CN112415196A - 一种分析分子活力的系统和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析分子活力的系统和应用,基于现有“流动体法”测量待测分子活力时的缺陷而提出,将待测分子如酶,或其作用的底物,或待测分子发挥其活力所需的辅因子等,其中之一固定在一个相对于流动体静止的载体上,形成对应的固定体;其他的成分保留于流体中,构成流动体。反应进行的同时,可连续检测底物或产物浓度的变化。若流动体干扰测量,则可容易地抛弃,保留固定体,进一步对固定体上残留的底物或生成的产物进行检测。由于没有流动体的干扰,可以方便地放大信号。所有的步骤都在一个容器和一台仪器里完成,可以方便地实现一体化、自动化、标准化和规模化。
Description
技术领域
本发明是一种分析分子活力的系统和应用,具体涉及一种测量分子活力的方法和应用及其涉及的分析系统、固定体、捕获体和流动体,属于生物技术领域。
背景技术
酶,是生物催化剂。它能够在生理条件下,高效率和高特性地催化生物化学反应。我们知道,生物体中酶的数量和种类是天文数字,相当一部分酶催化的生化反应相似但又有细微的区别。有些酶(同工酶),催化完全一样的生化反应,但表达在不同的细胞或组织,有些酶(酶的异构体),不仅催化完全一样的生化反应,而且表达在同一个细胞里。这些种类繁多的酶分工又协助,共同完成生命活动。
酶活力是酶催化生物化学反应的能力。研究发现,某个特定的酶活力的改变,往往导致一个特定的疾病。例如,蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活力的下降是导致阿尔茨海默病和肺癌的关键性因素;糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β,GSK-3β)和细胞周期依赖性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5,CDK-5)活力的上升导致阿尔茨海默病,而这两个激酶活力的下降导致肝癌。因此,在生物医学领域中,测量样品中某个特定酶的活力,而不是一类酶,具有极其重要的临床诊断价值,也是筛选特效药物的关键。
测量生物样品中某个特定酶(待测酶)的活力,而不是一类酶,是一个严峻的挑战:酶的数量和种类众多,同一类酶的功能高度相似;待测酶的含量很低,生物样品珍贵等。通常,研究者会在体外建立一个酶参与的分析系统,检测反应物或产物的浓度变化,由终点法和速度法计算出这个体外酶促反应速率,它通常被定义为酶活力。毫无疑问,适当的分析系统是检测酶活力的关键。目前,几乎所有的用于测量酶活力的反应系统,都是单一的“流动体系统”,即酶与其作用的底物混合于同样的流动体中,其产物也在这个流动体里。在这个流动的混合物中,酶、底物和产物都是可流动或可移动的,它们都是“流动体”,因此,我们把它们称为“流动体法”。
在酶活力测量时,实现这种“流动体”的酶促体外分析系统的方式通常有两种:
A.全流体法。整个生物样品与特异性底物共同孵育,样品与底物都是流动体,待测酶催化其作用的底物转化成产物,测定底物或产物的含量。对于这种方式而言,由于酶、底物和产物全部都是流体,因此,称为“全流体法”。
B.流体—悬浮物法。把待测酶用免疫沉淀法等方法从生物样品中纯化、分离出来,得到含有待测酶的沉淀物,然后,将这个沉淀物悬浮于流体的体外分析系统中,酶催化底物转化成产物,测定底物或产物的含量。对于这种方式而言,虽然沉淀物本身是固态的,但它悬浮于溶液中,没有固定在一个位置,是一个可移动的物体(可被流动体所搬动),因此,这种方式被称为“流体—悬浮物”,也归纳为“流动体法”。
从目前的流动体法来看,每个成分如酶、底物和产物等都是可移动的,没有一个成分是固定的。在测量酶活力时,难以甚至无法分离其中的一个成分。因此,“流动体法”存在以下不可克服的缺陷:
A.无法方便地、特异地测量某个特定同工酶或亚型的酶活力。全流体法未将待测分子进行分离,使用的是整个生物样品,样品中的其他酶也可能参加酶促反应,因此,最终的结果是同类酶的总活力。在“流体—悬浮物法”中,虽然免疫沉淀法能将待测酶从生物样品中分离,提高了特异性,但是,分离过程繁琐、费时;
B.无法排除内源性底物的干扰。全生物样品也含有待测酶的内源性底物。这些内源性的底物也参与酶促反应,给出不可忽略的背景噪音,但外源性底物给出的信号才是我们要的。
C.背景噪音高。免疫沉淀剂有相当高的非特异性吸附,给出相当的背景噪音。这些背景噪音会干扰甚至掩盖测量信号,对其特异性造成影响;
D.难以甚至无法抛弃干扰成分。体外分析系统难免含有干扰信号测量的干扰物。为了获取纯净的信号,这些干扰物应当被去除。由于所有的成分都是可流动的,所以,去除干扰物和纯化产物极其麻烦;
E.信号难以放大。“流动体法”中所有的成分如酶、反应物和产物都混在一起,难以分离,它们干扰信号放大反应;
F.“流动体法”步骤中涉及到的所有试剂都是分离的,必须现用现配,无法预先合为一体;
G.操作动作复杂,无法在一个容器和一台仪器里完成所有的步骤。“流动体法”涉及的步骤:加样—沉淀(离心/磁场)—悬浮—弃上清液—沉淀。动作精细、复杂,难以被机器所模仿,测量的全过程不得不采用手工操作。操作者需反复切换不同的仪器和容器;悬浮物干扰测量,不得不分离悬浮物,转移流体。上述从加样到测量的所有步骤操作流程长,且无法用一个容器和仪器完成,难以实现一体化、自动化和规模化;
H.可重现差,难以制定临床诊断标准。试剂分离,反复切换容器和仪器,全手工操作,测量结果高度依赖实验者的经验与技巧,难以获得可重复的检测结果。因此,检测方法和临床诊断标准难以统一。
综上所述,当今的“流动体法”由于所有成分的没有固定,都处于流动和移动的状况,导致了检测信号与背景噪音难以甚至无法分解,信号难以放大,信噪比低,无法实现一体化、自动化和标准化。测量酶活力成为一个极其繁琐的生化实验,限制了酶和其他分子活力测量在临床检验、科学研究上的应用。
发明内容
区别于现有酶活力测量“流动体法”中酶分析系统中所有成分均为流动的或可移动的情况,本发明提供了一种新的分析系统、固定体和捕获固定体,这个新的分析系统是将待测分子如酶,或其作用的底物,或待测分子发挥其活力所需的辅因子等,其中之一固定于固定载体(载体)上而形成相应的待测分子、底物或辅因子固定体,其他成分形成流动体。固定体在体系中是不可流动的且相对于分析系统中的其他流动体是静止不动的,可用于解决活力测量“流动体法”存在的特异性差、信噪比低、操作动作复杂、可重现差等缺陷。
因此,相对于已有的“流动体法”,本发明可称为“固定体法”。
本发明还提供了一种活力测量的方法即采用上述分析系统进行的待测分子的活力测量,由于本发明的分析系统中的固定体相对于流动体是固定的不流动的,因此,便于待测分子的纯化,信号与噪音的分离,有助于测量精度和操作性的提升。
本发明还提供了一种活力测量的试剂盒,包括上述捕获固定体或其他固定体的活力试剂盒。
本发明还提供了一种一体机,包括完成上述捕获固定体或其他固定体的制备以及生物分子活力的测量操作。
本发明基于以下原理实现:
包括三种技术方案:待测分子固定体法、底物固定体法和辅因子固定体法。这三种方案的共同特征是把分析系统分解为两个部分:固定体与流动体:
A.固定体。不被流动体所移动的物体。待测分子、底物和辅因子其中之一被特异性地固定在固定体。相应的固定体被称为待测分子固定体、底物固定体和辅因子固定体。
B.流动体。流动体为可流动的物体如液体、气体、气溶胶等。流动体提供系统变化的环境,含有系统变化的必要成分。但是,不含有被固定在固定体上的成分。
固定体与流动体一旦接触,系统变化立即启动。检测系统随时间的变化量,如底物的消耗量或/和产物的生成量,通过相应的数学模型如速度法或/和终点法计算酶或其他分子的活力。
本发明通过下述技术方案实现:
待测分子固定体法:
一种分析分子活力的系统,包括流动体和待测分子固定体,底物和辅因子位于流动体,样品中的待测分子被固定于载体上以形成相对于流动体静止的待测分子固定体,
所述固定包括以下步骤:
A.将可与待测分子特异性结合的特异性捕获剂直接包被在载体上得到待测分子捕获固定体,或者,首先将侨联剂包被在载体上,得到侨联固定体,然后,将可与待测分子特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到待测分子捕获固定体;
