符号系统，例如字母数字字符条形码或其他机器可读代码，并且还提供了设计为分析从测试条产生的数据的软件。
在一个实施方案中，阅读器是指用于检测和/或定量数据的仪器，例如在测试条上。数据可以是肉眼可见的，但不必是可见的。在以上并入的美国专利号6,267,722，6,394,952和6,867,051中公开和描述了此类阅读器。反射率阅读器是指适用于使用反射光(包括荧光或任何波长的电磁辐射)读取测试条的仪器。可以使用光检测器或其他检测器(例如电荷耦合二极管(CCD))检测反射率。示例性反射率阅读器包括适于接受测试条的盒槽、发光二极管、光纤、感测头，包括用于沿着测试条定位感测头的手段、读取光检测器输出并控制发光二极管的开启和关闭操作的控制电路、用于存储原始和/或加工数据的存储电路以及光检测器，例如硅光电二极管检测器。应当理解，颜色变化是指颜色的强度或色调的变化，或者可以是不存在颜色或颜色消失的颜色的外观。
在一个实施方案中，将样品施加到诊断免疫测定测试条，并产生有色或暗带。对于目标浓度范围，在测试条的测试区域(或检测区域)中有色标记物反射的颜色强度与存在于测试的样品中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其缀合物或衍生物)的量成正比或以其它方式相关联。根据本实施方案，使用适合于读取测试条的阅读器装置，例如反射率阅读器，读取产生的颜色强度。在测试条的测试区域(或检测区域)中有色标记物反射的颜色强度与存在于测试的样品中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物、其缀合物或衍生物)的量成正比。换言之，测试区域中较暗颜色的线指示较小量的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物，或其缀合物或衍生物)，而测试区域中较浅颜色的线指示较大量的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物或其缀合物或衍生物)。目测或使用适合于读取测试条的阅读器装置，例如反射率阅读器，读取所产生的颜色强度，即颜色线的暗度或明度。
由阅读器装置获得的反射率测量与样品中存在的小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物，或其缀合物或衍生物)的存在、不存在和/或数量相关。阅读器沿着条读取多个读数，并获取用于生成结果的数据，所述结果指示存在于样品中的小分子(例如代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物、或其缀合物或衍生物)的存在、不存在和/或数量。系统可以将此类数据与病症、状况或其风险的存在相关联。
如本文其他地方所述，除了读取测试条之外，阅读器还可以(任选地)适于读取符号系统，例如条形码，其存在于测试条或壳体上并且编码涉及测试条装置和/或测试结果和/或患者和/或试剂的信息或其他期望的信息。通常，关联的信息存储在远程计算机数据库中，但可以手动存储。此外，当使用该装置并在其中编码信息时，可以打印符号系统。
健康概况
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定包括对一种或多种医学方案的遵守的因素以产生受试者的健康概况。在一个实施方案中，医学方案是一种预防方案。因此，本发明的特征在于用于鉴定有形成状况的风险的受试者的方法，对于所述状况，通过检测因素并且评估本文公开的健康概况来规定一种或多种预防性药物。这些因素或其他方面健康状况也可用于监视经历治疗和疗法的受试者，以及用于当可用可接受备选时选择或修改疗法和治疗为备选，所述备选在具有低遵守率的受试者中会是有效的。
可以通过测量一种或多种本文所述的因素，并将因素的存在和值与参考值或指数值进行比较来评估形成HIV的风险。可以用数学算法或公式进行此类比较，以便将来自多个个别因素和其他参数的结果的信息组合成单个测量或指数中。可以任选地选择鉴定为具有增加的HIV风险的受试者，以接受咨询，增加的监测频率或治疗方案，例如施用治疗性化合物。任选地，具有HIV的受试者可以相对于他们的个人健康概况选择为接受咨询或增加的监测频率。
因此，本发明的因素可用于产生受试者的健康概况或签名：所述受试者(i)没有HIV或预期不形成HIV和/或(ii)具有HIV或预期形成HIV。可以将受试者的健康概况与预定概况或参考概况进行比较，以诊断或鉴定有形成HIV风险的受试者，监测对预防方案的遵守以及监测NRTI或其他预防性药物的有效性。关于本发明的因素的数据也可以与其他数据或测试结果组合或相关联，例如但不限于临床参数的测量或HIV的其它算法。
从本文所述的本发明的方法获得的信息可以单独使用，或者与来自受试者或来自得自受试者的生物样品的其他信息(例如年龄、种族、性取向、生命体征、血液化学等)组合使用。
本发明的各种实施方案描述了配置为在多个时间点监视、跟踪和报告个体中预防性药物水平的机制。在一个实施方案中，该系统允许从来自个体的多个样品中收集与预防治疗方案相关的代谢物的存在的数据。当在来自单一个体的随后样品中检测与预防性药物相关的代谢物水平的变化(即增加或减少)时，系统可以给用户/评估者通知形成规定的预防性药物针对的病症或状况的风险的可能性。例如，在某些实施方案中，系统在服用预防性药物后第1、2、3和4天记录用户/评估人员输入系统中或系统自动记录的代谢物的存在，并应用算法识别模式，其预测在缺乏其他预防性药物的干预施用的情况下，个体有感染病症的高风险的日子。例如，算法分析可以在中央(例如，基于云的)系统中进行。可以将上传到云的数据存档和收集，以便学习算法根据所有患者的集体数据集优化分析。在一些实施方案中，该系统组合量化的临床特征和生理学，以帮助基于收集的数据客观、早期和至少半自动地诊断风险。
在一些实施方案中，系统供个人使用并由个体受试者跟踪。在一些实施方案中，将来自系统的数据上载到中央系统，并且提供者评估数据并做出诊断或推荐。在一些实施方案中，提供者可以通过POCT系统和远程评估者计算系统之间的实时数据馈送来进行实况分析。
系统具有几个优点。为了方便起见，系统在电子装置(例如电子手持装置或甚至可穿戴数据收集装置)的上下文中可以是试剂盒或应用程序的形式。系统也对提供商有利。提供者可以在家中，上下班期间或在其它情况下离开诊所时评估对治疗方案的遵守。此外，提供者可以批准继续使用预防剂而无需诊所访视，条件是个人遵守了规定的方案。针对会提示个体可能有增加的风险的治疗遵守的瞬时失误，系统也可以改变提供者或个人自身。
在某些实施方案中，系统用于跟踪个人的进行的进展。为了实现此类进行的评估，在一些实施方案中，可以使评估应用经由网络可访视的内容存储，其他内容存储库或其他内容集合下载到可穿戴数据收集装置或在可穿戴数据收集装置上流式传输。本质上，内容的范围可以从简单的文本、图像或视频内容等到完全复杂的软件应用程序(“应用程序”)或应用程序套。内容可以免费获得或基于订阅。内容可以是独立的，可以基于其播放内容的现有能力(例如显示文本、图像、视频、应用等的内置能力以及收集数据的能力)在可穿戴数据收集装置上播放，或可以在旨在整合来自内容提供商的内容的内容使能框架(content-enabling framework)或平台应用程序中播放或部署。此外，内容消费者可以包括有感染HIV的风险的个人或其家人，以及希望将系统模块并入其专业实践中的临床医生、内科医生和/或教育工作者。
在一个实施方案中，可以在蜂窝电话、平板计算机、台式计算机等上实现本发明的评估HIV感染风险的系统。在某些实施方案中，除了评估之外，系统的一个或多个模块还提供了支持个人应对HIV及其特征的训练机制，例如，在某些情况下，当接收急救或对具有HIV的个体提供急救时提供帮助采用动作的训练机制。
在一个实施方案中，本发明的系统可以在电子病历数据库/软件中的幕后自动运行的介质中，从而若指定数据来提示警报，则自动发生通知。
在另一个实施方案中，本发明的系统可以为包含“机器学习”的形式，因此随着输入更多信息并开发新的类似物，过程和比较器得以更新和改进。
在一些实施方案中，本发明可以应用于评估患者对含有TFV的方案的顺从性，以治疗或预防乙肝病毒。
疾病
在一个实施方案中，可以向被诊断为具有HIV的人开包含一种或多种的NRTI的药物以治疗HIV。在一个实施方案中，可以向有感染HIV风险的个体开包含一种或多种NRTI的药物，该药物每日服用以作为预防措施，以减少因暴露事件而感染HIV的风险。此类个体可以是诊断为具有HIV的个体的亲戚。此类个体可以是诊断为具有HIV的个体的长期护理提供者。此类个体可以是诊断为具有HIV的个体的短期护理提供者。此类个体可以是诊断为具有HIV的个体的居住或非居住配偶。在某些情况下，此类个体可以参与涉及HIV或用于治疗或预防HIV的药物的研究。在一些实施方案中，人可以诊断为具有乙肝病毒并由于与以上针对HIV给出的原因相似的原因而开NRTI。
