CN101809447A - 药物监测方法 - Google Patents
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Abstract
通过使用所述母体化合物特别的衍生物描述得到至少一种结合剂的方法,该结合剂结合化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合化合物的药物无活性形式。本发明还涉及相应生成的结合剂和衍生物。此外,提供了使用所述结合剂监测所述母体化合物药物活性形式的药物监测方法。
Description
定性和定量测定法在生命科学的不同领域中具有巨大重要性。本发明一般涉及测定生物流体中药物化合物的试剂和方法。特别地,提供了测定存在于样品中活性成分例如药物化合物的量或浓度的生物测定法。此外,提供了得到识别化合物的药物活性代谢物的结合剂的方法。相应的结合剂是药物监测法中有价值的工具。
在药理学中,使用许多药物,而不监测血中浓度或其它体液,因为其剂量一般可以根据患者接触该物质的临床反应改变。然而,该方法因一些药物而是不可能的或至少是困难的,因为药物水平不充分会导致治疗不足或耐受性,而过度水平可以是毒性的和/或损害组织。治疗药物监测是专项于测定血液或其它生物样品中药物水平化学分支。其主要着重于具有窄治疗指数的药物,即易于剂量不足或超剂量的药物。为了提供优化的治疗,监测相应的药物由此是有益的。通常需要药物监测的相应药物实例是抗-感染药例如庆大霉素和万古霉素;氨基糖苷抗生素;免疫抑制剂例如环孢素、依维莫司;抗癫痫药;抗精神病药例如氯氮平和锂、抗癌药、地高辛等。
为了实现治疗效果,特别应以提供充分抑制所涉及的酶的剂量施用作为酶抑制剂起作用的药物。然而,由于患者代谢改变,所以剂量需求也可以在患者之间显著改变。AEB071是典型和新的蛋白激酶C(PKC)同种型的选择性和强效抑制剂,其具有的ki值在nM范围。
前体药物是以具有较低乃至无药物活性的形式施用的药物化合物。一旦施用,前体药物就在体内被代谢成活性化合物。前体药物应用背后的原理一般是吸收、分布、代谢和排泄(ADME)优化。就前体药物而言,通常有必要监测足量前体药物被转化成药物活性代谢物以得到治疗效果。
在药物监测上下文中的术语“母体药物”通常表示对患者施用时药物的分子结构。一旦被吸收,母体药物就可以进行称作生物转化(代谢)的化学改变,从而产生称作代谢物的改变的分子。肠壁和肝包含最高浓度的代谢酶,它们通常被描述为微粒体酶,因为它们集中于细胞内质网内的小囊泡中。然而,酶是遍在的并且在无数其它部位催化生物转化。
母体药物及其代谢物可以具有可变程度的药理学活性,称作活性或无活性,并且其毒性也可以改变。例如,作为母体因为起作用的镇静药可以被转化成三种无活性的代谢物,还可以被转化成有活性的和镇静的,而另一种是有活性的和心脏毒性的。此外,这些分子形式各自可以显示改变的分布和消除模式。这些代谢改变使得药物化合物的药物活性浓度的检测变得困难,因为如果在检测测定中无活性代谢物得到识别,可能产生错误的结果。
为检测小分子特别设计监测/免疫测定法可能是一种挑战。这种小分子通常缺乏抗原性,使得难以产生例如结合小分子的抗体。为了增加小分子的免疫原性,可以使较大抗原化合物例如蛋白质或多肽类与药物缀合。
为了监测药物化合物,开发了监测某一浓度药物在患者中的治疗效果的诊断工。大部分已知药物监测方法利用结合药物化合物的抗体,推定它用于患者样品中的检测/监测。然而,有效监测极为困难,因为药物活性形式与例如无活性代谢物之间的正确区分对测定化合物的治疗活性浓度而言是重要的。与无活性代谢物相应的交叉反应性相关的问题是现有技术中众所周知的(例如参见Rentsch等,2006:Therapeutic drug monitoring derImmunsuppressiva)。
本发明的目的在于提供具有低概率检测药物化合物无活性代谢物的药物监测法。本发明的目的还在于提供用于研发相应特异性药物监测法,特别是用于生产适合结合剂的方法,所述结合剂例如特异性识别所监测化合物的活性形式的抗体。本发明的目的还在于鉴定和提供高概率特异性结合化合物AEB071的药物活性形式的适合结合剂。相应结合剂可以用于AEB071的药物监测法。
本发明的第一个实施方案提供了得到至少一种结合剂的方法。该结合剂结合至少一种母体化合物的药物活性形式的特异性高于结合所述母体化合物的药物无活性形式,该方法包括:
(a)通过屏蔽所述母体化合物的部分所述药物活性形式制备所述母体化合物的所述药物活性形式的至少一种衍生物;
(b)使用所述衍生物得到结合所述衍生物的一组结合剂;
(c)从所述结合剂组中选择至少一种结合剂,该结合剂结合所述衍生物以及至少一种所述母体化合物的药物活性形式。
本发明的一个方面涉及提供至少一种结合剂,它特异性结合药物化合物的药物活性形式并且具有结合无活性代谢物的低概率。
为了得到相应的特异性结合剂,本发明使用得到/获得相应结合剂的确定方法。根据一个重要的方面,不将母体化合物用于得到所述结合剂,而是使用特别设计的其衍生物。
