TR201816378T4 - Olanzapin haptenleri. - Google Patents

Olanzapin haptenleri. Download PDF

Info

Publication number
TR201816378T4
TR201816378T4 TR2018/16378T TR201816378T TR201816378T4 TR 201816378 T4 TR201816378 T4 TR 201816378T4 TR 2018/16378 T TR2018/16378 T TR 2018/16378T TR 201816378 T TR201816378 T TR 201816378T TR 201816378 T4 TR201816378 T4 TR 201816378T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
group
methyl
olanzapine
hapten
carrier
Prior art date
Application number
TR2018/16378T
Other languages
English (en)
Inventor
Garrett Donahue Matthew
Gong Yong
Salter Rhys
Hryhorenko Eric
R Decory Thomas
M Remmerie Bart
Sankaran Banumathi
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of TR201816378T4 publication Critical patent/TR201816378T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin

Abstract

Mevcut buluş, olanzapinden türetilen yeni konjugatların ve immünojenlerin sentezi için yararlı olan Formül I bileşikleri ile ilgili olup, R1, R2 ve R3 tarifnamede tanımlanmıştır. Buluş ayrıca bir olanzapin hapten ve bir protein konjugatları ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME OLANZAPIN HAPTENLERI BULUSUN ALANI Bulus, biyolojik insan sivilarinda olanzapin varligini belirlemeye yönelik immün analizler ile ilgilidir. BULUSUN GEÇMISI tedavisi için dopamin reseptörü antagonistleri olarak kullanilmak üzere piperazin ikameli aril benzodiazepinleri ile ilgilidir. EP O 582 368, MSS bozukluklarinin tedavisi için tiyenobenzodiazepin baglayicilar içeren ön ilaçlarla ilgilidir. Sizofreni, dünya popülasyonunun yaklasik olarak %O.45-l'ini etkileyen kronik ve zayif düsürücü bir psikiyatrik bozukluktur (van Tedavinin temel amaçlari, psikotik semptomlarin sürekli remisyonunu saglamak, relapsin risk ve sonuçlarini azaltmak ve hastanin fonksiyonlarini ve genel yasam kalitesini iyilestirmektir. Birçok sizofreni hastasinda mevcut antipsikotik ilaçlarla semptom stabilitesi saglanmaktadir, ancak ilaca yetersiz baglilik, günlük uygulanan oral ilaçlarla relaps bakimindan yaygin bir nedendir. Uyumsuzlugun sonuçlarini arastiran birtakim çalismalarda (Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. reçeteli ilaçlarini almayan sizofreni hastalarinin daha yüksek relaps, hastaneye yatis ve intihar oranlarina ve ayrica artmis mortalite oranlarina sahip olduklari gösterilmistir. Sizofreni hastalarinin %40 ila 75'inin bir günlük oral tedavi rejimine bagli kalma konusunda zorluk çektigi kestirilmektedir (Lieberman, J. A.: Stroup, T. 8.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. 8.; Rosenheck, R. A.: Perkins, D. 0.; Keefe, R. 8. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, B. D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New ilaç izlemi (TDM), anti-psikotik ilaçlar da dahil olmak 'üzere ilaçlarin serum veya plazma konsantrasyonlarinin tedavi izlemi ve optimizasyon için tayin edilmesidir. Bu tip izlemler örnegin ilaç rejimlerine bagli kalmayan, terapötik dozlara ulasamayan, terapötik dozlara yanit vermeyen, optimum düzeyin altinda tolerans sergileyen, ilaçlar arasi farmakokinetik etkilesimler sergileyen veya uygunsuz plazma konsantrasyonlarina yol açan anormal metabolizmaya sahip olan hastalarin belirlenmesini saglar. Anti-psikotik ilaçlarin hastada emilim, dagitim, metabolizma ve vücuttan atilma kapasitesi anlamli düzeyde bireysel degiskenlik gösterir. Bu tip farkliliklar eslik eden hastaliktan, yastan, eszamanli uygulanan ilaçtan veya genetik özelliklerden kaynaklanabilir. Farkli ilaç formülasyonlari da anti-psikotik ilaçlarin metabolizmasini etkileyebilir. TDM her bir hasta için doz optimizasyonu saglayarak terapötik ve fonksiyonel sonuçlari iyilestirir. TDM ilaveten reçete yazan hekimin reçete edilen dozajlara uyumu garanti etmesini ve etkili serum konsantrasyonlarinin elde edilmesini saglar. Bugüne kadar, anti-psikotik ilaçlarin serum veya plazma konsantrasyonlarinin seviyelerini belirleme yöntemleri arasinda, UV veya kütle spektrometresi ile sivi kromatografi (LC) ve radyoimmunolojik teslerin kullanimi yer alir (bakiniz, örnegin, Woestenborghs ve digerleri, 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA's" in Methodological Surveys, Biochemistry and Analysis 20:241-246. Analysis of Drugs and Metabolites, Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, ekzl3-l7; Huang ve digerleri, 1993 and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Radyo immün analizlerde risperidon ve/veya paliperidon saptanir. Salamone Vd. US Patent No. 8,088,594'te risperidonu ve paliperidonu saptayan, ancak farmakolojik olarak pasif metabolitleri saptamayan antikorlarin kullanildigi risperidona yönelik bir rekabetçi immün analizi açiklar. Rekabetçi immün analizde kullanilan antikorlar belirli bir immünojene karsi gelistirilir. Yine bir rekabetçi formatin kullanildigi, baska bir anti-psikotik ilaç olan olanzapine yönelik bir ELISA analizi ID Labs Inc. (London, Ontario, Kanada) tarafindan piyasaya sürülür. Kullanim Talimatlarinda analizin tarama amaciyla tasarlandigi ve adli kullanimi veya arastirmalarda kullanimi hedefledigi ve spesifik olarak terapötik kullanima yönelik olmadigi belirtilir. Talimatlarda tüm pozitif numunelerin gaz kromatografisi/kütle spektrometrisi (GC-MS) ile dogrulanmasi gerektigi önerilir ve kullanilan antikorun olanzapin ve klozapini saptadigi belirtilir (bkz. ID Labs Inc., "Instructions For Use Data Sheet IDEL- FO83", Rev. Tarihi Agustos 8, 2011). Bu yöntemlerin bazilari (yani HPLC ve GC/MS) maliyetli ve emek-yogun olabilir ve genelde sadece uygun ekipmanlara sahip büyük veya özellesmis laboratuvarlarda uygulanir. Anti-psikotik ilaç düzeylerini belirlemeye yönelik baska yöntemlere, özellikle reçete yazan bir hekimin muayenehanesinde (dolayisiyla her bir hastanin tedavisi çok daha vakitlice ayarlanabilir) ve LC veya GC/MS ekipmanlarini içermeyen veya hizli test sonuçlarina ihtiyaç duyulan diger tibbi ortamlarda uygulanabilecek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadir. Olanzapin sudur: BULUSU'N ÖZETI Mevcut bulusta, anti-psikotik olanzapin ilacinin düzeylerini belirlemeye yönelik böylesi bir iyilestirilmis yöntemi mümkün kilan bilesikler ve konjügatlar saglanir. Bulus, Formül I bilesikleri içerir, R1\©\ / \ Formül I . O ,CHzNHg veya H m k/NWOH VNWSÖ 0 O _ O ,CHgNHz veya CH;NEC(O)(CH2)1C02H'dir; R3, H'dir; R1, Râ Eö'ün ikisinin H olmasi geregi kosuluyla, Ve ayrica R4, R2 ve R3'ün hepsinin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; m 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; Bulus, bulus konusu bilesiklerin konjugatlari ile proteinler gibi immünojenik tasiyicilari ve bu gibi konjügatlarin üretilmesi için prosesleri kapsar, bahsedilen prosesler, bulus konusu bilesiklerin immünojenik tasiyicilar ile temas ettirilmesini içerir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekiller 1-3, üç farkli fare füzyon 11,1 hibridomundan üretilen kompetitif ELISA sonuçlarini göstermektedir; Sekil 4, bir yanal akis testi cihazinda kullanilan rekabetçi bagisiklik testi formatini gösterir; Sekil 5, olanzapin antikor klonu 35 ile olusturulan tipik bir doz yaniti egrisi; Sekil 6 olanzapin antikor klonu 61 ile olusturulan tipik bir doz yaniti egrisini gösterir; ve Sekil 7, olanzapin antikoru 3F11 ile elde edilen bir tipik doz BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulusta, anti-psikotik ilaçlarin düzeylerinin belirlenmesini saglayan bilesikler ve konjügatlar saglanir. Bu tip yöntemler klinisyenlerin bir randevuda bir hastanin semptomlarindaki kötülesmenin baglilik eksikliginden kaynaklanma ihtimalini nesnel sekilde degerlendirmesini saglayacaktir. Alternatif olarak, bagliligin mevcut olmasi halinde, bir klinisyen farkli bir tedavi seçenegini düsünebilir. Bu tip yöntemler ile saglanan terapötik ilaç izlemi, en etkili tedavi seçeneklerinin belirlenmesi açisindan önemlidir. Klinisyenler ayrica bu tip TDM'lerin hastalariyla çok farkli bir iliski kurmalarini saglayacagina inanmaktadir, yani tedaviye bagli kalmama konusunda bir varsayimsal tartismadan, hastalarin tedavi rejimlerinin optimizasyonunda aktif bir sekilde sorumluluk almalarini saglamak suretiyle daha isbirlikçi bir tartismaya geçis saglayacagina inanmaktadir. Yöntemin gelistirilmesi ilk önce bir proteine bagli bir sentetik hapten içeren birtakim immünojenlerin sentezlenmesini gerektirir. Bir hapten, protein gibi büyük bir tasiyiciyla birlestiginde bir immün yaniti uyarabilen küçük bir moleküldür. Tek basina antikor olusumunu uyarma kapasitesine sahip olmayan, ancak antikorlar ile reaksiyona girebilen, çogunlukla düsük molekül agirligina sahip proteinsiz maddelerdir. Bir hapten-protein konjügati antikorlarin üretimini uyarabilir. Küçük moleküllere yönelik spesifik antikor üretimi, immün analiz gelistirme açisindan faydalidir (Pharm Res. Bulus, Formül I bilesikleri içerir, Formül 1 burada: HawîMpH #RAM ON:) www. O ,CHzNHgveya CH:NHC(O)(CHÜEC02H; gfxN 1 N/`\ H \ m 0 H k\/N OH \\/ \Nf#TN O 0 . O ,CHzNHzveya cszNHc (0) (GHz) mCOzH' dir; R3, H'dir; Rh Râ Eö'ün ikisinin H olmasi geregi kosuluyla, ve ayrica R1, R2 ve R3'ün hepsinin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; m 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, Formül 1 bilesiklerini içermekte olup, O ,CHzNHz veya CHzNHctO) (cuzmcom: `u im îßftb/ R3. H. 0 O 0 O ,CHzNHz veya CH:NHC{O) (cnmmcom' dir; ya R1 ya da Rz'nin H olmasi geregi kosulu ve ayrica hem R1 hem de Iý'nin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; Ayrica burada, Formül 1 bilesikleri tarif edilmekte olup: burada: R1, H veya CH2NH-(Y)P-G'dir; R2, H, veya CHzNH-(Y)p-G'dir; ya Rl ya da R2'nin H olmasi kosuluyla ve ayrica hem R1 hem de Rz'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir, burada: Y, bir organik aralayici gruptur; G, bir tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubudur; Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, Formül 1 bilesiklerini içermekte olup, 0 .CHzNHz veya CHzNHC(O) (CthrCOzH: 0 \ 1& H ` m N/\\ R2, H, H 0. o 0 CHzNHz'veya CH;NHC(O)(CHÜnCO;H'dir; ya R1 ya da R2'nin H olmasi geregi kosuluyla ve ayrica, hem R1 hem de Rê'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; Bulusun baska bir yapilanmasinda, 2 gib/Im o R1, H, ', CHzNHz, veya CH2NHC(O) (CH2)mC02H; 3 gib/Im o R?, H, " CHzNH2 'veya CHzNHC(C» (CH2)mC02H; ya IRl ya da R2'nin H olmasi geregi kosuluyla ve ayrica, hem Rl hem de R2'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir Formül I bilesigi olup, H 8 "eya Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, su bilesiktir: Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, su bilesiktir: Mevcut bulus ayrica, immunojenik bir tasiyici ile mevcut bulusun bilesiklerinin konjugatlarini saglamaktadir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bu sebeple Formül I bilesiginin bir konjugatidir: Formül I Riiî-I. H 0. 