JPH06507021A - 多重リガンドを同時検出する新規接合体及び検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多重リガンドを同時検出する新規接合体及び検定法発明の分野 本発明は体液試料中の多重選択標的リガンドを同時検出するのりガント−受容体 検定の分野にある。

発明の背景 本明細書で用いられた場合、用語「リガンド−受容体検定」は、リガンドとその 標的リガンドと結合しつる受容体との間の錯体の形成により検出しうる少な（と も一つの標的リガンドの検定を言う。標的リガンドは、被検体自体又は検出され れば試料中に被検体の存在を推定するのに用いることができる物質でありうる。

本発明の関係において、用語「リガンド」はハブテン、ホルモン、ペプチド、蛋 白、デオキシリボ酸（ＤＮＡ）　、リポ核酸（ＲＮＡ）並びに前述の材料の代謝 産物及び診断的興味を引き特異的リガンド受容体を有しうる天然又は合成起体の 他の物質を含む。リガンド−受容体検定は、一般に、体液、食品生成物、動物溶 液及び環境試料中のリガンドの存在及び濃度のインヒドロ測定に有用である。例 えば、ヒト血液又は尿中の特異的ホルモン、ペプチド、蛋白、治療薬、及び毒薬 の測定によって、ヒトの状態の医療診断は有意に改良された。試料中のそのよう なリガンドの定性、判定量及び定量測定用の簡単迅速な検定は、引き続き必要で ある。さらに、多くの状況で、そのような検定は非技術的ユーザーにより実施さ れ、解釈するのに十分に簡単であることが必要である。

リガンド−受容体検定は、リガンド受容体による標的リガンドの結合に依存し、 試料中の標的リガンドの濃度を測定する。リガンド−受容体検定は競合又は非競 合として記載できる。競合的検定は、一般に標的リガンドを含んでいると推定さ れる試料、リガンド類似接合体及びリガンド受容体により提供された限られた数 の結合部位についてこれらの種の競合を含む。当業者は、この基本的競合状況の 多くの変形が既に記載されており、本明細書では、本発明の一般的目的に当ては まるもの以外は詳細に論じないことを理解するであろう。

競合的リガンド−受容体検定はさらに同種又は不均質であるとして記載できる。

同種検定では、競合に関係している全ての反応物を互いに混合し、標的リガンド の量は、リガンド受容体とリガンド類似接合体との結合の程度へのその効果によ り測定する。米国特許番号第３．８１７．８３７号は、そのような同種競合リガ ンド−受容体検定を記載する。

不均質競合的リガンド−受容体検定は、遊離リガンド類似接合体からりガント受 容体に結合したリガンド類似接合体の分離及び結合又は遊離フラクションの測定 を要する。そのような検体を実施する方法は、米国特許第３．６５４．０９０号 、第４，２９８、６８５号、第４．４２り、　４３８号及び第４．５０６．００ ９号、ヨーロッパ特許出願８７３０９７２４．０並びにＰＣＴ国際出願番号／Ｕ Ｓ８６１００６６８に記載される。遊離物から結合物の分離は、固相又は沈殿上 のリガンド受容体の固定化によって遊離リガンド類似接合体からリガンド受容体 及びそれに結合した全てのものを除去することによう違威しつる。次いで結合又 はａ離フラクション中のりガント類似接合体のｌを測定し、試料中の標的リガン ドの濃度と関連づけることができる。一般に結合フラクションが便利な形で、例 えば面相であると、それにより要すれば、洗浄して残っている非結合リガンド類 似接合体を除去し、結合リガンド類似接合体又は関連生成物の測定を促進できる 。遊離フラクションが通常、液体の形であると測定するのに一般に便利でない。

多重リガンドを単一検定で測定しようとすると、個々のリガンド類似接合体の応 答がある方法で識別できない限り、全てを単一リガントに混合すると、各リガン ドについてのリガンド類似接合体の遊離フラクションの測定は不可能である。し かしながら、視覚的に判断する検定でリガンド類似接合体の遊離フラクションを 検定することは、そのような検定で示される色の密度がリガンド濃度の範囲をは るかに越えて一般にリガンド濃度に比例するので、明らかに有利である。

不均質、競合的リガンド−受容体検定方法で遊離リガンド類似接合体を検定する のに用いることができる一方法は、固相上標的リガンドに特異的な第二の固定化 受容体を提供し、それにより第一のリガンド受容体に結合しないリガンド類似受 容体は固相上で固定化された第二のリガンド受容体に結合できる。そのような検 定を実施する方法は１９８９年１月ｌＯ日に出願された米国特許出願番号第２９ ５、５６０号及びヨーロッパ特許出願９０３００２８３．０に記載され、これら 両者を引用して明細書記載の一部とする。

このような方法により試料中の多重リガンドの存在又は量を検定するため、当業 者は多重、分離検定、各検定は問題の一つのリガンドに向けられる、又はリガン ド類似接合体の混合物による単一検定、各接合体は標的リガンドの一つについて 特異的である、を利用するであろう。多重、分離検定、例えば悪用の薬物のスク リーンは時間、労力及び材料を消費する。より有効な別の検定はりガント類似接 合体、リガンド受容体及び多重標的リガンドについての同時競合結合反応を生ず るための試料の混合物を用いる。各標的リガンドの存在又は量は、反応混合物を 反応混合物中、個々のリガンド類似接合体に特異的な不連続地帯に固定される固 相上で受容体と接触させること、結合したリガンド類似接合体から信号を発展さ せること及び検出可能な信号を標準により生じたものと関連させることにより実 質的に測定する。信号発展要素の濃度に一般に比例する増強した非特異的信号発 展をこうむるリガンド類似接合体の混合物を利用する検定を検定に用いる。１０ のリガンド類似接合体を分離検定に必要な濃度で混合すると、得られる混合物は 、単一リガント類似接合体を利用する検定に観察される量の約１０倍の非特異的 信号発展を示す。リガンド受容体検定の感受性は、非特異的結合により発展した 信号により通常、実際に限られる。従ってリガンド類似接合体の混合物を利用す る検定の結果、各標的リガンドに対する感受性は増加する。各リガンド類似接合 体に用いられる信号発展要素の濃度の減少は、非特異的信号を減するため、最大 検定応答を減少させ、結果として検定感受性が低くなり、検定に関しての濃度範 囲が小さくなる。試料中の多重標的リガンドを同時に検定するためにリガンド類 似接合体の混合物を用いることにより得られた効率の恩恵は、結果として感受性 及び検定範囲でのロスにより相殺される。本発明はこれらの欠損に打勝つもので ある。

米国特許第４．５０６．００９号に記載された方法は、リガンド類似体及び信号 発展要素に結合した異なるリガンドである不溶性結合成分の両方を有するリガン ド類似接合体を利用する。不溶性受容体は、リガンド類似体に対する標的リガン ドに特異的な抗体の結合により立体的に妨げられないで、遊離リガンド類似接合 体を沈殿するのに用いられる。本発明は、同じ信号発展要素に結合した二つのリ ガンド間の物理的関係を利用し、二つのリガンドが同じ信号発展要素に一般的に 結合できず、それゆえリガンド−受容体結合反応が独立して維持することを示す 。もしそのような接合体が二つの標的リガンドの検定に用いられると、第一の標 的リガンドへのリガンド受容体の結合は第二の標的リガンドへの他のリガンド受 容体の結合に影響するであろう。二つの標的リガンドは、そのような接合体を用 いて正確に検定できない。先行技術は、既に記載された欠陥に苦しむリガンド類 似接合体の混合物を使用することなく、試料中の多重標的リガンドの同時検定を 可能にする溶液を提供できない。

非競合検定は、一般に検定で測定すべき標的リガンドの濃度より実質的に過剰の りガント受容体を利用する。標的リガンドを二つのリガンド受容体、一つのりガ ント受容体はりガント受容体接合体の形で存在し、第二リガンド受容体はしばし ば固相に結合する、に結合することにより検出し、未結合反応剤、例えば未結合 第一リガント受容体接合体からの分離を促進するサンドイッチ検定は、非競合検 定の例である。リガンド受容体接合体を利用する検定は、競合及び非競合検定を 含む。多重標的リガンドがリガンド受容体接合体の混合物を用いる単一試料中に 検定されると、増加した非特異的結合及び減少した感受性の問題がリガンド類似 接合体の混合物について記載された同じ理由で起きる。本発明は、接合体を形成 する単一信号発展要素に結合した結合ドメイン中のリガンド類似体又はリガンド 受容体を利用することにより、試料中の多重リガンドの同時検定を促進する。

