KR101255828B1 - 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석방법 - Google Patents

단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성 및 정량적 분석방법에 관한 것이다. 본 발명은 효소 활성형 억제제 및 결합제를 이용하여 시료내 효소 활성형을 분석함으로써 단순 결합제(예컨대, 항체)를 이용하여 효소 활성형을 분석하는 방법보다 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 장점을 가진다. 본 발명은 단순 결합제를 이용하여 효소 활성형을 분석하는 방법보다 작은 장비를 이용하여 복잡하지 않고 간단하게 시료내에 존재하는 효소 활성형을 분석할 수 있다. 본 발명은 타겟 효소 또는 효소의 활성형에 억제제 및 결합제를 동시에 이용함으로써 신속하고 특이적으로 분석할 수 있으며, 이러한 본 발명의 특성을 이용하여 약품(drug)을 고속으로 그리고 대량(high-throughput)으로 스크리닝을 할 수 있다. 또한, 본 발명은 약품 투여 대상체(예컨대, 동물 또는 인간)에서의 약품의 효능 및 투여량에 대한 임상 모니터링을 위한 POCT(Point of care testing)에 적용될 수 있다.

Description

단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석방법{QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYTICAL METHOD FOR ANALYZING THE ACTIVITY TYPE OF AN ENZYME THAT IS ACTIVATED BY PROTEOLYSIS}
본 발명은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성 및 정량적 분석방법에 관한 것이다.
단백질들은 여러 가지 기능을 하기 위하여 한 가지 혹은 그 이상의 다양한 조절 경로를 이용하고 있다. 이러한 여러 가지 조절 경로에는 단백질의 특정 위치에서의 절단, 결실, 추가, 사이드 체인의 콘버트나 모디피케이션 등 다양한 방법들이 있다.
단백질, 특히 효소는 다양한 메커니즘을 통하여 효소의 활성이 조절된다. 첫째, 최종 산물(product)에 의하여 효소의 활성이 조절되는 피드백 억제 조절, 둘째, 헤모글로빈에서의 O2, H+ 및 CO2 의 상호 작용 또는 대장균(E. coli)에서의 ATCase(aspartate transcarbamoylase)의 활성 조절 기작과 같은 알로스테릭 조절(allosteric control), 셋째, 칼모둘린(calmodulin)이 세포 내의 Ca+2 을 감지하여 다른 효소들을 활성화시키는 조절, 안티헤모필릭 인자(antihemophilic factor)가 세린프로테아제의 활성을 증가시키 혈액 응고의 속도를 증가시키는 조절 또는 사이클릭 AMP 이 프로틴 키나아제 A 의 억제 서브유닛을 제거시킴으로서 키나아제의 활성시키는 조절과 같은 조절 단백질에 의한 자극 및 억제, 넷째, 단백질 키나아제가 ATP 에서 포스포릴 그룹을 떼어 효소에 붙임으로써 효소를 활성화시키는 조절기작 및 단백질 포스파타아제가 활성화된 효소로부터 포스포릴기를 가수분해하여 불활성화시키는 가역적 공유결합 변형, 그리고 다섯째, 지모젠(zymogens) 또는 프로효소(proenzymes)의 펩티드 결합을 가수 분해를 통한 비가역적인 효소 활성 조절 메커니즘이 있다.
특히, 효소적 활성을 위한 메커니즘 중에서 단백질 분해(proteolytic cleavage)에 의한 프로효소(proenzymes)으로부터 효소 활성형으로의 전환은 지모젠(zymogens) 또는 프로효소에서의 펩티드 결합을 가수 분해를 통하여 지모젠 또는 프로효소를 효소 활성형으로 전환시키는 비가역적인 효소 활성 조절 메커니즘이다. 예컨대, 단백질 분해에 의한 효소의 활성형은 리포프로틴-관련 포스포리파아제 A2(Lipoprotein-associated phospholipase: Lp-PLA2), 트롬빈, 유로키나아제, 트립신, 키모트립신, 엘라타아제 및 서브틸리신등과 같은 효모 활성형이 알려져 있다.
효소가 활성형으로 전환된 후 기질과의 결합하는 경우 효소 활성형의 구조적인 형태 변화에 있어서 다음과 같은 2 가지의 이론이 있다: 첫째, 락 앤 키(lock and key) 이론은 효소 활성형 억제제가 효소 활성형과 결합하는 경우 효소 활성형의 형태 변화에 영향을 주지 않는다는 이론이며, 인듀스드 핏(induced fit) 이론은 억제제가 효소 활성형과 결합하는 경우 효소 활성형의 형태가 변화된다는 이론이다.
Lp-PLA2 는 인간의 경우 PLA2G7 유전자에 의하여 암호화된 프로포스포리파아제 A2 가 단백질 분해에 의하여 활성화된 효소이며, Lp-PLA2 는 441 개의 아미노산으로 이루어진 45 kDa 단백질이다. 또한, 프로포스포리파아제 A2 의 인간 mRNA 전장서열 및 단백질 서열은 GenBank 접근번호 NM_005084 및 NP_005075 에 각각 공지되어 있다. 또한, Lp-PLA2 는 PAF(platelet-activating factor) 아세틸하이드로라아제이며, 아세틸 그룹의 가수분해를 통하여 PAF 를 생물학적으로 불활성화 생산물인 LYSO-PAF 및 아세테이트로의 분해 과정을 촉매한다고 알려져 있다.