在一个实施方案中，本发明提供了用于快速确定个体最近是否(例如，在一周内)服用NRTI的系统。在一个实施方案中，测试结果可以用于确定个体是否服用了如由提供者或研究经理开的包含一种或多种NRTI的药物。在一个实施方案中，测试结果可以用于确定个体在暴露事件中是否具有感染HIV的高风险。
一方面，本发明是有用的，因为确定个体对规定的预防或治疗计划的遵守水平可以向医生告知该个体的未来治疗计划。一方面，本发明是有用的，因为确定个人对研究的遵守水平可以向研究人员告知新的NRTI药物功效收集的数据的有效性。例如，若参加测试新NRTI的研究的个人使用了本发明，并且测试结果指示该人已按照规定服用了NRTI，则提供研究结果的置信度。或者，若测试结果指示个体未按照规定服用NRTI，则研究人员可以确定该个体应从正在进行的研究中移除。
在一个实施方案中，可以提供激励方法以改善对规定计划的遵守，其中以任何方式激励个体服用包含NRTI的药物，并且本发明用于监测对规定计划的遵守。激励方法是本领域公知的，包括但不限于金钱补偿和游戏化。
在一个实施方案中，本发明涉及用于其他药物的尿液测定法，包括最终用作预防剂或PrEP剂的其他药物。在一个实施方案中，本发明涉及用于其他药物的护理点测定法，包括最终用作预防剂或PrEP剂的其他药物。
施用
在一些实施方案中，将如本文所述的测定法或系统施用于采取预防的患者。在一些实施方案中，将如本文所述的测定法或系统施用于采取暴露前预防的患者。在一些实施方案中，将如本文所述的测定法或系统施用于服用NRTI如TDF和/或FTC的患者。在一些实施方案中，将如本文所述的测定法或系统施用于服用NRTI如TAF和/或FTC的患者。在一些实施方案中，将如本文中别处描述的测定法或系统施用于服用TruvadaTM或配制为含有TDF和/或TAF的任何其他药物的患者。
在一些实施方案中，在访视卫生保健提供者或设施期间，由提供者在临床环境中将本发明的测定法或系统施用于患者。在一些实施方案中，患者在临床环境之外使用测定法或系统。在一些实施方案中，在临床环境之外使用测定法或系统的患者将结果告知内科医生。在一些实施方案中，在临床环境之外使用测定法或系统的患者这样做不依赖于向内科医生报告结果。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，除非另有规定，否则它们不意图构成限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和以下示例性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例1
TFV衍生物(或TFV类似物)
TFV衍生物T1由Organix，Inc.(Woburn，MA)合成，其验证了图1所示的TFV衍生物的合成路线。
以前已经描述过类似物合成(27，29)。到T1的合成路线在图2中示出。按照公开的文献方法(27，28)，在五个步骤中合成化合物1.1，(R)-2-((二异丙氧基磷酰基)甲氧基)丙基4-甲基苯磺酸盐化合物。1.1与6-氯-9H-嘌呤缩合，然后用乙二胺处理，以优异的产率(72％)给出胺衍生物1.3。中间体1.3中的氨基部分与酸衍生物1.4b的偶联以90％的产率给出相应的酰胺衍生物1.5。中间体1.5中的异丙基和三苯甲基保护基团的脱保护给出期望的靶物T1。
这种通用的合成路线也已得到验证，并且可用于合成靶物T2-T6。每种TFV衍生物产生约＞50mg，并通过1H-NMR、LC-MS/MS和元素分析进行了分析验证，以确认其结构和分子量与TFV衍生物一致。在进行生物学评估和随后用作免疫原之前，每种TFV衍生物产生≥95％纯度。
实施例2
TFV衍生物(或TFV类似物)的缀合物以生成抗体
将实施例1中所述的TFV衍生物缀合至载体蛋白以进行兔免疫和制备检测器缀合物。适合于免疫和产生抗体的其他动物是本领域众所周知的，并且是可商购的，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、鸡和山羊。
为了制备免疫原，将TFV衍生物缀合到钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)中。KLH和BSA是用于生产小分子Ab的载体蛋白，并使用已公开的方法(30，31)生成。其他合适的载体蛋白是本领域众所周知的，并且是可商购的。
还使用TFV衍生物制备HRP缀合物以用于ELISA使用。使用标准硫醇/马来酰亚胺偶联化学方法将蛋白质(半抗原和HRP缀合物)和药物衍生物连接在一起。通过将衍生物与马来酰亚胺标记的HRP连接来生成HRP。利用完善建立的程序(32)制备缀合物。
为了生成抗血清，随后一旦合成TFV衍生物并且与KLH缀合就用它们免疫兔。将所有TFV衍生物的性能作为HRP与生成的抗体的缀合物进行评估。
实施例3
针对TFV衍生物缀合物制备的多克隆抗体的生成和筛选
使用来自实施例2的TFV衍生物缀合物的免疫原性组合物开发多克隆抗体(pAb)。pAb的生成和筛选由Calico BioLabs(Pleasanton，CA)进行。进一步开发了这些pAb和ELISA以证明原料合格并选择将用于单克隆抗体(mAb)生产的兔。
兔抗体适用于临床检测法，并且在特异性、亲和力和稳定性方面通常超过其啮齿动物对应物(33-36)。尽管有时优选较大的动物，例如绵羊、山羊和驴，因为它们为pAb生成提供了更大的血量，但兔mAb的特异性通常高于其他物种的特异性。可以快速且成本有效地生成兔mAb，并且新技术正在用于简化和改进这些过程。小鼠mAb通常具有nm范围(10-9M)的亲和力，但是通常可以在pm范围内以10-10M或甚至10-12M的亲和力常规生成兔mAb，比小鼠mAb高10至＞1000倍。兔是一种优越的选择物种，并且是生成多克隆和单克隆测定试剂两者的当前行业标准。
针对包含TFV衍生物缀合物的两种免疫原中的每种免疫两只兔子。使用标准方案对兔进行加强，并从每只兔收集抗血清。注射后以12天间隔从兔收获pAb。利用在1∶16,000稀释时约4倍信噪比的可接受的效价。通常，制备超过95％的对靶小分子(例如，代谢物、NRTI或本文所述的任何化合物、或其衍生物和缀合物)具有特异性的pAb。
通过使用TFV衍生物与琼脂糖珠的缀合的标准程序，通过亲和纯化从血清中分离pAb，然后进行柱层析。从两只兔产生约50mg亲和纯化的pAb。分离的pAb命名为“312”和“313”。
在下文所述的ELISA测定中测试pAb。最终的pAb具有一条具有适当斜率以允许在目标截留浓度附近进行+/-25％的分离的测定曲线。可接受的PAb也具有目标截留附近的+/-50％的分离。
实施例4
多克隆抗体的验证和ELISA测定法
为了验证实施例3中产生的pAb，将来自实施例3的纯化的pAb用于原型测定法开发。使用实施例2中产生的HRP试剂和纯TFV作为对照，筛选并评估用于抗体特异性和亲和力的早期出血。产生一条曲线，并且鉴定抗体，该抗体具有1％截留的检测限(10ng/mL，因为通过LC-MS/MS将TFV保护水平的截留测定为1000ng/mL)。
生物样品
将尿液样品收集并且脱鉴定(de-identified)，所述尿液样品包含50份已知的TFV阳性样品和50份来自未服用PrEP的个体的阴性样品。在CHOP LC-MS/MS仪上对脱鉴定的样品的TFV水平进行量化(17)。阳性样品的截留是TFV水平＞1000ng/mL。在3个月时段内收集133个残余尿液样品。来自已知未服用TFV的患者的尿液样品用作阴性对照，以评估与尿液中任何成分的抗体交叉反应性。
竞争ELISA测定法
为了测试多克隆抗体，使用以下测定方案进行竞争测定法。在该测定法中，药物浓度与产生的信号成反比。用抗TFV抗体包被微量滴定板，然后将TFV标准品或患者样品(有或没有药物)或TFV阳性尿液与HRP-TFV衍生物缀合物混合，并允许自由竞争板上的抗体。使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物检测溶液，然后用酸终止反应。在450nm处测量吸光度，并且通过与TFV标准曲线比较的颜色强度确定药物浓度。