B.待测分子捕获固定体特异性地固定待测分子,得到待测分子固定体。
所述待测分子为未被表位标签标记的分子或被表位标签所标记的分子,可以是单一分子或多个分子构成的分子复合物,包括酶、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、核苷酸、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸、金属离子、多亚基的蛋白、离子通道或配基-门控通道。
所述特异性捕获剂为未被表位标签标记的分子或被表位标签所标记的分子,包括抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素、半胱氨酸、甲氨蝶呤、金属原子或离子;
进一步的,特异性捕获剂的选择如下:
A.可特异性捕获待测分子的抗体;
B.可特异性捕获表位标签的抗体;
C.链霉亲和素,特异性捕获被生物素(表位标签)标记的待测分子;
D.亲和素,特异性捕获被生物素(表位标签)标记的待测分子;
E.生物素,特异性捕获被链霉亲和素和/或亲和素(表位标签)标记的待测分子;
F.半胱氨酸,特异性捕获被半胱氨酸S-转移酶(表位标签)标记的待测分子;
G.二或三价金属离子,特异性捕获被多聚组氨酸(表位标签)标记的待测分子;
H.甲氨蝶呤,捕获被二氢叶酸还原酶(表位标签)标记的待测分子;
I.半胱氨酸S-转移酶,特异性捕获,被半胱氨酸(表位标签)标记的待测分子;
L.二氢叶酸还原酶,捕获被甲氨蝶呤(表位标签)标记的待测分子;
M.抗Fc恒定区的抗体,捕获被Fc恒定区(表位标签)标记的待测分子;
N.可与待测分子特异性结合的辅因子。
所述侨联剂包括羧甲基葡聚糖、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗-抗体的Fc端、链霉亲和素、亲和素、生物素、半胱氨酸、甲氨蝶呤、金属原子或离子;
进一步的,侨联剂的选择如下:
A.蛋白A,固定抗体和被抗体恒定区(Fc区)标记的捕获剂;
B.蛋白G,固体抗体和被抗体恒定区(Fc区)标记的捕获剂;
C.蛋白L,固体抗体和被抗体恒定区(Fc区)标记的捕获剂;
D.抗-抗体的Fc恒定区,固定抗体;
E.链霉亲和素,固定被生物素(表位标签)标记的特异性捕获剂;
F.亲和素,固定被生物素(表位标签)标记的特异性捕获剂;
G.生物素,固定被链霉亲和素和亲和素(表位标签)标记的特异性捕获剂;
H.半胱氨酸,固定被半胱氨酸S-转移酶(表位标签)标记的特异性捕获剂;
L.二或三价金属离子,固定被多聚组氨酸(表位标签)标记的特异性捕获剂;
J.甲氨蝶呤,固被二氢叶酸还原酶(表位标签)标记的特异性捕获剂;
M.抗表位标签的抗体,固定各种表位标签。
所述表位标签包括抗体的Fc端、生物素、链霉亲和素和亲和素、半胱氨酸S-转移酶、多聚组氨酸、二氢叶酸还原酶、FLAG和3×FLAG、血凝素A、c-Myc、绿色荧光蛋白、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白或抗体的Fc恒定区等;
进一步的,表位标签的选择如下:
A.生物素,被链霉亲和素、亲和素捕获;
B.链霉亲和素和亲和素,被生物素捕获;
C.半胱氨酸S-转移酶,被半胱氨酸捕获;
D.二氢叶酸还原酶(DHFR),被甲氨蝶呤捕获;
E.FLAG(DYKDDDDK)和3×FLAG,被抗FLAG抗体捕获;
F.血凝素A(HA),被抗血凝素A抗体捕获;
G.c-Myc,被抗c-Myc抗体捕获;
H.绿色荧光蛋白(GFP)被抗GFP抗体捕获;
I.硫氧还蛋白,被抗硫氧还蛋白的抗体捕获;
J.麦芽糖结合蛋白(MBP),被抗麦芽糖结合蛋白抗体捕获;
L.半胱氨酸,半胱氨酸S-转移酶捕获;
M.甲氨蝶呤,被二氢叶酸还原酶(DHFR)捕获;
N.抗体恒定区(Fc区),被蛋白A、G和L捕获。
所述步骤A中,将特异性捕获剂或侨联剂包被在载体上时,所用的包被剂包括磷酸缓冲盐溶液、三乙醇胺缓冲盐水溶液、0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液或共价偶联剂(如马来酰亚胺类和NHS酯等)。
通过化学键将所述特异性捕获剂或侨联剂包被在载体上,将特异性捕获剂固定在桥联剂上,以及将待测分子固定于待测分子捕获固定体的特异性捕获剂上,所述化学键来自于共价键、离子键、金属键、静电引力、配位键、范德瓦尔氏力、离子-偶极力、离子-诱导偶极力或氢键。
还包括对待测分子捕获固定体和待测分子固定体进行洗涤和封闭液,所述封闭液用基础缓冲液配制,并含有封闭成分,封闭成分选自牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白以及明胶蛋白,
所述基础缓冲液满足:不干扰待测因子活力和信号检测、pH控制在0~14之间、含有0~10%离子或非离子型表面活性剂、适合于保持待测分子原始活力的离子强度和渗透压。
对于本发明而言,流动体的构成并不限于样品和底物,还包括可能的反应物、其他必要成分和环境等,这里所指的静止是指待测分子固定体不被流动体所搬运,或者是不随流动体的流动而移动。
在分析系统变化中,待测分子位于固定体或流动体其中之一,不可同时存在于固定体与流动体,也不在它们之间交换。
所述的样品为总体的一部分,它能够代表总体的特征,含有待测分子,是标准化处理后的样品,包括生物样品、环境样品、药物样品、化工产品或食品样品;
本发明所指的标准化处理是指样品被标准化。这个标准化的指标通常是样品的体积、质量和浓度等。标准化的目的是保持这些指标在不同样品间保持一致。所述样品的浓度通常用其标志性成分的浓度代表。例如,样品为生物,其DNA或蛋白浓度就可方便地代表样品的浓度。测得生物样品的DNA和蛋白质浓度之后,然后用适当的缓冲液调整DNA或蛋白浓度,使各个生物样品的DNA或蛋白浓度一样,再用于制备待测分子固定体。
所述样品缓冲液用基础缓冲液配制,并含有能够保护样品和待测分子活力不被破环的试剂,如蛋白水解酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂、DNA水解酶和RNA水解酶抑制剂和防腐剂等。
所述流动体包括液体、气体、胶体、气溶胶或悬浮液;
流动体有两种:
A.样品。任何具备流体特征、含有待测分子的样品。若样品不是流体,则将其制备成流体。
B.分析系统的反应液。流动体含有待测分子所作用的底物、辅因子和其他必要的成分。流动体也为生化提供适当的反应环境如pH、离子强度、渗透压和表面活性剂等。
所述载体为不可被流动体改变其位置的惰性物体,其形态包括试管、微孔板、固定化的颗粒、膜、片状、芯片或其组合。在系统变化过程中,载体不与流动体发生物理、化学作用,不被流动体消耗,不干扰对系统的观测,也不会被流动体所搬运、转移。
本发明中,用于制备所述载体的常见材料有聚苯乙烯、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酰氨凝胶、聚苯乙烯-苯二乙烯树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物、玻璃、硅和金属等。
进入本发明的分析系统之前,样品必须用适当的溶剂制备成流体。在本发明的实例中,用基础缓冲液溶解、稀释样品,并含有能够保护样品和待测分子活力不被破环的试剂,如蛋白水解酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂、DNA水解酶和RNA水解酶抑制剂和防腐剂等。
底物固定体法:
一种分析分子活力的系统,包括流动体和底物固定体,含有待测分子的样品位于流动体,底物被固定于载体上以形成相对于流动体静止的底物固定体,
所述固定包括以下方式:
A.将底物直接包被在载体上,或直接在载体上合成,得到底物固定体;
B.将可与底物特异性结合的特异性捕获剂首先包被在载体上得到底物捕获固定体,底物捕获固定体特异性地捕获底物,得到底物固定体;
C.将侨联剂包被在载体上得到侨联固定体,然后,将可与底物特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到底物捕获固定体,底物捕获固定体特异性捕获底物,得到底物固定体。