Lp-PLA2 는 혈액에서 저밀도 리포프로틴(low-density lipoprotein: LDL)과 함께 주로 이동하며, 약 20%는 고밀도 리포트로틴과 관련되어 있다고 알여져 있다. Lp-PLA2 는 염증세포에 의하여 생산되며, LDL 에서 산화된 포스포리피드(phospholipid)를 가수분해시킨다. 보다 구체적으로, Lp-PLA2 는 LDL 에 있는 리포리피드를 lysoPC(lysophosphatidylcholine)과 oxNEFA(xidized nonesterified fatty acids)으로 가수분해시키고, 산화된 LDL 이 동맥내피를 투과한 후 마크로파지에 의하여 흡수되어 폼세포(foam cell)를 형성한다. 형성된 폼세포는 림프구에 의하여 용혈되어 잔여물이 점차 증가되어 혈관을 좁게 만들고 결국 동맥혈관 안으로 유출되어 혈관을 막거나 염증을 유발시킨다.
종래 개발된 Lp-PLA2 활성 분석은 발광 또는 방사활성 Lp-PLA2 기질 및 카운터를 필요로 한다. 보다 구체적으로, 발광 또는 형광 기질인 Lp-PLA2-기질을 이용하여 Lp-PLA2 활성을 분석하는 경우 2 단계의 세척과정을 필요하며 기질이 Lp-PLA2 에 특이적이지 않기 때문에 특이성을 나타내기 위하여 특정 농도의 Lp-PLA2 가 필요하다. 또한, 방사활성 Lp-PLA2 기질을 이용하여 Lp-PLA2 활성을 분석하는 경우 비절단 또는 절단된 방사활성 Lp-PLA2 기질의 침전을 위한 BSA(bovine serum albumin)을 첨가한 후 원심분리하고, 기질의 침전을 위하여 금속이온으로 케미컬 및 버퍼를 최적화하는 단계를 필요로 할 뿐만 아니라, 활성 측정을 위하여 신틸레이션(scintillation) 카운터를 필요로 하며 POCT(Point of Care Testing)하기에 복잡하다는 문제점이 있다.
현재, 효소 활성형의 정량적 또는 정성적으로 분석하는 방법은 일반적으로 항원-항체 반응과 같은 면역학적 방법이 널리 이용되고 있다.
그러나, 이러한 면역학적 방법은 대부분 시그널 표지가 결합된 항체를 타깃 효소 또는 효소의 활성혈과 직접적인 결합만으로 검출하는 방법이며, 검출 결과를 분석하는데 복잡한 단계를 이용함으로써 상당한 시간이 소요되고, 결과의 정확도면에서도 신뢰도가 매우 떨어진다는 문제점이 있다.
따라서, 활성을 가지는 효소의 활성형, 특히 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 정성적 및 정량적으로 검출 또는 분석할 수 있는 신규한 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 간단하면서 빠르게 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 효소의 활성형에 특이적으로 결합하는 효소의 활성형 억제제 및 결합제를 이용하여 시료 내에 효소의 활성형의 존재 유무 또는 효소 활성형의 양을 신속하고 정확하게 분석할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적인 분석방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석방법을 제공한다:
(a) 포획제(capturing agent)로서 상기 효소 활성형의 억제제에 분석하고자 하는 시료 내의 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 접촉(contacting)시키는 단계;
(b) 검출자로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉(contacting)시켜 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 형성시키는 단계; 및
(c) 상기 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 검출하는 단계; 상기 복합체의 검출은 시료 내 상기 효소 활성형이 존재함을 나타낸다.
본 발명자들은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 간단하면서 빠르게 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 효소의 활성형에 특이적으로 결합하는 효소의 활성형 억제제 및 결합제를 이용하여 시료 내에 효소의 활성형의 존재 유무 또는 효소 활성형의 양을 신속하고 정확하게 분석할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 특이적으로 그리고 신속하게 정성 또는 정량적으로 분석할 수 있는 방법이다.
본 발명의 명세서에서, 효소의 활성형을 언급하면서 사용되는 용어 "정성적 분석" 은 시료 내 타겟 효소 활성형의 존재 유무를 분석하는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서에서, 효소의 활성형을 언급하면서 사용되는 용어 "정량적 분석" 은 시료 내 타겟 효소 활성형의 양(예컨대, 농도)을 분석하는 것을 의미한다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세히 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 포획제로서의 효소 활성형 억제제와 효소 활성형의 접촉
우선, 포획제로서 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소 활성형의 억제제에 분석하고자 하는 시료 내의 효소 활성형을 접촉시켜, 효소 활성형 억제제가 효소 활성형에 결합되도록 한다.
본 발명에 의하여 정성 또는 정량적으로 분석할 수 있는 효소의 활성형은 자연계에 존재하는 유기체에서 발견될 수 있는 모든 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형이다.
본 발명의 명세서에서, 표현 "효소의 활성형(active form) 또는 효소 활성형" 은 단백질분해에 의하여 효소가 본래의 기능인 효소활성을 나타낼 수 있는 효소 형태 또는 구조를 의미한다.
본 발명이 단백질 분해에 의한 효소의 활성형을 정성 또는 정량적으로 분석하는데 이용하는 방법인 경우, 바람직한 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 V, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이며, 보다 바람직하게는 Lp-PLA2, TAFIa, 혈액응고 인자 Va, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII 또는 트롬빈이며, 보다 더 바람직하게는 Lp-PLA2 또는 TAFIa 이다.
본 발명에 따르면, 포획제로서 효소 활성형 억제제가 이용된다.
본 명세서에서 용어 "효소 억제제(enzyme inhibitor)" 는 효소와 결합하여 효소의 활성을 감소시키는 분자를 의미한다. 상기 효소 억제제는 직접 또는 간접적으로 효소 활성부위에서 기질이 효소와 상호작용을 하는 것을 차단시키며, 가역 또는 비가역적으로 결합을 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "효소 활성형 억제제" 는 활성형의 효소에 결합하여 효소의 활성을 감소시키는 분자를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 효소 활성형의 억제제는 효소 활성형, 또는 프로효소와 효소 활성형 모두에 결합할 수 있는 억제제를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 효소 활성형의 억제제는 효소 활성형에만 특이적으로 결합하는 억제제이다.