由于该测定法使用竞争形式，因此无需担心用三明治式测定法看到的随机背景结合。主要问题是可以从没有明显结构相似性的物质发生的交叉反应性。用尿液库中的临床样品评估ELISA的特异性，这证实呈TFV阴性以建立基线特异性性能。鉴定与交叉反应性或基质干扰有关的问题，并产生了“有问题的”样品库。该库进一步用作最终标准的一部分，以从产生的一系列mAb克隆中进行选择。通过测试100个已知为TFV阳性的样品来评估测定法的灵敏度：50个掺加50％的截留浓度的纯化的TVF的TVF阴性血清样品，以及50个以150％的截留掺加的样品。建立了用于多克隆测定法的中间性能，以提供判断mAb性能改善的基线。
竞争性ELISA进一步针对尿液TFV质谱测试进行了验证，该测试具有先前验证的1000ng/mL截留。MS测试可以充当标准品，以在100个独特的掺加的样品外用50个TFV阳性的存库临床样品和50个存库阴性样品产生对于我们的灵敏性和特异性目标足够的能力。
ELISA可以以灵敏性＞90％和特异性＞90％检测具有已知浓度的尿液库样品中的TFV。此ELISA可用作评估和量化mAb的对照系统。
测定方案和程序
A.缀合物HRP
缀合物：
1.在5ml PBS中重建5mg EZ-Link马来酰亚胺活化的HRP粉末＝＞1mg/mL
2.向Eppendorf管添加1mg HRP＝＞1mL
3.向管添加1mg衍生物＝＞50uL
4.允许在室温下温育3小时
重力滤器-PD10柱：
5.取下顶盖并倒出柱存储
6.切下柱缺口的密封末端
7.用平衡缓冲液填充柱-5mL
8.允许缓冲液完全进入填充床
9.重复4次
10.添加样品并添加平衡缓冲液至总计2.5mL
11.让样品完全进入床并在收集管中收集流过物
12.在装置下放置收集管并洗脱
13.用3.5mL缓冲液洗脱
14.收集洗脱液并储存于4C
15.用StabilZyme HRP缀合物稀释至适当浓度＝＞1∶1,000
B.替诺福韦(TFV)标准品系列
替诺福韦-Sigma Aldrich#SML1795
1.测量10mg粉末到15mL锥形管中
2.添加10mL水＝＞浓度1mg/mL
3.在PBS中准备适当的稀释液
-2,000ng/mL标准品
-1,000ng/mL标准品
-500ng/mL标准品
-10ng/mL标准品
C.ELISA方案-抗体包被的板形式
1.用.5ug/孔的抗体包被Greiner Bio-one聚苯乙烯96孔板
-50μl/孔在PBS中1∶100的抗体313稀释液
2.允许在室温下温育2小时或在4℃过夜
3.用AquaMax 2000洗板机在TBST(.1％Tween20/TBS)中洗板200μl/孔4X。
4.在室温下用200μl孔的TBST中的2％BSA封闭1小时
5.从孔中吸出封闭缓冲液
6.向孔添加50μl TFV标准品或样品
-一式两份分配每个样品或标准品
7.在室温下温育30分钟
8.添加浓度1∶1,000的50μl HRP缀合物
9.充分混合并在室温下温育1小时
10.从孔中抽吸体积
11.用AquaMax 2000洗板机在TBST(.1％Tween20/TBS)中洗板200μl/孔4X。
12.添加50μl TMB
13.在室温下温育5分钟
14.添加50μl终止溶液(.25M硫酸)
15.使用SpectraMax I3X在450nm处读取板
结果
ELISA结果描绘于表2和图3。表2中的数据代表在指定浓度在PBS中稀释的游离药物(替诺福韦)的标准曲线。抗体“312”和“313”能够产生可接受的校准曲线，并允许1,000ng/ml的截留附近的解析。对于抗体313，500和1,000ng/ml之间有7.54个标准偏差分离(CV＝12.0％)，并且1,000和2,000ng/ml之间有6.28个标准偏差分离(CV＝4.4％)。这指示抗体312和313针对替诺福韦具有足够的灵敏性。
表2
ELISA结果
标准品 pAb 312 pAb 313
10 1.18 1.306
500 0.749 0.642
1,000 0.493 0.463
2,000 0.286 0.328
实施例5
多克隆抗体对替诺福韦的特异性
基于50个对替诺福韦呈阳性的临床尿液样品(在验证的LC-MS上尿液TFV水平＞1,000ng/mL)和50个对替诺福韦呈阴性的临床尿液样品(在验证的LC-MS上尿液TFV水平＜10ng/mL)，表3中的数据比较了每种抗体的特异性。多克隆抗体312和313两者均正确地将50个样品中的50个鉴定为TFV阳性。对于TFV阴性样品，抗体312与50个样品中的27个样品有交叉反应，而抗体313与50个样品中的24个样品有交叉反应。这指示pAb 313比pAb 312具有略小的交叉反应性。
表3
抗体312和313特异性的比较
抗体312(+) LC-MS(+) LC-MS(-)
(+) 50 27
(-) 0 23
抗体313(+)
(+) 50 24
(-) 0 26
为了鉴定引起交叉反应性的化合物，将潜在交叉反应性的化合物(与TFV具有相似化学结构的化合物)掺加在缓冲液中，并用pAb对其进行测试。我们测试了11种化合物，并且针对每种抗体对表3中的每种物质计算其百分比交叉反应性。相对于pAb 312中的三种，已鉴定出四种与pAb 313表现出某种交叉反应性测量的化合物。由于本文所述的重组和亚克隆单克隆抗体可针对这些化合物进行筛选，因此该数据为相对于pAb 312用pAb 313进行mAb开发提供了进一步的理由。
表4
pAb 313和312的交叉反应性
Figure BDA0002539859150000691
结论：
基于这些验证研究的结果，证实了由本文所述的衍生物缀合物产生的抗体对游离TFV和尿液临床样品中的TFV均灵敏。进一步选择pAb“313”作为生产mAb的候选者，若需要的话，选择返回到pAb“312”。
实施例6
测量服用替诺福韦艾拉酚胺的患者中替诺福韦水平的尿液测定法的验证
从3个患者分组中采集血液和尿液样品：(1)10名按照基于TAF的方案具有受抑制的病毒的HIV阳性参与者；(2)10名施用1剂FTC/TAF，然后从给药后1-3小时开始进行尿液和血浆采样7天的HIV参与者，以及(3)10名施用每日7剂FTC/TAF，然后从最后一剂后1-3小时开始进行尿液和血浆采样10天的HIV参与者。采用对TFV具有高灵敏度和特异性的液相层析-串联质谱法(LC-MS/MS)分析样品。将来自分组2的样品与施用一剂FTC/TDF的历史分组进行比较。
HIV阳性参与者为90％的男性，40％的非洲裔美国人和10％的西班牙裔(中位年龄＝53.5y；范围＝51-79y)。HIV治疗方案包括TAF加以下药物之一：杜鲁特韦(dolutegravir)(3)，加强型埃替格韦(elvitegravir)(3)，加强型达芦那韦(darunavir)(2)，雷特格韦(raltegravir)(1)或利匹韦林(rilpivirine)(1)。HIV阴性参与者为55％的男性和70％高加索裔(中位年龄＝30.5y；范围＝23-47y)。来自HIV阳性参与者的尿液样品显示，尿液中的TFV浓度比血浆中的TFV浓度高2个对数(分别为1000ng/mL对10ng/mL)(图4)。在HIV受试者中单剂FTC/TAF后的尿液样品在给药后1-3小时产生范围为100-1000ng/mL的TFV浓度，在10名参与者的8名中，TFV浓度保持＞100ng/mL达6天。这些浓度与来自施用FTC/TDF的历史分组的浓度相当，尽管在接受FTC/TDF的受试者中，药物摄入后尿液中TFV的浓度上升更快，并且与接收FTC/TAF的受试者相比，在停药后的前4天平均而言更高(图5)。连续7剂FTC/TAF后收集的尿液样品在中断给药后1-3小时产生TFV浓度＞1000ng/mL，在10名参与者的8名中TFV水平＞100ng/mL直至停药后7天(图6)。在所有时间点，两个HIV阴性分组中的血浆TFV浓度均较低(≤10ng/mL)。
尽管血浆水平很大程度上检测不到，但在服用FTC/TAF的患者中，TFV以可检测的浓度在尿液中持续存在至少7天，尿液TFV浓度与服用FTC/TDF的患者相当。鉴于本研究中相对于稳态TFV浓度模式的单剂差异，这项研究证明了使用尿液TFV测定法评估TAF遵守的可行性，具有减少的“白大褂”遵守的机会。未来的研究应解决基于TDF和TAF的方案之间尿TFV清除模式的差异。
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引用合并
贯穿本申请引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容，以及附图和序列表的内容在此通过引用整体并入，就像每个单独的出版物或专利都具体且单独并入一样。在有冲突的情况下，可以以本申请(包括本文的任何定义)为准。
等同方案