为了固定小分子如短肽等的底物,牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素可作为桥联剂首先包被于载体表面。然后,用马来酰亚胺等偶联剂将底物小分子通过共价键与桥联剂交联,最终小分子底物就被固定于载体上。
与待测分子固定体法相同的是,底物固定体法中也包括对样品的标准化、包被、洗涤、封闭等操作,其操作过程中具体使用的缓冲液、特异性捕获剂、侨联剂、表位标签以及载体等均与待测分子固定体法相同。
辅因子固定体法:
一种分析分子活力的系统,包括流动体和辅因子固定体,含有待测分子的样品和底物位于流动体,辅因子固定于载体上以形成相对于流动体静止的辅因子固定体。
所述固定包括以下方式:
A.将辅因子直接包被在载体上,或直接在载体上合成,得到辅因子固定体;
B.将可与辅因子特异性结合的特异性捕获剂首先包被在载体上得到辅因子捕获固定体,辅因子捕获固定体特异性地捕获辅因子,得到辅因子固定体;
C.将侨联剂包被在载体上,得到侨联固定体,然后,将可与辅因子特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到辅因子捕获固定体,辅因子捕获固定体特异性捕获辅因子,得到辅因子固定体。
所述辅因子为辅酶、辅基或金属离子等分子发挥其活性所必需的物质,例如:铁离子、锌离子、卟啉、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、辅酶A、辅酶Q、硫胺素焦磷酸、生物素或各种维生素等。
牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素可作为桥联剂首先包被于载体表面。然后,用马来酰亚胺等偶联剂将辅因子通过共价键与桥联剂交联,最终辅因子就被固定于载体上。
与待测分子固定体法相同的是,辅因子固定体法中也包括对样品的标准化、包被、洗涤、封闭等操作,其操作过程中具体使用的缓冲液、特异性捕获剂、表位标签以及载体等均与待测分子固定体法相同。
一种固定体,如上述所述的待测分子固定体,如上述所述的底物固定体,如上述所述的辅因子固定体,或者是将待测分子固定于如上述所述辅因子固定体上以形成的固定体。
一种捕获固定体,如上述所述的待测分子捕获固定体、如上述所述的底物捕获固定体、如上述所述的辅因子捕获固定体、或者是如上述所述在用于固定待测分子时的辅因子固定体。
一种如上述方法制备得到的侨联固定体。
一种假性固定体,用于测量分子活力系统的本底值,按上述方法,将特异性捕获剂替换为假性捕获剂,制备得到的对应的假性待测分子捕获固定体及其对应的假性待测分子固定体;
或者,按上述方法,将底物或辅因子替换为假性底物或辅因子,制备得到的对应的假性底物固定体或假性辅因子固定体;
或者,按上述方法,将侨联剂替换为假性侨联剂,制备得到的对应的假性侨联固定体。
一种标准品固定体,用于标定分子活力系统的活力,按上述方法,用已知含量的待测分子替代待测样品,制备得到的待测分子标准品固定体;
或者,按上述方法,用已知含量的底物制备得到底物标准品固定体;
或者,按上述方法,用已知含量的辅因子制备得到辅因子标准品固定体;
或者,按上述方法,用已知含量的产物制备得到产物标准品固定体。
一种活力测量的方法,包括以下步骤:
A.建立所述分析系统;
B.使流动体与相应的固定体接触,分析系统发生物理和/或化学变化,如新的物质产生、输入能量的形式发生了变化、分子或离子的位置发生了改变、以及分子的构象发生了改变等;
C.观测和记录系统随时间的变化,如过程中反应物或产物的含量变化、能量的变化和分子的构象的变化等;
D.获得系统变化数据和数学模型,计算得到待测分子的活力。
一种试剂盒,包含以下成分:
A.如以上所述的侨联固定体、待测分子捕获固定体、底物固定体、辅因子固定体或在用于固定待测分子时的捕获固定体;
B.能够保护样品和待测分子活力不被破环的试剂,如蛋白水解酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂、DNA水解酶和RNA水解酶抑制剂和防腐剂等;
C.封闭成分,如牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白以及明胶蛋白中至少一种的干粉;
D.待测分子的底物;
E.标准品、标准品固定体;
F.阴性对照,包括对应的假性固定体;
G.阳性对照,包括待测分子纯品、底物纯品、辅因子纯品以及相应产物的纯品;
H.用于反应的浓缩反应液或其必要成分的干粉或浓缩液以及必需的溶剂;
I.操作流程说明书;
J.分析系统变化的数学模型。
一种一体机,包括以下操作步骤:
A.完成以上所述侨联固定体、待测分子捕获固定体、待测分子固定体、底物固定体和辅因子固定体的制备,以及假性固定体和标准品固定体的制备;
B.完成各种固定体的洗涤与封闭;
C.完成分析系统的变化;
D.检测分析系统变化给出的信号;
E.记录、存储、显示、输出并分析检测数据;
D.具备接入互联网、远程控制和区块链功能。
在上述待测分子固定体法、底物固定体法和辅因子固定体法三种技术方案中,待测分子固定体法公开了制备待测分子固定时使用的固定载体、特异性捕获剂、侨联剂、表位标签以及包被、洗涤、封闭等操作及其使用的缓冲液,当然,在底物固定体法和辅因子固定体法所对应的操作过程中同样适用。具体可参见下表1所示。
表1三种方案中共用的材料和试剂
本发明与现有技术相比,具有以下优点及有益效果:
本发明针对现有“流动体法”的分析系统进行改进,提出了一种可实现待测分子固定、底物固定、辅因子固定的分析系统,改进后的分析系统中,待测分子、底物或辅因子被固定在载体上,不再是可移动、可搬运的流动成分,便于待测分子活力测量时与流动体中的其他干扰因素进行分离,不仅能避免信号干扰影响反应,还能简化操作,以测量酶活力为例,具有以下优点:
A.本发明可方便、精准地测量每个同工酶和亚型的酶活力。专用于特定同工酶或亚型活力的测量,采用待测分子固定法将待测酶固定在载体上,形成具有酶固定体的分析系统。在形成待测酶固定体时,样品中的其他成分如待测酶的同工酶被抛弃,只有待测酶保留在固定体上。在随后的分析步骤中,只有待测酶参与系统变化如催化底物转化,以及特异性的辅因子参与待测酶催化反应。避免全流体相进行酶活力测量时,因样品中其他同类酶也可能参与酶反应,最终得到的上述同类酶的总活力,而不是特定酶活力的活力。本发明也可测量同类生物分子的特定的某个亚型分子的活力。
B.可排除内源性底物的干扰。我们知道,全样品也含有待测酶的内源性底物。这些内源性的底物也参与酶促反应,给出不可忽略的背景噪音,然而,外源性底物给出的信号才是我们要的。本发明采用具有酶固定体的酶分析系统,方便地抛弃样品中的内源性底物,直接过滤掉背景噪音。
C.背景噪音低。本发明采用酶固定体法、底物固定体法和辅因子固定体法建立的对应固定体,易于洗涤,封闭非特异性位点,可进一步降低背景噪音。因此,上述固定体法的信噪比大大高于流动体法。
D.可方便地抛弃对测量信号有干扰的成分。本发明在底物固定体法和辅因子固定体法中,底物和辅因子固定于载体上形成对应的底物固定体和辅因子固定体,酶催化该固定体转化的产物也固定于载体上。因此,抛弃流动体和洗涤固定体后,干扰成分也被抛弃。
E.可方便地放大信号。由于可方便地抛弃干扰物,因此,可以对固定体上的检测信号方便地放大,提高了检测的灵敏性。
F.可预先大规模、标准化制备各种固定体,并长期保存。本发明可预先制备侨联固定体、待测分子捕获固定体、底物固定体和辅因子固定体,以及相应的假性固定体和标准品固定体。这些固定体相当稳定,可长期保存于冷藏温度,甚至室温。因此,可大规模地预先制备,以预制的试剂盒方式大规模供给,简化了实验步骤,实现标准化和高通量的检测。
G.可在一个固定体和一个仪器里完成所有的步骤。本发明方法操作动作简单,从制备各种的固定体到信号检测,都在一个载体和一个仪器上完成,不必在离心机→试管→摇床→酶联板→读板仪等不同的仪器和容器反复循环。操作动作也极其简单:加样→孵育→弃液→洗涤,其过程可被机器所模仿,通过目前市售的自动生化仪即可很方便的实现这些过程,实现一体化、自动化、标准化和规模化测量分子尤其是酶活力。