상용화된 다양한 약물(drug) 분자들은 효소 억제제를 포함한다.
본 발명에서 이용 가능한 효소 활성형 억제제는 자연의 억제제(natural inhibitor), 예컨대 Lp-PLA2 에 대한 Apo C-III를 포함한다. 또한, 본 발명에서 이용 가능한 효소 활성형 억제제는 비-자연적 억제제(non-natural inhibitor)를 포함하며, 예컨대 합성 억제제를 포함한다. 예를 들어, Lp-PLA2 의 합성 억제제로서 Darapladib 이 본 발명에 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 억제제는 단백질(단편, 항체, 도메인등), 펩타이드(예컨대, L- 또는 D-아미노산 올리고펩타이드), DNA 앱타머, RNA 앱타머, PNA(Peptide Nucleic acids) 및 유기 화합물을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 억제제는 효소의 활성형과 결합하여 효소의 활성형의 구조적인 형태를 변형 또는 변형시키지 않으면서 효소 활성형의 기능을 억제시키는 물질을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 억제제는 효소의 활성형과 결합하여 효소의 활성형의 구조적인 형태를 변형시키지 않으면서 효소의 활성형의 기능만을 억제시킬 수 있는 억제제이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 또는 비경쟁적 결합을 통하여 결합할 수 있는 억제제를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 결합을 하여 기질이 결합하는 것을 억제하는 억제제이다.
본 발명에서 단계 (a)에서의 포획제는 직접적으로 효소 활성형과 결합할 수 있으며 또는 고상 기질(substrate) 표면에 결합된 상태에서 효소 활성형과 결합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 단계 (a)에서의 포획제는 는 고상 기질 표면상에 결합된 상태로 효소 활성형과 특이적으로 결합한다.
포획제를 고상 기질 상에 결합시켜 사용하는 경우, 본 발명에 이용될 수 있는 고상기질은 당업계에 공지된 다양한 고상 기질을 포함하며, 예컨대 유리, 금, 은, 알루미늄, 크롬, 실리콘, 게르마늄, 갈륨비소, 갈
Figure 112012061746663-pct00007
인, 규산질화물, 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론 또는 섬유의 고상 기질이다.
본 발명에서 이용되는 고상 기질에는 효소 활성형의 고정화를 위하여 당업계에 공지된 다양한 링커 분자가 부착될 수 있다.
아래에 기재된 바와 같이, 본 발명을 이차원적 포맷으로 실시하는 경우에는, 포획제는 평평한 면을 가지는 플레이트 상에 고정화 되는 것이 바람직하다. 본 발명을 삼차원적 포맷으로 실시하는 경우에는, 포획제는 비드 또는 입자에 고정화 되는 것이 바람직하다.
단계 (b): 포획제 -효소 활성형- 검출자 복합체의 형성
이어, 검출자를 단계 (a)의 결과물에 접촉(contacting)시켜 포획제-효소 활성형-검출자 복합체의 형성시킨다.
상기 검출자는 효소 활성형에 특이적일 필요는 없으며, 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제가 검출자로 이용될 수 있다.
검출자는 단계 (a)에서 효소 활성형 억제제에 결합된 효소 활성형에 결합을 한다.
검출자는 비드(예컨대, 마이크로비드) 또는 입자(예컨대, 마이크로 입자 및 나노입자)에 결합된 형태로 이용될 수도 있다. 비드 또는 입자에 결합된 검출자를 이용하는 경우, 바람직하게는 상기 비드 또는 입자는 금속 비드 또는 입자이며, 예컨대 자성 비드, 자성 입자, 금 비드 또는 금 입자이다.
본 발명에서 이용하는 결합제는 효소 또는 효소의 활성형에 결합할 수 있는 결합제이다. 바람직하게는, 본 발명에서의 결합제는 효소의 활성형 또는 효소와 효소의 활성형 모두에 결합할 수 있는 결합제이며, 보다 바람직하게는 효소의 활성형에 특이적으로 결합 할 수 있는 결합제이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 결합제는 올리고펩타이드, 항체(예컨대, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 키메릭 항체), 리간드, 올리고뉴클레오타이드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)(Bock LC et al., Nature 355(6360):564-6(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K, J Mol Med . 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R., Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):14272-7(1998))이며, 보다 바람직하게는 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명은 효소의 활성형에 포획제와 먼저 결합시킨 후 포획제와 결합된 효소의 활성형에 결합제를 결합시킨 후 시그널을 검출하는 단계를 통하여 실시되나, 효소 활성형에 포획제 및 결합제를 동시에 접촉시키는 단계를 통하여 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 효소 활성형에 포획제 및 결합제를 동시에 접촉시키는 단계를 통하여 실시된다.
단계 (c): 포획제 -효소 활성형- 검출자 복합체의 검출
최종적으로, 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 검출한다. 복합체의 검출은 시료 내 효소 활성형이 존재함을 나타낸다.
포획제-효소 활성형-검출자 복합체의 검출은 다양한 방식으로 할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합된 검출자를 이용하여 상기 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 실시할 수 있다. 또한, 검출가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있는 항-검출자 항체(예컨대, ELISA 에서의 이차항체)를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 검출자는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함하며, 단계 (c)는 상기 검출자에 결합된 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 단계 (c)는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합된 항-검출자 항체를 처리하고 상기 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출자 또는 항-검출자 항체에 결합된 검출가능한 시그널 발생 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지(예컨대, 플루오레세인, TAMRA, Cy5, Cy3, HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이며, 보다 바람직하게는 효소 표지, 형광 표지 또는 발광 표지이고, 가장 바람직하게는 형광 표지이다.