そのような接合体は、感受性又は検定範囲を損なうことなく試料中の、個々のリ ガンド受容体接合体の混合物の使用に関係する多重リガンドの同時検定を可能に する。

本発明は、先行技術方法の欠陥を阻止する。それは、信号発展要素が試料中の少 なくとも二つの標的リガンドの検定用の少なくとも二つの結合ドメイン、各結合 ドメインはリガンド類似体又はリガンド受容体を有する、に結合する接合体を利 用する検定方法を記載する。

発明の要約 本発明は信号発展要素に結合し、接合体を形成する結合ドメインを教授し、請求 する。各結合ドメインは検定計画に依存している少なくとも一つのリガンド類似 体又はリガンド受容体を含む。結合ドメインは、それらがそれらの各標的リガン ドの検定で互いに独立して作用するよう構成される。各結合ドメインは、同じ信 号発展要素に結合した他の結合ドメインの結合反応に影響を及すことなく、検定 においてその各結合相手と結合しつる。本発明の新規接合体は、試料中の多重標 的リガンドを検出する不均質検定方法に有用であり、検出方法は、標的リガンド に特異的な不連続帯を有する固相を利用する。

定義 請求の範囲及び明細書を解釈する場合、以下の用語は下記の意味を有するであろ う。

リガンド−リガンド受容体に対する結合相手。リガンドは検定計画に依存してい るリガンド受容体でありうる。

リガンド類似体−他の種、例えば信号発展要素に共有結合で又は非共有結合で付 着しうる標的リガンドの化学的誘導体。リガンド類似体及び標的リガンドは同じ であり得、両者はりガント受容体に結合することができる。

リガンド受容体−リガントに結合可能な受容体、典型的には抗体、しかしそれは 検定計画に依存しているリガンドでありうる。

リガンド類似接合体−リガント類似体及び信号発展要素の接合体。リガンド類似 体は信号発展要素に直接に結合しつるか、或はそれらは蛋白又はポリマーに結合 し得、生成物は信号発展要素に結合しつる。リガンド類似接合体及びそれらの意 図されたりガント受容体は相補性である。リガンド類似接合体とそれらの意図さ れたリガンド受容体以外のリガンド受容体は非相補性である。

リガンド受容体接合体−リガント受容体と信号発展要素の接合体。リガンド受容 体は、信号発展要素に直接結合しうるか或はそれらは蛋白又はポリマーに結合し 得、生成物は信号発展要素に結合しうる。リガンド受容体接合体とそれらの意図 されたリガンド又はリガンド類似体は相補性である。リガンド受容体接合体とり ガント又は意図された標的以外のりガント類似体は非相補性である。

接合体−少なくとも二つの異なる結合ドメインに結合した信号発展要素、各結合 ドメインはその相補性結合相手に結合しうる少なくとも一つのリガンド類似体又 はリガンド受容体を含む。

信号発展要素−要素、信号発展相と共同して検出可能な信号を発展する接合体、 例えば酵素。

信号発展相−信号発展要素を信号を発展するようにする材料を含んでいる相、例 えば酵素基質溶液。

反応混合物−競合的イムノアッセイにおいて、標的リガンド及び競合的結合反応 に関係する検定試薬を含んでいると推定される試料中の混合物。

固相−その上で標的リガンドの検出のための不連続帯が固定された固相で、そこ で信号は、検定結果の相互関係のための信号発展段階の間、最終的に発展する。

リガンド類似構成物−固相上に固定された、又は信号発展要素ではない分子に結 合した、少なくとも一つのリガンド類似体。

発明の詳細な説明 先行技術で記載される、試料中の多重標的リガンドの不均質競合的リガンド−受 容体検定は、リガンド類似接合体、リガンド受容体、及び標的リガンドを含んで いると推定される試料の混合物を利用する。試料はリガンド受容体と接触させ、 リガンド類似接合体は別個に加えるか又は試料とりガントを同時に接触させて反 応混合物を形成させつる。リガンド受容体は、遊離接合体から、リガンド受容体 に結合した接合体の分離を促進するため、固相上の不連続帯に固定しうる。競合 的結合反応を行い、相補性リガンド受容体に結合する個々のリガンド類似接合体 の量を、試料中ま対応する標的リガンドの量と関連させる点まで進める。

先行技術のリガンド類似接合体は信号発展要素に結合した標的リガンドのリガン ド類似体を含んだ。二又はそれ以上の標的リガンド用のリガンド類似体は、試料 中の多重標的リガンドの検定のための同じ信号発展要素に一般に結合しない。

というのは、一つの標的リガンド用のリガンド類似体へのりガント受容体の結合 が他の標的リガンドのための近くのリガンド類似体とそのリガンド受容体との結 合によって潜在的に防害されるからである。このような情況の下に、一つの標的 リガンドの検定に必要な競合的結合反応は、不確かな検定結果を生じる他の標的 リガンドの検定に影響を及ぼす。そのような相互作用の証拠は、本発明の背景に 記載したように単一標的リガントの検定でこれらの干渉を使用する米国特許第４ ゜５０６、００９号に見られる。信号発展要素にでたらめに結合する異なる標的 リガンド用のリガンド類似体は、潜在的にそのような干渉にさらされる。信号発 展要素に結合する異なる標的リガンドへのリガンド類似体の密度をこれらの効果 が検定実施に影響を及ぼさないことを保証する密度まで下げることは、検定計画 目標に達するためにリガンド類似体密度を変える検定計画者の能力を厳しく限定 する。これらの問題を避けるため、先行技術検定は、リガンド類似接合物の混合 物を使用し、そこで各信号発展要素は一つの標的リガンドについてのリガンド類 似体に結合し、試料中の多重標的リガンドを同時に検定する。リガンド類似接合 体のそのような混合物により要求される高濃度の信号発展要素により、試料中の 全ての標的リガンドに対する検定感受性を減する高い非特異的結合とすることが できる。

同様に不均質競合的検定又は不均質非競合的検定でリガンド受容体接合体を利用 する試料中の多重標的リガンドについての先行技術検定は、リガンド受容体接合 体の混合物を用い実施する。このような検定での強い非特異的結合及び各標的リ ガンドについての感受性の結果としての欠損は本発明により救済される。

本発明の接合体は、信号発展要素に結合する結合ドメインを有し、そこで各結合 ドメインは少なくとも一つのリガンド類似体又はリガンド受容体を含む。結合ド メインは、信号発展要素上の結合ドメインの密度が高くても、それらの各標的リ ガンドの検定で互いに独立して作用する。そのような接合体の構築及び使用は検 定計画に依存する。

信号発展物に結合したリガンド類似体を利用する不均質競合的検定において、各 結合ドメインは信号発展要素に結合した少なくとも一つのリガンド類似体を含み 、それにより結合ドメインはその相補性リガンド受容体と結合できる。もじりガ ント類似体が、例えばその相補性リガンド受容体と同様の大きさか又はより大で ある蛋白抗原であると、リガンド類似体は、共有結合又は非共有結合手段により 信号発展要素に直接結合でき、信号発展要素上の他の結合ドメインに結合できる 非相補性リガンド受容体からも干渉されることなくその相補性リガンド受容体に 結合できる、信号発展要素上に結合ドメインを産生ずる。当業者は信号発展要素 にリガンド類似体を結合するのに用いた手段が必ずしもその相補性リガンド受容 体に結合できる機能結合ドメインとはならないことを認識するであろう。同じ類 似体を含んでいる多重結合ドメインは、単一信号発展要素に結合でき、接合体の 、相補性リガンド受容体についての標的リガンドと競合能力を変える。リガンド 類似体が相補性リガンド受容体よりも実質的に小さいと、リガンド類似体は、ま ず相補性リガンド受容体と大きさが同じであるかより大である分子構造物、例え ば蛋白又はポリマーと好ましくは共有結合手段により結合し、次いで生成物は信 号発展要素と結合して信号発展要素上に結合ドメインを産生ずる。機能結合ドメ インは、その相補性リガンド受容体に結合しつる少なくとも一つのりガント類似 体を含まなければならない。当業者は、分子構造物に結合したリガンド類似体の 数が接合体の、相補性リガンド受容体についての標的リガンドと競合する能力を 変えるのに用いることができることを認識するであろう。本発明の特に好ましい 実施態様は、まず異なる標的リガンドについてのリガンド類似体をウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）に別個に結合し、それによりＢＳＡ分子が単一標的リガントに ついてのりガント類似体にのみ結合させることによる試料中のハブテンである多 重標的リガンドの検定用の接合体の構築である。生成物は混合して信号発展要素 と結合し単−信号発展要素上に結合ドメインの混合物を産生ずる。信号発展要素 に、又、多くのりガント類似体に結合した各ＢＳＡ、それにより少なくとも一つ のリガンド類似体はその相補性リガンド受容体に結合できる、は信号発展要素上 の結合ドメインである。好ましい信号発展要素は、色素を含有しているポリマー 、色素を含有しているラテックス粒子、色素を含有しているリポソーム及び金属 ゾルを含む。特に好ましい信号発展要素はコロイド金である。ＢＳＡ分子の混合 物のコロイド金への結合、ＢＳＡ分子のあるものは一形態のリガンド類似体に結 合している、は吸着により達成できる。リガンド類似体の蛋白への結合方法及び 蛋白のコロイド金への吸着方法は、当業者にとって周知であり、例えば米国特許 第３．８１７．８３７号、第３．８７８．１８７号、第３．８８４．８９８号、 第４．２０３．８０２号、第４．２８１．０６５号、第４．３１３．７３４号、 ロジャーズ等、クリニカル・ケミストリイ、２４．９５−１００　（１９７６） 　及びゲオルグヘーガン等、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリイ・アンド・ キトケミストリイ　２５．１１８７−１２００　（１９７７）参照。リガンド類 似体対ＢＳＡの標識化比及び非標識ＢＳＡと又はコロイド金への吸着用の他の蛋 白と混合されるリガンド類似体に結合したＢＳＡ分子の相対割合は、検定実施に より経験的に測定する。標的リガンドに特異的な抗体による不均質競合的検定に 用いて、そのような接合体は試料中の多重標的リガンドの検定にうまく用いられ て来た。