0 o 0 amma; veya CH;NHC(O) (CI-[2)mC02I-I; R4, H, O` /\ /%VVL\ }/\N \ rn N/`\ O 0 o ` O ~CH2NH2 veya CZ-ZzNI-IC (0) (CI-:2)mc02i-I'dir; R3, H'dir; Rh R& R"ün ikisinin H olmasi geregi kosuluyla, ve ayrica R1, R2 ve R3'ün hepsinin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; m 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; ve bir immünojenik tasiyicidir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir formül I bilesiginin bir konjügati olup, 3 H @Is/jî& O .CHzNHz veya CHzNHC (O) (CthrCOzI-I; E N 'm îÂ/#Fr ya R1 ya da Rz'nin H olmasi geregi kosulu ve ayrica hem R1 hem de R2'nin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; ve bir immünojenik tasiyicidir. Burada ayrica, Formül I'e ait bir bilesigin bir konjügati tarif edilmekte olup, burada: R1, H veya CH2NH-(Y)p-G'dir; R2, H, veya CH2NH-(Y)p-G'dir; ya Rl ya da Rz'nin H olmasi kosuluyla ve ayrica hem R1 hem de R2'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir; Y, bir organik ara gruptur; G, bir tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubudur; p, l'dir; ve bir immünojenik tasiyicidir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir formül I bilesiginin bir konjügati olup, burada: O .CHzNHz veya CHzNI-IC (0) (CH2)ir.C02H; R2, H, H m O` 0 O ` Nîgwnî3:îý O CHzNHz veya CHzNHC (0) (CH2JmC021-I'dir; ya R1 ya da R2'nin H olmasi geregi kosulu ve ayrica hem R1 hem de R2'nin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; ve bir immünojenik tasiyicidir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir formül I bilesiginin bir konjügati olup, burada: R1, H, , CH2NH2, veya CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir; 31^mJLMm R2, H, ° CHZNHz veya CHZNHC(O)(CH2)mCOzH'dir; ya R4 ya da R2'nin H olmasi geregi kosuluyla ve ayrica, hem Rl hem de R2'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; ve bir immünojenik tasiyicidir. Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, asagidakilerden: O ; ve bir immünojenik tasiyicidan olusan bir bilesigin bir konjügatidir. Mevcut bulusun tercih edilen uygulamalari, yukaridaki konjügatlar olup, burada immünojenik tasiyici bir proteindir. Mevcut bulusun daha tercih edilen uygulamalari, yukaridaki konjügatlar olup, burada protein, anahtar deligi limpet hemosiyanini, sigir tiroglobulin veya ovalbüminidir. Bulusta ayrica, yukaridaki bilesikleri bir immünojenik tasiyici ile temas ettirme prosesiyle üretilen ürünler saglanir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bu yuzden Formül I bilesiginin; Formül I burada: O .CHzNI-lz veya CHzNHC (o: (CHzlmC02H; H m kili VNWN cazNHc (0) (CH: ) n-,COzH' dir; .CHzNHzveya Râ H'dir; R1, R2, Rß'ün ikisinin Il olmasi geregi kosuluyla ve ayrica, RÃ, R2 ve R3'nin hepsinin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4, veya 5'tir; immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi islemi ile yapilan bir üründür.Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir formül I bilesiginin; R1, H veya CH2NH-(Y)P-G'dir; R2, H, veya CHzNH-(Y)p-G'dir; ya Rl ya da R2'nin H olmasi kosuluyla ve ayrica hem R1 hem de Rg'nin ayni anda H olamayacagi kosuluyla; R3, H, Y, bir organik ara gruptur; G, bir tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubudur; p, l'dir; bir immünojenik tasiyici ile temas ettirilmesini içeren bir prosesle üretilen bir üründür. Burada ayrica, bir Formül I bilesiginin; Formül 1 burada: O '/\N/k\fL\N/`j R1, H, H "1 o` O 0 7%."th 0 O .CHzNI-I: veya CH;NHC(O) (CH2)ir.C02I-I; R2, H 0. 0 o . O -CHzNHz veya CH:NHC[O)(CH2)mCOzH'dir; R3, H'dir, ya Rl ya da R2'nin H olmasi geregi kosulu ve ayrica hem R1 hem de R2'nin ayni anda H'nin olamayacagi kosuluyla; m 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4, veya 5'tir; immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi prosesi ile yapilmis bir ürün tarif edilmektedir. Mevcut bulusun tercih edilen bir baska uygulamasi, bir Formül I bilesiginin, ya R3 ya da R2'nin H olmasi geregi kosulu ve ayrica hem R3 hem de Rz'nin ayni anda H olmayabilecegi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4, veya 5'tir; immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi islemiyle yapilan bir üründür. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir formül I bilesiginin 3{` $ N\ 2 \\/N` 'wky/OH R1. Hi H " '3 0 1` › ,"x O .CHzNHz veya CHzNHC (0) (CHzSJmCOzm 1-" N` \_,I \ ` .` i\i R4' H' H \ '3 o Äi`NII M\ N/\\ .3 (3 ..J O .cngNng veya CHzNHC (0) (CH;)mC02H'dir; R1, H, ` CH2NH2, veya CHZNHC(O) (CH2)mC02H'dir; R2, H, ' Ü` CH2NH2 veya CHzNHC(O) (CH2)mCO2H'dir; ya R1 ya da R2'nin H olmasi kosulu ve ayrica hem R1 hem de R2'nin ayni anda II olamayacagi kosuluyla; R3, H'dir; m, 1, 2, 3, 4 veya 5'tir; n, 1, 2, 3, 4, veya 5'tir; immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi islemiyle yapilan bir üründür. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bir bilesigin immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi prosesi ile yapilmis bir üründür. Mevcut bulusun tercih edilen bir baska uygulamasi, bir immünojenik tasiyici ile O bilesiginin temas ettirilmesi prosesi ile yapilmis bir üründür. Mevcut bulusun tercih edilen bir baska uygulamasi, H bilesiginin immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi islemiyle yapilan bir üründür. Mevcut bulusun tercih edilen bir baska uygulamasi, bilesiginin immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi islemiyle yapilan bir üründür. Mevcut bulusun daha çok tercih edilen bir uygulamasi, yukaridaki bilesiklerin immünojenik bir tasiyici ile temas ettirilmesi prosesi ile yapilmis bir üründür, burada immünojenik tasiyici, bir proteindir ve burada protein, keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulin veya ovalbümindir. KISALTMALAR Burada ve basvuru boyunca asagidaki kisaltmalar kullanilabilir: AMAS N-(a-maleimidoasetoksi) süksinimit ester BTG sigir tiroglobulini BUûJ tribütilamin DCC disikloheksilkarbodiimid DCM diklorometan DIEA diizopropiletilamin DMF N,N-dimetilformamid DMSO dimetilsülfoksit TANIMLAR edilen herhangi bir maddeyi ifade eder. Mevcut bulus itibariyla temsili konjügatlar, bir küçük molekülün, örnegin Formül I bilesiklerinin büyük bir molekülle, örnegin bir tasiyici veya bir poliamin polimeri ve özellikle de bir proteinle birlestirilmesi yoluyla elde edilenleri kapsar, konjugattaki küçük molekül, büyük molekül üzerindeki bir veya daha fazla aktif bölgeye katilabilir. EDTA etilendiamintetrasetikasit SATA N-süksinimidil S-asetiltiyoasetat TEA trietilamin THF tetrahidrofuran TFA trifloroasetik asit o.s. oda sicakligi DIG diizopropilkarbodiimid DMAP N,N-dimetil-4-aminopiridin EDC l-etil-3(3-dimetilaminopropil) karbodiimithidroklorür NHS N-hidroksisüksinimid TFP Tetraflorofenil PNP p-nitrofenil TBTU O-(Benzotnazol-l-il)N,N,N',N'- tetrametiluronyum tetrafloroborat HOBT N-Hidroksibenzotriazol DEPBT 3-(dietoksifosforiloksi)-l,2,3- benzotrazin-4(3H)-on BOP-Cl Bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfonik DTT ditiyoeritritol hapten, antikor olusumunu uyarma kapasitesine sahip olmayan, ancak antikorlarla reaksiyona girebilen bir proteinsiz maddedir. Antikorlar, bir haptenin yüksek molekül agirlikli bir immünojenik tasiyiciya kenetlendirilmesi ve akabinde bu kenetli ürünün, yani immünojenin bir insan veya hayvan bireye enjekte edilmesi yoluyla uyarilir. üretme veya olusturma kapasitesine sahip bir maddeyi ifade eder. Burada kullanildigi haliyle bir "immünojenik tasiyici", haptenlerle bir veya daha fazla konumda birlesebilen ve böylece bu haptenlere spesifik olarak baglanabilen antikorlarin üretimini saglayabilen bir immünojenik maddedir ve yaygin olarak bir proteindir. Immünojenik tasiyici maddelerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, yabanci olarak algilanan ve dolayisiyla konakçida bir immünolojik yaniti uyaran proteinleri, glikoproteinleri, kompleks poliamino-polisakkaritleri, partikülleri ve nükleik asitleri kapsar. Poliamino- polisakkaritler, bu tip hazirlama için bilinen konvansiyonel yollarin herhangi biriyle polisakkaritlerden hazirlanabilir. Sinirlandirici olmaksizin albüminler, serum proteinleri, lipoproteinler, vb. dahil olmak üzere immünojenik tasiyicilar olarak çesitli protein tipleri kullanilabilir. Temsili proteinler sigir serum albümini, keyhole limpet hemosiyanin, yumurta ovalbümini, sigir tiroglobulini, fraksiyon V insan serum albümini, tavsan albümini, kabak çekirdegi globülini, difteri toksoidi, tetanos toksoidi, botulinus toksini, süksinillenmis proteinler ve polilizin gibi sentetik poli(aminoasitleri) kapsar. Immünojenik tasiyicilar ayrica monosakkaritlerin tekrarli kondenzasyonu üzerinden olusan yüksek molekül agirlikli bir polimer olan poli amino-polisakkaritleri kapsar. Polisakkaritlerin örnekleri nisastalar, glikojen, selüloz, karbonhidrat zamklari, örnegin arap zamki, agar ve benzerleridir. Polisakkarid ayrica, poli(amino asit) kalintilari çapa lipid kalintilarini da kapsar. Immünojenik tasiyici ayrica tek basina veya yukarida belirtilen poli(amino asitler) veya polisakkaritler ile konjüge edilmis halde bulunan bir poli(nükleik asit) olabilir. Immünojenik tasiyici ayrica kati partiküller içerebilir. Partiküller genel olarak en az yaklasik 0.02 mikron (pm) ve en fazla yaklasik 100 pm ve genellikle yaklasik 0.05 um ila 10 nm çapindadir. Partikül organik veya inorganik, sisebilen veya sismeyen, gözenekli veya gözeneksiz olabilir, optimal olarak suyunkine yakin bir yogunluga, genel olarak yaklasik 0.7 ila 1.5 g/mL'lik bir yogunluga sahip olabilir ve saydam, yari saydam veya opak bir materyalden olusabilir. Partiküller, sinirlandirici olmayan örnekler olarak eritrositler, lökositler, lenfositler, hibridomlar Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli ve Virüsler de dahil olmak üzere hücreler ve mikroorganizmalar gibi biyolojik materyaller olabilir. Partiküller ayrica organik ve inorganik polimerler, lipozomlar, lateks, fosfolipit veziküller veya lipoproteinlerden olusabilir. bir ana bilesikten üretilen bir kimyasal bilesigi veya molekülü ifade eder. Bir kimyasal bilesigin "analogu", bir karbon atomlari zincirine ve bir referans bilesik ile ayni belirli fonksiyonel gruplara sahip olan bir kimyasal bilesigi ifade eder, ancak burada analogun karbon zinciri referans bilesige kiyasla daha uzun veya daha kisadir. Bir "isaret", "saptayici molekül" veya "raportör", bir