H.本发明测量误差小,成本低,由于所有的步骤实现了自动化、规模化、标准化和一体化,最大程度控制了测量误差,降低了测量成本,为大规模的临床生化检验和制定临床生化指标提供了技术基础。
需要指出的是,本发明不限于有关酶的场景,也可适用于测量其他分子活力的场景,只要待测分子或其它必要成分能够固定于固定载体,其他成分构成流动体,测量其他分子活力时仍然具备相同的测量优势。
在本发明涉及的专业术语中:
分子的活力:衡量分子功能的半定量或定量的指标。例如,单位时间里酶把多少量的底物转化成产物;单位时间里血红蛋白结合或释放了多少的氧气;分子之间的结合率、抑制率、激动率以及协同率等。
反应物:待测分子作用的对象。在系统变化中,它们的物理或/和化学状态发生了改变。在本专利中,既可以是物质,也可以是能量。
底物:是反应物的一种,但特指的是待测分子作用的特异的、关键的对象。它与待测分子的相互作用以及转化,反映了分子的功能。
系统变化:指一个开放、封闭或孤立系统的熵值发生改变的过程。例如,有新的分子生成,转化了能量的形式,改变了能量或物质的分布,改变了物质的含量或浓度,改变了物质的空间位置以及改变了物质的溶解度等。
分析系统:指一个可以观测待测分子活力的系统。通过观测待测分子促进的分析系统变化,依据相应的数学模型,以确定待测分子的活力。
包被:将侨联剂、捕获剂、底物或辅因子等直接连接在载体上的操作。
固定:将捕获剂、底物或辅因子通过桥联剂间接连接在载体上,以及把待测分子通过捕获剂间接连接在载体上的操作。
桥联剂;可与捕获剂连接的分子,它们首先被包被在固定载体表面上。桥联剂不可与待测分子、底物或辅因子连接。
捕获剂:可将待测分子、底物或辅因子从游离状态固定到载体的分子。捕获剂仅仅与相应的待测分子、底物或辅因子结合,而不与其他分子结合。通常,捕获剂已经预先固定于固定载体上。
假性捕获剂:不可与分析系统中的任何分子(包括待测分子在内)有特异性的、紧密的结合,但是,能与这些分子有非特异性、松散的结合。假性捕获剂给出的是本底值。
表位标签:连接在待测分子、捕获剂、底物或辅因子上的外源性分子或基团。这些外源性分子或基团,不属于自然状况下待测分子、捕获剂、底物或辅因子上的组成。表位标签是研究者为了识别、分离和固定感兴趣分子而添加的人工标签。
特异性结合:两个分子间专一的、排他性的结合,犹如钥匙与锁的关系。
特异性捕获:已经固定的捕获剂专一地、排他地与游离的待测分子结合。特异性捕获可同时完成待测分子的纯化、分离和固定。
标记:将表位标签连接到感兴趣分子的过程。
附图说明
图1为本发明采用待测分子固定体法进行待测分子活力测量的原理示意图。
图2为本发明采用底物固相法/辅因子固定体法进行酶活力测量的原理示意图。
图3为本发明采用待测分子固定体法的操作流程示意图。
图4为本发明采用底物/辅因子固定法的操作流程示意图。
图5为本发明采用酶固定体法测定蛋白磷酸酯酶2A活力的操作流程示意图。
图6为本发明采用底物固定体法测定糖原合酶激酶3活力的操作流程示意图。
具体实施方式
下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对所要求的本发明提供进一步的说明,除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明是基于现有“流动体法”测量特定酶活力时的缺陷,提出了一种分析系统和固定体及活力测量的方法、试剂盒和一体化测量设备,其原理是:将底物、辅因子或待测因子其中之一固定在一个相对于流动体静止的载体上,形成对应的固定体;其他的成分保留于流体中,构成流动体。然后,流动体和固定体两体接触,系统变化开始。系统变化的同时,可连续检测底物或产物浓度的变化。若流动体的成分干扰测量,终止系统变化后,则可容易地抛弃流动体,保留固定体,进一步对固定体上残留的底物或生成的产物进行检测。由于没有流动体成分的干扰,可以方便地放大信号。以酶活力测量为例,所有的步骤,从固定载体的制备、酶促反应、信号检测、直至酶活力计算,都在一个容器和一台仪器里完成,可以方便地实现一体化、自动化、标准化和规模化,如图1、图2所示。
依据上述原理,本发明提出了三种检测流程:待测分子固定体法、底物固定体法和辅因子固定体法。三种方案所涉及的一些共同材料和试剂参见上表1所示。
(一)待测分子固定体法
若待测分子是酶,则待测分子就被称为“待测酶”,相应的固定体法就被称为“待测酶固定体法”。酶固定体法的操作流程如下(图3):
第一步,制备待测酶捕获固定体和假性待测酶捕获固定体。将针对待测酶的特异性捕获剂固定在载体上得到待测酶捕获固定体。载体为不可被流动体改变其位置的惰性物体。在该系统的变化过程中,载体不与流动体发生物理、化学作用,不被流动体消耗,不干扰对系统的观测,也不会被流动体所搬运。用于制备载体的常见材料有聚苯乙烯、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酰氨凝胶、玻璃、硅和金属等。载体常见的形式有:试管、微孔板、固定化的颗粒、膜、片状或芯片等。
有两种方案把这些特异性的捕获剂固定在载体上:直接法和间接法。
A.直接法。把针对待测酶的特异性捕获剂,直接包被在载体上。首先,将捕获剂用适当的包被剂配制成适当浓度的工作液。然后,在适当的温度等条件下,直接将捕获剂工作液与载体共同孵育一定的时间。随后,抛弃多余的捕获剂工作液,用基础缓冲液洗涤待测分子捕获固定体。
B.间接法。首先将侨联剂如蛋白G/A/L和抗-抗体等包被在载体上,然后,这些侨联剂高亲和、高特异地结合捕获剂。首先,将桥联剂用适当的包被剂配制成适当浓度的工作液。然后,在适当的温度等条件下,将侨联剂工作液与载体共同孵育一定的试剂。随后,抛弃多余的侨联剂工作液,用基础缓冲液洗涤桥联固定体。最后,将适当的捕获剂工作液(用封闭液或基础缓存液配制)如抗体等加入桥联固定体上,在适当的温度等条件下孵育一定的时间。抛弃多余的捕获剂,洗涤捕获固定体。
用假性捕获剂替代待测酶捕获剂,按照同样的方法和条件,制备假性捕获固定体。
第二步,封闭待测酶捕获固定体的非特异性结合位点。在适当的温度等条件下,将适当的封闭液与捕获固定体共同孵育一定的时间,然后,抛弃多余的封闭液,不要洗涤捕获固定体,直接进入下一步操作。假性捕获固定体按照同样的方法和条件,进行洗涤和封闭。
第三步,制备待测酶固定体和假性待测酶固定体。捕获固定体特异地捕获生物样品中的待测酶,待测酶因此而固定在捕获体上,形成酶固定体。与之对应的是,假性捕获固定体不能特异性地固定待测酶,它捕获背景成分(非特异结合),因此,假性捕获固定体仅给出本底值。
需要指出的是,由于任何分子都可以相互结合,尤其是生物大分子之间,因此,在制备待测酶固定体的过程中,除特异性捕获剂与待测酶之间特异性的结合外,如抗体-抗原结合,还包括通过分子间作用力与其他分子的经非特异性结合,这种非特异性的结合是松散的,但无法避免,因此,这种非特异性的结合给出系统的本底值和初始值。
用适当的方法制备样品,确定蛋白浓度,将各个样品的蛋白浓度用细胞裂解缓冲液调整成一样,然后,将加入相同体积的样品于待测酶捕获固定体上,在适当的温度等条件下,孵育一定的时间。待测酶就被固定于待测酶捕获固定体上,即为待测酶固定体,抛弃多余的样品,洗涤待测酶固定体。用假性捕获固定体替代待测酶捕获固定体,按同样的方法和条件制备假性待测酶固定体。
第四步,建立待测酶分析系统,在待测酶固定体中加入流动体,形成待测酶分析系统。底物和其他必要成分构成流动体,流动体通常是指液体、气体或悬浮液。在适当的温度等条件下,将流动体与待测酶固定体相接触,共同孵育一定的时间。待测酶催化底物转变成产物。例如在一个实施例中,蛋白磷酸酯酶催化底物的磷酯键被水解,释放出磷酸,同时,底物也转变成无磷酸基团的产物。
用假性待测酶固定体替代待测酶固定体,在相同的方法和条件,与流动体共同孵育。假性待测酶固定体给出本底值。
第五步,测量和计算待测酶促反应底物或产物的浓度/含量变化率。有两种测量和计算的方案:
A.终点法,分别测量初始或终止时底物或产物的浓度,它们的差值即为浓度/含量变化值,除以时间,即得到变化率,初始值由假性待测酶固定体给出。
B.速度法,随着反应的进行,连续测量底物或产物的浓度/含量,计算浓度/含量—时间函数的斜率,即为浓度/含量变化率,实际上,测量与待测酶催化反应同时进行的。