異なるリガンド類似体を信号発展要素に結合するのに用いられる結合化学は、結 合ドメイン中のりガント類似体と、溶液中の又は固相上に固定された非相補性リ ガンド受容体との低い親和性結合相互作用となる類似性を有する。そのような望 ましくない結合相互作用は、反応混合物中に、例えば防害阻害因子及び検定での それらの使用と題する継続中の出願、１９９１年４月１０日に受理された出願番 号第６８３、４５６号、これを引用して明細書記載の一部とする、に記載される ような防害阻止因子を加えることにより実質的に除去する。

信号発展要素に結合したリガンド受容体を用いる本発明の不均質検定において、 各結合ドメインは、信号発展要素に結合した少なくとも一つのリガンド受容体を 含み、それにより結合ドメインは、非競合的検定でその標的リガンドと、又は競 合的検定で標的リカンド、リガンド類似体又はリガンド類似構成物と結合するこ とができる。信号発展要素に結合し結合ドメインとして作用するりガント受容体 にとって、同じ信号発展要素上の近くの非相補性結合ドメインに生じている結合 結果によって影響されることな（その標的リカンド、リガンド類似体又はリガン ド類似構造物に結合できなければならない。リガンド受容体は標的リガンド、リ ガンド類似体又はリガンド類似構成物と同様の大きさか、又はより大であるべき である。これがその場合でないと、同じ標的リガンドについてのリガンド受容体 は、互いに結合して、リガンド受容体の集合体産生じ、次いでそれは信号発展要 素と結合して結合ドメインを産生ずる。本発明において好ましいリガンド受容体 は、抗体である。好ましい信号発展要素は、色素を含んでいるポリマー、色素を 含んでいるラテックス粒子、色素を含んでいるリポソーム及び金属ゾルを含む。

特に好ましい信号発展要素はコロイド金である。特に好ましいのはコロイド全土 の吸着前、異なるモノクローナル抗体を違いに混合することにより形成する接合 体である。信号発展要素に結合されるリガンド受容体及び他の蛋白又はポリマー の最良混合物は検定の特別の目的に依存し、経験的に決定される。

本発明のある不均質競合的検定方法では、反応混合物は、試料、信号発展要素に 結合した少なくとも二つの異なる結合ドメインを含む接合体、容具なる結合ドメ インは標的リカンドについてのリガンド受容体に結合しうる、及び固相上の不連 続帯に固定されているリガンド受容体、晶帯は標的リガンドに特異的である、を 接触させることにより形成する。反応混合物は、リガンド受容体帯に結合した接 合体の量が試料中の標的リガンドの濃度に関連するまでインキュベートする。

別法として、試料を固相と接触させ、次いで接合体を固相と接触させる。未結合 接合体は、信号発展要素との接触前に固相から洗浄除去するか、又は例えば米国 特許第４．２３３．４０２号及び第７．３９１．９０４号に記載される方法を適 用して洗浄することなく信号を発達させうる。固定化リガンド受容体の各不連続 帯で発達した信号は、当業者によく知られた較正方法によりその個々の標的リガ ンドの濃度と関連づける。固定化リガンド受容体の不連続帯が十分な距離で空間 に分けられていなければならないことに注意することが重要で、これにより接合 体の一地帯への結合は、隣接地帯での競合反応に利用しつる接合体の濃度を使い 切らない。リガンド受容体帯が表面で固定化された面相、例えば多孔性膜がこの 理由から好ましい。

本発明の他の不均質競合的検定方法では、反応混合物は、試料、各標的リガンド にいての可溶性リガンド受容体、及び信号発展要素に結合した少なくとも二つの 異なる結合ドメイン、容具なる結合ドメインは標的リガンドについてのリガンド 受容体に結合しうる、を接触させることにより形成する。反応混合物を、リガン ド受容体に結合しない結合ドメインの量が試料中の標的リガンドの量に関連する までインキュベートする。次いで反応混合物を固定化リガンド受容体の不連続帯 を含んでいる固相と接触させる、各地帯は標的リカンドに特異的である。リガン ド受容体により結合しない接合体上の結合ドメインは、固相上のそれらの各地帯 に結合しうる。未結合接合体は、信号発展相との接触前に固相から洗浄除去する か、又は例えば米国特許第４．２３３．４０２号及び第４．３９１．、９０４号 に記載された方法を適用して洗浄することなく信号を発展させつる。固定化リガ ンド受容体の各不連続帯で発展した信号は、当業者にらく知られた較正方法によ りその各標的リガンドの濃度に関連させる。本発明の接合体は、検定方法でリガ ンド類似接合体の代りに用いると、例えば米国特許第４．６３２．９０１号、第 ４．７２７．０１９号、第４．９５９．３０７号、第４．９６３．４６８号及び ヨーロッパ特許出願９０３００２８３．０に記載されるような装置と共に、試料 中の多重標的リガンドの同時検定を実質的に改良する。好ましい検定方法は多孔 質要素上の不連続帯、各地帯は標的リガンドに特異的である、に固定された受容 体を含む固相を用いる。特に好ましい検定方法は、固定化リガンド類似抗体を含 んでいる不連続帯を伴う固相、例えば１９９０年９月１４日に受理された継続中 の米国特許出願番号第５８３．０４６号に記載されるものを用いる。

本発明の幾つかの不均質競合的検定方法では、反応混合物は、試料、信号発展要 素に結合した少なくとも二つの異なる結合ドメインを含んでいる接合体、容具な る結合ドメインは、その標的リガンドに結合可能な少な（とも一つのりガント受 容体を含む、及び固相上の不連続帯に固定化されるリガンド類似体、各地帯は標 的リガンドに特異的である、を接触させることにより形成する。反応混合物を、 リガンド類似体地帯に結合した接合体の量が試料中の標的リガンドの濃度と関連 するまでインキュベートする。別法として、試料を固相と接触させ、次いで接合 体を固相と接触させる。未結合接合体は、信号発展相との接触前に固相から洗浄 除去するか、又は例えば米国特許第４．２３３．４０２号及び第４．３９１．９ ０４号に記載される方法を適用じて洗浄することな（信号を発展させうる。固定 化リガンド類似体の各不連続帯に発展した信号は、当業者によく知られた較正方 法によりその各標的リガンドの濃度に関連させる。固定化リガンド類似体の不連 続帯は十分な間隔で空間に分離していなければならず、それにより一地帯への接 合体の結合は近接帯での競合反応に用いうる接合体の１度を使用しつくさないこ と注目するが重要である。リガント類似体地帯が表面上に固定化される固相、例 えば多孔質膜がこの理由から好ましい。