종래 타겟 프로효소 또는 효소의 활성형을 검출하기 위해서 이용되는 방법은 타겟 프로효소 또는 효소의 활성형에 직접 시그널 표지를 결합시키거나 시그널 표지가 결합된 항체를 결합시킨 후 시그널을 검출하는 방법을 이용하여 왔다. 그러나 이러한 방법은 타겟 프로효소 또는 효소의 활성형을 검출하는데 복잡한 단계(다양한 시약 및 세척단계)로 인하여 많은 시간 및 장비가 요구되었다.
본 발명은 포획자로서 효소 활성형의 억제제와 시그널 표지된 결합제를 함께 이용하여 타겟 효소의 활성형을 특이적으로 검출함으로써 간단하고 빠르게 결과를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 타겟 효소의 활성형에 대한 검출 정확도를 획기적으로 향상시킨 방법이다.
본 발명에서 단계 (c)는 효소 활성형에 결합된 검출자의 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하여 실시된다.
본 발명에서의 단계 (c)를 통한 최종적인 결과 분석은 당업계에서 "리더" 또는 "스캔너" 로 공지되어 있는 자동화된 장치를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서는 단계 (c)는 광학 센서, 광원 및 광원검출기를 포함하는 광학 검출기, 흡광 또는 형광을 측정하는 광학 검출기, UV 검출기, 방사 검출기, 공초점현미경 검출기, CCD(charge-coupled device) 카메라 또는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 광학 센서, 광원 및 광원검출기를 포함하는 광학 검출기, 흡광 또는 형광을 측정하는 광학 검출기 또는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (b) 및 단계 (c) 사이에 단계 (b)의 반응결과물을 세척하는 단계를 추가적으로 포함한다.
상기 검출자 또는 항-검출자 항체에 결합된 표지가 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2 '-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 기질을 단계 (b)의 반응 결과물에 처리하고 이로부터 나오는 발색 또는 발광을 측정하여 단계 (c)를 실시한다.
본 발명은 시료 내에 존재하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 정성 및/또는 정량적으로 분석 할 수 있는 방법이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 효소의 활성형을 포함하는 시료는 포유류, 조류, 파충류 또는 양서류로부터 수득된 시료이며, 보다 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득된 시료이다.
보다 더 바람직하게는 포유류의 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 모유, 땀, 조직 적출액, 종양 적출액, 관절액, 척수액, 기관의 균질액, 정액 또는 질 분비물이며, 보다 더욱 바람직하게는 포유류의 혈액, 혈장, 혈청, 조직 적출액 또는 종양 적출액이고, 가장 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.
본 발명은 질환 또는 질병과 관련된 다양한 효소의 활성형을 검출 및 정량하는 데 이용될 수 있다. 프로효소로부터 효소 활성형으로 전환되어 질환 또는 질병을 야기하는 효소 활성형이라면 제한 없이 본 발명이 적용될 수 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 분석 대상의 효소 활성형은 동맥경화증에 관여하는 효소 활성형이며, 보다 바람직하게는 죽상동맥경화증, 세동맥경화증, 중막경화증, 협심증, 심근경색증, 뇌혈관성 치매, 일과성 뇌허헐발작, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌혈전증, 뇌색전증 또는 말초혈관폐쇄증에 관여하는 효소 활성형이다.
한편, 상술한 본 발명은 크게 두 가지 포맷으로 실시할 수 있다: (i) 이차원적 포맷; 및 (ii) 삼차원적 포맷.
상기 이차원적 포맷 및 삼차원적 포맷의 가장 큰 차이는 포획제의 존재 형태이다. 이차원적 포맷에서, 포획제는 플레이트와 같은 고상기질 상에 결합되어 있으며, 삼차원적 포맷에서, 포획제는 비드 또는 입자에 결합되어 있다.
이차원적 포맷은 위에서 상세히 설명되어 있으며, 도 1a-도 2b 에 도시되어 있다.
삼차원적 포맷은 포획제가 비드 또는 입자에 결합되어 있는 것이다. 예를 들어, 포획제로서 Lp-PLA2 활성형 억제제인 Apo C-III가 이용되고 검출자로서 Lp-PLA2 활성형에 결합하는 항체가 이용되는 경우, 자성입자에 결합된 Apo C-III와 표지가 결합된 Lp-PLA2 항체를 시료와 동시에 반응시킨다. 결합반응을 종료한 다음, 이어 반응결과물에 자기장을 인가하여 Apo C III-자성입자-Lp-PLA2 활성형-Lp-PLA2 항체 복합체를 분리한다. 이어, 상기 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 시료 내 Lp-PLA2 활성형의 정성적 및/또는 정량적 분석을 실시한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석방법을 제공한다:
(a) 포획제로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제에 분석하고자 하는 시료 내의 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 접촉시키는 단계;
(b) 검출자로서 상기 효소 활성형에 결합하는 억제제를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시켜 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 형성시키는 단계; 및
(c) 상기 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 검출하는 단계; 상기 복합체의 검출은 시료 내 상기 효소 활성형이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 두 번째 양태는, 포획제로서 결합제가 이용되고 검출자로서 효소 활성형 억제제가 이용되는 것을 제외하고는, 첫 번째 양태와 동일하다. 따라서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석용 키트를 제공한다: (a) 포획제(capturing agent)로서 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 억제제; 및 (b) 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석용 키트를 제공한다: (a) 포획제로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제; 및 (b) 검출자로서 상기 효소 활성형에 결합하는 억제제.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 방법을 구현하기 위한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 검출자는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합된 항-검출자 항체를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 결합을 하여 기질이 결합하는 것을 억제하는 물질이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 포획제는 고상기질(substrate)에 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 결합제는 항체이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단백질분해에 의하여 활성화된 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 V, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이며, 보다 바람직하게는 Lp-PLA2, TAFIa, 혈액응고 인자 Va, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII 또는 트롬빈이며, 가장 바람직하게는 Lp-PLA2 또는 TAFIa 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 결합을 하여 기질이 결합하는 것을 억제하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형에만 특이적으로 결합하는 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적인 분석방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 효소 활성형 억제제 및 결합제를 이용하여 시료내 효소 활성형을 분석함으로써 단순 결합제(예컨대, 항체)를 이용하여 효소 활성형을 분석하는 방법보다 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 장점을 가진다.