在一个实施终点法的案例中,以蛋白磷酸酯酶为例,测量其酶活力的过程如下:
蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物如磷酸化的丝/苏/酪氨酸短肽,或pNPP水解释放出磷酸。然后,采用钼酸铵-马来绿测定自由磷酸浓度。终点法需要知道两个时间点的磷酸浓度:零时刻和终时刻。为了获取零时刻的值,用正常的免疫球蛋白(假性捕获剂)替代真正的抗-蛋白磷酸酯酶的抗体(捕获剂)制备假性捕获固定体,其他的操作流程与真实的抗体组(蛋白磷酸酯酶捕获固定体)完全一样。正常的免疫球蛋白不会特异性的吸附待测酶,但会非特异性吸附其他蛋白。因此,假性待测酶固定体给出的磷酸浓度是本底值,可以视为零时刻值。真正的抗蛋白磷酸酯酶的抗体除特异吸附蛋白磷酸酯酶外,也有非特异性吸附,因此,抗体组(待测酶捕获固定体)测得终点值。从终点值减去零时刻值即得到净的磷酸增加值,这个值除以时间,即得到产物磷酸的变化率:
在一个实施速度法的案例中,同样以蛋白磷酸酯酶为例,其测量酶活力的过程如下:
用紫外—可见光读板仪或荧光读板仪连续监测和记录酶反应产物的光密度或荧光强度随时间的变化。然后,制作光密度或荧光值—时间曲线。计算这条曲线的初始斜率,这个初始斜率即可代表产物磷酸的变化率。以DiFMUP底物为例,蛋白磷酸酯酶催化DiFMUP水解释放磷酸:
DiFMU是强荧光物质。从DiFMU荧光强度—时间曲线得到的斜率是DiFMU荧光强度随时间的变化率即:
斜率=DiFMU荧光强度/分钟
制作DiFMU浓度(μM)—荧光强度标准曲线。利用这条标准曲线,计算出DiFMU浓度的变化率:
从上面的反应方程式可以得到磷酸与DiFMU的摩尔比是1,因此,DiFMU浓度的变化率等于磷酸浓度的变化率,磷酸含量的变化率计算如下:
第六步,样品酶活力的定义和计算。酶的活力通常用它所催化反应的初始速率来表示。通常,一个酶活力单位(1U)定义为每分钟一个pmol(10-12mol)的产物被消耗掉或产物生成。例如,一个蛋白磷酸酯酶活力(1U)定义为蛋白磷酸酯酶每分钟催化底物释放出的磷酸数量,即1U为前述的一个磷酸含量变化率(pmol/分钟):
1U=1pmol磷酸/分钟或酶活力(U)=磷酸含量变化率(pmol/分钟)
为了比较不同样品之间的酶活力,通常样品的酶活力表达为每毫克蛋白有多少单位的酶活力。同样以蛋白磷酸酯酶为例:
样品的单位质量蛋白酶活力(U/mg)=磷酸含量变化率(pmol/分钟)÷样品的蛋白质量(mg)
公式中的磷酸含量变化率由第四步的终点法和速率法测量、计算得到。
注意,上述的DiFMU荧光强度是扣除了假性待测酶固定体给出的本底值后的净值。
(二)底物固定体法
第一步,制备底物固定体、假性底物固定体和标准品固定体。如图4所示,将与待测分子发生特性相互作用的分子(底物),固定在固定体上。待测分子与底物的结合,犹如锁与钥匙是特异结合—待测分子是锁,底物是钥匙。例如,受体与它的配基。如果待测分子是受体,那么,它的配基就被视为底物。把它的配基固定在固定载体上,就是底物固定体法。
载体为不可被流动体改变其位置的惰性物体。在分析系统的变化过程中,载体不与流动体发生物理、化学作用,不被流动体消耗,不干扰对系统的观测,也不会被流动体所搬运。用于制备载体的常见材料有聚苯乙烯、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酰氨凝胶、玻璃、硅和金属等。载体常见的形式有:试管、微孔板、固定化的颗粒、膜、片状或芯片等。
固定是通过化学键将侨联剂、捕获剂和底物直接或间接固定于载体上,可能使用到的化学键如共价键、离子键、金属键、静电引力、配位键、范德瓦尔氏力、离子-偶极力、离子-诱导偶极力或氢键等。
制备底物固定体,同样有两种方案:直接法与间接法。
A.直接法。将特异性底物直接包被在载体上得到底物固定体,例如,当底物是一个短肽或寡聚核苷酸,则可方便的在载体上直接合成,得到底物固定体,与之对应的,该固定载体表面材料应为聚苯乙烯-苯二乙烯树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物或聚丙烯酰胺等。将底物固定到载体上后,抛弃多余的底物,洗涤底物固定体(洗涤液与酶固相法一致,下同)。
B.间接法。首先,将针对底物的特异性捕获剂包被在载体上得到底物捕获固定体,然后,底物捕获固定体固定底物,从而获得底物固定体。获得底物捕获固定体同样有两个方法:直接法和间接法:
Ⅰ.直接法。直接将特异性的捕获剂包被在载体上。这些特异性的捕获剂可以是针对底物本身的抗体,也可以是可与底物的表位标签结合的抗体或配基。将捕获剂用包被剂配制成适当浓度的工作液,然后,在适当的温度下,工作液与载体孵育一定的时间。最后,抛弃多余的捕获剂工作液,用基础缓冲液洗涤底物捕获固定体。
Ⅱ.间接法。首先将桥联剂包被在固定载体上,得到侨联固定体。然后,侨联固定体固定捕获剂,得到底物捕获固定体。首先,将桥联剂用包被剂配制成适当浓度的工作液;在适当的温度等条件下,桥联剂工作液与固定载体孵育一定的时间后,抛弃多余的桥联剂工作液,用基础缓冲液洗涤桥联固定体。然后,将捕获剂用基础缓冲液或封闭液配制成适当浓度的工作液;在适当的温度等条件下,捕获剂工作液与桥联固定体孵育一定的时间后,最后,抛弃多余的捕获剂工作液,用基础缓冲液洗涤桥联固定体,得到底物捕获固定体。
为了固定小分子如短肽等的底物,牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素可作为桥联剂首先包被于载体表面。然后,用马来酰亚胺等偶联剂将底物小分子通过共价键与桥联剂交联,最终小分子底物就被固定于载体上。用假性底物和标准品替代底物,按照同样的方法和条件,制备假性底物固定体和标准品固定体。
第二步,建立生化分析系统,在底物固定体中加入待测样品和其他必要成分,形成生化分析系统。已知蛋白浓度的样品和必要成分构成流动体。流动体通常是指液体、气体或悬浮液。流动体的蛋白浓度必须一致,其他成分的浓度也要一致(与待测分子固定体法一致)。在适当的温度等条件下,将流动体与底物固定体接触,共同孵育一定的时间。待测分子与底物相互作用,待测分子把底物转变成产物。例如在一个实施例中,蛋白磷酸酯酶催化底物的磷酯键被水解,释放出磷酸,同时,底物也转变成无磷酸基团的产物。
用假性底物固定体替代底物固定体,按照同样的方法与条件,与相同的流动体共同孵育。
第三步,观测分析系统中的底物或产物的浓度/含量变化率。与酶固定体法一样,也可采用终点法和速度法测量和计算浓度变化率。相应的方案可参考酶固定体法的终点法和速度法。因为底物固定于载体上,通常产物也被固定于载体上,因此,抛弃流动体后可方便地检测固定体上产物的含量。如有必要,可对信号放大。
同时,假性底物固定体也按同样的方法和条件被观测和记录。假性底物固定体给出的是本底值。
按同样的方法和条件观测标准品固定体给出的检测信号,建立检测信号与底物或产物含量的函数关系。利用这个函数关系,可以计算出分析系统中,底物或产物的浓度/含量变化率。
第四步,酶活力的定义和计算。与酶固相法一样,可参考酶固定体法的相关内容。
(三)辅因子固定体法
第一步,制备辅因子固定体、假性辅因子固定体和标准品固定体。辅因子固定体法在制备辅因子捕获体、辅因子固定体、假性辅因子固定体和标准品固定体时的操作流程与底物固相法相似,所用试剂或材料,如载体、特异性捕获剂、封闭液等,根据所对应的辅因子不同而进行选择,即可得到对应的辅因子捕获体和辅因子固定体。可选择的辅因子有金属离子、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)、辅酶A(Coenzyme A,CoA)、辅酶Q(Coenzyme Q)、硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP)、生物素(biotin)或各种维生素(Vitamin)。但需要指出的是,辅因子通过直接法与载体进行固定而得到辅因子固定体时,当辅因子是金属离子时,可通过螯合的方式直接固定于载体上。
除此之外,在辅因子中,由于辅酶可特异性的与酶结合,因此,当辅酶固定于载体上形成辅因子固定体后,还可作为捕获剂特异性的待测分子,形成对应的酶固定体。