本领域技术人员将理解，可以在不脱离所附权利要求书所阐述的本发明的精神和范围的情况下对其进行形式和细节的各种改变。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。虽然已经讨论了本发明的特定实施方案，但是以上说明书是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求书，其等同方案的全部范围和说明书以及此类变化来确定。此类等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。
序列表
<110> 尤休尔股份有限公司
<120> 用于监测对核苷逆转录酶抑制剂疗法的遵守的产品和方法
<130> U1214.70003WO00
<140> 尚未分配
<141> 与说明书一起
<150> US 62/572,126
<151> 2017-10-13
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Asp Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser
20 25 30
Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Gly Asn Tyr Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Ser Asn Tyr Trp Thr Thr Ser Val Asn Tyr Gly Pro Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Glu Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 2
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn
35 40 45
Arg Tyr Ser Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Arg Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Thr Gly Thr Ser Ile Ala Thr Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys
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Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile
275 280 285
Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln
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Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro
340 345 350
Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser
355 360 365
Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser
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Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr
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Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
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Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Asn Val Tyr Lys Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Ala Tyr Asp Cys Arg Ser Gly Asp Cys Arg Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 4
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Asn Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Ile Phe Ser Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Gly Ser Thr Ala Lys Gly Asp Arg Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Glu Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Ser Asn Tyr Tyr Ser Arg Ser Thr Asn Tyr Val Val Pro Phe Gly Gly
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Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
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Ile Phe Pro Pro Ser Ala Asp Leu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
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Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 6
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Ser Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Trp Ala Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Gly Arg Val Thr Ser Asn Gly Asp Asn Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
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Pro Pro Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
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Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
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Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
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Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
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Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
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Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
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Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