基于母体化合物的结构设计衍生物,使得它们具有产生结合剂的最高概率,这些结合剂可以识别母体化合物的药物活性形式,而具有识别母体化合物的药物无活性代谢物的最低概率。为了达到该效果,使化合物的一些部分与结合剂屏蔽。通过使用相应屏蔽结构,结合剂无法接近分子的屏蔽区。这具有可以得到定向于非屏蔽的且由此易于接近的分子部分的结合剂的效果。在本发明的一个实施方案中,分子未屏蔽的部分相当于代谢作用可以使化合物失活这样的分子位置。因此,可以得到识别相当于分子活性化学结构的化学结构的结合剂。因此,如果代谢变化改变了结合剂所识别的分子部分,则结合剂的结合至少减少或完全被阻止。这种措施确保了结合剂对结合剂所识别的位置上的活性化学结构更具有特异性。
为了证实分子指定位置至少部分被结合剂所识别,可以设计包含屏蔽结构的衍生物,所述屏蔽结构屏蔽所关注的代谢位置。相应衍生物可以用于分析结合剂是否对指定位置具有高度特异性,因为本发明方法得到的特异性结合剂不应结合或可以以较低特异性结合所述衍生物,其中所述代谢位置被屏蔽。这种衍生物可以构成选择极具特异性结合剂的有价值的工具。
然后,那些结合剂选自得到的结合剂组,它们结合母体化合物的衍生物和药物活性形式。这种选择对消除例如识别屏蔽结构且由此对分子不具有特异性的结合剂而言是重要的。相应选择例如可以通过如下文进一步详细描述的竞争性测定法进行。这种方法能够优化对一些化合物、特别是通过使用标准方法产生的小化合物具有特异性的结合剂的产生。
就推定产生对母体化合物的确定活性代谢物具有特异性的结合剂而言(就前体药物而言),当设计衍生物与所检测活性代谢物的化学结构非常类似时,母体化合物的化学结构可以改变。这确保了结合剂识别指定靶标,即活性代谢物的正确化学结构。这种模拟活性代谢物化学结构的修饰的结构在相应的衍生物上未被屏蔽,而是暴露且由此易于接近,从而确保了生成结合剂,它们在母体化合物在体内被转化成活性代谢物时特异性识别/结合化学改变的这一分子部分。可以从使用相应衍生物得到的结合剂组中选择特异性识别母体化合物活性,而不是(无活性)的代谢物化学结构的结合剂。
正如一般介绍中概括的,母体化合物可以具有几种不同的代谢物,一些可能具有活性,一些无活性。根据一个实施方案,选择的结合剂识别一种以上母体化合物的药物活性形式,例如母体化合物及其至少一种其它活性代谢物。然而,就一些药物或应用而言,重要的是区分母体化合物的不同药物活性形式且由此区分例如活性母体化合物及其至少一种其它药物活性代谢物。就此而言,选择结合剂,使得它们以较高特异性结合期望的靶标(母体化合物或活性代谢物)。例如,可以通过使用母体化合物和活性代谢物作为竞争靶标的竞争性结合测定法达到这一目的。因此,可以选择那些描述对指定靶标具有所需的选择性的结合剂。
就具有一个以上其中化合物可以通过代谢作用失活的位置的母体化合物而言,可以生成至少两种衍生物,其中各衍生物在分子的不同位置上屏蔽结合。根据潜在代谢位置数量的不同,可以根据可能导致分子失活的代谢位置数量调整衍生物的数量,以得到一种结合剂,它结合至少一种母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合所述母体化合物的药物无活性形式。
“衍生物”意指推定可以通过一个原子被另一个原子或原子团替代由母体化合物产生的化学化合物或分子。例如,可以基于母体化合物结构,通过一种或多种化学反应(例如连接基连接)制备衍生物。然而,根据修饰类型的不同(例如就母体化合物基本化学结构被修饰以模拟药物活性代谢物而言),不同合成途径可能是必要的。本发明的衍生物包含修饰,其中母体化合物的某一位置被屏蔽,由此通常防止相应得到识别分子屏蔽部分的结合剂结合。
术语“母体化合物的药物活性形式”意指母体化合物和药物活性代谢物。那些化合物中的至少一种需要被结合剂识别,例如母体化合物或其活性代谢物。为了研发特异性识别活性代谢物的结合剂,推定监测前体药物活性特别有用,因为前体药物通常以无活性(或活性明显较低)的形式被施用,然后被代谢成治疗活性代谢物。母体化合物还可以在分子的几个不同位置上失活。因此,至少一种母体化合物的药物活性形式被结合剂识别。它可以是位点特异性的,因为结合剂仅可以识别分子的一个部分(就抗体而言是表位)。如果母体分子在不同代谢位置上失活-未被结合剂识别/结合-则这种失活可能无法被相应结合剂识别。在这种情况下,识别失活可能发生的分子不同部分的几种结合剂可以联用。然而,这取决于母体化合物和它如何被代谢且由此需要基于每种情况评价。
“药物活性”特别意指化合物的指定治疗效果。然而,该术语还包括其它重要药理学活性,例如毒性效果。这种情况指的是在一些情况中监测例如患者的毒性代谢物,且由此特异性识别毒性代谢物的特异性结合剂可能是有用的。
可以通过使用与分子偶合的化学屏蔽结构屏蔽母体化合物以得到衍生物。这种屏蔽结构可以是适合于阻断分子那些推定被屏蔽这样的部分的化学基团。这种阻断基可以是结合一个或多个母体化合物药物活性形式(包括其中间体,例如氨基内酰胺类、氨基内酯类等)的羟基、氨基或羧基的任意基团,从而防止在这些基团上发生反应。当所述衍生物用于得到结合剂时,推定在那些屏蔽位置上特别防止了结合剂结合。通常在存在屏蔽结构时,结合剂可以攻击/识别屏蔽结构,但不是主要的化学结构。适合的屏蔽结构可以包含连接所屏蔽分子位置的载体。