本発明の他の不均質競合的検定方法では、反応混合物は、試料、各標的リガンド についてのりカント類似体構造物、及び信号発展要素に結合した少なくとも二つ の異なる結合ドメイン、各結合ドメインはその標的リガンドに結合可能な少なく とも一つのリガント受容体を含む、を接触させることにより形成する。反応混合 物は、リガンド類似体構造物に結合しない結合ドメインの量が試料中の標的リガ ンドの量に関連するまでインキュベートする。次いで混合物を固定化リガンド類 似体の不連続帯を含んでいる固相と接触させる。各地帯は標的リガンドに特異的 である。リガンド類似体構造物により結合されない、接合体上の結合ドメインは 、固相上のそれらの各地帯に結合することができる。未結合接合体は、信号発展 相との接触前に固相から洗浄除去するか、又は例えば米国特許第４．２３３．４ ０２号及び第４．３９１．９０４号に記載された方法を適用して洗浄することな （信号を発展させつる。固定化リガンド類似体の各不連続帯で発展した信号は、 当業者によく知られた較正方法によりその各標的リガンドの濃度に関連させる。

本発明の接合体は、検定方法でのりガント受容体接合体の混合物の代りに用いる と、例えば米国特許第４．６３２．９０１号、第４．７２７．０１９号、第４． ９５９．３０７号、第４．９６３．４６８号及びヨーロッパ特許出願９０３００ ２８３．０に記載されるような装置と共に、試料中の多重標的リガンドの同時検 定を実質的に改良する。好ましい検定方法は、多孔質要素上の不連続帯に固定化 されたリガンド類似体を含む固相を用い、各地帯は標的リガンドの一つに特異的 である。

本発明の不均質非競合的検定方法に於ては、試料を、各標的リガンドに特異的な 不連続帯に固定化されたりガント受容体を含む固相と接触させる。次いで固相は 本発明の接合体と接触させることができる。接合体は、信号発展要素に結合した 少なくとも二つの異なる結合ドメインを含み、容具なる結合ドメインはその標的 リガンドに結合可能な少なくとも一つのリガンド受容体を含む。別法として、試 料は、接合体と次いて固相と接触させることができる。不均質非競合的検定方法 の実施に好ましい方法及び装置は、米国特許第４．７２７．０１９号に記載され る。本発明の接合体は、そのような検定方法でリガンド受容体接合体の混合物の 代りに用いると、試料中の多重標的リガンドを同時に検定する能力を実質的に改 良する。

不均質検定に於いては、検定試薬と標的リガンドの相互作用により産生ずる応答 に加えて情報を供給するため検定に内部較正及び制御機能を含むことがしばしば 有利である。そのような一つの機能は付加検定による較正をすることなく標的リ ガンド濃度の定性又は定量を可能にする内部基準を与えることである。そのよう な方法は米国特許第４．８４９．３３８号及びヨーロッパ特許出願８７３０２４ ０３．８及び９０３００２８３０に記載される。このような方法は、標的リガン ドのリガンド類似体以外のりガントを信号発展要素と結合することにより実施で きる。そのようなリガンドの分子構造物への、次いで信号発展要素への結合によ り、これらのりガントについての結合ドメインを産生てきる。一つの結合ドメイ ンが標的リガンドの検定に用いられ、他の結合ドメインが例えば検定の内部較正 用集団として用いられる二つの異なる結合ドメインを含む接合体は、二つの結合 ドメインが互いに影響されることな（独立して最適化できるので、先行技術を越 える実質的改良である。標的リガントの検定用の結合ドメイン及び内部基準又は 制御機能用の結合ドメインを有する接合体は、たとえ検定が単一標的リガントを 計画したとしても、本発明の一部をなすと考えられる。

本発明は試料中の多重標的リガンドの検定に用いられる接合体を記載する。試料 中のすべての標的リガントの検定に必要な全ての結合ドメインを含む単一接合体 を構築することが可能であるが、実際的考慮が、標的リガンドのある種の組合せ 又はパネルの検定に用いられる接合体の構築を一般に助けるであろう。そのよう な接合体は、さらに、試料中の標的リガントのそのようなパネルのいかなる組合 せの検定にも組合せできる。

多重標的リガンドの検定も、信号発展要素上のある結合ドメインはりガント類を 含み、ある結合ドメインはりカント受容体を含む、結合ドメインの組合せを含む 接合体を用い実施できる。そのような検定では、一つの標的リガンドは不均質競 合的検定方法で検出てき、他の標的リガンドは不均質非競合的検定方法で検出で きる。信号発展要素上の本明細書に記載される異なる結合ドメインと本明細書に 記載される方法の組合わせである不均質検定方法の組合わせは、本発明の範囲内 にある。

実施例１ 試料中アンフェタミンおよびモルフインの試薬および同時検定アセチルチオプロ ピオン酸の合成 テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、７００ｍ１）中３−メルカプトプロピオン酸（７ ｍｌ、０．０８モル）およびイミダゾール（５，４ｇ、　０．０８モル）の撹拌 溶液にアルゴン下、ＴＨＦ　（１００ｍｌ）中１−アセチルイミダゾール（９， ６ｇ、　０．０８７モル）の溶液を１５分にわたって滴下して加えた。その溶液 はＴＨＦを真空下で除いた後見に３時間室温で撹拌した。残留物を氷冷水（１８ ｍｌ）で処理し、生じた溶液を水冷濃ＨＣＩ　（１４，５ｍ１）で酸性化してｐ Ｈを１．５−２にした。混合物を水で抽出（２Ｘ５０ｍｌ）Ｌ、硫酸マグネシウ ムで乾燥後蒸発させた。残った黄色油状固体の粗生成物（１０，５ｇ）をクロロ ホルム−ヘキサンから再結晶し、融点４４−４５℃の白色固体としてアセチルチ オプロピオン酸４．８ｇ　（収率４１％）を得た。

３−０−カルボキシメチルモルフイン塩酸塩の合成モルフインサルフェート（１ ，６７ｇ１５ｘｌＯ−３モル）を炭酸カリウム（２゜０７ｇ、１．５Ｘ１０−２ ）と共に８０ｍ１エタノールに溶解した。その溶液を撹拌しながら加熱還流し、 ２ｍｌエタノール中にブロモ酢酸（０，７ｇ、５　Ｘ　１０−３モル）を含有す る溶液を加えた。これを２時間還流し、次にフラスコを氷水浴で冷却した。１２ Ｎ塩酸を用いてｐＨを３に調節し、沈澱を濾過した。溶媒は真空下で蒸発させて 、１０ｎｌエタノールを残留物に加えた。沈澱を濾過し、溶媒を真空下で蒸発さ せた。残留物を水／アセトン（１０：９０）から再結晶した。生成物的３００ｍ ｇを回収した。

３−０−［２−（２−アミノ−４−チアノブタン酸チオラクトン）−アセトアミ ド］−モルフイン塩酸塩（モルフイン−ＨＣＴＬ）の合成ホモシスティンチオラ クトン塩酸塩（０，１２ｇ、　７．８ｘ　１０”モル）、（０゜６２ｇ、７．８ ｘｌＯ−４モル）ピリジンおよび（０，２９６ｇ、７．８ｘｌＯ−’モル）３− ０−カルボキシメチルモルフイン塩酸塩を５■ｌジメチルホルムアミドに溶解し た。続いてジシクロへキシルカル系ジイミド（０，１７７ｇ、８゜６Ｘ１０−’ モル）を含有するジメチルホルムアミド溶液１ｍｌを加えた。フラスコをアルゴ ンで一掃し、溶液を２５℃で３時間撹拌した。溶媒を真空下で除き、水２０１１ を残留物に加えた。溶液を５分間撹拌し、続いて不溶性ジシクロヘキシル尿素を 濾過した。濾液を塩化メチレン１０■１で洗浄した。飽和炭酸カリウム水溶液で 水層のｐＨを７に調節した。水溶液を塩化メチレン１０ｍ１で６回抽出した。集 め合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム２ｇで乾燥し、濾過後溶媒を真空下で 除いた。エタノール（２０ｍｌ）を残留物に加え、真空下で蒸発してピリジンを 除いた。酢酸エチル（１０＋ｍｌ）を加え、不溶性沈澱を濾過した。エーテル性 塩酸（ＩＭ）をｐＨ試験紙が赤になるまで撹拌しながら溶液に加えた。白色固体 を濾過し、酢酸エチルで洗浄した。生成物を真空下で乾燥し、その収量は３１６ ｍｇであった。