(iii) 본 발명은 단순 결합제를 이용하여 효소 활성형을 분석하는 방법보다 작은 장비를 이용하여 복잡하지 않고 간단하게 시료 내에 존재하는 효소 활성형을 분석할 수 있다.
(iv) 본 발명은 타겟 효소 또는 효소의 활성형에 억제제 및 결합제를 동시에 이용함으로써 신속하고 특이적으로 분석할 수 있으며, 이러한 본 발명의 특성을 이용하여 약품(drug)을 고속으로 그리고 대량(high-throughput)으로 스크리닝을 할 수 있다.
(v) 또한, 본 발명은 약품 투여 대상체(예컨대, 동물 또는 인간)에서의 약품의 효능 및 투여량에 대한 임상 모니터링을 위한 POCT(Point of care testing)에 적용될 수 있다.
도 1a-1b 는 본 발명을 이용하여 시료내에 존재하는 Lp-PLA2 에 대한 정성 및 정량적으로 분석 과정을 나타낸 개략도이다. 도 1a 는 평면 고상기질(solid substrate)의 표면에 고정 결합된 Lp-PLA2 억제제와 시그날 표지가 결합된 Lp-PLA2 결합제(항체)를 이용하여 시료내에 존재하는 Lp-PLA2 를 정성 및 정량적으로 분석하는 방법을 나타낸 개략도이다. 도 1b 는 평면 고상기질의 표면에 고정 결합된 Lp-PLA2 억제제와 시그날 표지가 결합된 Lp-PLA2 결합제(항체)를 이용하여 시료 내에 존재하는 Lp-PLA2 를 정성 및 정량적으로 분석하는 방법을 나타낸 개략도이며, 시료내 Lp-PLA2 억제제가 존재하는 경우 Lp-PLA2 는 Lp-PLA2 억제제와의 결합에 의하여 평면 고상기질 표면에 결합된 Lp-PLA2 억제제와 결합하지 않고 분리되어 시그널을 나타내지 않는다. 본 발명을 이용하는 경우, 시료 내 활성형 Lp-PLA2 의 포함 유무 및 활성형 Lp-PLA2 의 양을 분석할 수 있다.
도 2a-2b 는 실시예 2 의 분석 과정에 대한 모식도이다.
도 2c 는 실시예 2 의 결과를 보여주는 그래프이다. y 축의 단위는 흡광도 (Ab 620nm)이다.
도 3a 는 정상인 및 패혈증 환자의 혈장에서 TAFIa 및 TAFIai 에 대한 본 발명에 따른 분석 결과이다. 빗금쳐진 바(bar)의 정상인의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai 의 ELISA 결과이고 환자군의 1-25 까지는 패혈증 환자의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai 의 ELISA 결과이다.
도 3b 는 정상인 및 암 환자의 혈장에서 TAFIa 및 TAFIai 에 대한 본 발명에 따른 분석 결과이다. 빗금쳐진 바(bar)가 정상인의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai ELISA 결과이고 나머지 점박이 바(bar)가 암 환자의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai ELISA 결과 수치이다.
도 3 은 정상인 및 혈액투석 환자의 혈장에서 TAFIa 및 TAFIai 에 대한 본 발명에 따른 분석 결과이다. 빗금쳐진 바(bar)가 정상인의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai ELISA 결과이고 나머지 점박이 바(baar)가 혈액투석 환자의 혈장에서 측정된 TAFIa 및 TAFIai ELISA 결과 수치이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.
실시예 1: Apo C- III ( Apolipoprotein C- III )가 코팅된 칩을 이용한 LPL(lipoprotein lipase ) 활성형 분석
실험재료 및 장비
본 실험에 이용된 실험 재료 및 장비는 다음과 같다:
Apo C-III(Sigma, 미국), LPL 항체(mouse anti-lipoprotein lipase monoclonal antibody, Unconjugated; 클론: Abcam, 미국), 아비딘(Sigma, 미국), EDC(Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride; Thermo, 미국), NHS(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt; Fluka, 미국), 술포-NHS-바이오틴(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin; PIERCE, 미국), 형광 입자(Fluorescent particle; FluorSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.2 ㎛, dark red fluorescent (660/680), Molecular Probes), BSA(Bovine serum albumin; BOVOGEN, 오스트레일리아), 덱스트란(Dextran; Dextran from Leuconostoc sp., Fluka, 미국), Tween 20(Sigma, 미국), 투석 막(Dialysis membrane; Spectra/pro dialysis membrane 12,000-14,000, Spectrum Lab, 미국), 원심분리기(MICRO 17RT, Hanil Science, 대한민국), FREND 리더기(나오엔텍, 대한민국), UV 스펙트로포토미터(Spectrophotometer; UV-1800, SHIMADZU, 일본), 인큐베이터(HANBAEK, 대한민국)
Apo C- III 바이오티닐레이션( biotinylation )
PBS(phosphate buffered saline)을 이용하여 1 mg/㎖로 희석된 Apo C-III를 제조하고, 1 차 증류수를 이용하여 10 mM 바이오틴을 제조하였다. 그 다음, 1 mg/㎖ 농도의 1 ㎖ Apo C-III에 10 mM 바이오틴 27 ㎕를 혼합한 후 상온에서 1 시간 30 분 교반 반응시켰다. 상온에서 반응시킨 반응물을 투석 막에 넣고 PBS 에 담가 투석하였으며, 1 ℓ PBS 로 3 시간 마다 총 3 회 교체하였다. 투석된 반응물을 280 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 확인한 후 냉장 보관 하였다.