所述偶合可以通过使用连接基结构进行。适合的连接基可以选自:与所述载体的氨基反应的酰化基团;与所述载体上的硫氢基(巯基)、硫代甲基、咪唑基或氨基反应的烷基化基团,最优选马来酰亚胺基;例如与蛋白质羧基反应的酯和酰胺形成基团;与所述肽单元上的硫氢基反应的二硫化物形成基团,例如5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸酯)基团、邻-吡啶基二硫化物和烷基硫醇基、二羰基,例如环己二酮基和其它1,2-二酮基;与酚基反应的重氮基。连接基可以被适合的例如具有2-20个C原子、优选2-10个C原子的烷基延长。特别适合的连接基用于衍生物A和B(参见下文)中,它们也可以用于得到不同母体化合物的衍生物。
母体化合物可以是小分子。正如介绍中概括的,得到用于检测小分子的结合剂特别具有挑战性,因为难以得到针对小分子的结合剂。由于这一原因,所以当获得抗体时使用载体是有益的。
母体化合物可以选自免疫抑制剂、抗感染药、抗癫痫药、抗精神病药和抗癌药。这些药物特别难以给药,且因错误剂量导致的效果可能很严重。这种情况特别适用于移植中使用的免疫抑制剂。因此,监测相应化合物特别有益。然而,通过本发明方法可以监测任意药物化合物/用于得到特异性结合剂。
根据一个实施方案,母体化合物是小分子。正如介绍中概括的,小分子难以监测。然而,本发明能够得到针对小分子的特异性结合剂。根据一个实施方案,小分子是蛋白激酶C(PKC)抑制剂。根据一个也用于所述实施例的实施方案,母体化合物AEB071用作推定监测的母体化合物。该化合物具有如下化学结构:
该化合物(PKC抑制剂)是具有改善治疗窗/特性的免疫抑制剂。
为了得到能够监测样品中AEB071的适合结合剂,可以使用至少一种衍生物,其具有如下化学结构:
屏蔽结构例如载体可以连接例如位置X1和/或X2。就此而言,在不连接屏蔽结构的情况中,X1和/或X2可以是氢。至少一个X1和X2包含相应屏蔽结构。如上所述,偶合可以通过连接基结构进行。
根据一个实施方案,衍生物A和/或B用作生成结合剂的衍生物:
衍生物A
衍生物B
在实施本发明方法时这些衍生物特别用于得到对母体化合物AEB071具有特异性的结合剂。
优选通过分析存在母体化合物药物活性形式是否抑制结合剂结合衍生物选择本发明方法的选择步骤(c),其中选择那些具有最高概率结合母体化合物的药物活性形式的结合剂。进行相应分析的适合方法是使用衍生物的竞争性结合测定法,所述衍生物作为结合配偶体与作为所述结合剂靶标的母体化合物的药物活性形式竞争。进行相应竞争性结合测定的一个实施方案是免疫测定法,例如ELISA测定法。然而,其它免疫测定法也可以用于这种分析。因此,根据本发明方法的一个实施方案,进行免疫测定法以测定结合剂的结合特异性。
根据一个特别适合的实施方案,在母体化合物具有一个以上代谢位置的情况中,所述代谢位置可以因代谢作用被失活或化合物较大,由此提供几个用于结合剂的表位,在步骤(c)中选择至少一种结合剂,它特异性结合母体化合物的药物活性形式,得到针对它的衍生物,并且也结合母体化合物的至少一种不同衍生物,该衍生物屏蔽非第一种衍生物的分子的不同部分,但保留作为第一种衍生物暴露的同一分子部分。通过对结合剂与不同衍生物的结合模式进行对比分析,可以确定当母体分子的不同部分与所用各衍生物中的结合屏蔽时,母体分子药物活性形式的特定部分被结合剂结合/识别。还可以通过生成分子指定/推定代谢位置被屏蔽的衍生物确定或分析化合物的结合区(即就抗体而言是表位)。对所述屏蔽区具有特异性的结合剂不结合相应衍生物。因此,这种代谢位置被屏蔽的衍生物可以用于证实得到的结合剂的特异性。
根据一个实施方案,选择步骤(c)中的结合剂,它区分AEB071分子及其活性代谢物,具有如下结构:
化合物C:
正如可以观察到的,存在于AEB071t中的哌嗪环上的甲基在化合物C中不存在。如本文所述,可以通过如本文所述在母体化合物AEB071与化合物C之间的竞争性测定选择适合的结合剂。
可以通过筛选结合剂文库得到适合的结合剂,以鉴定/得到结合根据本发明教导制备的衍生物的结合剂。用于相应结合剂文库的实例例如是展示出结合剂的噬菌体噬菌粒文库。得到例如体外抗体的方法还描述在Hudson,PJ和Souriau,C.(2003)Engineered antibodies.Nat.Med.9,129-134)中,将该文献引入本文作为参考。
结合剂可以具有任意结构,条件是它们能够特异性识别和结合靶标。结合剂可以选自具有结合功能的抗体、抗体片段或其变体,具有提供结合功能的蛋白质骨架的结合剂,例如抗促成素。具有与抗体类似结合功能的结合剂综述在Hey等:Artificial,non-antibody binding proteins forpharmaceutical and industrial application,Trends in Biotechnology,Vol23 No.10,2005年10月,514-522页中给出,将该文献引入本文作为参考。抗体片段是包含至少20种来自所述完整抗体的氨基酸,优选至少100种仍然具有结合容量的氨基酸的抗体的任意片段。在优选的实施方案中,该抗体片段包含抗体结合区例如Fab片段,F(ab)2片段,包含多个结合结构域的多链抗体(multibodies)例如双抗体、三链抗体或四链抗体,单结构域抗体或亲和抗体(affibodies)。抗体变体是具有相同结合功能,但例如改变的氨基酸序列的抗体衍生物或抗体片段。