saptanabilir sinyal üreten veya bir saptanabilir sinyal üretmek üzere uyarilabilen herhangi bir moleküldür. Isaret bir analit, immünojen, antikor veya baska bir nwlekül, örnegin bir reseptör veya bir reseptöre baglanabilen bir molekül, örnegin bir ligand, özellikle bir hapten ile konjüge edilebilir. Isaretlerin sinirlandirici olmayan örnekleri radyoaktif izotoplar (örnegin 1125I), enzimler (örnegin ß-galaktosidaz, peroksidaz), enzim fragmanlari, enzim substratlari, enzim inhibitörleri, koenzimler, katalizörler, floroforlar (örnegin rodamin, floresin izotiyosiyanat veya FITC veya Dylight 649), boyalar, kemilüminesan maddeler ve lüminesan maddeler (örnegin dioksetanlar, lusiferin) veya duyarlastiricilari Burada kullanildigi haliyle bir "ara grup", bir kimyasal yapida bir fonksiyonel baglanti grubu üzerinden haptenler, tasiyicilar, immünojenler, isaretler veya baglanma partnerleri gibi iki veya daha fazla alt yapiyi birlestiren bir kismi ifade eder. Bu ara gruplar organik bilesiklerde tipik olarak mevcut olan ve organik bilesiklerde tipik olarak gözlemlenen yollarla bir araya getirilen atomlardan olusur ve dolayisiyla "organik ara grup" olarak adlandirilabilir. Ara gruplari bir araya getirmek için kullanilan kimyasal yapi bloklari bu basvurunun ilerleyen kisimlarinda tarif edilecektir. Tercih edilen ara gruplar arasinda düz zincirli veya dallanmis, doymus veya doymamis karbon zincirleri bulunur. Bu karbon zincirleri ayrica zincirin içinde bir veya daha fazla heteroatom.ya da zincirde veya zincirlerin terminuslarinda herhangi bir karbon atomunun bir veya daha fazla hidrojen atomu yerine bir veya daha fazla heteroatom içerebilir. "Heteroatomlar" teriminden kasit, oksijen, azot, fosfor ve kükürtten olusan gruptan seçilen karbon disindaki atomlardir, burada azot, fosfor ve kükürt atomlari herhangi bir yükseltgenme durumunda bulunabilir` ve kendilerine bagli karbon atomlarina veya baska heteroatomlara sahip olabilir. Ara grup ayrica zincirin bir parçasi olarak veya zincirdeki atomlardan birinin üzerinde bir sübstitüsyon olarak siklik veya aromatik gruplar içerebilir. Ara gruptaki atomlarin sayisi, hidrojen disindaki atomlar sayilarak belirlenir. Bir ara grubun içindeki bir zincirde bulunan atomlarin sayisi, bagli alt yapilar arasinda en kisa yol üzerinde bulunan hidrojen disindaki atomlar sayilarak belirlenir. Tercih edilen zincir uzunluklari 1 ila 20 atomdur. Bir "fonksiyonel baglanti grubu", bir hapten üzerinde bulunan ve bir hapten ile baska bir grubun (örnegin bir isaret veya tasiyici) bir konjügatini üretmek üzere hapten kisminin bir kovalent kimyasal bag olusumu üzerinden baska bir gruba kenetlendirilmesi için kullanilabilir bir reaktif bölge saglamak amaciyla kullanilabilen bir reaktif grubu ifade eder. Hapten bu yolla hapten için bir rekabetçi baglanma partneri olusturmak üzere biyotin gibi bir gruba baglanabilir. Ara gruplar hapteni tasiyiciya baglamak için kullanilabilir. Farkli uzunluktaki ara gruplar, antikor olusum sürecinin optimizasyonu için bagisiklanan hayvanin veya insanin immün sistemine sunulmak üzere haptenin tasiyiciya farkli mesafelerde eklenmesini saglar. Hapten molekülünde farkli konumlara ekleme, antikor tanimayi etkilemek üzere hapten üzerindeki spesifik bölgelerin immün sisteme sunulma firsatini mümkün kilar. Ara grup, hapten türevini sulu ortamlarda daha çözünür hale getirmek için hidrofilik çözündürücü gruplar içerebilir. Hidrofilik çözündürücü gruplarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polioksialkiloksi gruplarini, örnegin polietilen glikol Zincirlerini; hidroksil, karboksilat ve sülfonat gruplarini kapsar. kimyasal bag olusturmak üzere bir elektron çifti veren bir türü ifade eder. "Elektrofilik grup" veya "elektrofil" terimi, bir reaksiyonda bir kimyasal bag olusturmak üzere bir nükleofilden bir elektron çifti alan bir türü ifade eder. karbon atomu üzerinde bir hidrojen atomu yerine bir atomun veya atomlar grubunun sübstitüsyonunu ifade eder. Sübstitüentlerin sinirlandirici olmayan örnekleri halojen atomlari, amino, hidroksi, karboksi, alkil, aril, heteroalkil, heteroaril, siyano, alkoksi, nitro, aldehit ve keton gruplarini kapsar. doymus veya doymamis düz zincirli ve dalli radikalleri ifade eder ve bu terimin spesifik olarak herhangi bir doygunluk derecesine veya düzeyine sahip radikalleri kapsamasi amaçlanir. Alkil, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, metil, etil, propil, izopropil, bütil, izobütil, sek-bütil, tert-bütil, pentil, izopentil, heksil, izoheksil, heptil, oktil, 2,2,4-trimetilpentil, nonil, desil, undesil ve dodesili kapsar. veya kismen doymamis monosiklik veya bisiklik hidrokarbon halka radikalini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler siklopropil, 1,1-dimetil siklobütil, 1,2,3-trimetilsiklopentil, sikloheksil ve sikloheksenili kapsar. atomu veya bir kükürt atomunu ifade eder, burada azot, fosfor ve kükürt atomlari izin verilen herhangi bir yükseltgenme durumunda bulunabilir. heteroatom, zincirde veya zincirlerin terminuslarinda herhangi bir karbon atomundaki bir veya daha fazla hidrojen yerine bir veya daha fazla heteroatom içeren bir alkil grubunu ifade eder. arasindan seçilen› en› az bir* heteroatomdan olusan. bir aromatik olmayan (yani doymus veya kismen doymamis) halkayi ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler tetrahidrofuril, dihidropiranil, piperidil, 2,5- dimetilpiperidil, morfolinil, piperazinil, tiyomorfolinil, imidazolidinil ve imidazolinili kapsar. karbon atomuna bagli olan en az bir hidroksil grubunu ifade eder. atomuna bagli olan en az bir primer veya sekonder amino grubunu ifade eder. karbon atomuna bagli olan en az bir alkoksi grubunu ifade eder. 12 kadar karbon atomuna sahip düz veya dallanmis zincirli radikalleri ifade eder. Örnekler arasinda, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi ve butoksi bulunur. ifade eder ve ayrik veya es dagilimli boyutlara sahip polietilen glikolleri kapsar. atomuna bagli olan en az bir kükürt grubunu ifade eder. Kükürt grubu herhangi bir yükseltgenme durumunda olabilir ve sülfoksitler, sülfonlar ve sülfatlari kapsar. karbon atomuna bagli olan bir karbonil grubuna sahip bir grubu ifade eder. karbon atomuna bagli olan en az bir karboksilat grubunu ifade eder. veya aralkil karboksilat esterlerini kapsar. bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder ve burada herhangi bir halka, N, 0 veya 8 arasindan seçilen bir ila dört heteroatomdan olusabilir ve azot ve kükürt atomlari izin verilen herhangi bir oksidasyon durumunda bulunabilir. Örnekler benzimidazolil, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, furil, imidazolil, izotiazolil, izoksazolil, oksazolil, pirazinil, pirazolil, piridil, pirimidinil, pirrolil, kinolinil, tiazolil ve tienili bisiklik aromatik halka radikallerini ifade eder. Halka üzerinde istege göre alkil sübstitüentleri bulunabilir. Örnekler fenil, bifenil ve naftalini kapsar. grubunu ifade eder. Örnekler benzil, feniletil ve 2-naftilmetili alkil, sikloalkil, heteroalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. Bir "asilleme maddesi" bir moleküle -C(O)Ra grubunu ekler. alkil, sikloalkil, heteroalkil, haloalkil, aril, aralkil ve heteroarildir. "Sülfonilleme maddesi", bir moleküle -S(O)Ra grubunu Haptenlerin tasiyici gruplara eklenmesi için reaktif fonksiyonel baglanti gruplari tasiyan ara gruplar çok çesitli yöntemlerle hazirlanabilir. Ara grup, hapten ve tasiyici ile seçici sirali reaksiyon saglamak için herhangi bir uçta gruplarla diferansiyel olarak fonksiyonellestirilmis veya aktiflestirilmis bir leekül kullanilarak elde edilebilir, ancak ayni reaktif grup her iki uçta da kullanilabilir. Tasiyiciya baglanacak hapten ve fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için seçilen gruplar, hapten ve haptenin baglanacagi tasiyici üzerindeki fonksiyonellik türüne göre belirlenir. Ara gruplar ve haptenlere ve tasiyicilara baglanti yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, London, Amsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 ve Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook, çevrimiçi indirme veya basili kopya talebi için Thermo Scientific http://www.piereenet.com/ ve dahil edilen referanslarda tarif edilenleri kapsar. Ara gruplarin olusumu için diferansiyel olarak aktiflestirilmis birçok molekül Örnegin Thermo Scientific gibi firmalardan temin edilebilir Bir amino grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, ara grup ile hapten arasindaki baglanti modlari, hapten üzerindeki aminin bir asil halojenür veya aktif ester tasiyan bir ara grup yapi blogu ile reaksiyonunu içerir. "Aktif esterler", kararli bir baglanti olusturmak üzere hafif kosullar altinda bir nükleofilik grup, örnegin bir amino grubu ile reaksiyona giren esterler olarak tanimlanir. Kararli bir baglanti, ileriki kullanim kosullarinda, örnegin sonraki sentez adimlarinda, bir immünojen olarak kullanimda veya bir biyokimyasal analizde saglam kalan bir baglanti olarak tanimlanir. Kararli bir baglantinin tercihli bir örnegi bir amid bagidir. Aktif esterler ve üretim yöntemleri Benoiton, N.L., in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, New York, vol E22 section 3.2:443 ve Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006 tarafindan tarif edilir. Tercih edilen aktif esterler p-nitrofenil ester (PNP), N- hidroksisüksinimid. ester (NHS) ve tetraflorofenil esteri (TFP) kapsar. Asil halojenürler ilgili alanin uzmanlarinca bilinen birçok yöntemle, örnegin karboksilik asidin tiyonil klorür veya oksalil klorür ile reaksiyonu üzerinden hazirlanabilir, bkz.: Fieser, L.F ve Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 ve dahil edilen referanslar. Bunlar p-nitrofenil esterler (PNP) gibi baska aktif esterlere dönüstürülebilir, bu esterler ise edildigi üzere aktif bifonksiyonel ara gruplar olarak örnek 35'te açiklandigi üzere N,N-disüksinimidil karbonat (CAS 74124-79-1) ile bir bilesigin karboksilik asidinin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin veya diizopropiletilamin gibi bir organik baz varliginda reaksiyona sokulmasi yoluyla ya da susuz kosullar altinda N-hidroksisüksinimid ve disikloheksilkarbodiimid (DCC) veya baska bir dehidrasyon maddesi kullanilarak hazirlanabilir. Tetraflorofenil esterler (TFP), Wilbur Vd., Bioconjugate Chem. 2004,75(l):203 tarafindan bildirildigi üzere karboksilik asitlerin susuz kosullar altinda bir aprotik solvent içerisinde trietilamin veya diizopropiletilamin gibi. bir organik bazin varliginda 2,3,5,6- tetraflorofeniltrifloroasetat ile reaksiyona sokulmasi yoluyla hazirlanabilir. Ilgili alanin uzmanlari, digerlerini yani sira, Tablo 1'de gösterilen ara gruplarin bilinen yöntemlerle hazirlanabilecegini ve reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden amino tasiyan haptenlere baglanabilecegini takdir edecektir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiyol grubuna baglanmasini saglar. 