안티 - LPL 항체 형광 컨쥬게이트
pH 6.2, 50 mM MES 버퍼를 이용하여 1 mg/㎖ 안티-LPL 항체를 제조하였다. 제조된 1 mg/㎖ 안티-LPL 항체 용액에 50 mM 과 100 mM 의 농도가 되도록 EDC 와 NHS 를 각각 첨가하였다. 혼합된 용액에 0.2 중량/부피% 형광 입자를 즉시 혼합한 후 상온에서 3 시간 동안 교반 반응시켰다. 교반된 반응물을 12,000 g 로 15 분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 반응물의 침전물을 PBS 로 재부유시킨 다음 12,000 g 로 15 분간 원심분리한 후 상층액을 제거시켰다. 그 다음, 상층액이 제거된 침전물을 1% BSA 가 첨가된 PBS 로 재부유시키고, 형광 입자의 중량/부피%가 0.2 가 되도록 하였다. 상기와 같은 방법으로 제조된 안티-LPL 항체 형광 컨쥬게이트를 냉장 보관하였다.
칩 제조
PBS 용액에 아비딘을 100 ㎍/㎖이 되도록 희석한 후 50 mM 과 100 mM 의 농도가 EDC 와 NHS 를 각각 첨가하여 아비딘 용액을 제조하였다. 제조된 아비딘 용액을 카르복실기가 유도된 PMMA(poly(methyl methacrylate) 슬라이드 위에 1.5 ㎕ 돗팅(dotting) 하였다. 아비딘 용액이 돗팅된 슬라이드를 37℃ 인큐베이터에서 1 시간 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션된 슬라이드를 pH 7.4, 0.1M Tris 용액으로 세척한 후 슬라이드상에서 아비딘이 돗팅 되었던 위치에 10 ㎍/㎖로 희석된 바이오틴화된 APO C-III를 1.5 ㎕로 돗팅하였다. APO C-III의 희석은 1% BSA 포함된 PBS 용액으로 하였다. 바이오틴화된 APO C-III로 돗팅된 슬라이드를 37℃ 인큐베이터에서 1 시간 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 슬라이드를 1% BSA, 0.05% Tween 20 및 0.5% 덱스트란이 첨가된 PBS 용액으로 세척한 후 상온에서 건조시켰다. 그 다음, 1% BSA, 0.01% Tween20 및 3% 덱스트란이 첨가된 pH 7.4, 0.1 M Tris 용액을 이용하여 0.2 중량/부피%로 희석시킨 안티-LPL 항체 형광 컨쥬게이트를 1.2 ㎕의 양으로 돗팅시킨 후 건조시켰다. 건조된 슬라이드의 유동을 유도 및 제어할 수 있는 또 다른 슬라이드와 접합하여 시험할 수 있는 칩을 제조하였다.
실험 방법
제조된 칩의 샘플 주입(inlet) 부위에 샘플(lipoprotein lipase 가 존재하거나 또는 존재하지 않는 환자 혈청 또는 혈장)을 30 ㎕를 떨어뜨렸다. 샘플을 떨어뜨린지 5 분이 경과 하면 시험되는 칩을 FREND 리더기((주)나노엔텍)에 삽입시켰다. 약 40 초 후에 FREND 리더기의 디스플레이 화면에 샘플 내 LPL 의 존재 정도가 정량적으로 표시되며, 이러한 정량적인 표시는 LPL 의 활성화 정도를 나타낸다.
실시예 2: Apo C- III ( Apolipoprotein C- III )가 코팅된 마이크로플레이트를 이용한 Lp - PLA2 ( lipoprotein associated phospholipase 2) 활성형 분석
실험재료 및 장비
본 실험에 이용된 실험 재료 및 장비는 다음과 같다:
Apo C-III(A3106, Sigma, 미국), Lp-PLA2 항체(mouse anti-lipoprotein lipase monoclonal antibody, 클론 4B4, diaDexus, 미국), Lp-PLA2(diaDexus, 미국), Horse radish peroxidase conjugated Goat anti-mose IgG(Sigma, 미국), 마이크로플레이트(NUNC, 덴마크), BSA(Bovine serum albumin; BOVOGEN, 오스트레일리아), Tween 20(Sigma, 미국), Tetramehtylbenzidine(TMB)(Sigma, 미국), 인큐베이터(HANBAEK, 대한민국), Infinit M200(TECAN, 스위스)
Apo C- III 코팅
pH 9.5, 100 mM 카보네이트 버퍼를 이용하여 2 ㎍/㎖로 희석된 Apo C-III를 제조하고, 마이크로플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 2 시간 코팅시켰다. 2 시간 경과 후, 각 웰 안의 희석된 Apo C-III 용액을 제거하고, 1% BSA 가 포함된 인산염완충용액을 각 웰에 200 ㎕씩 넣는다. 37℃ 인큐베이터에서 1 시간 경과 후 각 웰의 용액을 제거하고 건조 시켰다.