根据一个实施方案,结合剂是抗体。抗体的应用具有如下优点:它们易于通过例如对动物施用上述衍生物产生对所述衍生物的特异性免疫原性应答生成。
动物可以选自小鼠、大鼠、家兔、小鸡、豚鼠、山羊和绵羊。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。得到相应抗体的适合方法描述在Ed Harlow和David Lane的“Antibodies-A laboratory Manual”,1988和/或W.C.Davies的“Monoclonal antibody protocols”,1995中,将这些文献引入本文作为参考。由于单克隆抗体的较高特异性,所以通常优选单克隆抗体。可以通过从使用所述衍生物免疫接种动物中回收产生至少一种抗体的细胞、使所述产生抗体的细胞无限增殖并且从抗体产生的无限增殖细胞分离单克隆抗体得到单克隆抗体。
可以用于本发明上下文的适合载体包括蛋白质、糖蛋白、复合多糖体和颗粒。各种蛋白质可以用作载体。这些蛋白质包括但不限于清蛋白和血清蛋白,例如球蛋白、目镜蛋白、脂蛋白等。示例蛋白包括牛血清清蛋白(BSA)、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(ova)、牛血清丙种球蛋白(BGG)和类似蛋白。还可以使用合成载体。适合的多糖例如是淀粉、糖原、纤维素或碳水化合物树胶可以用作载体。特别优选载体在屏蔽中的应用,条件是推定动物免疫接种小分子,因为载体增加化合物的免疫原性。
由于使用上述方法,所以可以得到适合的结合剂,其结合至少一种母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合所述母体化合物的药物无活性形式。本发明的一个关键要素在于设计上文具体描述的衍生物。相应结合剂由此非常适用于高度灵敏性和可靠的药物监测法。设计/选择本发明的结合剂,使得它们主要结合母体化合物的活性形式。在一些实施方案中,设计它们,使得其甚至能够区分活性代谢物的不同形式。这种特异性是重要的优点,因为它防止了偶然检测到可能干扰得到的药物监测结果的母体化合物的无活性代谢物。
另外,本发明提供了相应设计的衍生物和得到的结合剂。可以如所述的通过修饰母体化合物,使得母体分子无代谢作用或无相关代谢作用发生可以使母体化合物失活这样的部分被屏蔽,得到所述衍生物。这具有获得针对化合物相关部分的结合剂的效果。根据母体化合物大小的不同,还可以生成几种衍生物,以便通过生成变体衍生物依次屏蔽母体化合物的所有部分。代谢失活这样的部分通常保持不被屏蔽。可以通过测试所述结合剂与所述衍生物的交叉反应性选择特异性结合所有衍生物中易接近(不被屏蔽)的分子部分的结合剂。
本发明特别提供了具有如下基本结构的AEB071衍生物:
其中X1和/或X2模拟屏蔽结构的偶合位置或是氢。至少一个位置X1或X2携带屏蔽结构,如上所述,例如载体可以作为屏蔽结构与化学骨架通过连接基结构偶合。发现在位置X1和/或X2上屏蔽母体分子AEB071产生衍生物,它们能够生成结合剂,这些结合剂对母体化合物非常具有特异性且由此针对药物活性化合物。由于这些衍生物的确定屏蔽模式,其中谨慎选择连接基结构的连接点以保持潜在代谢位置可接近,所以这些衍生物是生成对母体化合物具有特异性的结合剂的有价值的工具。
相应衍生物的确定实例是衍生物A和衍生物B:
衍生物A:
衍生物B:
通过本发明教导提供的还有具有如下结构的AEB071变体:
化合物C:
可以使用这种变体-如上所述-以结合使母体化合物AEB071所具有的特异性高于结合活性代谢物化合物C的抗体。为了进行相应测试,例如,可以使用可检测标记或载体提供这种化合物。
本发明还提供了通过所述筛选方法得到的结合剂。根据尤其适合于监测/检测母体化合物AEB071的一个实施方案而言,通过使用上述定义的AEB071衍生物之一-特别是衍生物A和/或衍生物B选择结合剂。根据一个实施方案,所述结合剂结合母体化合物AEB071所具有的特异性高于结合化合物C。优选所述结合剂是选自2G8、4G4、3A3或6B11的抗体。本发明优选的抗体是4G4、3A3。
本发明的另一个方面提供了药物监测方法,其包括:
-使推定包含至少一种母体化合物的药物活性形式的样品接触至少一种结合剂;
-通过使用至少一种结合剂测定所述母体化合物的所述药物活性形式的浓度,所述结合剂结合所述母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合所述化合物的药物无活性形式。