3› iyi 1&- O -"k. ._ . g O K1 ve n için makul 0 `"J \/t`7/J arasindadir Hapten üzerindeki amin ve ara grup yapi blogu üzerindeki bir karboksilik asit fonksiyonelliginin birbirine bir kenetleme maddesinin varliginda dogrudan kenetlenmesi de bir baglanti modu olarak kullanilabilir. Tercih edilen reaktifler, peptit sentezinde tipik olarak kullanilanlardir. Peptit kenetleme reaktifleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla su reaktifleri kapsar: O- (Benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronyum tetrafloroborat (TBTU, CAS #125700-67-6), bkz. Pruhs, S., Org. Process. Res. Dev. 2006, 70:441; bir karbodiimid dehidrasyon maddesi, örnegin N-N- disikloheksilkarbodiimid (DCC), diizopropilkarbodiimid (DIC) veya birlikte N-Hidroksibenzotriazol (HOBT, CAS #2592-95-2), bkz. Konig (dietoksifosforiloksi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-on (DEPBT, 73(7):601; Bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfonik klorür; (BOP-Cl, 547-51 ve Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, Chapter 2 ve Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), 6309 Shepardsville Rd., Louisville KY www.aapptec.coni ve dahil edilen referanslarda ayrintili olarak tarif edilen digerleri. Bu yöntemler, hapteni ara gruba baglayan kararli bir amid baglantisi saglar. Bilinen yöntemlerle elde edilebilen ve yukarida açiklanan ve belirtilen yöntemlerle reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden amino tasiyan haptenlere baglanabilen ara gruplarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Tablo 2'de gösterilir. Bu ara gruplar haptenin bir tasiyici üzerinde bir tiyol grubuna baglanmasini saglar. 11%/er E Nm( .S [7 Nm I 3› n için makul aralik 1-10 arasindadir Ara gruplar ayrica tasiyiciya baglanma kapasitesine sahip fonksiyonel baglanti grubunun olusturulmasi adimi da dahil olmak üzere uygun kimyasal gruplarin haptene adimlar halinde sirali olarak baglanmasi yoluyla üretilebilir. Bkz. Genel Reaksiyon Semalari altinda verilen temsili örnekler. ilaveten, ara grubun baglanti noktasi olarak haptenin bir nükleofilik gruba, örnegin bir tiyol grubu, bir amino grubu veya bir hidroksil grubuna sahip oldugu durumlarda, ara grup ayrica tiyol, amin veya hidroksil grubunun alkillenmesi yoluyla da olusturulabilir. Ara grubu baglamak için bir sübstitüsyon reaksiyonuna ugrama kapasitesine sahip bir grup, örnegin bir alkil halojenür veya sülfonik asit ester, mesela p-Tolüensülfonat ile uygun sekilde sübstitüe edilmis herhangi bir alkil grubu kullanilabilir. Alkilleme reaksiyonlari ile ilgili birçok örnek ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve spesifik örnekler genel kimya literatüründe bulunabilir' ve rutin deneyler üzerinden optimize edilebilir. Alkilleme reaksiyonlari ile ilgili birçok referans içeren. bir tartisma March's Advanced Organic Chemistry, Smith, M.B. ve March,, John Wiley & Sons, Inc. NY, 2001, Bölüm 10'da bulunabilir. Hapten üzerindeki nükleofilik grubun, örnegin bir aminin bir üre olusturmak üzere bir izosiyanat ile reaksiyonu veya bir tiyoüre baglantisi olusturmak üzere bir izotiyosiyanat ile reaksiyonu gibi baska baglantilar da kullanilabilir, bkz: Li, Z., et.al., Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2003, olusturmak üzere izosiyanat gruplari ile reaksiyona sokularak hidroksil gruplari tasiyan haptenlere baglanabilir. Ara grup bir uçta izosiyanat fonksiyonel grubuyla ve tasiyici ile reaksiyona girme kapasitesine sahip bir fonksiyonel baglanti grubuyla diferansiyel olarak aktiflestirilebilir, bkz. Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. ve Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212-2.l8. Bir karboksilik asit grubu tasiyan haptenler söz konusu oldugunda, bir ara grup kisminin haptene baglanma modlari, örnekleri Tablo 3'te gösterildigi ve hazirlanisi yukarida tarif edildigi üzere karboksilik asit grubunun bir asil halojenüra veya aktif ester olarak aktiflestirilmesi, akabinde bir amid, hidrazit, diasilhidrazin veya ester baglantisi olusturmak üzere ara grup kismi üzerinde bir amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) veya hidroksil (-OH) grubu ile reaksiyona sokulmasi ya da karboksilik asit grubunun dogrudan ara grup kismi üzerinde bir amino grubuna kenetlenmesi veya yukarida tarif edildigi üzere örnekleri Tablolar 4 ve 5'te gösterilen bir peptit kenetleme reaktifi ve/Veya karbodiimid. dehidrasyon reaktifi ile dogrudan tasiyiciya kenetlenmesini içerir. Aktiflestirilmis esterlerin yapimina ve peptit kenetleme maddelerinin kullanimina yönelik olarak yukarida atif yapilan referanslarda bulunan prosedürler, reaksiyon kosullarinin rutin optimizasyonu üzerinden, karboksilik asit tasiyan haptenlerin amino gruplari içeren ara grup yapi bloklarina ve protein tasiyicilara baglanmasi için kullanilabilir. +Na`0'3s'fî El) 0%: g g ........ 002)( I (flî/NO'I Sülfo NHS ve NHS TF- klorur AK` i 5IV`FI ` ::J/i` IFP~NI \'C) '\ ,5: ` : (Ev ` S K: 6% \ ,J »4 LJ V î` .Nîü'îsis HOBI BOP-(J No:43& . / NCN E-et'îwî- diizopropilkarbodiDisikloheksilkarbod " dimetilaminopropil) karbodiimid. HCl (EDC) Hapten üzerinde ara grubu baglamak için baska elektrofilik gruplar bulunabilir, örnegin bir sülfonil halojenür âmsnca veya elektrofilik fosfor grubu, örnegin: Bkz. Malachowski, William P,, Coward, James K., Journal of Organic burada RC alkil, sikloalkil, aril, sübstitüe edilmis aril, aralkildir. Aldehit veya keton gruplari tasiyan haptenler, bununla sinirli olmamak kaydiyla bir asilhidrazon olusturmak üzere ara grup üzerinde }hN-NH-C(O)- ile gösterilen bir hidrazit grubuyla reaksiyon da dahil olmak üzere birtakim yöntemlerle ara gruplara baglanabilir, bkz. Chamow, S.M., Kogan, T.P., Peers, D.H., Hastings, R.C., Byrn, R.A. ve Askenaszi, A., Ji Biol. Chem., 1992, saglayan bifonksiyonel hidrazit ara gruplarinin örnekleri Tablo 6'da gösterilir. Haptenler ayrica tasiyicinin tiyol ile reaksiyona girebilen bir grup saglayacak sekilde degistirilmis olmasi kaydiyla tasiyici ile reaksiyona girebilen tiyol gruplari içerebilir. Tasiyici gruplar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, haptenin tasiyiciya baglanmasini saglayan bir reaksiyona girebilen bir grubun katilimi için, tasiyici üzerinde bulunan bir amino grubunun N-Süksinimidil maleimidoasetat (AMAS, CAS# 55750-61-3), Süksinimidil iyodoasetat gruplardan herhangi biriyle reaksiyona sokulmasi suretiyle bir fonksiyonel maleimid grubu içeren bir grubun baglanmasi gibi yöntemlerle degistirilebilir. Tasiyici ile bir bag olusturma kapasitesine sahip fonksiyonel baglanti grubu, kararli bir baglanti olusturma kapasitesine sahip olan ve tasiyici üzerinde bulunan birtakim farkli gruplara karsi reaktif olabilen herhangi bir grup olabilir. Fonksiyonel baglanti grubu tercihen tasiyici veya türevi üzerinde bulunan bir amino grubu, bir karboksilik asit grubu veya bir tiyol grubu ile reaksiyona girer. Fonksiyonel baglanti grubunun sinirlandirici olmayan örnekleri bir karboksilik asit grubu, asil halojenür, aktif ester (yukarida tarif edilmistir), izosiyanat, izotiyosiyanat, alkil halojenür, amino grubu, tiyol grubu, maleimid grubu, akrilat grubu (H2C=CH-C(O)-) veya vinil sülfon grubudur (HzC=CH-SOz-), bkz. Fonksiyonel baglanti grubu, hapten ile kademeli olarak reaksiyona girebilen diferansiyel olarak aktiflestirilmis bir ara grup yapi blogunun bir parçasi olarak bulunabilir ve elde edilen hapten türevi akabinde tasiyici ile reaksiyona sokulabilir. Alternatif olarak hapten, sonraki bir reaksiyon ile fonksiyonel baglanti grubuna dönüstürülebilen bir öncül grup tasiyan bir ara grup ile türevlendirilebilir. Ara grup üzerinde bulunan fonksiyonel baglanti grubunun bir amin veya bir karboksilik asit grubu olmasi halinde, tasiyici üzerinde bulunan karboksilik asit grubu veya amin ile kenetlenme reaksiyonu, peptit kenetleme reaktiflerinin yukarida bu reaktifler için atif yapilan referanslarda verilen prosedürlere göre kullanilmasi yoluyla dogrudan gerçeklestirilebilir. Bir karisik disülfit baglantisi olusturmak üzere tasiyici üzerinde bir tiyol grubu ile etkilesime girebilen ara grup üzerindeki fonksiyonel baglanti grubu olarak belirli disülfit gruplari, Örnegin piridildisülfitler kullanilabilir, bkz. Ghetie, V., et al., Bioconjugate Chem., 1990, l:24-3l. Bu ara gruplar, örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Tablo 7'de gösterilenleri içerdigi üzere, amin tasiyan haptenin, piridildisülfit grubunu tasiyan bir ara gruba bagli bir aktif ester ile reaksiyonu üzerinden baglanabilir. +Na,hs *(9* N `TÄ^LNH ,L: "N,o f/Qsy/ ufkb O \\, \N 0 Tasiyici çogu kez bir proteindir ve baglanti için lizin rezidülerinin s-amino gruplari kullanilabilir, burada dogrudan bir amin-reaktif fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon gerçeklestirilir ya da N-Süksinimidil S-Asetiltiyoasetat (SATA, CAS 76931-93-6) veya bir analogu da dahil olmak üzere tiyol içeren bir grup ile türevlendirmeden sonra, hapten üzerindeki fonksiyonel baglanti grubu ile reaksiyon için tiyol grubunu açiga çikarmak üzere asetat grubu hidroksilamin ile kesime ugratilir. tiyol gruplari ayrica bunlarla sinirli olmamak kaydiyla 2- merkaptoetilamin (bkz. Bilah, M. vd., Bioelectrochemistry, 2010, 50(l):49), fosfin reaktifleri (bkz. Kirley, T.L., Analytical olmak üzere hafif indirgen reaktifler kullanilarak disülfit baglarinin protein tasiyicilar ile indirgenmesi yoluyla tasiyiciya dahil edilebilir. GENEL REAKSIYON SEMALARI Mevcut bulusun temsili bilesikleri asagida açiklanan genel sentez yöntemlerine göre sentezlenebilir. Formül (I) bilesikleri ilgili alanin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle hazirlanabilir. Asagidaki reaksiyon semalarinin sadece bulusun örneklerini temsil etmesi ve bulusu herhangi bir sekilde sinirlandirmamasi amaçlanir. L`/Ä N/%* / L<ý^W$/\S " Rz'nin, CEhNHC(O)(CHnnC02H oldugu Formül I bilesikleri, Sema l'e göre yapilabilir. (l-metil-4-(2-metil-l0H-benzo[b]tiyeno[2,3- e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metanamin'in tepkimesi, Örnek 1, adim I'de tarif edilen sekilde hazirlanmis, bir siklik anhidrür bilesigi ile, Örnegin süksinik anhidrür veya glutarik anhidrür ile, piridin gibi bir çözücü içinde, oda sicakligi ila 60°C arasinda degisen sicakliklarda, yaklasik 48 saat süreyle devam edilmistir. Teknikte yetkin kimseler, ayni kimyanin formül I bilesikleri olusturmak kullanilabilecegini takdir edeceklerdir, burada RE CHzNHC(O)(CH2)m;C02H'dir < """" N` :Li - ;rw ,NH N ----- / ij" nn› OH * b ß"{N; ° "m-:I 'In DIEA / . 