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Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaggtac acatgttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgttag 660
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<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
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Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
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Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro
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Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
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Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
305 310 315 320
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
325 330 335
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
370 375 380
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
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Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
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Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
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<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120
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gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gaggccctac cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca 360
cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 420
ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 480
tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 540
agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 600
gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 660
aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 720
aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 780
aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 840
cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 900
atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 960
ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1020
gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1080
atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1140
gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1200
agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1260
ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1320
tga 1323
<210> 11
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Tyr Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser
20 25 30
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
35 40 45
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
50 55 60
Gln Ser Asn Tyr Trp Thr Thr Ser Val Asn Tyr Gly Pro
65 70 75
<210> 12
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Ile Asp Leu Asn Arg Tyr Ser Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Arg Thr Gly Thr Thr Trp
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Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Gly Thr Ser Ile Ala Thr Asp Ile
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<210> 13
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Ser Ser Gln Asn Val Tyr Lys Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu
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Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln
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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr
50 55 60
Tyr Cys Ala Gly Ala Tyr Asp Cys Arg Ser Gly Asp Cys Arg Ala
65 70 75
<210> 14
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asn Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly Tyr Ile Phe Ser Thr Gly Phe Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr
35 40 45
Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr
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<210> 15
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
35 40 45
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
50 55 60
Gln Ser Asn Tyr Tyr Ser Arg Ser Thr Asn Tyr Val Val Pro
65 70 75
<210> 16
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Phe Ser Leu Ser Ser Ser Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Arg
20 25 30
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser
35 40 45
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50 55 60
Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Val Thr Ser Asn Gly Asp Asn Asn Ile
65 70 75
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Tyr Cys Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Ile Asp Leu Asn Arg Tyr Ser Val Gly
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Gln Ser Ser Gln Asn Val Tyr Lys Asp Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asn Met Gln
1 5
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Phe Ser Leu Ser Ser Ser Ser Met Gly
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Tyr Ile Tyr Arg Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Val
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Tyr Ile Phe Ser Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Gln Ser Asn Tyr Trp Thr Thr Ser Val Asn Tyr Gly Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Thr Gly Thr Ser Ile Ala Thr Asp Ile
1 5
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Ala Gly Ala Tyr Asp Cys Arg Ser Gly Asp Cys Arg Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Gly Ser Thr Ala Lys Gly Asp Arg Asp Ile
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gln Ser Asn Tyr Tyr Ser Arg Ser Thr Asn Tyr Val Val Pro
1 5 10
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Val Thr Ser Asn Gly Asp Asn Asn Ile
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Glu Ala Leu Pro Tyr
1 5
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115

Claims (104)

1.特异性结合替诺福韦的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中所述轻链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:17、19、21和23的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:25、27、29和31的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:33、35、37和39的氨基酸序列。
2.特异性结合替诺福韦的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中所述重链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:18、20、22和24的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:26、28、30和32的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:34、36、38和40的氨基酸序列。
3.权利要求1或权利要求2的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:12、14、16或42所示的可变重链氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:11、13、15或41所示的可变轻链氨基酸序列。
5.抗体制剂，其包含权利要求1-4中任一项的抗体。
6.权利要求5的抗体制剂，其中所述制剂是单克隆抗体制剂。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项的重链或轻链。
8.权利要求7的分离的核酸，其中所述核酸选自克隆载体、表达载体、异源重组载体和病毒整合载体。
9.用权利要求7-8中任一项的核酸转化的细胞。
10.权利要求9的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述细胞是选自兔、仓鼠、小鼠、大鼠、鸡、山羊、猴、绵羊、猪、马、牛和人的细胞。
12.检测受试者的生物流体样品中的替诺福韦的方法，其包括使权利要求1-4中任一项的抗体与来自所述受试者的生物流体样品接触。
13.权利要求12的方法，其中对所述受试者开NRTI或施用NRTI。
14.权利要求12的方法，其中所述生物流体样品是尿液。
15.用于进行测定法以检测患者的流体样品中的代谢物的方法，其中对所述患者开NRTI或施用NRTI，包括：
(a)将流体样品施加到样品垫；
(b)使所述样品沿着所述样品垫侧向流到缀合标记物垫；其中所述缀合标记物垫包含与可检测标记物缀合的第一试剂，并且其中所述缀合标记物垫的一部分和所述样品垫的一部分形成第一界面；
(c)使所述样品沿着所述缀合标记物垫侧向流到膜；其中所述膜的一部分和所述缀合标记物垫的一部分形成第二界面；其中所述膜包含至少一种第二试剂，所述第二试剂结合到所述膜以形成测试线；
(d)将所述第一试剂与所述第二试剂结合以在所述测试线处形成第二试剂-第一试剂复合物，并使所述可检测标记物在所述测试线处形成可检测信号，
(e)在存在可检测信号的情况下将所述患者诊断为不遵守治疗或预防方案；或在缺乏可检测信号的情况下诊断为遵守治疗或预防方案。
16.用于进行测定法以检测患者的流体样品中的代谢物的装置，其中对所述患者开NRTI或施用NRTI，包含：
(a)用于接触所述流体样品的样品垫；
(b)缀合标记物垫，所述缀合标记物垫具有与可检测标记物缀合的第一试剂，该缀合标记物垫的一部分和所述样品垫的一部分形成第一界面；