可以通过上述方法得到可以用于相应测定法的适合结合剂。上文详细描述方法的关键要素在于适合衍生物的电脑虚拟在先设计,所述衍生物生成识别失活可能发生所述分子的代谢关键部分的结合剂,通过使用竞争性实验选择结合所述衍生物和母体化合物药物活性形式的结合剂,由此得到识别母体化合物药物活性形式的结合剂。
在本发明的药物监测法中,可以进行竞争测定以使用靶子化合物作为结合结合剂的配偶体测定浓度,所述配偶体竞争所述结合剂结合存在于生物样品中的母体化合物的药物活性形式(如果存在)。如果药物活性形式在样品中不存在,则没有相关结合发生。所述样品可以是获自监测患者,例如获自已经服用AEB071的移植患者的生物样品。
根据一个实施方案,通过使用标准校准曲线比较从结合测定中得到的结果测定样品中母体化合物的至少一种药物活性形式的浓度。可以通过使用连续稀释的母体化合物或其活性形式生成校准曲线得到相应标准曲线。然后可以将获得的生物样品值与标准曲线比较,由此能够测定存在于样品中的母体化合物的药物活性形式的浓度。
根据一个实施方案,被结合剂识别的母体化合物的药物活性形式或其衍生物与可检测标记缀合,并且这种缀合物能够与存在于样品中的所述母体化合物的药物活性形式竞争结合剂的结合。当所述化合物以治疗药物监测浓度存在时,所述标记提供所述母体化合物的所述药物活性形式的信号指示。相应技术的实例例如是荧光偏光免疫测定(FPIA)、克隆的酶供体免疫测定化学发光异源免疫测定(CMIA)。当然,其它同源或异源免疫测定也可以用于测定这种样品中母体化合物的浓度。本文给出的实例由此是非限制性的。
根据一个实施方案,靶标是用于得到结合剂或被具有相同特异性的结合剂识别的其变体。用于与所分析样品中母体化合物的药物活性形式竞争结合剂结合的靶标由此可以是用于得到相应结合剂的衍生物。这确保了所述竞争剂被具有最高特异性的结合剂结合。然而,还能够使用所述衍生物的变体,它被优选具有相同特异性的结合剂识别。变体的应用是切实可行的,条件是它例如有利于测定(例如通过使用不同的载体)。
根据一个实施方案,用于进行竞争测定的结合剂携带可检测标记。然后,例如,一旦加入样品并且在进行适当孵育和洗涤步骤后,就可以通过测定样品中标记的减少测定样品中母体化合物的药物活性形式的浓度。
根据另一个实施方案,将与母体化合物竞争结合剂结合的靶标固定在基质上。所述基质可以具有任意的类型,例如芯片、包含多孔的培养板、柱或任意其它适合的基质。例如,可以将用于得到结合剂的衍生物或仍然被结合且由此被结合剂识别的其变体都固定在所述基质上。使相应制备的基质在推定包含至少一种母体化合物药物活性形式的样品存在下接触结合剂。或者,可以反向进行测定并且将结合剂固定在基质上。
然后,检测在样品存在下所述结合剂与固定在基质上的衍生物/靶标结合。为了检测,可以加入第二种结合剂,它识别第一种结合剂并且携带可检测标记。就此而言,固定结合剂而非衍生物/靶标,将衍生物/靶标加入到测定中并且相应地检测。通过检测所述第二种结合剂的所述可检测标记进行检测。
因此,根据一个实施方案,药物监测法包括标记的结合剂和/或其中加入第二种结合剂,它识别第一种结合并且其中第二种结合剂携带可检测标记。
可以通过免疫测定法进行检测。进行相应免疫测定法的适合形式是ELISA。
可以使用药物监测法监测的适合的母体化合物如上所述并且可以选自免疫抑制剂、抗-感染药、抗癫痫药、抗精神病药和抗癌药。
还可以使用本发明的药物监测法监测小分子。可以相应监测的适合的小分子和用于该目的的适合结合剂如上所述;我们参考了上述披露内容。
根据本发明的一个实施方案,所监测的母体化合物是小分子PKC抑制剂AEB071。为了检测生物样品中的母体化合物,可以使用一般如上所述的AEB071衍生物,特别是衍生物A和/或衍生物B。可以如本文所述将衍生物固定在基质上。衍生物可以包含载体分子。相应的测定法优选具有1-500或1-300ng/ml或2-250ng/ml的工作范围。
优选可以通过上述方法得到并且用于本发明测定法的所述结合剂是选自2G8、4G4、3A3或6B11的抗体。
本发明还提供了用于测定样品中至少一种母体化合物的药物活性形式的浓度的诊断试剂盒,其包含:至少一种结合剂,它结合母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合母体化合物的药物无活性形式;和任选用于测定所述样品中所述母体化合物的所述药物活性形式浓度的试剂。
适合的结合剂如上所述和如权利要求中所述。所述诊断试剂盒还可以包含基质,其中用于所述结合剂的靶标或结合剂固定在所述基质上。可以将如上述和权利要求中所述的AEB071衍生物或被具有相同特异性的结合剂识别的其变体固定在基质上。
用于诊断试剂盒的所述结合剂和/或竞争靶标可以携带可检测标记。然而,还可以使用第二种结合剂,它结合携带可检测标记的所述结合剂或竞争靶标。
还提供了基质,它具有如权利要求所定义的衍生物或如权利要求所定义的固定在其上的结合剂。相应的基质用于所述药物监测法。