1' `N,- xîrri %11 'N OH R2'nin 0 oldugu Formül I bilesikleri, Sema 2'e göre yapilabilir. Iý'nin, Sema 1'de tarif edildigi sekilde hazirlanmis CHQNHC(O)(CHQHC02H oldugu Formül I Bilesikleri, N-t- butoksikarbonilpiperazin, dietil siyanofosfonat ve abaz, örnegin diizopropiletilamin ile muamele edilir. Tepkime, diklorometan gibi bir çözücü içinde, yaklasik 2 saat süreyle oda sicakliginda gerçeklestirilir. Piperazinil grubunun korumasinin kaldirilmasi, Sema 2'de tarif edildigi sekilde trifloroasetik anhidrür ile gerçeklestirilir, daha sonra uygun bir anhidrür, örnegin süksinik anhidrür veya maleik anhidrür ile, uygun bir bazin örnegin diizopropiletilaminin varliginda tepkime yapilir. Teknikte yetkin kimseler, ayni kimyanin formül I bilesikleri olusturmak için kullanilabilecegini takdir edecektir. k/,Nxmß-H burada Rl sudur: . *::;""N""`5" . Ik" bnm .t `W/ ün H kg:/)\`f S Rl'in 0 oldugu Formül I bilesikleri, Sema 3'e göre yapilabilir. Maleimid ilgili alanda bilinen herhangi bir yöntemle dahil edilebilir. Maleimit fonksiyonellestirici gruplar örnegin 2,5- dioksopirrolidin-l-il 2-(2,5-diokso-2,S-dihidro-lH-pirrol-l- il)asetat, burada m l'dir, DMF veya CHzClz gibi bir çözücü, ve bir baz, örnegin tributilamin 'veya trietilamin içinde kullanilabilir. Alternatif olarak, Sema 2'de tarif edilen korumasi kaldirilmis piperazinil grubu, Formül I'in bilesiklerini vermek için Sema 3'te tarif edildigi gibi bir maleimid islevselligi ile detaylandirilabilir burada Rl sudur: v . Teknikte yetkin kimseler, ayni kimyanin formül I bilesikleri olusturmak için kullanilabilecegini takdir edecektir, burada R sudur: Se \ ~ ;LMN \ v m m . Aralayici ve baglanti grubunun olanzapinin. diazepin halkasinin Ornatilmamis ikincil nitrojene eklenmis oldugu bilesikler, 4 ila 8 arasi Semalarda gösterilen tepkimeler yoluyla elde edilebilir. Nitrojenin asilasyonu, Su, J. et.al, Bioorganic and Med. Chem. Bir bazin varliginda, bir aprotik çözücü içinde su3uz kosullar altinda süksinik asidin mono ester mono asit klorürünün kullanilmasi, esterin islevselliginin, teknikte uzman kisilerce bilinen standart kosullar kullanilarak hidrolize edilebildigi bir ara ürün, örnegin, burada daha önce tarif edilen ve bu açiklamanin örnekleri ile gösterilen yöntemlerle bir immünojene daha ayrintili olarak verilebilecek bir hapteni saglamak üzere sulu baz saglar. ýßzs( Â" 1` baz (if if' #Q g`\,)\N/"\.S/\~ 2) hidroliz h\.//"N" s " Su, et.al., yukarida, ayrica sülfonamitlerin hazirlanmasini bildirmektedir. Fonksiyonellestirilmis sülfonilklorürün bir baz varliginda kullanimi yoluyla, susuz sartlar altinda aprotik bir çözücü içinde, Sema 5'te gösterilen sekilde, bir karboksi hapten hazirlanabilir ve burada açiklanan ve bu açiklamanin örnekleri ile gösterilen yöntemlerle bir immünojene dönüstürülebilir. Su, et.al., yukarida, ayrica Sema 6'de gösterilen sekildeki bir hidrazinin, bir nitrit ester ile halka azotunun diazotizasyonu ve ardindan asetik asit içinde çinko ile indirgeme yoluyla hazirlanmasi için yöntemler ögretmektedir. Ortaya çikan hidrazin ayrica, Sema 7'de gösterilen çesitli yollarla fonksiyonellestirililebilir. Bir bifonksiyonel aralayici yapi tasi, örnegin AMAS ile, bir amin bazi, örnegin, tributilamin varliginda, DMF gibi bir çözücü içinde burada tarif edilen sekilde tepkime, bir tiyol grubu ile tepkime yoluyla bir tasiyiciya eklenebilen bir maleimit hapten verebilir. Fonksiyonellestirilmis bir sülfonil klorür, örnegin, m-karboksibenzensülfonilklorür ile baz varliginda sülf0nilasyon, burada daha önce tarif edilen ve bu açiklamanin örnekleri ile gösterilen yöntemlerle bir tasiyiciya baglanmak için bir karboksi grubu tasiyan bir sülfonilhidrazit saglayabilir. Ayrica, hidrazin, fonksiyonellestirilmis bir aldehit veya keton ile, örnegin, levulinik asit, US4022780'de tarif edilen sekilde, katalitik bir miktardaki asit ile yogusma ile olusan suyun çikarildigi kosullar altinda, sema 7'de gösterildigi gibi bir hidrazon saglamak için tepkimeye sokulabilir. Hidrazon, daha sonra, sodyum siyanoborohidrür kullanilarak daha önce atifta bulunulan Su, J. ve digerlerinin yöntemiyle, doygun bir türev elde etmek üzere indirgenebilir. film( %1" 1) izoamiyel nitrit /\`~{ IHH* *1 Na.. Bmwu @nff / /N-J baz g `i _, `\`u Ni'/ \LJ{)`IIJ*`S/ "` k//` N/l\S/_ levulinik asiî `IL/'i Sema 8'de gösterildigi gibi halka azotunun dogrudan alkilasyonu, direkt olarak olanzapine bir alkil grubu eklemek için U86034078'de tarif edilen yöntem kullanilarak da gerçeklestirilebilir. Fonksiyonel bir alkil halojenürün, örnegin, 4-klorometilbütiratin kullanilmasi yoluyla, bu teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinen standart kosullar kullanilarak hidroliz yoluyla, daha önce burada açiklanan ve bu açiklamanin örnekleri ile gösterilen yöntemlerle bir immünojen olarak ayrintili sekilde hazirlanabilen bir hapteni saglayabilen bir ara madde elde edilebilir. f'N A _If-..PVJ` sur/N`o-/R\ /SYÇHÄ PROTHN ***** ?%5 = 2 }~13N-~-0H O OLANZAPIN S = 'fm i." PROTEIN--}P_~j/}\\/Si . /\N/i:\›;N` HN""PROTEIN OLANZAPIN H "m n Maleimit ile fonksiyonellestirilmis haptenler, burada Rl veya R2 2^~ N ; sudur: `J Sema 9'da gösterilen yönteme göre proteinlere konjuge edilebilir. Epsilon-azotun N-süksinimidil 8- asetiltiyoasetat (SATA) ile asillenmesi yoluyla protein lizin rezidülerinin aktivasyonu ve akabinde S-asetil grubunun hidroksilamin ile hidrolizi sonucunda bir nükleofilik sülfhidril grubu üretilir. Sülfhidril aktivasyonlu proteinin, maleimid türevli hapten (genel sema 3'te açiklandigi gibi hazirlanir) ile konjügasyonu, bir Michael katilma reaksiyonu üzerinden ilerler. Uygun proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, proteinleri, maleimid ile fonksiyonellestirilmis haptenlere konjuge etmek için kullanilabilir, burada R1 veya R2 Sema 10:i r N---OH /H-ý 0 Ho \; H/"OLANZAPIN 9561( 1 '1 PROTEIN _ PRO EIN iLk/,k AOLANzAPIN Karboksilik asit ile fonksiyonellestirilmis haptenler, burada Rl veya R?, CH2NHC(O)(CH2)mC02H'dir, Sema lO'da gösterilen yönteme göre proteinlere konjuge edilebilir. N-hidroksisüksinimit ve uygun bir kenetleme maddesi, örnegin disikloheksilkarbodiimit, ve bir baz, örnegin tributil amin ile, DMF gibi bir çözücü içinde, yaklasik 20 °C'lik bir sicaklikta, yaklasik 18 saat süreyle tepkime, hidroksipirrolidin-Z,5-diyon ayrilan grubu ile karboksilik asidi aktiflestirir. Aktiflestirilen baglantilayici ve hapten akabinde fosfat tamponu (bir pH 7.5) gibi bir solvent içerisinde yaklasik °C'de yaklasik 2.5 saat boyunca bir protein ile konjüge edilebilir. Uygun proteinler ilgili alanin uzmanlarinca bilinir ve keyhole limpet hemosiyanin, sigir tiroglobulini ve ovalbümini kapsar. Ayni metodoloji, proteinleri karboksilik asit ile fonksiyonellestirilmis haptenlere konjuge etmek için kullanilabilir burada Rl veya R2 sudur: 33.," ü "%âg" N "1 ANTIKOR ÜRETIMI Yukaridaki konjügatlar, kendisine yönelik olarak üretilen antipsikotik ilaca (olanzapin) baglanan antikorlarin üretimi için faydalidir. Bu antikorlar analizlerde anti-psikotik ilacin hasta numunelerinde varligini ve/veya miktarini belirlemek için kullanilabilir. Bu tip bir tayin terapötik ilaç izlemini mümkün kilarak bu izlemin tüm faydalarini saglar. Anti-psikotik ilaçlarin düzeylerinin tayini, sunlar da dahil olmak üzere birçok amaç için kullanilabilir: risperidon, paliperidon, ketiapin, aripiprazol ve bunlarin metabolitlerinden olusan gruptan seçilenler de dahil olmak üzere diger anti-psikotik ilaçlar ile kombinasyon halinde tayin (bu tip bir tayin, bu anti-psikotik ilaçlarin eszamanli ölçümünü saglar); hastanin reçete edilen tedaviye bagliligini veya uyumunu belirleme; bir hastanin bir oral anti-psikotik rejimden bir uzun etkili enjekte edilebilir anti-psikotik rejime geçmesi gerekip gerekmedigini belirlemek için bir karar araci olarak kullanim; etkili veya güvenilir ilaç düzeylerini elde etmek veya idame ettirmek amaciyla oral veya enjekte edilebilir anti-psikotiklerin doz düzeyinin veya doz uygulama araliginin artirilmasi veya azaltilmasinin, gerekip gerekmedigini belirlemek için, bir karar araci olarak kullanim; anti-psikotik ilaç tedavisinin baslangicinda minimum pK düzeylerinin elde edildigine dair kanit saglamak suretiyle bir yardimci olarak kullanim; çok sayida formülasyonda bulunan veya çok sayida kaynaga ait olan anti- psikotik ilacin biyoesdegerligini belirlemeye yönelik kullanim; polifarmasi ve potansiyel ilaç-ilaç etkilesimlerinin etkisini degerlendirmeye yönelik kullanim ve bir hastanin bir klinik deneye dahil edilip edilmeyecegine dair bir gösterge olarak ve akabinde klinik deney ilaç gerekliliklerine bagliligin izlenmesi için bir yardimci olarak kullanim. Buradaki bilesikler ile birlikte bir immünojenik tasiyici içeren bulus konusu konjügatlarin saglanmasi halinde, anti-psikotik ilaca baglanan antikorlar, örnegin poliklonal, monoklonal, kimerik ve hümanize antikorlar üretilebilir. Özellikle öngörülen bu tip antikorlar, monoklonal ve poliklonal antikorlari ve ayrica bu antikorlarin antijen baglanma domenini ve/veya bir veya daha fazla komplementerlik. belirleyici bölgesini içeren fragmanlarini, örnegin rekombinant proteinleri kapsar. Antikor tercihen ilaca ve arzu edilen farmakolojik olarak aktif' herhangi bir metabolite baglanacaktir. Bir ilaç konjügatinda bir immünojenik tasiyicinin baglanma yerinin degistirilmesi yoluyla antikorlara seçicilik ve metabolitlerle ve/veya ilgili ilaçlarla çapraz reaktivite kazandirilabilir. Olanzapin için, ilgili ilaç klozapin ile çapraz reaktivitesi, arzu edilebilir veya edilmeyebilir, ve olanzapin metabolitleri, örnegin lON-gluronit veya 4-N-desmetil olanzapin ile çapraz reaktivite, arzu edilebilir veya edilmeyebilir. Bu ilaçlarin ve/veya metabolitlerin birçogunu saptayan antikorlar ya da her birini ayri olarak saptayan antikorlar üretilebilir (dolayisiyla antikorun "spesifik baglanma" özellikleri tanimlanabilir). Bir antikor, bir veya daha fazla bilesige baglanimi esmolar veya büyük ölçüde esmolar oldugunda bir veya daha fazla bilesige spesifik olarak baglanir. Bu tip antikorlarin üretim yöntemleri, bir konakçinin mevcut bulusun özelliklerine sahip konjügat (bir immünojen olarak bilesik ve immünojenik tasiyici) ile asilanmasini içerir. Uygun konakçilar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla fareler, siçanlar, hamsterler, kobaylar, tavsanlar, tavuklar, esekler, atlar, maymunlar, sempanzeler, orangutanlar, goriller, insanlar ve bir olgun immün yanit olusturma kapasitesine sahip herhangi bir türü kapsar. Bagisiklama prosedürleri ilgili alanda layikiyla bilinir ve "The Publishing Group, 2000) ve içerisinde atif yapilan referanslar gibi çok sayida bilimsel eserde ve yayinda bildirilir. Tercihen, mevcut bulusun özelliklerine sahip bir immünojen bir konakçi bireye, örnegin bir hayvana veya insana bir adjuvan ile birlikte verilir. Uygun adjuvanlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Freund adjuvani, toz alüminyum hidroksit (alum), Bordetella. pertussis ile birlikte alüminyum hidroksit ve monofosforil lipit A-sentetik trehaloz dikorinomikolati (MPL-TDM) Poliklonal antikorlar bir memeli konakçida istege bagli olarak bir adjuvan ile birlikte uygulanabilen bir immünojenin bir veya daha fazla enjeksiyonu ile uyarilabilir. Tipik olarak, bir immünojen ya da bir immünojen ve bir adjuvan kombinasyonu bir memeli konakçiya bir veya daha fazla subkütanöz veya intraperitoneal enjeksiyon ile uygulanabilir. Bagisiklama programi tercihen en az bir hafta ve daha çok tercih edildigi haliyle iki veya daha fazla hafta boyunca uygulanir. Bu sekilde üretilen poliklonal antikorlar ilgili alanda iyi bilinen yöntemlerle izole edilebilir ve saflastirilabilir. Monoklonal antikorlar örnegin Kohler ve Milstein, Nature 256:495- 497 (1975) referansli yayinda açiklanan layikiyla bilinen hibridoma yöntemleriyle üretilebilir. Hibridoma yöntemleri tipik olarak bir konakçinin veya bir konakçidan alinan lenfositlerin bagisiklanmasini, lenfositleri salgilayan veya salgilama potansiyeline sahip olan monoklonal antikorun toplanmasini, lenfositlerin ölümsüzlestirilmis hücrelerle kaynastirilmasini ve arzu edilen monoklonal antikoru salgilayan hücrelerin seleksiyona ugratilmasini içerir. Bir konakçi, bir immünojene spesifik antikorlari üreten veya üretme kapasitesine sahip olan lenfositleri uyaracak sekilde bagisiklanabilir. Alternatif olarak lenfositler in vitro olarak bagisiklanabilir. Insan hücreleri arzu edildiginde periferik kan lenfositleri kullanilabilir, ancak dalak hücreleri veya diger memeli kaynaklara ait lenfositler tercih edilir. Lenfositler örnegin polietilen glikol gibi bir füzyon maddesinin kullanimiyla kolaylastirilabilen bir proses olarak hibridoma hücrelerini olusturmak üzere bir ölümsüzlestirilmis hücre dizisiyle kaynastirilabilir. Örnek olarak, transformasyon yoluyla ölümsüzlestirilmis mutant kemirgen, sigir veya insan miyelom hücreleri kullanilabilir. Kaynastirilmis olmayan ölümsüzlestirilmis hücrelere kiyasla, hibridoma hücrelerinin büyük ölçüde saf popülasyonlari tercih edilir. Bu nedenle füzyondan sonra hücreler, örnegin hipoksantin guanin fosforibosil transferaz (HGPRT) enziminden yoksun mutant miyelom hücreleri kullanilarak, kaynastirilmis olmayan ölümsüzlestirilmis hücrelerin büyümesini veya sagkalimini inhibe eden uygun bir ortamda büyütülebilir. Böylesi bir durumda HGPRT'den yoksun hücrelerin büyümesini engellemek ve ayni zamanda hibridomlarin büyümesini saglamak için ortama (HAT ortami) hipoksantin, aminopterin ve timidin ilave edilebilir. Ölümsüzlestirilmis hücreler tercihen etkili bir sekilde kaynasir, HAT gibi bir ortamda seleksiyon yoluyla karisik popülasyonlardan izole edilebilir ve füzyondan sonra antikorun stabil ve yüksek düzeyli ekspresyonunu destekler. Tercih edilen ölümsüzlestirilmis hücre dizileri, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (Manassas, VA) temin edilebilen miyelom hücre dizilerini kapsar. Hibridoma hücreleri antikoru genelde hücre disina salgiladigindan, kültür ortamlari, anti-psikotik ilaca spesifik monoklonal antikorlarin varligi için analiz edilebilir. Monoklonal antikorlarin baglanma spesifikligini ölçmek için radyo immün analiz (RIA) veya enzime bagli immünsorban analizi (ELISA) gibi in vitro baglanma analizlerinin immün presipitasyonu kullanilabilir. Monoklonal antikor salgilayici hibridoma hücreleri sinirli seyreltme prosedürleriyle tekli klonlar halinde izole edilebilir ve alt kültürlenebilir. Uygun kültür ortamlari, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Dulbecco'nun Degistirilmis Eagle Ortami, RPMI- 1640 ve polipeptit içermeyen, polipeptidi azaltilmis veya serum içermeyen ortamlar, örnegin Ultra. DOMA PF veya HL-l'i (Biowhittaker, Walkersville, MD) kapsar. Alternatif olarak hibridoma hücreleri in Vivo olarak assit halinde büyütülebilir. Monoklonal antikorlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla polipeptit A-SEPHAROSE, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, siyaliz, amonyum sülfat presipitasyonu ve afinite kromatografisi de dahil olmak üzere konvansiyonel immünglobülin (Ig) saflastirma prosedürleriyle bir kültür ortamindan veya assit sivisindan izole edilebilir ve/Veya saflastirilabilir. Monoklonal antikorlar ayrica rekombinasyon yöntemleriyle, örnegin U.S. Patent No. 4,166,452'de açiklanan yöntemlerle üretilebilir. Monoklonal antikorlari kodlayan DNA konvansiyonel prosedürlerle, Örnegin murin agir ve hafif antikor zincir genlerine, tercihen anti-psikotik ilaçlara spesifik antikorlari salgilayan monoklonal antikor hibridoma hücre dizilerinden izole edilmis prob DNA'ya spesifik olarak baglanan oligonükleotit problari kullanilarak izole edilebilir ve sekanslanabilir. IMMÜN ANALIZLERI Bu sekilde üretilen antikorlar immün analizlerde antipsikotik ilaci tanima/antipsikotik ilaca baglanma için kullanilabilir, böylece ilacin bir hasta numunesinde varligi ve/veya miktari saptanabilir. Analiz formati tercihen bir rekabetçi immün analiz formatidir. Bu tip bir analiz formati ve baska analizler, diger yerlerin yani sira, Hampton Vd. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS 1983) tarafindan açiklanir. Yukarida tarif edilen bir antikoru içeren bir reaktif kiti de saglanabilir. Bir temsili reaktif kiti, anti-psikotik ilaca (olanzapin) baglanan bir antikor, bir anti-psikotik ilacin veya bir türevinin bir analogunu bir isaretleme grubuna kenetli halde içeren bir kompleks ihtiva edebilir ve istege bagli olarak ayrica bir anti-psikotik ilaci veya ilgili bir standardi bilinen bir miktarda içeren bir veya daha fazla kalibratör ihtiva edebilir. Yukarida belirtildigi üzere reaktif kitleri, ölçülecek analiti bilinen bir miktarda içeren kalibratörler ve/veya kontrol materyalleri içerebilir. Analit konsantrasyonu, bir numune için elde edilen sonuçlarin, bir standart için elde edilen sonuçlarla karsilastirilmasi yoluyla hesaplanabilir. Bir kalibrasyon egrisi olusturulabilir ve sonuç kümelerini iliskilendirmek ve bir numunede bir analitin konsantrasyonunu belirlemek için kullanilabilir. Bir analit, örnegin bir anti-psikotik ilaç içerdigi düsünülen herhangi bir numune, tercih edilen mevcut yapilanmalarin yöntemlerine göre analiz edilebilir. Numune arzu edildiginde ön isleme tabi tutulabilir ve analize müdahale etmeyen uygun herhangi bir ortamda hazirlanabilir. Numune tercihen bir sulu ortam, örnegin bir konakçiya ait bir Vücut sivisi ve en çok tercih edildigi haliyle plazma veya serum içerir. adi geçen bulus sahibi: Remmerie), "Haptens of Olanzapine" (Vekil Referans No. PRD, adi geçen bulus sahibi: Remmerie), "Haptens of Quetiapine" (Vekil Referans No. PRD, PRD, "Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD, "Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof" (Vekil Referans No. CDS, "Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD, "Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD, "Antibodies to Risperidone Haptens and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD, "Antibodies to Aripiprazole and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD85129USPSP, ilk adi geçen bulus sahibi: Hryhorenko), "Antibodies to Olanzapine and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD85133USPSP, ilk adi geçen bulus sahibi: Hryhorenko), "Antibodies to Paliperidone and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD85127USPSP, ilk adi geçen bulus sahibi: Hryhorenko), "Antibodies to Quetiapine and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD85135USPSP, ilk adi geçen bulus sahibi: Hryhorenko), "Antibodies to Risperidone and Use Thereof" (Vekil Referans No. CD baslikli birlikte askida bekleyen basvurular. ÖRNEKLER Mevcut bulusun temsili bilesikleri asagida açiklanan genel sentez yöntemlerine göre sentezlenebilir. Formül (I) bilesikleri ilgili alanin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle hazirlanabilir. Asagidaki örneklerin sadece bulusun örneklerini temsil etmesi ve bulusu herhangi bir sekilde sinirlandirmamasi amaçlanmaktadir. (1-Metil-4-(2-metil-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4- il)piperazin-Z-il)metanamin tert-Butil 3-siyanopiperazin-l-karboksilat THF içindeki bir tert-butil 3-siyanopiperazin-1-karboksilat (21,1 g, 0,1 mol) ve sulu formaldehit (24 g, %37 su içinde) çözeltisine, sodyum siyanoborohidrür (31,5 g, 0,5 mol) küçük porsiyonlar halinde ilave edilmistir. Tepkime karisimi ortam sicakliginda gece boyunca eskitilmis, ardindan su ile seyreltilmis ve etil asetat ile ekstrakte edilmistir. Organik faz doymus sulu sodyum klorür ile yikanmis, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulmus, filtre edilmis, ve vakum altinda konsantre edilmistir. Ham ürün baslik bilesigini elde etmek üzere kolon kromatografisi marifetiyle aritilmistir, lH tert-Butil 3-(aminometil)-4-metilpiperazin-1-karboksilat H2N/\T/"\P;é/ xo/ Adim A'da tarif edilen sekilde hazirlanmis metanol ( içindeki bir tert-butil 3-siyano-4-metilpiperazin-1-karboksilat (10,5 g, 47 mmol) çözeltisine metallik nikel (10 g) ve trietilamin (5 mL) ilave edilmistir. Karisim ortam sicakliginda gece boyunca, hidrojen gazi (50 psi) atmosferi altinda karistirilmistir. Tert- butil 3-siyano-4-metilpiperazin-l-karboksilat tüketilince karisim filtre edilmis ve filtrat, saflastirilmadan bir sonraki adimda kullanilan ham tert-butil 3-(aminometil)-4- metilpiperazin-l- karboksilat elde etmek üzere vakum altinda konsantre edilmistir. tert-Butil 3-((1,3-dioksoizoindolin-2-il)metil)-4-metilpiperazin- 1-karboksilat Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan, tetrahidrofuran (-4-metilpiperazin-1- karboksilat (5,5 g, ham) ve sodyum bikarbonat (2,52 g, 30 mmol) karisimina, tetrahidro furan (20 mL) içindeki bir 2H-izoindol-2- karboksilik asit, 1,3-dihidro-1,3-diokso-, etil ester (6,59 g, 30 mmol) çözeltisi ortam sicakliginda ilave edilmistir. 