ｐ−ニトロアンフェタミン塩酸塩の合成ｄ−アンフェタミンサルフェート（１０ ｇ、２．７Ｘ１０−２モル）を硫酸（５ｍｌ）に溶解し、その溶液を氷水浴で冷 却した。発煙硝酸（４，６ｍ１）を反応溶液に滴下して加えた。反応混合物を氷 水浴上で１時間撹拌した後、氷水に注いだ。水酸化ナトリウム（ＩＯＮ）を加え て、溶液のｐＨを１２に調節した。混合物をジエチルエーテル（２Ｘ１００ｍｌ ）で抽出し、集め合わせた有機層を水洗（２Ｘ１００ｍｌ）後、無水硫酸マグネ シウムで乾燥した。乾燥剤を濾過して除き、ＩＮエーテル性塩酸を加えて塩酸塩 を形成させた。溶媒は真空下で除いた。アセトン（２０（１ｍｌ）を白色残留物 に加え、懸濁液を室温で２時間撹拌した。次に懸濁液を濾過し、得られる白色沈 澱をエタノール／アセトンから再結晶して、融点１９１−１９２℃の白色結晶質 固体としてｐ−ニトロアンフェタミン塩酸塩３．５ｇ　（６０％）を得た。

ｐ−アミノアンフエタミンニ塩酸塩の合成ｐ−ニトロアンフェタミン塩酸塩（３ ，５ｇ、１．６Ｘ１０”モル）をメタノール２００ａ＋１に溶解し、続いて１０ ％パラジウム−炭（１，０ｇ）およびギ酸アンモニウム（７，０ｇ）を加えた。

反応混合物を室温で２時間撹拌した。触媒は濾過して除き、溶媒は真空下で蒸発 させた。部分的に結晶性の残留物を水２０ｍ１に溶解し、水酸化カリウムペレッ トを加えて溶液をｐＨ１２に調節した。その溶液を次に塩化メチレンで抽出（３ Ｘ６０ａ＋１）　し、集め合わせた有機層を水洗（ＩＸ５０ｍｌ）後、無水硫酸 マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾過して除き、ＩＮエーテル性塩酸を加えて 塩酸塩を形成させた。溶媒を真空下で除き、融点２２５−２４０℃の白色結晶性 固体としてｐ−アミノアンフェタミンニ塩酸塩２．０ｇ（５６％）を得た。

ｐ−アセチルチオプロピオンアミドアンフェタミン塩酸塩（アンフェタミン−Ａ ＴＰ）の合成 ｐ−アミノアンフエタミンニ塩酸塩（２，Ｏｇ、　９　Ｘ　１０−”モル）を無 水ジメチルホルムアミド（８８ｍｌ）に溶解した。アセチルチオプロピオン酸（ １，５ｇ、　１゜Ｏｘ　１０−”モ／ｌ／）を加え、続イテ無水ビ’）　シン（ ２，４ｍｌネ２．　９７　Ｘ　１０−”モル）および１−（３−ジメチルアミノ プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１，９ｇ、１．Ｏｘｌ’Ｏ−２ モル）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を真空下で除いた。

残留物を水に溶解し、塩化メチレン（３Ｘ　５　（１＋１）で洗浄後、続いて０ ．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７（１００ｏ＋１）を加えた。その水溶液を再び塩 化メチレン（３Ｘ　５０ｍ１）で洗浄した。溶媒は、真空下で除いた。

エタノール（２Ｘ　５０ｍ１）を加え、真空下で除いて残留水を共沸除去した。

暗黄色の残留物を塩化メチレン（３Ｘ　５０ｍ１）と共に粉砕した。活性炭を集 め合わせた塩化メチレン溶液に加え、室温で３０分間撹拌した。その炭素を濾過 して除き、溶媒は真空下で蒸発させた。その濃厚油状物を塩化メチレンに再び溶 解し、ＩＮエーテル性塩酸で酸性化した。塩化メチレン／ジエチルエーテル溶液 をデカンテーションして除き、残査を真空下で乾燥して、オレンジ色の結晶性固 体として標記化合物１．２ｇを得た。

キーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に付着した抗体スクリーニングアッセ イ用リガンド類似体の調製 上記リガンド類似体、アンフェタミン−ＡＴＰおよびモルフイン−ＨＣＴＬの蛋 白への付着は、加水分解によって産生じた遊離チオール形のリガンド類似体をス クシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）フクロヘキサン−１−カルボキン レート（ＳＭＣＣ，ビエルソエ・ケミカル・カンパ＝　−（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

））による蛋白の誘導化の産物である反応性マレイミドを含有する蛋白に反応さ せることにより達成される。遊離チオール形のリガンド類似体は、一般にマレイ ミド−蛋白よりも実質的に過剰モルで反応させ、反応性マレイミドの全部がリガ ンド類似体に結合するようにした。遊離チオール形のアンフェタミン−ＡＴＰリ ガンド類似体はアンフェタミン−ＡＴＰをメタノール８０％／水２０％中０．１ ２Ｍ炭酸カリウムに溶解することで産生した。室温で５分後、チオール濃度をエ ルマン（Ｅｌｍａｎ）の方法（アルカイック・バイオケミストリー・アンド・バ イオフィジックス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）、８ ２巻、７０頁（１９５９年））によりＤＴＮＢとの反応で決定した。ｉ１離チオ ール形のモルフイン−ＨＣＴＬを、５．７ｍｌのジメチルホルムアミド７０％／ 水３０％に溶解することにより産生させ、ＩＮ水酸化カリウム１．４３ｍ１を加 えた。５分後、チオール濃度をＤＴＮＢとの反応で決定した。遊離チオール形の リガンド類似体をカップリングのためにマレイミド−蛋白に加えた場合、必要に 応じてｐＨを７に調節した。

ＫＬＨ（１４ｍｇ／ｍｌの５ｍ１）はスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイ ミドメチル）フクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ） １５ｍｇを加え、室温で１時間以上撹拌しながらＩＮ水酸化カリウムでｐＨを７ と７゜５の間に維持することにより、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣと反応させた。０， １Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、および０．１．５Ｍ塩化ナト リウム、ｐＨ７でのゲル濾過クロマトグラフィーにより蛋白を未反応のＳＵＬＦ Ｏ−ＳＭＣＣから分離し、ＫＬＨ−マレイミド２４ｍ１を３　、１　ｍｇ／ｍｌ の濃度で集めた。遊離チオール形のリガンド類似体をＫＬＨ−マレイミドに過剰 に加えて事実上全てのマレイミドと反応させ、その溶液を４℃で４時間撹拌し、 次に標準技術を用いるマウスの免疫処置の前に、３容量のパイロジエンを含まな いリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４で透析した。

ＢＳＡ　（２０ｍｇ／ｍｌの３．５ｍ１）Ｉ；！、アセトニｈ　’Ｊ　／Ｉ１０ ．３ｍｌ中ＳＭＣＣ６，７ｍｇの溶液を加え、ＩＮ水酸化カリウムでｐＨを７と ７．５の間に維持しながら室温で１時間溶液を撹拌することにより、ＳＭＣＣと 反応させた。Ｏ，１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、および０． １５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７でのメチル濾過クロマトグラフィーにより蛋白を 未反応物質がら分離した。遊離チオール形のリガンド類似体を過剰にＢＳＡ−マ レイミドに加え、その溶液を４℃で４時間撹拌した。溶液は、標準技術によりリ ガンド類似体に結合する抗体を検出するためのミクロタイタープレートを覆うの に用いた。

ＡＰ　（１０，９ｍｇ／ｍ１（７）１．５ｍ１．）　ハ、ＳＵＬＦＯ−３ＭＣＣ ３，Ｉｇを溶液に加え、１Ｍ水酸化カリウムを用いてｐＨを７と７．５の間に維 持しながら室温で１時間溶液を撹拌することにより、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣと反 応させた。０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、および０．１ ５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７でのケル濾過クロマトグラフィーにより蛋白を未反 応物質から分離した。

遊離チオール形のリガンド類似体をＡＰ−マレイミド（３，５６１ｇ／ｍｌ”？ ’０．２ｍ１）に加えてＡＰ−マレイミド１モルにつき薬剤１０モルを加えるよ うにし、その溶液を４℃で１．５時間撹拌した。０．１Ｍリン酸カリウム、０． ０２Ｍホウ酸カリウム、および０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７でのゲル濾過 クロマトグラフィーにより蛋白を未反応物質から分離し、リガンド類似接合体は 希釈して検定に使用した。