可以根据本发明教导使用的标记是产生或可以被诱导产生可检测信号的任意分子。该标记可以与分析物、免疫原、结合剂、示例地由上述方法产生的结合剂或由此具有特异性的第二种结合剂或另一种分子缀合,所述另一种分子例如可以结合受体的分子例如配体,特别是半抗原。标记的非限制性实例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂、发光剂、致敏物、无磁性或磁性颗粒、固体支持物、脂质体、配体、受体和半抗原放射性同位素。
术语“样品”或“生物样品”意指推定包含母体化合物的药物活性形式的样品。它包括但不限于来自活物或在先活物的任意量的物质。这种活物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、家兔、马和其它动物。这种物质包括但不限于血液、血清、尿、泪、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑液组织、软骨细胞、滑液巨噬细胞、内皮细胞和皮肤。
本发明还提供了用于测定样品中至少一种母体化合物的药物活性形式的浓度的诊断试剂盒,其包含:至少一种结合剂,它结合母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合母体化合物的药物无活性形式,以便测定所述样品中母体化合物的所述药物活性形式的浓度。
可以通过上述方法得到结合剂。适合的结合剂还描述在权利要求9-12中。所述诊断试剂盒还可以包括适合的缓冲液、试剂和使用说明书。
根据一个实施方案,诊断试剂盒包含基质,其中用于所述结合剂的靶标或结合剂自身固定在所述基质上。如上所述,可以用于得到结合剂的衍生物可以用作靶标。或者,可以使用被具有相同特异性结合剂识别的其变体。
用于检测生物样品中母体化合物浓度的几种适合的方法如上所述。根据所用检测方法的不同,结合剂、竞争靶标和/或识别结合剂或竞争靶标的第二种结合剂携带可检测标记。诊断试剂盒特别用于监测AEB071。适合的实施方案如上所述并且也可以用于诊断试剂盒。
本发明还提供了基质,它携带上述AEB071衍生物且特别是衍生物A(BJC)和/或衍生物B(BJC)或通过上述筛选方法得到的结合剂。适合的实例如上所述。这些衍生物可任选携带适合的载体。
实施例
现在通过实施例,使用为建立药物监测方法生成的针对AEB071的适合结合剂进一步详细描述本发明。
1.衍生物的设计
为了得到适合的结合剂,此处生成特异性结合母体化合物AEB071活性形式的抗体、两种衍生物即衍生物A(BJC)和衍生物B(BJA)(结构如上)。这两种衍生物是修饰的在两个不同位上具有活化连接基的AEB071形式。选择两种衍生物以便以最高概率生成识别母体化合物AEB071和最低概率识别AEB071的药物无活性代谢物的抗体。为了得到相应抗体,通过使KLH载体蛋白与相应位点缀合屏蔽分子的一些部分。所述载体防止抗体对屏蔽部分生成和增加免疫原性。通过使用这种原理,可以通过适当设计衍生物预先设计针对相关代谢作用发生的化合物的潜在决定位置的抗体特异性。衍生物的设计确定了易影响母体化合物的可利用抗原结合位点。
2.对衍生物具有特异性的抗体产生
按照标准方法(参见上文)衍生物的相应缀合物用于家兔和小鼠的各免疫接种。
在家兔中生成多克隆抗血清(pAb),并且在各加强接种后测试与衍生物缀合物的反应性。最终加强接种对固定化化合物进行亲和纯化。
类似地,生成针对缀合物的单克隆小鼠抗体(mAb)。由选择的克隆的杂交瘤细胞系生产抗体。生产针对两种衍生物的pAb和mAb。
通过直接ELISA方法对pAb血清、杂交瘤上清液和纯化的pAb和mAb进行特异性结合抗原分析。
3.AEB071特异性抗体的选择
选择那些抗体用于进一步测试,它们在高度稀释测试下特异性结合母体化合物AEB071的缀合衍生物及其母体化合物。得到的数据显示mAb和pAb是那些化合物结合测定的高度有效的特异性工具,特别是AEB071在药物监测法中使用它们。
在选择和纯化步骤过程中,测试与母体化合物AEB071结合。该过程通过测试游离药物AEB071抑制抗体结合BJC或BJA缀合物进行。发现、相应地选择展示出被游离药物AEB071高抑制百分比的抗体。就mAb而言,选择分别具有不同结合抑制特征的一定范围的抗体用于进一步评价。
游离药物AEB071的抑制表明抗体不仅识别所述衍生物或其包含载体的缀合物,而且识别游离药物且由此识别母体化合物。这对研发AEB071监测法,特别是免疫测定法而言是重要的,其对活性化合物具有特异性。
选择游离药物几乎完全抑制结合这样的抗体确保了大部分抗体识别母体化合物而非所述衍生物的连接基或载体蛋白。因此,基于AEB071竞争性结合不同缀合或标记BJC或BJA衍生物的监测法是切实可行的。相应竞争性方法的适合实例如上所述并且也是众所周知的。
具有不同抑制特征的抗体生成能够选择用于研发测定法的抗体,这些测定法能够分析宽范围的AEB071浓度。此外,获得各种相应抗体还能够选择可以区分母体化合物与不同活性代谢物这样的抗体。
合并了游离药物观察到的抑制的进行的直接缀合结合测定法显示基于来自动物或患者的样品中游离药物或紧密相关化合物抑制抗-BJC或抗-BJA抗体结合的测定法切实可行,它用于与基于AEB071已知浓度的校准曲线一起定量。按照这种方式可以可靠地测定样品中化合物的实际浓度。