실험 방법
시험에 사용된 희석, 반응 및 세척 완충액으로 Tween20 0.05%가 포함된 pH 7.4 의 인산염 완충액을 사용하였다. Apo C-III가 코팅되어 있는 마이크로플레이트의 웰에 Lp-PLA2 를 1 ㎍/㎖로 희석하여 100 ㎕씩 넣고 반응 시켰다(도 2a). 또는, Lp-PLA2 및 Apo C-III를 각각 최종 1 ㎍/㎖ 및 0.5 ㎍/㎖이 되도록 희석하여 Apo C-III가 코팅되어있는 마이크로플레이트의 웰에 100 ㎕씩 넣고 반응 시켰다(도 2b). 각각의 반응 준비물에 대하여 37℃ 인큐베이터에서 50 분 반응시키고, 이어 각 웰의 용액을 제거하고 2 회 세척하였다. 세척된 각 웰에 5 ㎍/㎖로 희석된 항-Lp-PLA2 항체 용액을 100 ㎕씩 넣고 37℃ 인큐베이터에서 50 분 반응 시켰다. 이어, 각 웰의 용액을 제거하고 2 회 세척하였다. 세척된 각 웰에 1/5,000 로 희석된 HRP 가 접합된 염소 항-마우스 항체 용액을 100 ㎕씩 넣고 37℃ 인큐베이터에서 30 분 반응 시켰다. 이어, 각 웰의 용액을 제거하고 3 회 세척하였다. 세척된 각 웰에 TMB 용액을 100 ㎕씩 넣고 상온에서 30 분 반응시켰다. 반응된 각 웰에 100 ㎕의 2 N 황산 용액을 첨가 한 후, 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 측정은 TECAN Infinit M200 을 사용하며, 측정 파장으로 450 nm, 보정 파장으로 620 nm 를 사용하였다.
실험 결과
마이크로플레이트 상에 코팅되어 있으며 Lp-PLA2 에 대한 억제제 기능을 하는 Apo C-III는 본 발명의 시스템에서 Lp-PLA2 에 대하여 포획제의 역할을 한다. Lp-PLA2 및 프리(free) 상태의 Apo C-III를 모두 포함하는 시료를 첨가한 경우, 프리(free) 상태의 Apo C-III와 결합된 Lp-PLA2 는 마이크로플레이트에 코팅되는 있는 Apo C-III와 결합을 하지 못한다. 즉, 프리 상태의 Apo C-III 및 마이크로플레이트 상에 고정화 된 Apo C-III는 Lp-PLA2 에 대하여 경쟁적으로 결합을 한다.
Figure 112012061746663-pct00001
도 2c 및 표 1 에서 볼 수 있듯이, Lp-PLA2 및 프리(free) 상태의 Apo C-III를 모두 포함하는 시료를 적용한 경우, 포획제로 사용된 고정화 Apo C-III에 의하여 경쟁 결합 반응이 이루어진 결과, 프리 상태의 Apo C-III가 없는 반응과 비교하여 37.6% 시그널이 감소하였다. 이와 같은 실험 결과는, 억제제를 이용하여 PLP 의 활성도를 측정 할 수 있음을 보여 주는 예라 할 수 있다.
실시예 3: PTCI 가 코팅된 마이크로플레이트를 이용한 TAFIa 및 TAFIai 분석
실험 재료 및 방법
패혈증(sepsis) 환자, 암 환자 및 혈액투석 환자 혈장(plasma)으로부터 TAFI 와 TAFIai 의 활성을 측정하기 위하여 본 발명에 따른 HTS(High-Throughput Screening) 분석을 실시하였다.
우선, PTCI(potato tuber carboxypeptidase inhibitor; Sigma)를 소듐 카보네이트-비카보네이트(sodium carbonate-bicarbonate) 버퍼와 혼합하여 PTCI 의 농도를 2 ㎍/㎖로 맞춘 후, 96-웰 플레이트(Nunc Modules for Fluorescence)에 100 ㎕씩 넣었다. 상기 플레이트를 모이스쳐 챔버(moisture chamber)에 넣고 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 플레이트를 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4, Sigma)로 3 번 세척하였다. Blockace(설인유업주식회사, Japan)를 증류수와 혼합하여 10 ㎍/㎖로 희석시킨 후, 플레이트 각 웰에 150 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 모이스쳐 챔버안에서 인큐베이션 후 PBS 로 3 번 세척하였다.
패혈증 환자, 암 환자 및 혈액투석 환자의 혈액으로부터 분리한 각각의 혈장을 TBST(Tris buffered saline, with Tween 20, pH 8.0, Sigma)와 혼합하여 30 부피%로 희석시켰다. 혈장이 포함된 각각의 혼합액을 미리 제작한 PTCI 로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 TBST 로 각 웰을 3 회 세척하였다.
이어, TBST 에 항-TAFI 항체(Monoclonal mouse anti-TAFI, Hytest, 4TA1_16C5)와 Blockace 를 각각 1 ㎍/㎖와 0.8 ㎍/㎖로 희석하고 희석액을 100 ㎕씩 각 웰에 분주하였다. 희석액이 포함된 플레이트를 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, TBST 로 각 웰을 3 회 세척하였다. 그런 다음, 항-IgG(Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody, sigma, A8924) HRP(horseradish peroxidase)를 TBST 로 1 x 104 배로 희석하고, Blockace 의 농도가 0.8 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 후 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 분주된 플레이트를 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 TBST 로 각 웰을 3 회 세척하였다. 마지막으로, ECL 솔루션(Thermo, 37070)을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가한 후, 빅터 플레이트 리더기(Victor Plate reader; VICTOR3, PerkinElmer)로 신호 강도를 측정하였다.