(c)包含膜的测定法，所述膜的一部分和所述缀合标记物垫的一部分形成第二界面；和
(d)与膜结合以形成测试线的至少一种第二试剂，所述第一界面允许流体从所述样品垫流到所述缀合标记物垫并且接触所述可检测标记物，所述第二界面允许流体从所述缀合标记物垫流到所述膜，并接触所述至少一种膜结合的第二试剂以形成第二试剂-第一试剂复合物，并且引起所述可检测标记物在所述测试线处形成可检测信号，
其中可检测信号的存在指示所述患者不遵守治疗或预防方案，并且其中可检测信号的缺乏指示所述患者遵守治疗或预防方案。
17.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中调控所述可检测信号以提供可检测信号的存在指示所述患者遵守治疗或预防方案。
18.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其是侧向流测定法。
19.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其是侧向流免疫测定法。
20.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求70-93中任一项的化合物或其缀合衍生物。
21.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求88的化合物的缀合衍生物。
22.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求92的化合物的缀合衍生物。
23.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求90的化合物的缀合衍生物。
24.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求93的化合物的缀合衍生物。
25.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求89的化合物的缀合衍生物。
26.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求91的化合物的缀合衍生物。
27.权利要求15-26中任一项的方法或装置，其中所述缀合衍生物是缀合有HRP的衍生物。
28.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求1-4或99-103中任一项的抗体。
29.权利要求28的方法或装置，其中所述抗体与可检测标记物缀合。
30.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第一试剂是权利要求1-4或99-103中任一项的抗体。
31.权利要求30的方法或装置，其中所述抗体与可检测标记物缀合。
32.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求70-93中任一项的化合物，或其缀合衍生物。
33.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求88的化合物的缀合衍生物。
34.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中第二试剂是权利要求92的化合物的缀合衍生物。
35.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求90的化合物的缀合衍生物。
36.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求93的化合物的缀合衍生物。
37.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求89的化合物的缀合衍生物。
38.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述第二试剂是权利要求91的化合物的缀合衍生物。
39.权利要求32-38中任一项的方法或装置，其中所述缀合衍生物是缀合有HRP的衍生物。
40.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其进一步包含在所述膜下游的吸收垫。
41.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述膜是硝酸纤维素。
42.权利要求16的装置，其在壳体中提供。
43.权利要求42的装置，其中所述壳体进一步包含用于读取所述可检测信号的开口。
44.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述抗体是多克隆抗体。
45.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述抗体是单克隆抗体。
46.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述抗体是权利要求1-4中任一项的抗体。
47.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述代谢物是TFV。
48.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述膜进一步包含第三试剂，所述第三试剂与所述测试线下游或上游的膜结合以形成对照线。
49.权利要求48的方法或装置，其中所述第三试剂结合所述第一试剂以在所述对照线处引起可检测信号，其中在所述对照线处所述可检测信号的存在指示所述侧向流测定法的适当性能。
50.权利要求48-49中任一项的方法或装置，其中所述第三试剂是抗HRP抗体。
51.权利要求48至50中任一项的方法或装置，其中所述第三试剂是抗兔IgG抗体。
52.权利要求48至50中任一项的方法或装置，其中所述第三试剂是抗小鼠IgG抗体。
53.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其是护理点测试。
54.权利要求16的装置，其是筒。
55.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述流体样品是尿液。
56.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述预防方案是针对NRTI的PrEP。
57.权利要求15的方法或权利要求16的装置，其中所述NRTI选自TDF、FTC和TAF或其衍生物或其组合。
58.权利要求57的方法或装置，其中所述NRTI是TAF。
59.权利要求57的方法或装置，其中所述NRTI是TDF。
60.权利要求57的方法或装置，其中所述NRTI是FTC。
61.权利要求57的方法或装置，其中所述NRTI是TDF/FTC的组合。
62.权利要求57的方法或装置，其中所述NRTI是TAF/FTC的组合。
63.试剂盒，其包含：
(a)用于接收生物样品的样品收集容器；和
(b)用于测定所述生物样品的权利要求16的装置；
64.权利要求63的试剂盒，其进一步包含使用说明书。
65.权利要求63的试剂盒，其进一步包含手持装置。
66.权利要求65的试剂盒，其中所述手持装置是阅读器。
67.权利要求66的试剂盒，其中所述阅读器适合于接收权利要求35的装置。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述阅读器是反射率阅读器。
69.权利要求69的试剂盒，其中所述生物样品是尿液。
70.具有根据式(I)的结构的化合物：
Figure FDA0002539859140000051
或其药学可接受盐，其中：
A1、A2或A3之一是
Figure FDA0002539859140000052
A1、A2和A3中的两个是氢或NH2；
Y是键、NR3、O或S；
L是C1–C12-亚烃基、C3–C7-环亚烃基、C3–C7-杂环烯、亚芳基或杂亚芳基，它们各自可以是被一个或多个选自以下的取代基任选取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1–C4-烷基、-C1–C4-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7或-C(O)X1；