通过选择AEB071衍生物与用于抗体的实施的缀合策略和选择策略,得到有价值的测定工具用于研发基于抗体结合靶标的新的监测法(特别是免疫测定法),所述靶标被样品中所述化合物竞争。当然,也可以使用其它竞争性测定方式,它们中的许多是现有技术中公知的。
单克隆和多克隆抗-AEB071抗体的特异性试验
产生免疫测定,其中将用于获得抗体的衍生物与培养板的空孔固定。然后加入选择的抗体与母体分子AEB071。适当洗涤步骤后,提供使用抗-物种PO(过氧化物酶)抗体并且加入相应底物OPD(邻苯二胺)检测抗体与固定衍生物的结合。实验设置如下:
NUNC MaxiSorb 74981培养板用于固定衍生物BJA,它携带卵清蛋白载体(ova)。该过程通过混合ova-BJA与pH7,41μg/ml PBS缓冲液进行。将该混合物在4℃下静置过夜。将该混合物加入到培养板的空孔中。加入200μl Pierce PBS SuperBlock并且在室温下、在黑暗中将相应培养板振摇1小时。然后用300μl洗涤溶液将培养板洗涤3次。
将抗体和合并了AEB071的抗体加入到各孔中(100μl)并且孵育15-30分钟。使用下列抗体:多克隆抗体(家兔):抗-BJA和抗-BJC。单克隆抗体(小鼠):抗-BJA(2G8和4G4)和抗-BJC(3A3,6B11)。在室温下、在黑暗中振摇下将孵育进行2小时。然后用300μl洗涤溶液将样品洗涤3次。然后加入100μl抗-物种-PO抗体并且在室温下、在黑暗中振摇下孵育1小时。然后用300μl洗涤溶液将样品洗涤3次。
然后加入底物OPD(100μl)。将1片溶于20ml蒸馏水。
在室温下、在黑暗中振摇下进行孵育20分钟。
然后加入100μl终止溶液H2SO42N。
在490nm测定溶液的OD。
使用下列设置:
1ug/mL ova-BJA 测试的抗体 AEB071 抗-物种-po抗体 OPD
+ + - + +
+ - - + +
- + - + + NS1
+ + + + +
+ - + + +
得到下列结果:
+ 0ng/mL +500ng/mL +200ng/mL + 50 未包被
AEB071 AEB071 AEB071 ng/mL NS1
AEB071
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pAb A 2.028 0.993 1.166 1.034 0.071
抗 包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
pAb B 2.715 1.536 1.872 2.294 0.067
抗 包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
-BJC ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
2G8 C 1.911 0.120 0.152 0.469 0.063
包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
4G4 D 2.628 0.076 0.089 0.270 0.065
包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
3A3 E 1.608 0.118 0.173 0.415 0.058
包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
6B11 F 2.112 0.205 0.335 0.779 0.059
包 被 包 被 包 被 包 被 未包被
ova-BJA ova-BJA ova-BJA ova-BJA
测定结果也如图1中所示,其中显示以%OD计的AEB071的抑制率(无AEB 071=100%OD)。经测定使用AEB071小分子包被并非切实可行,因为该化合物不与培养板适当附着(数据未显示)。然而,使用携带载体的原始衍生物包被(例如卵清蛋白)起作用。因此,衍生物-此处的ova-BJA-与培养板附着。
如果使用未包被(NS1),则不会得到明显的信号。因此,背景是低的。此外,抗物种缀合抗体(B0和NS2)不会以非特异性方式结合测定物。这对避免背景而言也是重要的。
当加入AEB071时,全部选择的抗体结合固定化衍生物得到抑制。这表明所用抗体均对AEB071具有特异性。使用抗体4G4得到最佳特异性。
为了建立可以用作测定未知样品(例如生物样品)中AEB071浓度的校准曲线,如下表中所述进行连续稀释(孔中的终浓度)。如下制备AEB071对缓冲液中4G4和3A3的抑制曲线:
1ug/mL ova-BJA 测试的抗体:AEB071 抗-物种-po抗 OPD
体
4G4: 1:1-500
10’000 ng/l
2A3: 1:
50’000
+ + + + + Bn
+ + - + + B0
+ - + + + NS1
+ - - + + NS2
- + - + + NS3
- + + + NS4