マウスＩｇＧのＦｃフラグメントに対するラテックス固定化アフィニティー精製 ヤギＩｇＧ抗体の調製 アフィニティー精製ヤギ抗マウスＦｃ（バイオスバシフィク（ＢｉｏｓＰａｃｉ ｆｉｃ））およびポリスチレンラテックス粒子（硫酸化、１．０７μＩｎ）　（ インターフェイシャル・ダイナミックス（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍ ｉｃｓ））を４５℃で１時間、別々にインキュベートシ、抗体溶液をｐＨ５，５ で０．１Ｍ２−　（Ｎ〜モルホリノ）エタンスルホン酸で緩衝した。抗体溶液を 渦状に混ぜながら、抗体の最終濃度かり３ｍｇ／ｍｌで溶液がラテックス固体を １％含むようにラテックス粒子の懸濁液を抗体溶液に加えた。懸濁液を４５℃で ２時間インキュベートした後、懸濁液を遠心し、ラテックス粒子をペレットにし た。ラテックスペレットをリン酸緩衝食塩水中１％ウシ血清アルブミンに再び懸 濁し、室温で１時間インキュベートした。遠心によりラテックスをペレットとし た後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、更に遠心分離することにより３回洗浄した 。最終的に得られたペレットを１％固体のラテックス濃度に、ホウ酸緩衝食塩水 、０．１％アジ化ナトリウム、ｐｎｓ、ｏで再懸濁した。

このラテックス製剤の１％懸濁液はモノクローナル抗体４０μｇ／ｍｌを結合す る能力があった。

モノクローナル抗体の製造および１次選択Ｂａ１ｂ／ｃマウスの免疫処置をリウ 　ディー、（ＬＩＬｌ、Ｄ、）　、パーセル　アール。

（Ｐｕｒｓｓｅｌｌ、　Ｒ，）およびレヴイー　ジエイ、ジー、（Ｌｅｖｙ、　 Ｊ、　Ｇ、　）　、クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ　Ｃｈｅｗ）　、２５ 巻、５２７−５３８頁（１９８７年）の方法に従い行った。

Ｓ　Ｐ　２／　０−Ａｇ１４骨髄腫瘍細胞と膵臓細胞の融合、ハイブリドーマの 増殖およびクローニングは標準技術に従い行った。更なるクローニングのための ハイブリドーマの選択を９６ウ工ル段階（９６−ｗｅｌｌ　ｓｔａｇｅ）で培養 上清を用いて始めた。標準エリザ（ＥＬＩＳ＾）法をエリザプレートに吸着した ＢＳＡに付着したモルフインまたはアンフェタミンリガンド類似体のどちらかで 行った。典型的な例では、２０プレートで融合が見られたのは１つだけで、プレ ート当たり約１０−２０ウエルがエリザアッセイで陽性であった。この段階で、 連結部（ｌｉｎｋｉｎｇ　ａｒ＋ｅ）のＳＭＣＣ部位に対する抗体を後の考察か ら除去するのであれば、第２次選択を行うことができる。ＳＭＣＣにより誘導さ れたりガント類似体と結合しないＢＳＡを用いるエリザアッセイは、ＢＳＡに結 合したリガンド類似体を結合した陽性クローンのどれがＳＭＣＣ−ＢＳＡに実際 に結合しているかを同定した。得られた抗体の特別な目的次第で、ＳＭＣＣ−Ｂ ＳＡに特異的な抗体をこの段階で取り除くことができる。

標的リガンドに結合する抗体を更に選択するための検定エリザアッセイによって 同定される抗体を以下の検定法を用いて更にスクリーニングする。抗体希釈液２ ５μｍ、希釈液または標的リガンド基準または交差反応種２５μｌおよびアルカ リホスファターゼに接合したリガンド類似体２５μｌを含有する反応混合物を室 温で２０分間、■底ミクロタイタープレート中でインキュベートした。ラテック スに吸着しているヤギー抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）の１％懸濁液の２５μｍ 容量を各反応混合物に加え、更に１０分インキュベートした。

次に反応混合物を３００Ｏｒｐｍ（１５００ｇ）でスイングローター内で遠心分 離にかけた。各ウェルからの上清２５ｐ１容量を酵素活性について検定した。高 アフィニティー抗体が、事実上全ての免疫反応性接合体を結合するのに必要な量 よりも実質的に過剰であるウェルでの酵素活性測定により、結合可能なリガンド 類似体を含有しない酵素と結合した酵素活性を測定した。この上清の活性の非− 免疫反応性フラクションは、測られた活性から除いて免疫反応性フラクションと 結合した活性を測定した。最初に、約１ｎＭのりガント類似接合体を用いる一方 、反応混合物中の抗体濃度を約１００１Ｍから１％Ｍ以下の範囲で抗体を連続的 に希釈することにより、高アフィニティー抗体をこの検定で選択した。遊離免疫 反応性接合体酵素活性は、上清を検定することにより測定し、結合免疫反応性接 合体酵素活性は、総免疫反応性接合体酵素活性から遊離免疫反応性活性を控除す ることにより測定した。これらの条件下で、抗体が接合体に対し過剰であるとき 、１０以上の結合／遊離酵素活性比率を示す抗体を高アフィニティー抗体と考え 、本発明においては特に好ましいものである。このような検定における標的リガ ンド濃度の関数として結合／遊離の比率を測定することにより、標準曲線を発展 させ、標的リガンド以外のリガンドにより抗体交差反応性を測定した。本発明で は試料中の多重リガンドの検定に、標的リガンドに対する高いアフィニティーお よび検定計画目標内にある交差反応性をもつ抗体を使用した。

ＳＭＣＣ−ウシ血清アルブミン１０／１　（ＳＭＣＣ−ＢＳＡＩＯ／１）の調製 アセトニトリル０．８７＋ａｌ中ＳＭＣＣ（１７，５雇ｇ、５．２Ｘ１０−’モ ル）を０゜１Ｍリン酸カリウム、Ｏ，１Ｍホウ酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナト リウム、ｐＨ７，５中ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ　（３５０功ｇ、５．２ｘｌ Ｏ−６モル）１７．５ｍｌに加えた。その溶液を室温で１時間撹拌し、ＩＮ水酸 化カリウムを加えることにより、ｐＨを７−７．５に維持した。蛋白溶液を０． １Ｍリン酸カリウム、０゜０２Ｍ２Ｍホウ酸カリウム、　１５Ｍ塩化ナトリウム 、ｐＨ７で平衡にしたＧＨ２５樹脂（アミ：ｌン−：）−ポレーション（八ｍ１ ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　））を含有する２、５ｃｍＸ２５ｃｍのカラムにかけた。

１０．５ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ−ＢＳＡを３Ｑｍｌ集める。蛋白を概算したマレ イミド基よりわずかに過剰なメルカプトエタノールと反応させ、ＤＴＮＢにより 未反応のメルカプトエタノールを測定することによるマレイミド基に対するＳＭ ＣＣ−ＢＳＡの分析から、平均７マレイミド基が各ＢＳＡに結合することを示し た。蛋白溶液を一７０℃で凍結した。

ＳＭＣＣ−ウシ血清アルブミン１５／１　（ＳＭＣＣ−ＢＳＡ１５／１）の調製 アセトニトリル２．４６１ｎｌ中ＳＭＣＣ（４９，２ｍｇ、１．５Ｘ１０−’モ ル）を２つに分け、１０分間隔で０．１Ｍリン酸カリウム、０．１Ｍホウ酸カリ ウム、０゜１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７，５中ウソ血清アルブミン、ＢＳＡ　 （６００ｍｇ。

９Ｘ１０−’モル）３Ｑｍｌに加えた。その溶液を室温で１時間撹拌した。蛋白 溶液を０．１Ｍリン酸力ＩＪ”７ム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、０．１５Ｍ塩 化ナトリウム、ｐＨ７に対し分子量２０００で切断されたパイロサート（ＰＹＲ Ｏ９ＡＲＴ）超濾過モジュール（サートリアス、ゲッティンゲン（Ｓａｒｔｏｒ ｉｏｕｓ、　Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）で透析した。

５ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣ−ＢＳＡを８３ｍ１集める。蛋白を概算したマレイミド 基よりわずかに過剰なメルカプトエタノールと反応させ、ＤＴＮＢにより未反応 のメルカプトエタノールを測定することによるマレイミド基に対するＳＭＣＣ− ＢＳＡの分析から、平均９マレイミド基力洛ＢＳＡに結合することを示した。蛋 白溶液を一７０℃で凍結した。