第二步,建立分析系统,参考底物固定体法的操作方式建立分析系统,在适当的温度下,将流动体与辅因子固定体共同孵育一定的时间。酶催化底物转变成产物。流动体由样品和其他必要的成分组成。按照同样的方法和条件,假性辅因子固定体也与相同的流动体孵育。
第三步,测量酶促反应底物或产物的浓度/含量变化率。与待测酶固定体法一样,也可采用终点法和速度法测量和计算浓度变化率。相应的方案可参考待测酶固定体法的终点法和速度法。按照同样的方法和条件,观测假性辅因子固定体和标准品固定体给出的信号,用于确定系统的本底值和数学模型。
第四步,酶活力的定义和计算。与待测酶固定体和底物固定体法一样,可参考待测酶固定体法的相关内容。
下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式,当然,本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1:采用待测酶固定体法测量大脑组织中蛋白磷酸酯酶2A(proteinphosphatase 2A,PP2A)的酶活力。
如图5所示,具体实施步骤如下:
第一步,制备侨联固定体。选择蛋白G(protein G)为侨联剂。用0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH=9.6)配置蛋白G工作液(1~10μg/ml)。然后,将蛋白G工作液加入到96孔板中,每孔100μl。孵育过夜(4℃)后,扔掉多余的蛋白G溶液,用基础缓冲液(50mM Tris·Cl,100mM NaCl,1%(v/v)Triton X-100,pH 7.5)洗涤三次96孔板,每孔200μl,每次10分钟。
第二步,制备PP2A捕获固定体和假性捕获固定体。选择抗PP2A抗体(anti-PP2AIgG)为捕获剂,正常的免疫球蛋白(IgG,与anit-PP2A IgG为同动物种属)为假性捕获剂。用基础缓冲液,将anti-PP2A IgG配制成0.5~5μg/ml抗体工作液。然后,每孔侨联固定体加入100μl抗体工作液,4℃,孵育过夜。然后,扔掉多余的抗体工作液,用基础缓冲液洗涤三次,每次10分钟。用摇床。最后,得到PP2A捕获固定体。用IgG替代anit-PP2A,采用同样的方法和条件制备假性捕获固定体。
第三步,制备PP2A固定体和假性PP2A固定体。大鼠皮质匀浆于细胞裂解液(加入蛋白水解酶抑制剂),离心(12,000g×20min),分离上清与沉淀。弃沉淀,留上清。测定上清的蛋白浓度,然后,将样品的蛋白浓度用细胞裂解液(不含蛋白磷酸酯抑制剂)调整到0.25~2.00μg/μl。每孔PP2A捕获固定体加入100μl样品,4℃,孵育过夜,然后,扔掉多余的样品,用基础缓冲液洗涤三次,每次10分钟,用摇床。最后,得到PP2A固定体。用假性捕获固定体替代PP2A捕获固定体,采用同样的方法制备假性PP2A固定体。
第四步,建立酶分析系统。PP2A固定体催化DiFMUP生成DiFMU。用分析缓冲液[50mMTris·Cl(pH7.5),0.1mM CaCl2 and 1mM NiCl2]洗涤96孔板两次,每孔100μl,每次5分钟。同时,用分析缓冲液配制底物反应工作溶液。底物DiFMUP可配制成5~500μM的工作溶液。然后,每孔加入100μl的50μM DiFMUP工作溶液,放入荧光分光光度计(荧光读板仪)中,温度设置为37℃,激发波长为360nm,发射波长为460nm,读取取荧光值。第一次读得荧光强度后,每5分钟读一次,酶触反应时间为30~120分钟。假性PP2A固定体,也与相同PP2A固定体同样处理,同样测量,给出系统的本底值。同一块板上,也加入不同已知浓度的DiFMU(20.0,10.0,5.00,2.50,1.25,0.625和0.313μM),每孔100μl,同样的条件读取荧光强度。DiFMU同样用分析缓冲液配制,分析缓冲液用作标准曲线的空白孔。
第五步,结果与计算酶活力。每个时间点测得的DiFMU荧光值如下:
时间(分钟) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 |
荧光强度 | 21 | 61 | 107 | 165 | 221 | 279 | 338 | 396 |
上表的荧光值已经扣除了本底值。
用最小二乘法拟合上表的数据,得到直线方程如下:
荧光强度=10.9×时间(分钟)+7.1,R2=0.997
该直线方程的斜率为10.9,因此,荧光强度的变化率为:
10.9荧光强度单位/分钟
测得的DiFMU浓度—荧光强度如下:
荧光强度 | 0.0 | 37.7 | 69.7 | 133.7 | 291.7 | 518.9 | 1002.6 | 1875.1 |
[DiFMU](μM) | 0.0 | 0.313 | 0.625 | 1.25 | 2.50 | 5.00 | 10.0 | 20.0 |
设定空白孔([DiFMU]=0)荧光强度为零,每个浓度的荧光值减去空白孔的荧光值。
用最小二乘法拟合上表的数据,得到直线方程:
[DiFMU]=0.0104×荧光强度,R2=0.997
其中,[DiFMU]的单位是μM。加入的样品为100μl,蛋白浓度为1.00μg/μl。
每毫克蛋白的酶活力计算如下:
实施例2:采用底物固定体法测量糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)的酶活力。
如图6所示,具体实施方案如下:
短肽—ILSRRPS(p)YR—是GSK-3的特异性底物。GSK-3将磷酸基团添加到底物短肽的丝氨酸(S)残基上:
其中,“S(p)”代表的是磷酸化的丝氨酸,S(p)’代表预先被磷酸化的丝氨酸。
为了确定测量的本底值,特设计“假性底物”,即待磷酸化的丝氨酸被被谷氨酸被(glutamic acid,E)替代:ILERRPS(p)YR,因此,这个“假性底物”不会被磷酸化。为了便于固定短肽,将这两个短肽连接分别在牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)上:ILSRRPS(p)YR—BSA或ILERRPS(p)YR—BSA,BSA也可以连接在短肽的N端。
标准品参照品我们选用磷酸化丝氨酸(O-Phospho-L-serine,pSerine)或磷酸化丝氨酸—BSA(phospho-Ser—BSA,pS—BSA),把一系列的已知浓度的pSerine或pS—BSA固定在96孔酶联板上。
第一步,制备底物固定体、假性底物固定体和标准品固定体。用0.05M碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液(pH=9.6)配制底物短肽—BSA工作液(0.1μg/ml—10μg/ml)。将这个底物工作液加入底物捕获固定体中,每孔100μl工作液,4℃孵育过夜。抛弃多余的短肽溶液,用基础缓冲液洗涤酶联板三次。按照同样的方法和条件,用假性底物—BSA和pSer替代底物短肽,制备假性底物固定体和标准品固定体。除了这个直接固定法,还可以采用其他实施例的方案替代,例如:
短肽不连接任何的表位标签,直接固定在载体上;
牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素可作为桥联剂首先包被于载体表面。然后,用马来酰亚胺等偶联剂将短肽通过共价键与桥联剂交联,最终短肽就被固定于载体上。
短肽可连接表位标签,如把生物素(biotin)连接在这两个短肽的N/C末端,与预先包被或固定了链霉亲和素(streptavidin)的固相载体孵育,短肽就被固定在载体;
把短肽连接多聚组氨酸(Histidine,H)尾巴,这个尾巴可以连接在N-末端或C-末端,也可以N/C-两端同时连接。通常是6个组氨酸,例如:
ILSRRPS(p)YRHHHHHH
这个有多聚组氨酸尾巴的短肽可以通过两种方式连接到固相载体上:
在载体上,如96孔板,螯合了二价或三价金属离子如Ni2+,Co2+,Cu2+和Fe3+这些金属离子与多聚组氨酸尾巴形成螯合物,因此,短肽就固定在载体上。载体是通过螯合剂如亚氨基二乙酸或氨三乙酸螯合金属离子的,这些螯合剂是连接在固相上的。