30 dakika süreyle karistirdiktan sonra, süspansiyon filtre edilmis ve filtrat ham ürün elde etmek üzere konsantre edilmis, bu da, baslik bilesigini elde etmek üzere kolon kromatografisi marifetiyle aritilmistir. lH NMR (, 7.87-7.8O 2-((1-Metilpiperazin-2-il)metil)izoindolin-1,3-diyon 3". < \ Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan metanolik hidrojen klorür içindeki (20 mL) bir tert-butil 3-((1,3-dioksoizoindolin- 2-il)metil)-4-metilpiperazin-1-karboksilat (8,6 g) 1 saat süreyle oda sicakliginda karistirilmistir. Çözücü, sonraki adimda ilave aritma olmaksizin kullanilan, 2-((1-metilpiperazin-2- il)metil)izoindolin-1,3-diyon elde etmek üzere vakum altinda -Metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiyofen-3-karbonitril floro-Z-nitrobenzen (16,92 g, 120 mmol) çözeltisine dimetilsülfoksit içinde potasyum hidroksit (11,2 9, 200 mmol) ilave edilmistir. Reaksiyon karisimi oda sicakliginda gece boyunca karistirilmistir. Karisini su ile seyreltilmis ve ortaya Çikan süspansiyon filtre edilmistir. Filtre edilmis kek, ilave aritma olmaksizin kullanilan kirmizi bir kati seklindeki 5-metil-2-((2- nitrofenil)amino)tiyofen-3-karbonitril elde etmek üzere kurutulmustur. lH NMR: (, 8.27-8.25 6.80 (5, 1H). 2.49(s, 3H). -((2-Aminofenil)amino)-5-metiltiyofen-3-karbonitril Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan, etil asetat içinde (500 ml) bir 5-metil-2-((2-nitrofenil)amino)tiyofen-3-karbonitril ilave edilmistir. Siyah karisini oda sicakliginda gece boyunca hidrojen gazi atmosferi altinda karistirilmistir. LCMS'nin, 5- metil-2- ( (2-nitrofenil) anuno) tiyofen-3-karbonitril' in tamamiyla tüketildigini göstermesi üzerine, karisim.filtre edilmis ve filtrat -((2-aminofenil)amino)-5-metiltiyofen-3-karbonitril elde etmek üzere konsantre edilmistir. 1H NMR ( ö 7.29-7.21 (m, 2-Metil-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,41diazepin-4-amin Bir 2- ((2-aminofenil)amino)-5-metiltiyofen-3-karbonitril, önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanmis, (22,9 g, 100 mmol) içinde izopropanol ( karisimi 80 °C'ye :3 saat süreyle isitilmistir. Ortaya çikan süspansiyon filtre edilmis ve filtre keki kirmizi bir kati seklinde baslik bilesigi elde etmek üzere kurutulmustur. 1H NMR ( ö 2-((1-Metil-4-(2-metil-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4- il)piperazin-2-il)metil)izoindolin-l,3-diyon Bir 2-((1-metilpiperazin-2-il)metil)izoindolin-1,3-diyon, adim D'de tarif edilen sekilde hazirlanmis, (100 mg, 0,38 mmol), 2- metil-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4-amin, adim G'de tarif edilen sekilde hazirlanmis, (150 mg, 0,52 mmol) ve diizopropiletilamin (0,49 9, 3,8 mmol) çözeltisi, dimetilsülfoksit ( içinde, 2 saat süreyle 170 °C'de karistirilmistir. Tepkime su ile seyreltilmis ve etil asetat ile ekstrakte edilmistir. Organik faz konsantre edilmis ve kalinti 15 mg 2-((1-metil-4-(2- metil-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-2- il)metil)izoindolin-1,3-diyon elde etmek üzere kolon marifetiyle saflastirilmistir. lH NMR (, il)piperazin-2-il)metanamin Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan etanolik metilamin e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metil)izoindolen-1,3-diyon, (1,0 g) çözeltisi, ortam sicakliginda gece boyunca karistirilmistir. Çözücü vakum altinda çikarilmis ve kalinti kirmizi bir kati seklinde (l-metil-4-(2-metil-10H- benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metanamin hidroklorür tuzunu elde etmek üzere HPLC yoluyla saflastirilmistir. 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((l-metil-4-(2-metil- lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)metil)asetamit G( ,Ir-**çi ,i Örnek 1'de tarif edilen sekilde hazirlanan 570 pL DMF ve 13,3 pL tributilamin içindeki bir (1-metil-4-(2-metil-10H- benzo[b]tiyeno[2,3-e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z-il)metanamin (10,3 mg, 30,2 pmol) çözeltisine, bir N-(d-maleimidoasetoksi) bir DMF çözeltisi ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon 20 °C'de 18 saat karismaya birakilmistir, akabinde tiyol ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonlarinda oldugu gibi kullanilmistir. (2-Metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tiyeno[2,3- 2-(4-Siyano-2-nitro-fenilamino)-5-metil-tiyofen-3-karbonitril THF (2 mL) içindeki bir sodyum hidrür (%60, 0,58 g) süspansiyonuna, ve 2-amino-5-metil-tiyofen-B-karbonitril (1,10 g, 8,0 mmol), damla damla ilave edilmistir. Karisini gece boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Baska iki seri sodyum hidrür (%60, 0,50 g ve 0,4 g) bir sonraki 6 saat boyunca ilave edilmistir. 3 gün süreyle karistirmadan sonra, karisim buz-su içine dökülmüstür (20 mL) ve 6N hidroklorik asit (7 mL) ile pH 3'e asitlestirilmistir. Çökelti filtre edilmis ve su ile yikanmistir. Kati diklorometan ile ekstrakte edilmistir (35 mL). Çözelti, bir kati seklinde konsantre edilmis ve ilave saflastirma olmaksizin bir sonraki adimda kullanilmistir. LC-MS: m/z . 1H NMR (CDClw lO-Amino-Z-metil-4H-3-tiya-4,9-diaza-benzoff]azulen-7-karbonitril hidroklorür Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan etanol (5 mL) içindeki bir 2-(4-siyano-2-nitro-fenilamino)-5-metil-tiyofen-3-karbonitril süspansiyonuna (0,52 g), kalay klorür (1,36 g, 7,2 mmol) 6 N HCl içinde ilave edilmistir. Karisim, bir 85°C'lik yag banyosu içinde 3 saat süreyle isitilmis ve ardindan buz banyosunda sogutulmustur. Kati filtre edilmis, su ile yikanmis ve bir sonraki adimda ilave saflastirilma olmaksizin kullanilan kahverengi kati seklinde inorganik tuz içeren baslik bilesigini elde etmek üzere kurutulmustur. LC-MS: m/z . 1H NMR (DMSO-d& 2-Metil-10-(4-metil-piperazin-1-il)-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[f]azulen-7-karbonitril Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan, DMSO (6 mL) ve tolüen (6 mL) içindeki bir 10-amino-2-metil-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[t]azulen-7-karbonitril hidroklorür (0,6 g) çözeltisine l- metilpiperazin (4 mL) ilave edilmistir. Karisim 130 °C'lik yag banyosunda 17 saat süreyle isitilmistir. Çözelti konsantre edilmis, etilasetat (50 mL) ile seyreltilmis, su (20 mL) ve tuzlu su (20 mL) ile yikanmis, ve ardindan konsantre edilmistir. Kati diklorometan (10 mL) içinde çözülmüs ve doymus sodyum bikarbonat çözeltisi ile muamele edilmistir. Baslik bilesigi açik sari bir çökelti ile toplanmis, su ve diklorometan ile yikanmis, kurutulmus ve ilave saflastirilma olmaksizin bir sonraki adimda (2-Metil-4-(4-metilpiperazin-l-il)-lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e] H:N v1` y."/ksßx Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan metanol (90 mL) içindeki bir 2-Metil-10-(4-metil-piperazin-l-il)-4H-3-tiya-4,9- diaza-benzo[f]azulen-7-karbonitril, (0,25 g) çözeltisine konsantre HCl ( ilave edilmistir. Hidrojenasyon, 50 psi'de 1 saat süreyle gerçeklestirilmistir. Daha fazla Pd siyahi (147 mg) ilave edilmistir. Karisim, 50 psi'de 22 saat süreyle çalkalanmistir. Katalizör filtre edilmis ve metanol ile yikanmistir. Filtrat konsantre edilmis, doymus sodyum bikarbonat çözeltisi (5 nün ile doygun. hale getirilmis ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. Ürün, silikon kolon marifetiyle aritilmistir. LC-MS: m/z 2-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-1OH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metil)asetamit ,4; "N/&`âßgî JJ: su` Örnek 3'te tarif edilen sekilde hazirlanan 185 pL DMF ve 4,5 pL tributilamin içindeki bir (2-metil-4-(4-metilpiperazin-l-il)-1OH- umol) çözeltisine, süksinimit ester (AMAS, 10 mg/mL, 2,6 mg, 10,2 umol) DMF çözeltisi ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon 20 °C'de 90 dakika karismaya birakilmistir, akabinde tiyol. ile aktiflestirilmis protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metil)heksanamit F.«L ,x»`i""" H *55 `Ez `s Örnek 3'de tarif edilen sekilde hazirlanan diklorometan (4 mL) içindeki bir (2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-1OH- mmol) çözeltisine trietilamin ( ve 6- maleimidoheksanoik N-hidroksisüksinimit ester (53 mg, 0,17 mmol) diklorometan (1 mL) içinde ilave edilmistir. Çözelti 40 dakika süreyle oda sicakliginda karistirilmis, ardindan bir silika kolonu üzerine yüklenmis, trietilamin içeren %3-5 netanol/diklorometan ile elüte edilmistir. Baslik bilesigi, sari bir kati seklinde elde edilmistir. LC-MS: m/z . N-[2-Metil-10-(4-metil-piperazin-1-il)-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit C' 4ß.\`f' HO"/\ 4 LM/"ü s Etil asetat içindeki (50 mL) bir 1-hidroksi-pirrolidin-2,5-diyon ( çözeltisine, 3-klorokarbonil-propiyonik asit metil ester (1,15 g, 10 mmol) ilave edilmistir. Karisim, bir buz banyosunda sogutulmustür. Trietilamin ( damla damla eklenmistir. Ortaya çikan süspansiyon 10 dakika süreyle bir buz banyosunda ve 5 dakika süreyle buz banyosu olmadan karistirilmistir. Beyaz kati filtrasyon yoluyla çikarilmis ve etil asetat ile yikanmistir ( 1* Mc::: J af` H J "N/"s Örnek 3'te tarif edilen sekilde hazirlanan diklorometan (2 nm) içinde bir (2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H- mmol) çözeltisine trietilamin ( ve önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan süksinik asit 2,5-diokso- pirrolidin-l-il ester metil ester, (31 mg, 0,13 mmol) ilave edilmistir. Çözelti 1 saat süreyle oda sicakliginda karistirilmis ve konsantre edilmistir. Ham, bir silika kolonu üzerine yüklenmis, sari bir kati seklinde baslik bilesigi elde etmek üzere amonyum hidroksit içeren %3-5 metanol/diklorometan ile elüte edilmistir. LC-MS: m/z . benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit 1.4-/ Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan THF ( içinde bir N-[2-metil-10-(4-metil-piperazin-1-il)-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit metil ester, (80 mg, 0,18 mmol) süspansiyonuna su ( i1ave edilmis, çözelti 3 saat süreyle oda sicakliginda karistirilmis, seyreltik HCl ile asitlestirilmis ve kuruyana kadar konsantre edilmistir. LC-MS: m/z 442 (ana bilesigin M+l'i). 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((1-metil-4-(2-metil- lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][l,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)metil)asetamit- keyhole limpet hemosiyanin-konjügati fosfat tamponu, 0.46 M sodyum klorür (pH 7.4) içindeki 3.19 mL'lik solüsyonuna DMF içindeki 70.3 üL'lik bir N-süksinimidil-S- asetiltiyoasetat (SATA., 25 mg/mL, 1.75 mg, 7.60 umol) solüsyonu ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 1 saat enkübe edilmistir. Tepkimeye 319 uL 2.5M hidroksilamin, 50mM EDTA, pH 7,0 ilave edilmis ve ortaya çikan çözelti, 25 dakika süreyle 20°C'de bir silindir karistirici üzerinde enkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan KLH-SH'ye (4,29 mL, 12,7 mg 0,127 pmol) Örnek 2'de hazirlanan çözeltinin bir bölüntüsü ( ilave edilmistir, Ortaya çikan bulanik karisim 2 saat süreyle 20°C'de bir silindir karistirici üzerinde enkübe edilmistir. Tepkime, bir 20 pm'lik enjektör filtre içerisinden filtre edilmis, ardindan bir Sephadex G-25 kolonunda 100mM fosfat tamponu, 0,46M sodyum klorür, pH 7.4 kullanilarak saflastirilmistir. 