ＳＭＣＣ−ウシ血清アルブミン５０／１　（ＳＭＣＣ−ＢＳＡ５０／１）の調製 アセトニトリル０．３７ｍ１中ＳＭＣＣ（７，５ｍｇ、２．２Ｘ１０−’モル） を０．１Ｍリン酸力ｉ功ム、０．１Ｍホウ酸内カリウム０．１５Ｍ塩化ナトｌ功 ム、ｐＨ８゜０中ウソ血清アルブミン、ＢＳＡ　（３０ｍｇ、４．５ｘｌＯ”モ ル）２ｍｌに加えた。

その溶液を室温で１時間撹拌した。蛋白溶液を０．１Ｍリン酸カリウム、０．０ ２Ｍ２Ｍホウ酸カリウム、１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡にしたＧＨ２５ 樹脂（アミコン・コーポレーション（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃａｒｐ、　））を含有す る１ｃ＋＋＋ｘ２５ｃ、のカラムにかけた。５　、２３　ｍｇ／ａｌのＳＭＣＣ −ＢＳＡを５．２ｍｌ集める。蛋白を概算したマレイミド基よりわずかに過剰な メルカプトエタノールと反応させ、ＤＴＮＨにより未反応のメルカプトエタノー ルを測定することによるマレイミド基に対するＳＭＣＣ−ＢＳＡの分析から、平 均３０マレイミド基が各ＢＳＡに結合することを示した。蛋白溶液を一７０℃で 凍結した。

ＨＣＴＬＡＭ−ＢＳＡクロストーク（Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）阻害剤の調製Ｎ−ア セチルホモシスティンチオラクトンのチオールエステル（アルドリッチ・ケミカ ル・カンパニー、セント・ルイス、ミズーリ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、　、Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）８１０ｍｇ、　６．２８Ｘ１０−５モル）をジエチルホルム アミド７０％／水３０％１．２６ｍ１中でその化合物を溶解し、ＩＯＮ水酸化カ リウム０．０３２＋１を加えることにより加水分解した。遊離チオール（０，１ ４ｍ１中７．０＃モル）をＳＭＣＣ−ＢＳＡ（５０：　１．１ｍｌ中５．２ｍｇ ）に加え、室温で４時間反応させた。

その蛋白溶液を０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍ２Ｍホウ酸カリウム、　１ ５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡にしたセルファイン（ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ） 　Ｇ　Ｈ２５樹脂（アミコン・コーポレーション（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　 ））を含有する１ｃｍＸ　１２ｃｍのカラムにかけ、蛋白から未反応物質を分離 した。ＨＣＴＬＡＭ−ＢＳＡ生成物を４℃で貯蔵した。

ＢＳＡ−アンフェタミンの調製 アンフェタミン−ＡＴＰ　（０，０９５ｇ、３Ｘ１０−’モル、例１２）を８０ ％メタノール／２０％水中　０．１２Ｍ炭酸カルシウムの５０ｉ１に溶解した。

室温で５分後、チオール濃度をＤＴＮＢとの反応により測定し２５ａＭとした。

アンフェタミンチオール（７，６ｍｌ、１．９Ｘ１０−’モル）を撹拌しながら ２０．３ｍ１（０，４ｇ、５．９ｘｌＯ−’モル）のＳＭＣＣ−ＢＳＡに加えた 。溶液のｐＨをＩＮ塩酸で７に調節した。コンテナーをアルゴンで清浄にし、溶 液を室温で２時間撹拌した。次いで接合体溶液を１０ｍＭ（２−（Ｎ−モルホリ ノ）エタンスルホン酸、ｐＨ５，７７に対しパイロサートモジュールで透析し、 １００ｍ１の３．５７ｉｇ／■ＩＢｓＡ−アンフェタミンを収集した。蛋白溶液 を一７０℃で凍結した。

ＢＳＡ−モルフインの調製 モルフイン−ＨＣＴＬ　（０，０６８ｇ、１．３Ｘ１０”モル、例９）を５．７ １＋＋１の７０％ジメチルホルムアミド／３０％水に溶解し、１．４３ｍ１　Ｉ Ｎ水酸化カリウムを加えた。５分後、チオール濃度をＤＴＮＢとの反応により測 定し１６゜９ｍＭとした。モルフインチオール（６，４吐　１．ｌＸ１０−’モ ル）を撹拌しながら２６．７ｍ１５ＭＣＣ−Ｂ５Ａ１１５／ｌ（０，１６ｇ、２ ．４Ｘ１０−’モル）ｌこ加えた。コンテナーをアルゴンで清浄にし、溶液を室 温で２時間撹拌した。次いで蛋白溶液を１０ｍＭ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタ ンスルホン酸、ｐＨ５，７７に対してパイロサートモジュールを用い透析し、２ ９．５１１の５．３９ｍｇ／ｍｌＢ　ＳＡ−モルフインを収集した。蛋白溶液を 一７０℃で凍結した。

コロイド金接合体の調製 脱イオン水に塩化金三水和物を溶解しく０．７リツトル中１．３６ｇＬ溶液を０ ．２μフイルターに濾過することによりコロイド金を先ず調製した。濾液を加熱 用マントルを備えた丸底フラスコに加え、溶液を８５℃まで加熱した。クエン酸 ナトリウムの溶液（６，３５脱イオン水中２．５４　ｇ）を撹拌しながら加えて 、溶液を０．７リツトルの脱イオン水で、室温で希釈する前に、８５℃で１２分 間保持した。コロイド金への蛋白の吸着の直前に、１容量の０．２Ｍ　（２−（ Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　、ｐＨ５，７７を１９容量のコ ロイド金に加えて混合した。

ＢＳＡ及びＢＳＡに結合したりガント類似体の混合物をコロイド金に吸着させて 以下の操作により接合体を形成した。ＢＳＡ、ＢＳＡ−アンフェタミン及びＢＳ Ａ−モルフインの混合物を、混合物中の全蛋白の１０％を示すＢＳＡ−アンフェ タミンと２０％を示すＢＳＡ−モルフインにより、１０ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ５， ７７中５ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度に調製した。各蛋白混合物の１容量を各調製液中 コロイド金溶液の１９容量と混合した。調製液を室温で３０分間放置した。接合 体を４０゜０００ｇで２０分間２２℃で遠心に付し、接合体をペレットとした。

上清を除去し、ペレットを初め容量に等しい一容量の５０ｍＭリン酸カリウム、 １０１Ｍホウ酸、ｐＨ７，０でそれを再び懸濁し、記載したように遠心に付すこ とにより２回洗浄した。最終遠心後、ペレットの軟らかい部分を約１５膳１の緩 衝液に再び懸濁し、４℃に保持した。５４０ｎｍでの吸収は、１０％アンフェタ ミン／２０％モルフイン接合体に関する１６４であった。５４０ｎ鵬での吸収を 検定に用いた接合体の濃度を確認するのに用いた。

アンフェタミン及びモルフインの検定 アンフェタミン及びモルフインを同時検出する検定は、以下の試薬を組合せるこ とにより実施した＝１０μｍの０．５Ｍリン酸カリウム、０．１Ｍホウ酸カリウ ム、０、７５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ、　ｐ）（７（以下 「緩衝液」と称する）８０ａｌの尿試料、３μｍのコロイド金接合体、１４ａｌ の１．８５ｍｇ、／＋１でのＨＣＴＬＡＭ−ＢＳＡ、１．６μｍの二つのモノク ローナル抗体の混合物、１，１μｍの１４．２＋ａｇ／ｍｌでのモノクローナル 抗モルフイン及び０．５μｌの１１．７ｍｇ／ｍｌでのモノクローナル抗アンフ ェタミン。既知濃度のモルフイン及びアンフェタミンを含んでいる尿試料を、薬 物フリーの尿にアンフェタミンとモルフインを溶解することにより調製した。反 応混合物を渦動させ、各々をナイロン膜に適用し、その上でモノクローナル抗体 をアンフェタミン及びモルフインに結合させた（以下それぞれａｍｐｈ　Ａｂ及 びｍｏｒｐ　Ａと称する）。抗体を、２μｍの２ａ＋ｇ／Ｉ＋ｌ　ａｍｐｈ　Ａ ｂ及び２１１１の２０ｍｇ／ｍｌ　ｍｏｒｐ　Ａｂ、各々はｐＨ３，０緩衝液中 、を適用することにより、ナイロン膜の不連続帯に結合させた。固相抗体の親和 性は、本明細書で参考として引用する１９９０年９月１４日に受理された米国特 許出願番号５８３．０４６号に教授されるようなリガンドに関するよりもリガン ド類似接合体のリガンド類似体についてより大であった。膜を溝に切った表面に 接して置き、１９９０年３月１２日に受理された米国特許出願番号第５００．２ ９９号、ここに引用して明細書記載の一部とする、に記載されるような毛細管ネ ットワークを形成させた。膜を５０Ｉｌ１Ｍホウ酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナ トリウム及ヒ０．０２％（Ｖ／ｖ）　トリトンＸ−１００を含む溶液、ｐＨ８で 洗浄して未結合接合体を除去した。各不連続帯で膜に結合したコロイド金接合体 の色濃度をミノルタＣＲ２４１反射計で測定し、データをヒトの眼により認める ことができる最小色差の測定であるデルタＥ★の用語で表す。