在载体上,如96孔板,先后包被了蛋白G/A和固定了抗多聚组氨酸抗体。抗体与多聚组氨酸尾巴结合,将短肽固定在载体上。相关的方法可参照酶固定体法的第一步。
将假性底物(ILERRPS(p)YR)替代底物(ILSRRPS(p)YR),用同样的方法和条件,制备假性底物固定体。
用同样的缓存液配制成pSerine标准品,浓度梯度(ng/ml)为:0,0.05 0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,。每孔加入100μl标准品,因此,每孔pSerine的含量(pg)为:0,5,10,20,40,80,160,320。进一步将每孔标准品含量换算成皮摩尔(pmol,10-12mol):0.00,0.027,0.054,0.108,0.216,0.865,1.730。可根据系统给出的信号的强度调整标品的浓度梯度。然后,用这些标准品替代底物,按照同样的方法和条件,制备标准品固定体。
第二步,封闭固定体的非特异位点。把封闭液(5%BSA,用基础缓冲液配制)加入底物固定体、假性底物固定体和标准固定体中,每孔加入100μl,室温下孵育两小时。抛弃封闭液,不要洗涤,直接进入下一步。标准固定体的封闭液可保留到第三步,与测量样品同时抛弃。封闭是是一个选择步骤,研究者可根据实际情况选择是否封闭。
第三步,建立分析系统,即样品中的GSK-3催化底物短肽磷酸化。大鼠大脑皮质匀浆、离心、弃沉淀、留上清、测蛋白浓度(参照酶固定体法的相关步骤)。在冰上,用反应缓冲液(100mM ATP,50mM Tris-HCl,pH 7.3,10mM Mg-Acetate,and 0.01%β-mercaptoethanol,蛋白磷酸酯酶和蛋白水解酶抑制剂)将蛋白浓度调整为0.25~2.0μg/μl,得到流动体。然后,把这个流动体加入底物固定体和假性底物固定体中,每孔加入100μl。,立即置于37℃的恒温箱里,酶促反应立即开始。反应10~120分钟后,抛弃流动体,反应立即终止。96孔酶联板用基础缓冲液洗涤三次。
第四步,信号检测与放大,即检测固定体上的磷酸含量。可用常规的酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)测得固定体上的磷酸含量。抗磷酸化丝氨酸抗体(anti-phospho-Ser Ig G,anti-pSer IgG)可特异性识别磷酸化丝氨酸但不识别未被磷酸化的丝氨酸。将anti-pSer IgG兔多克隆配制成0.1~1.0μg/ml的工作液。每孔(包括底物固定体、假性底物固定体和标准品固定体)加入100μl工作液,4℃过夜或室温两小时孵育。抛弃多余的抗体工作液,用基础缓冲液洗三次。然后,每孔加入100μl抗兔IgG-生物素工作液(anti-rabbit Ig-biotin,用封闭液配制0.001~1.00μg/ml),室温孵育1~2小时。抛弃多余的二抗体工作液,用细胞裂解液洗三次。随后,加入100μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-horseradish peroxidase,Streptavidin-HRP,用封闭液配制0.01~0.1μg/ml),室温孵育0.5~1小时。孵育完毕之后,抛弃多余的液体,用基础缓冲液洗涤三次。立即加入100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)和过氧化氢,室温、避光孵育10~30分钟。显色反应被100μl终止液终止(1M HCl,或0.6M H2SO4)。把96孔酶联板放入读板仪,450nm为测量波长,540nm为参照波长,测量光密度值。每孔的净光密度值为它们的差值:
净光密度值=光密度值450nm-光密度值540nm
第五步,计算GSK-3酶活力。首先,我们利用标准品固定体建立净光密度值—丝氨酸含量的标准曲线。生物吸附通常是一条S曲线。我们采用四参数法拟合这条曲线:
y—因变量,这里为每孔的净光密度值;
x—自变量,这里为每孔磷酸化丝氨酸的皮摩尔数(pmol,10-12mol);
a—曲线上渐近线估值,即最大值;
d—曲线下渐近线估值,即最小值;
c—最大结合一半时对应的剂量;
b—希尔斜率,即曲线的最大斜率,最大结合一半时对应的曲线斜率。
然后,利用这条标准曲线公式,计算每个测量孔的磷酸化丝氨酸的含量(pmol):
同样,一个酶活力定义为每分钟一个pmol的丝氨酸被磷酸化。为了便于比较,同样将每孔的酶活力折算成每毫克蛋白的酶活力:
实施例3:
测量组织的蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活力的试剂盒。试剂盒里所有的固定体都是可坼卸和重新组合,因此,试剂盒包含了组装支架。除此之外,包含以下成分:
A.PP2A捕获固定体、侨联固定体和固定了PP2A纯品的标准品PP2A固定体;
B.能够保护样品和待测分子活力不被破环的试剂,如蛋白水解酶抑制剂和防腐剂等;
C.封闭成分,如牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白以及明胶蛋白;
D.PP2A的底物DiFMUP;以及相应产物DiFMU(标准品);
E.DMSO溶剂。用于溶解DiFMUP&DiFMU;
F.阴性对照,即假性PP2A捕获体固定体;
G.阳性对照,包括PP2A纯品。
H.用于反应的浓缩反应液或其必要成分的干粉或浓缩液;
I.操作流程说明书;
J.分析系统变化的数学模型。
实施例4:
测量样品中糖原合酶激酶3的活力试剂盒。
本试剂盒可用于测量样品中糖原合酶激酶3的活力。包括以下几个部分:
A.底物固定体和假性底物固定体。底物固定体已经固定了糖原合酶激酶3的底物,假性底物固定体固定的是假性底物。这些固定体是可坼卸的多孔板。这些多孔板可重新组合。底物固定体和假性底物固定体被密封保存在不透光的包装里;
B.标准品固定体。不同含量的标准品,磷酸丝氨酸,被固定在多孔板的不同孔,形成一个含量梯度。所用的多孔板与底物固定体完全一样;
C.组装多孔板的支架;
D.抗磷酸化丝氨酸的兔多克隆抗体;
E.抗兔IgG-生物素;
F.链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物;
G.3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)溶液;
H.过氧化氢溶液;
I.10倍浓缩的基础缓冲液;
J.封闭成,如牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白以及明胶蛋白;;
K.10倍浓缩的分析缓冲液;
L.若干大小试管;
M.使用说明书。
实施例5:一种制备固定体的一体化设备。
按照本发明所叙述方法和步骤,采用一体化设备制备本发明的各种固定体包括侨联固定体、待测分子捕获固定体、底物固定体和辅因子固定体。这个制备固定体的一体化设备有以下的功能:
A.可调控孵育的时间和温度。
B.可自动完成桥联剂、捕获剂、底物和辅因子加入到载体或固定体上。
C.可自动完成孵育。
D.可自动添加洗涤液和封闭液。
E.可自动抛弃多余的试剂和缓冲液。
F.可用适当的速度振动固定体。
G.具备编程功能。可根据不同的工艺制备条件设定加样的顺序、孵育时间和温度、振动的频率等参数。
H.该设备可与目前常见的操作系统兼容。可用移动通信设备和固定电脑控制。
I.该设备有手动备份,可在设备不能正常工作时,替代电子控制。
J.完成制备工作后,设备能给出一个报告。
K.数据和报告可用区块链加密。
实施例6:一种测量酶活力的一体化设备。
按照本发明所叙述的方法和步骤,采用一体化设备测量生物样品中的酶活力。这个一体化的设备可兼容待测分子固定体法、底物固定体法和辅因子固定体法。这个一体化的设备也可用于制备采用一体化设备制备本发明的各种固定体、捕获固定体和侨联固定体包括待测分子捕获固定体、待测分子固定体、底物固定体和辅因子固定体。这个一体的设备具备以下功能:
A.可调控孵育的时间和温度。
B.可自动完成桥联剂、捕获剂、底物和辅因子加入到载体或固定体上。
C.可自动加入样品。
D.可自动完成孵育。
E.可自动添加洗涤液和封闭液。
F可自动抛弃多余的样品、试剂和缓冲液。
G.可用适当的速度振动固定体。