各孔中的终浓度如下;
4G4 3A3 在ng/ml缓冲液中的AEB071
1:10’000 1:50’000
+ + 500
+ + 250
+ + 125
+ + 62.5
+ + 31.2
+ + 15.6
+ + 7.8
+ + 3.9
+ + 2
+ + 1
通过使用这种连续稀释,当测定OD时得到如图2中所述的校准曲线。
曲线A是对抗体4G4与AEB071关系得到的结果的代表。曲线B是对抗体3A3与AEB071关系得到的结果的代表。
图2说明如下:
4-P Fit:y=(A-D)/(1+(x/C)^B)+D:A B C D R°2
○曲线A(曲线4G4@AEB071:浓度v...2.058 1.218 12.9980.1080.997
□曲线B(曲线3A3@AEB071:浓度v...1.144 1.338 15.3460.1390.996
结果表明使用本发明方法得到的抗体适合于特异性检测样品中的AEB071。抗体4G4显示甚至比仍然展示可接受特异性的3A3更具有特异性。
Claims (20)
1.得到至少一种结合剂的方法,该结合剂结合至少一种母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合所述母体化合物的药物无活性形式,该方法包括:
(a)通过屏蔽所述母体化合物的所述药物活性形式的部分制备所述母体化合物的所述药物活性形式的至少一种衍生物;
(b)使用所述衍生物得到结合所述衍生物的一组结合剂;
(c)从所述结合剂组中选择至少一种结合剂,该结合剂结合所述衍生物以及至少一种所述母体化合物的药物活性形式。
2.根据权利要求1的方法,其中用屏蔽结构化学修饰衍生物的部分,使得所述母体化合物的所述药物活性形式的至少一部分接近结合剂,其中所述母体化合物的所述药物活性形式在哺乳动物中被代谢。
3.根据权利要求1或2的方法,其中制备至少两种用于得到结合剂的衍生物,其中衍生物各自在不同于另一衍生物的分子位置上携带屏蔽结构。
4.根据权利要求1-3中至少一项的方法,其中所述母体化合物是AEB071。
6.根据权利要求1-5中至少一项的方法,其中通过分析存在的至少一种母体化合物的药物活性形式是否竞争性抑制结合剂与所述衍生物结合进行选择步骤(c)。
7.根据权利要求1-6中至少一项的方法,其中在选择步骤(c)中,选择至少一种选自下组的结合剂:
(a)结合剂,其结合
-至少一种母体化合物的药物活性形式,
-得到的针对它的衍生物,和
-至少一种由母体化合物生成的第二种衍生物,其中母体化合物的不同部分在所述的第二种衍生物中被屏蔽;
(b)结合剂,其结合
-至少一种母体化合物的药物活性形式,
-得到的针对它、但不针对如下的衍生物,
-至少一种由母体化合物生成的第二种衍生物,其中母体化合物的不同部分在所述第二种衍生物中被屏蔽。
8.根据权利要求1-7中至少一项的方法,其中生成用于母体化合物各潜在代谢位置的衍生物,它可以使母体化合物失活。
9.通过根据权利要求1-8中至少一项的方法得到的结合剂。
10.用于监测样品中AEB071的药物活性形式的结合剂,可通过下列步骤得到:
(a)使用如权利要求13所定义的至少一种衍生物得到一组结合所述衍生物的结合剂;
(b)从所述组结合剂中选择结合所述衍生物和AEB071的至少一种药物活性形式的结合剂。
12.根据权利要求10或11的结合剂,其中该结合剂是选自2G8、4G4、3A3或6B11或其衍生物或片段的抗体,它们识别同一表位。
14.药物监测方法,包括
-使推定包含母体化合物的至少一种药物活性形式的样品接触至少一种结合剂;
-测定所述母体化合物的所述药物活性形式的浓度,
其中至少一种结合剂用于测定所述浓度,该结合剂以较母体化合物的药物无活性形式更高的特异性与所述母体化合物的药物活性形式结合。
15.根据权利要求14的药物监测方法,包括根据权利要求9-12中至少一项的结合剂。
16.根据权利要求14或15的药物监测方法,其中被结合剂识别的所述母体化合物的衍生物或母体化合物与可检测标记缀合,其中所述缀合的母体化合物或其衍生物的配置与样品中存在的所述母体化合物的药物活性形式竞争结合剂的结合,且其中所述标记提供所述母体化合物的所述药物活性形式浓度的信号指示。
17.根据权利要求14-16的药物监测方法,其中所述母体化合物是AEB071。
18.根据权利要求17的药物监测方法,其中用作竞争靶标的衍生物是根据权利要求13的衍生物或其被具有相同特异性的结合剂识别的变体。
19.根据权利要求17或18的药物监测方法,其中使用识别母体化合物AEB071和/或其药物活性形式的结合剂,且其中该监测方法具有1-500或1-250ng/ml的工作范围。
20.用于测定样品中母体化合物的至少一种药物活性形式浓度的诊断试剂盒,其包含:至少一种结合剂,该结合剂结合母体化合物的药物活性形式所具有的特异性高于结合母体化合物的药物无活性形式;和任选用于测定所述样品中所述母体化合物的所述药物活性形式浓度的试剂。
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