R1、R2、R3和R4各自独立是氢、C1–C6-烷基、C1–C6-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基，其中C1–C6-烷基、C1–C6-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基各自可以用一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1–C4-烷基、-C1–C4-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR5、-NR6R7、或-C(O)X2；
R5、R8、和R11各自独立是C1–C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、C0–C4-烷基-P(O)(OH)2、或-C(O)X4；
R6、R7、R9、R10、R12、和R13各自独立是氢、C1–C6-烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、或-C(O)X5；或
R6和R7、R9和R10、以及R12和R13与同它们附接的原子一起独立形成3至7元环，其可以被一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1–C4-烷基、-C1–C4-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR11、-NR12R13、或-C(O)X6；并且
X1、X2、X3、X4、X5、和X6各自独立是氢、C1–C6-烷基、C1–C6-卤代烷基、C2–C6-烯基、C2–C6-炔基、芳基、芳烷基、或杂芳基；
其中每个任选的取代基独立可以进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：＝O、-OH、-SH、-NO2、-CN、-C1–C4-烷基、-C1–C4-卤代烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基、杂芳基、-OR8、-NR9R10、和-C(O)X3。
71.权利要求1的化合物，其具有根据式(II)的结构：
Figure FDA0002539859140000071
或其药学可接受盐，其中R15是C1–C4-烷基。
72.权利要求71的化合物，其中R15是甲基。
73.权利要求70-72中任一项的化合物或其药学可接受盐，所述化合物具有根据式(IIa)的结构：
Figure FDA0002539859140000072
74.权利要求70-73中任一项的化合物或其药学可接受盐，所述化合物具有根据式(III)的结构：
Figure FDA0002539859140000073
75.权利要求70-73中任一项的化合物或其药学可接受盐，所述化合物具有根据式(IV)的结构：
Figure FDA0002539859140000074
76.权利要求70-73中任一项的化合物或其药学可接受盐，所述化合物具有根据式(V)的结构：
Figure FDA0002539859140000081
77.权利要求70-76中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中Y是NR3。
78.权利要求77的化合物或其药学可接受盐，其中R3是氢。
79.权利要求70-78中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中L是(CH2)n，其中n是1至6。
80.权利要求79的化合物，其中n是2。
81.权利要求70-80中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中R1是用一个或多个选自以下的取代基任选取代的C1–C6-烷基：卤素、＝O、-OH、-SH、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基和杂芳基。
82.权利要求81的化合物或其药学可接受盐，其中每个任选的取代基独立可以进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：-OH、-SH、-C1–C4-烷基、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基和杂芳基。
83.权利要求70-82中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure FDA0002539859140000082
其中R16是C1–C6-烷基、C3–C7-环烷基或芳基，它们各自可以被-SH、C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基或杂芳基任选取代。
84.权利要求70-83中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure FDA0002539859140000083
85.权利要求70-82中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure FDA0002539859140000084
其中m是1至6；并且R17是C3–C7-环烷基、C3–C7-杂环基、芳基或杂芳基。
86.权利要求70-82和85中任一项的化合物或其药学可接受盐，其中R1是
Figure FDA0002539859140000091
87.化合物或其药学可接受盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002539859140000092
88.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是：
Figure FDA0002539859140000101
89.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002539859140000102
90.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002539859140000103
91.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002539859140000104
92.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002539859140000111
93.权利要求87的化合物或其药学可接受盐，其中所述化合物是
Figure FDA0002539859140000112
94.免疫原性组合物，其包含：通过接头与(b)载体蛋白缀合的(a)权利要求70-93中任一项的化合物。
95.权利要求94的免疫原性组合物，其中所述接头共价结合所述载体蛋白上的活性残基(例如半胱氨酸或赖氨酸)与所述化合物。
96.权利要求94的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素交叉反应材料197(CRM197)、TT的片段C、钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白D、外膜蛋白(OMP)和肺炎球菌溶血素。
97.权利要求96的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是KLH。
98.权利要求96的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是BSA。
99.针对权利要求94-98中任一项的免疫原性组合物制备的多克隆抗体。
100.针对权利要求94-98中任一项的免疫原性组合物制备的单克隆抗体。
101.权利要求100的单克隆抗体，其中所述抗体是权利要求1-4中任一项的抗体。
102.多克隆抗体，其选择性结合权利要求70-93中任一项的化合物或权利要求94-98中任一项的免疫原性组合物。
103.单克隆抗体，其选择性结合权利要求70-93中任一项的化合物或权利要求94-98中任一项的免疫原性组合物。
104.权利要求103的单克隆抗体，其中所述抗体是权利要求1-4中任一项的抗体。
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