一般に２．５のデルタＥ★値はヒトの眼に可視ではない。この単位のより完全な 記載は、ＤＢ、シュド及びＧ、ウィゼッキ、ジョーン・ウィリイ・アンド・ソン グによるカラー・イン・ビジネス、サイエンス・アンド・インダストリイに見る ことができる。

検定結果を表Ｉに示す。

表１ デルりΣ會　デルタ　Ｅ＊ ０　０　２．４　２．６ １００　０　０．６　０．５ ２００　０　１＋０　１．６ ６００　０　Ｂ、４　１．５ １０００　０　３０．１　４．３ １５００　０　３コ、０　４．２ ０　Ｚｏｏ　２．５　Ｌ３ ０　ユ５００　４．２　１５．４ 結果は、アンフェタミンとモルフインの検定が本発明にょ７て構築された接合体 を用いて実施できることを示す。各々の標的リガンドの検定は、非相補性結合ド メイン、リガンド受容体及び標的リガンドの存在によって実質的に影響されない 。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する接合体であっ て、該接合体は信号発展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、 該結合ドメインの各々は、他の結合ドメインについてのリガンド受容体の存在下 、該標的リガンドの一つについてのリガンド受容体と結合することが可能である 。
2. ２．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、該第二結合ドメインについてのリガンド受容体の存在下、該標的リガンド以外 のリガンドと結合することが可能であり、且つ該第二結合ドメインは、該リガン ドの存在下、該標的リガンドについてのリガンド受容体と結合することが可能で ある。
3. ３．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、該第二結合ドメインについての第二リガンド受容体の存在下、第一リガンド受 容体を結合することが可能であり、且つ、該第二結合ドメインは、該第一リガン ド受容体の存在下、該標的リガンドについての該第二リガンド受容体を結合する ことが可能である。
4. ４．少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する接合体であっ て、該接合体は、信号発展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み 、該結合ドメインの各々は、該他の結合ドメインに結合することが可能であるリ ガンド類似体の存在下、該標的リガンドの一つについてのリガンド類似体に結合 することが可能である。
5. ５．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、該第二結合ドメインに結合することか可能なリガンド類似体の存在下、該標的 リガンド以外のリガンドを結合することが可能であり、且つ該第二結合ドメイン は、該リガンドの存在下、該標的リガンドについての結合リガンド類似体を結合 することが可能である。
6. ６．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、該第二結合ドメインに結合することが可能なリガンド類似体の存在下、リガン ド受容体に結合することが可能であり、且つ該第二結合ドメインは、該リガンド についての該リガンド受容体の存在下、該標的リガンドについてのリガンド類似 体を結合することが可能である。
7. ７．少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する接合体であっ て、該接合体は、信号発展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み 、各結合ドメインは、他の標的リガンドの存在下、該標的リガンドの一つに結合 することが可能である。
8. ８．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、該標的リガンドの存在下、該標的リガンド以外のリガンドを結合することが可 能であり、且つ第二結合ドメインは、該リガンドの存在下、標的リガンドに結合 することが可能である。
9. ９．標的リガンドの存在又は量を検出する接合体であって、該接合体は、信号発 展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを含み、該第一結合ドメインは 、標的リガンドの存在下、リガンド受容体を結合することが可能であり、且つ第 二結合ドメインは、該リガンドについてのリガンド受容体の存在下、標的リガン ドを結合することが可能である。
10. １０．少なくとも二つの異なるリガンド受容体に結合する単一接合体と競合する ことが可能である少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する 検定法であって、該検定法は、 ａ．少なくとも二つの結合ドメインを提供すること、該第一結合ドメインは、該 第一標的リガンドに特異的な固相上の第一不連続帯に固定された第一リガンド受 容体を結合することが可能であり、且つ該第二結合ドメインは、該第二標的リガ ンドに特異的な該固相上の第二不連続帯に固定された第二リガンド受容体を結合 することが可能である、ｂ．該接合体、試料及び該固を接触させて反応混合物を 形成すること、ｃ．該第一不連続帯に結合した該接合体の量を該第一標的リガン ドの存在又は量と関連させること、そして該第二不連続帯に結合した該接合体の 量を該試料中の該第二標的リガンドの存在又は量と関連させること、を含む。
11. １１．少なくとも二つの異なるリガンド受容体に結合する単一接合体と競合する ことが可能である少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する 検定法であって、該検定法は、 ａ．少なくとも二つの結合ドメインを有する該接合体を提供すること、該第一結 合ドメインは、該第一標的リガンドについての第一リガンド受容体を結合するこ とが可能であり、又、該第二結合ドメインは、該第二標的リガンドについての第 二リガンド受容体を結合することが可能である、ｂ．試料中、接合体並びに該第 一及び第二リガンド受容体を接触させて反応混合物を形成すること、 ｃ．該反応混合物を、該第一結合ドメインと結合することが可能である、第一不 連続帯に固定された、リガンド受容体及び、該第二結合ドメインと結合すること が可能である、第二不連続帯に固定された、リガンド受容体を有する固相と接触 させること、 ｄ．該第一不連続帯に結合した該接合体の量を該第一標的リガンドの存在又は量 と関連させること、そして該第二不連続帯に結合した該接合体の量を該試料中の 該第二標的リガンドの存在又は量と関連させること、を含む。
12. １２．単一接合体に結合する少なくとも二つのリガンド類似体と競合することが 可能である少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する検定法 であって、該検定法は、 ａ．少なくとも二つの結合ドメインを有する該接合体を提供すること、該第一結 合ドメインは、該第一標的リガンドに特異的な固相上の第一不連続帯に固定され た第一リガンド類似体に結合することが可能であり、又、該第二結合ドメインは 、該第二標的リガンドに特異的な該固相上の第二不連続帯に固定された第二リガ ンド類似体に結合することが可能である、ｂ．該接合体、試料及び該固相を接触 させて反応混合物を形成すること、ｃ．該第一不連続帯に結合した該接合体の量 を、該第一標的リガンドの存在又は量と関連させること、そして該第二不運続帯 に結合した該接合体の量を該試料中の該第二標的リガンドの存在又は量と関連さ せること、を含む。
13. １３．単一接合体に結合する少なくとも二つのリガンド類似体と競合することが 可能な少なくとも二つの標的リガンドの存在又は量を同時に検出する検定法であ って、該検定法は、 ａ．少なくとも二つの結合ドメインを有する該接合体を提供すること、該第一結 合ドメインは、該第一標的リガンドについての第一リガンド類似体構造物と結合 することが可能であり、又、該第二結合ドメインは、該第二標的リガンドについ ての第二リガンド類似体構造物に結合することが可能である、 ｃ．試料中、接合体並びに該第一及び第二リガンド構造物を接触させて反応混合 物を形成すること、 ｄ．該第一不連続帯に結合した該接合体の量を該第一標的リガンドの存在又は量 と関連させること、そして、該第二不連続帯に結合した該接合体の量を該試料中 の該第二標的リガンドの存在又は量と関連させること、を含む。
14. １４．単一接合体に結合することが可能である少なくとも二つの標的リガンド、 及び少なくとも二つの異なるリガンド受容体、固相上の第一不連続帯に固定され た該第一リガンド受容体及び該固相上の第二不連続帯に固定された該第二リガン ド受容体、の存在又は量を同時に検出する検定法であって、該検定法は、ａ．信 号発展要素に結合した少なくとも二つの結合ドメインを有する該接合体を提供す ること、該第一結合ドメインは該第一標的リガンドに結合することが可能であり 、且つ、該第二結合ドメインは該第二標的リガンドに結合することが可能である 、 ｂ．該接合体と該固相を試料と接触させること、ｃ．該第一不連続帯に結合した 該接合体の量を該第一標的リガンドの存在又は量と関連させること、そして該第 二不連続帯に結合した該接合体の量を該試料中の該第二標的リガンドの存在又は 量と関連させること、を含む。