H.可自动完成信号的连续检测和记录,例如:紫外—可见光光密度、红外和远红外光光密度、荧光光密度、pH值、离子浓度、电导率等。
I.具备时间控制功能。
J.具备编程功能。可根据不同的工艺制备条件设定加样的顺序、孵育时间和温度、振动的频率等参数。
K.可进行数据处理,例如:计算标准曲线,给出最佳拟合方程,依据标准曲线,计算出每个信号值所代表的反应物/产物所代表的含量或浓度,依据反应时间和样品量,计算出单位体积或单位质量的酶活力。
L.该设备可与目前常见的操作系统兼容。可用移动通信设备和固定电脑控制。
该设备有手动备份,可在设备不能正常工作时,替代电子控制。
M.完成制备工作后,设备能给出一个报告。
N.数据可被区块链保护。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种分析分子活力的系统,其特征在于:包括流动体和待测分子固定体,底物和辅因子位于流动体,样品中的待测分子被固定于载体上以形成相对于流动体静止的待测分子固定体,
所述固定包括以下步骤:
A.将可与待测分子特异性结合的特异性捕获剂直接包被在载体上得到待测分子捕获固定体,或者,首先将侨联剂包被在载体上,得到侨联固定体,然后,将可与待测分子特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到待测分子捕获固定体;
B.待测分子捕获固定体特异性地固定待测分子,得到待测分子固定体。
2.根据权利要求1所述的一种分析分子活力的系统,其特征在于:
所述待测分子为未被表位标签标记的分子或被表位标签所标记的分子,包括酶、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、核苷酸、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸、金属离子、多亚基的蛋白、离子通道或配基-门控通道;
所述特异性捕获剂为未被表位标签标记的分子或被表位标签所标记的分子,包括抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素、半胱氨酸、甲氨蝶呤、金属原子或离子;
所述侨联剂包括羧甲基葡聚糖、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗-抗体的Fc端、链霉亲和素、亲和素、生物素、半胱氨酸、甲氨蝶呤、金属原子或离子;
所述表位标签包括抗体的Fc端、生物素、链霉亲和素和亲和素、半胱氨酸S-转移酶、多聚组氨酸、二氢叶酸还原酶、FLAG和3×FLAG、血凝素A、c-Myc、绿色荧光蛋白、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种分析分子活力的系统,其特征在于:所述步骤A中,将特异性捕获剂或侨联剂包被在载体上时,所用的包被剂包括磷酸缓冲盐溶液、三乙醇胺缓冲盐水溶液、0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液或共价偶联剂。
4.根据权利要求1所述的一种分析分子活力的系统,其特征在于:还包括对待测分子捕获固定体和待测分子固定体进行洗涤和封闭液,所述封闭液用基础缓冲液配制,并含有封闭成分,封闭成分包括牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白以及明胶蛋白,
所述基础缓冲液满足:不干扰待测因子活力和信号检测、pH控制在0~14之间、含有0~10%离子或非离子型表面活性剂、适合于保持待测分子原始活力的离子强度和渗透压。
5.根据权利要求1所述的一种分析分子活力的系统,其特征在于:
所述样品为标准化处理后的样品,包括生物样品、环境样品、药物样品、化工产品或食品样品;
所述流动体包括液体、气体、胶体、气溶胶或悬浮液;
所述载体的形态包括试管、微孔板、固定化的颗粒、膜、片状、芯片或其组合。
6.一种分析分子活力的系统,其特征在于:包括流动体和底物固定体,含有待测分子的样品位于流动体,底物被固定于载体上以形成相对于流动体静止的底物固定体,
所述固定包括以下方式:
A.将底物直接包被在载体上,或直接在载体上合成,得到底物固定体;
B.将可与底物特异性结合的特异性捕获剂首先包被在载体上得到底物捕获固定体,底物捕获固定体特异性地捕获底物,得到底物固定体;
C.将侨联剂包被在载体上得到侨联固定体,然后,将可与底物特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到底物捕获固定体,底物捕获固定体特异性捕获底物,得到底物固定体。
7.一种分析分子活力的系统,其特征在于:包括流动体和辅因子固定体,含有待测分子的样品和底物位于流动体,辅因子固定于载体上以形成相对于流动体静止的辅因子固定体,
所述固定包括以下方式:
A.将辅因子直接包被在载体上,或直接在载体上合成,得到辅因子固定体;
B.将可与辅因子特异性结合的特异性捕获剂首先包被在载体上得到辅因子捕获固定体,辅因子捕获固定体特异性地捕获辅因子,得到辅因子固定体;
C.将侨联剂包被在载体上,得到侨联固定体,然后,将可与辅因子特异性结合的特异性捕获剂固定在侨联固定体上,得到辅因子捕获固定体,辅因子捕获固定体特异性捕获辅因子,得到辅因子固定体。
8.一种固定体,其特征在于:如权利要求1所述的待测分子固定体,如权利要求6所述的底物固定体,如权利要求7所述的辅因子固定体,或者是将待测分子固定于权利要求7所述辅因子固定体上以形成的固定体。
9.一种捕获固定体,其特征在于:如权利要求1所述的待测分子捕获固定体,如权利要求6所述的底物捕获固定体,如权利要求7所述的辅因子捕获固定体,或者如权利要求7所述的辅因子固定体。
10.一种侨联固定体,其特征在于:如权利要求1、6或7所述侨联固定体。
11.一种假性固定体,其特征在于:按权利要求1所述方法,将特异性捕获剂替换为假性捕获剂,制备得到的对应的假性待测分子捕获固定体及其对应的假性待测分子固定体;
或者,按权利要求6或7所述方法,将底物或辅因子替换为假性底物或辅因子,制备得到的对应的假性底物固定体或假性辅因子固定体;
或者,按权利要求1、6、7所述方法,将侨联剂替换为假性侨联剂,制备得到的对应的假性侨联固定体。
12.一种标准品固定体,其特征在于:按照权利要求1所述方法,用已知含量的待测分子替代待测样品,制备得到的待测分子标准品固定体;
或者,按权利要求6所述方法,用已知含量的底物制备得到底物标准品固定体;
或者,按权利要求7所述方法,用已知含量的辅因子制备得到辅因子标准品固定体;
或者,按权利要求6、7所述方法,用已知含量的产物制备得到产物标准品固定体。
13.一种活力测量的方法,其特征在于:包括以下步骤:
A.建立权利要求1、6或7任一项所述分析系统;
B.使流动体与相应的固定体接触;
C.观测和记录系统随时间的变化;
D.获得系统变化数据和数学模型,计算得到待测分子的活力。
14.一种试剂盒,其特征在于:包含以下成分:
A.如权利要求1所述待测分子捕获固定体、权利要求6所述底物固定体、权利要求7所述辅因子固定体、权利要求7所述捕获固定体或权利要求10所述的侨联固定体;
B.能够保护样品和待测分子活力不被破环的试剂;
C.封闭成分;
D.待测分子的底物;
E.标准品、标准品固定体;
F.阴性对照,包括对应的假性固定体;
G.阳性对照,包括待测分子纯品、底物纯品、辅因子纯品以及相应产物的纯品;
H.用于反应的浓缩反应液或其必要成分的干粉;
I.操作流程说明书;
J.分析系统变化的数学模型。
15.一种一体机,其特征在于:包括以下操作步骤:
A.完成如权利要求1所述待测分子捕获固定体和待测分子固定体、权利要求6所述底物固定体和权利要求7所述辅因子固定体的制备,权利要求10所述的侨联固定体、权利要求11所述假性固定体的制备,以及权利要求12所述标准品固定体的制备;
B.完成各种固定体的洗涤与封闭;
C.完成分析系统的变化;
D.检测分析系统变化给出的信号;
E.记录、存储、显示、输出并分析检测数据;
D.具备接入互联网、远程控制和区块链功能。
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