실험 결과
패혈증( Sepsis ) 환자에서 나타난 TAFIa - PTCI 및 TAFIai - PTCI 반응
패혈증 환자의 혈액을 이용하여 혈장 속에 있는 TAFIa 및 TAFIai 의 양을 측정하였다. PTCI 가 코팅된 96 멀티-웰 플레이트에 정상인 및 패혈증 환자의 혈장을 투입한 후, HRP 가 부착된 2 차 항체를 투여하여 TAFIa 및 TAFIai 의 농도를 측정하였다. 그 결과, 전신 감염을 일으킨 패혈증 환자 혈장에서 TAFI 의 아이소머(isomer)인 TAFIa 및 TAFIai 가 정상인에 비해 많이 형성이 되었음을 알 수 있었다(도 3a).
암( Cancer ) 환자에서 나타난 TAFIa - PTCI 및 TAFIai - PTCI 반응
패혈증 환자의 TAFIa 및 TAFIai 측정 방법과 동일한 방법으로 암 환자의 혈액을 이용하여 혈장 속에 포함된 TAFIa 및 TAFIai 의 농도를 측정하였다. 패혈증 환자와 마찬가지로, 암 환자의 혈장에서 TAFIa 및 TAFIai 의 농도 수치가 정상인에 비해 높게 나타났다(도 3b).
혈액투석( Hemodialysis ) 환자에서 나타난 TAFIa - PTCI 및 TAFIai - PTCI 반응
혈액투석 환자의 TAFIa 및 TAFIai 측정 방법과 동일한 방법으로 혈액투석 환자의 혈액을 이용하여 혈장 속에 포함된 TAFIa 및 TAFIai 의 농도를 측정하였다. 패혈증 환자와 마찬가지로, 혈액투석 환자의 혈장에서 TAFIa 및 TAFIai 의 농도 수치가 정상인에 비해 높게 나타났다(도 3c).

Claims (28)

  1. 다음 단계를 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석방법:
    (a) 포획제(capturing agent)로서 상기 효소 활성형의 억제제에 분석하고자 하는 시료 내의 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 접촉(contacting)시키는 단계;
    (b) 검출자로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉(contacting)시켜 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (c) 상기 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 검출하는 단계;
    상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 Ⅴ, 혈액응고 인자 Ⅶ, 혈액응고 인자 Ⅸ, 혈액응고 인자 Ⅹ, 혈액응고 인자 5, 혈액응고 인자 5, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-Otetradecanoylphorbol-13 acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이며; 상기 단계 (c)의 복합체의 검출은 시료 내 상기 효소 활성형이 존재함을 나타낸다.
  2. 다음 단계를 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석방법:
    (a) 포획제로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제에 분석하고자 하는 시료 내의 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형을 접촉시키는 단계;
    (b) 검출자로서 상기 효소 활성형에 결합하는 억제제를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시켜 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (c) 상기 포획제-효소 활성형-검출자 복합체를 검출하는 단계;
    상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 Ⅴ, 혈액응고 인자 Ⅶ, 혈액응고 인자 Ⅸ, 혈액응고 인자 Ⅹ, 혈액응고 인자 5, 혈액응고 인자 5, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-Otetradecanoylphorbol-13 acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이며; 상기 단계 (c)의 복합체의 검출은 시료 내 상기 효소 활성형이 존재함을 나타낸다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 검출자는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함하며, 상기 단계 (c)는 상기 검출자에 결합된 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합된 항-검출자 항체를 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 효소의 활성형은 Lp-PLA2, TAFIa, 혈액응고 인자 Va, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII 또는 트롬빈인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 효소의 활성형은 Lp-PLA2 또는 TAFIa 인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 결합을 하여 기질이 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 포획제는 고상기질(substrate)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 결합제는 올리고펩타이드, 항체, 리간드, 올리고뉴클레오타이드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 결합제는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)는 동시에 실시되는 것을 특징으로 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 모유, 땀, 조직 적출액, 종양 적출액, 관절액, 척수액, 기관의 균질액, 정액 또는 질 분비물인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직 적출액 또는 종양 적출액인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 다음을 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석용 키트:
    (a) 포획제(capturing agent)로서 상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 억제제; 및
    (b) 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제;
    상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 Ⅴ, 혈액응고 인자 Ⅶ, 혈액응고 인자 Ⅸ, 혈액응고 인자 Ⅹ, 혈액응고 인자 5, 혈액응고 인자 5, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-Otetradecanoylphorbol-acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이다.
  18. 다음을 포함하는 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 또는 정량적 분석용 키트:
    (a) 포획제로서 상기 효소, 효소 활성형 또는 이들 모두에 결합하는 결합제; 및
    (b) 검출자로서 상기 효소 활성형에 결합하는 억제제;
    상기 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형은 Lp-PLA2(lipoprotein-associated phospholipase A2), TAFIa(activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), 혈액응고 인자 Ⅴ, 혈액응고 인자 Ⅶ, 혈액응고 인자 Ⅸ, 혈액응고 인자 Ⅹ, 혈액응고 인자 5, 혈액응고 인자 5, 트롬빈(thrombin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 플라즈민(plasmin), u-PA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue plasminogen activator), 엘라스타아제(elastase), 서브틸리신(subtilisin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신 G(cathepsin G), 콜라겐, 콘카나발린 A, TPA(12-Otetradecanoylphorbol-acetate) 또는 TGF-β(transforming growth factor-β)이다.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 검출자는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합된 항-검출자 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 삭제
  22. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 포획제는 고상기질(substrate)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 결합제는 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 삭제
  25. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 효소의 활성형은 Lp-PLA2, TAFIa, 혈액응고 인자 Va, 혈액응고 인자 VII, 혈액응고 인자 IX, 혈액응고 인자 X, 혈액응고 인자 XI, 혈액응고 인자 XII 또는 트롬빈인 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 효소의 활성형은 Lp-PLA2 또는 TAFIa 인 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형의 기질 결합 부위에 대하여 기질과 경쟁적 결합을 하여 기질이 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 효소의 활성형 억제제는 효소 활성형에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키트.
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