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((l-metil-4-(2-metil- 10H-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)metil)asetamit-sigir tiroglobulin-konjügati Sigir tiroglobulininin (BTG, 20.0 mg, 0.03 umol) 100 mM fosfat tamponu (pH 7.5) içindeki 2.0 mL'lik solüsyonuna DMF içinde 276,0 uL'lik bir N-süksinimidil-S-asetiltiyoasetat (SATA, 25 mg/mL, 6.9 mg, 30.0 umol) solüsyonu ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 1 saat enkübe edilmistir. Tepkimeye 230 pL 2,5 M hidroksilamin, 50 mM EDTA, pH 7.0 ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 15 dakika enkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 5 mM EDTA (pH 6.0) ile saflastirilmistir. Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan BTG-SH'ye (4,73 mL, 14,3 mg, 0,022 umol) Örnek 2'de hazirlanan çözeltinin bir bölüntüsü ilave edilmistir , (. Elde edilen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 3 saat enkübe edilmistir. Tepkime, bir 0,45 üm'lik enjektör filtre içerisinden filtre edilmis, ardindan bir Sephadex G-25 kolonu üzerinde lOOmM fosfat tamponu, 0,14M sodyum klorür, pH 7.4 kullanilarak saflastirilmistir. lOH-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-4-il)piperazin-Z- il)metil)asetamit-ovalbümin-konjügati lOOmM fosfat tamponu, pH 7.5 içindeki 1,2 mL'lik bir ovalbümin çözeltisine (12,0 mg, 0,27 pmol), N-süksinimidil-S- bir DMF çözeltisi ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 1 saat enkübe edilmistir. Tepkimeye 120 pL 2.5M hidroksilamin, 50mM EDTA, pH 7.0'de ilave edilmistir. Elde edilen solüsyon bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 15 dakika enkübe edilmistir. Reaksiyon bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. Önceki adimda açiklandigi sekilde hazirlanan ovalbümin-SH'ye ( Örnek 2'de hazirlanan çözeltinin bir bölüntüsü ( ilave edilmistir. Elde edilen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20 oC'de 3 saat enkübe edilmistir. Tepkime bir Sephadex G-25 kolonu üzerinde 100 mM fosfat tamponu, 0,14M sodyum klorür, pH 7.4 kullanilarak saflastirilmistir. metilpiperazin-l-il)-10H- benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metil)asetamit - keyhole limpet hemosiyanin - konjügati Örnek 7, Adim A'da tarif edilen sekilde hazirlanan KLH-SH'ye (, Örnek 4'de tarif edilen sekilde hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N-((2-metil-4-(4- metilpiperazin-l-il)-10H-benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metil)asetamit çözeltisinin (6,9 umol) 300 uL'lik bir bölüntüsü ilave edilmistir. Elde edilen bulanik karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 2,5 saat enkübe edilmistir. Reaksiyon 0.2 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.46 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. metilpiperazin-l-il)-10H benzo[b]tiyeno[2,3-e][1,4]diazepin-7- il)metil)asetamit-0valbümin-konjügati Örnek 9, Adim A'da tarif edilen sekilde hazirlanan, ovalbümin- SH'ye, (, Örnek 4'de tarif edilen sekilde hazirlanan 2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirrol-l-il)-N- ((2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-benzo[b]tiyeno[2,3- e][l,4]diazepin-7-il)metil)asetamit çözeltisinin 200 uL'lik bir bölüntüsü (10,2 nmoles) ilave edilmistir. Elde edilen karisim bir silindirli karistirici üzerinde 20 °C'de 3 saat enkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda 100 mM fosfat tamponu, 0.14 M sodyum klorür (pH 7.4) ile saflastirilmistir. N-[2-Metil-10-(4-metil-piperazin-l-il)-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[f]azulen-7-ilmetil]-süksinamik asit-sigir tiroglobülin- konjügati Örnek 6'de tarif edilen sekilde hazirlanan bir N-[2-Metil-10-(4- metil-piperazin-l-il)-4H-3-tiya-4,9-diaza- benzo[f]azulen-7- ilmetil]-süksinamik asit, (7,9 mg, 18,0 umol), N- hidroksisüksinimit (NHS, 8,3 mg, 72,0 umol) ve N,N- disikloheksilkarbodiimit (14,9 mg, 72,0 umol) Çözeltisi 500 uL DMF ve 5 (ni tributilamin içinde 18 saat süreyle 20°C'de karismaya birakilmis, protein ile konjügasyon reaksiyonunda oldugu gibi kullanilmistir. çözeltisine 100 mM fosfat tamponu pH 7.5 içinde Adim A'da hazirlanmis (18,0 umol) 500 uL'lik çözelti ilave edilmis. Ortaya çikan bulanik karisim 20°C'de 2,5 saat süreyle silindir bir karistiricida enkübe edilmistir. Reaksiyon 0.45 um'lik bir siringa filtresinden filtrelenmistir ve akabinde bir Sephadex G-25 kolonunda ile saflastirilmistir. Olanzapin için Rekabetçi Immünolojik Test Olanzapin immünojenleri ile bir dizi bagisiklamadan sonra fare kuyrugundan alinan kan numuneleri bir ELISA ile reaktivite için test edilmistir. Hibridoma süpernatanlari da test edilmistir ve asagidaki Tablolar` 1 ve 2'de gösterilen ELISA. verileri birkaç hibridomanin reaktivitesini gösterir (füzyon partneri olarak NSO hücreleri kullanilmistir). Seyrelti Üst faz sonra, sinyallerin Olanzapin için spesifik olup olmadigini belirlemek için rekabetçi ELISA ile test edilmistir. Sekiller l- 3, fare füzyonu ll.l'den kaynaklanan üç temsili hibridomdan elde edilen sonuçlari gösterir. Veriler, klozapine karsi çesitli reaktiviteye sahip olanzapine spesifik reaktivite gösterir. Sekil 4, bir yanal akis analiz cihazinda kullanilan rekabetçi immün analiz formatini gösterir, burada yakalama antikoru, bir Olanzapin klonu, bir florofor ile konjüge olanzapinden olusan. bir tayin konjügati ile birlikte bir çipin üzerine çöktürülmüstür. Sekil 4'te gösterilen bu rekabet formatinda, düsük düzeyli analit (Olanzapin) yüksek sinyal ile sonuçlanir, yüksek düzeyli analit (Olanzapin) ise düsük sinyal ile sonuçlanir. Numunedeki Olanzapin ndktari, herhangi bir ilaç içermeyen bir kontrol numunesine kiyasla floresans kaybindan hesaplanabilir. Olanzapin klonu 35 ile üretilen tipik bir doz tepki egrisi Sekil 5'te gösterilmistir, burada olanzapin klonu 61 Sekil 6'da gösterilmistir ve olanzapin klonu 3Fll ise Sekil 7'de gösterilmistir. SEKIL i Kloz/Olan Rekabeti 30 40 50 Kons, ng/mL Kloz/Oian Rekabeti 8 _______ ~ ----- _D Kons, ng/mL Kloz/Olan Rekabeti 100 1 "-5 80 _` - 1.---. __._`_î 60 H* . M" 40 __k . O' --o-(Jozöl "`"î'".""'" -I-Olanßi Kons, ng/mL Rekabetçi Biçimler: Ab Asagi l 1 : »II I* 7 I . I him" E îsarvi 1! "am + Analit - Sinyal Analit - ' Antikor ___ 7 Analit - Analit . . . Antikor *- * Sinyal Ortalama Alan Olanzapin Ab Kionu 35 Ortalama Pik Alani karsisinda Olanzapin Konsantrasyonunun Test Edilmesi 100 150 200 Konsantrasyön (ng/n'iL) ' »40- Klon 35 Ortalama Alan Olanzapin Ab Klonu 35 Ortalama Pik Alani karsisinda Olanzapin Konsantrasyonunun Test Edilmesi .00 .00 .00 Konsantrasyon (ng/mL) Ortalama Tepe Alani Olanzapin Antikor Degerlendirmesi, Ortalama Pik Alani vs Olanzapin Konsantrasyonu Olanzapin Konsantrasyonu (ng/m L) TR
TR2018/16378T 2012-08-21 2013-08-20 Olanzapin haptenleri. TR201816378T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261691454P 2012-08-21 2012-08-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201816378T4 true TR201816378T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=49081007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/16378T TR201816378T4 (tr) 2012-08-21 2013-08-20 Olanzapin haptenleri.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9303041B2 (tr)
EP (2) EP3492473A1 (tr)
JP (3) JP6171014B2 (tr)
CN (1) CN104854110B (tr)
AU (1) AU2013306018B2 (tr)
CA (1) CA2882454C (tr)
ES (1) ES2701062T3 (tr)
HK (1) HK1211933A1 (tr)
PL (1) PL2888269T3 (tr)
PT (1) PT2888269T (tr)
TR (1) TR201816378T4 (tr)
WO (1) WO2014031587A1 (tr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2888234B1 (en) 2012-08-21 2017-12-06 Janssen Pharmaceutica NV Haptens of aripiprazole and their use in immunoassays
EP3333195B1 (en) 2012-08-21 2020-08-05 Janssen Pharmaceutica NV Antibodies to quetiapine and use thereof
PL2888269T3 (pl) * 2012-08-21 2019-06-28 Janssen Pharmaceutica Nv Hapteny olanzapiny
US20140057303A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof
JP6389176B2 (ja) 2012-08-21 2018-09-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． アリピプラゾールハプテンに対する抗体及びその使用
AU2013305879B2 (en) 2012-08-21 2017-10-12 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to aripiprazole and use thereof
AU2013305965B2 (en) 2012-08-21 2017-08-24 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to paliperidone and use thereof
AU2013305901B2 (en) 2012-08-21 2017-10-26 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to olanzapine and use thereof
US9664700B2 (en) 2012-08-21 2017-05-30 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to risperidone and use thereof
WO2014031645A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc Antibodies to risperidone haptens and use thereof
PT3663317T (pt) 2012-08-21 2023-01-23 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpos para haptenos de quetiapina e sua utilização
EP2888287A4 (en) 2012-08-21 2016-04-20 Ortho Clinical Diagnostics Inc ANTIBODIES AGAINST PALIPERIDONE HAPTENES AND THEIR USE
EP3390449A1 (en) 2015-12-17 2018-10-24 Janssen Pharmaceutica N.V. Antibodies to risperidone and use thereof
AU2016370853A1 (en) 2015-12-17 2018-06-07 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to quetiapine and use thereof
CN110950808A (zh) * 2019-10-30 2020-04-03 杭州博拓生物科技股份有限公司 一种氯氮平人工抗原及其制备方法
CN110938082A (zh) * 2019-10-30 2020-03-31 杭州博拓生物科技股份有限公司 一种奥氮平人工抗原及其制备方法
CN114685527B (zh) * 2020-12-25 2024-03-05 长沙博源医疗科技有限公司 一种奥氮平衍生物、免疫原、抗奥氮平特异性抗体及其制备方法与应用
CN114685477B (zh) * 2020-12-25 2023-11-17 长沙博源医疗科技有限公司 一种利奈唑胺衍生物、免疫原、抗利奈唑胺特异性抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4022780A (en) 1973-03-06 1977-05-10 Imperial Chemical Industries Limited Process for the manufacture of indole derivatives
US4166452A (en) 1976-05-03 1979-09-04 Generales Constantine D J Jr Apparatus for testing human responses to stimuli
ES2153373T3 (es) 1992-05-29 2001-03-01 Lilly Co Eli Derivados de tienobenzodiazepina para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central.
US6034078A (en) 1992-05-29 2000-03-07 Eli Lilly And Company Limited Thienobenzodiazepine compounds
ATE176329T1 (de) * 1992-06-26 1999-02-15 Johnson & Johnson Clin Diag Immunotests unter verwendung von markierten thyronin-analogen
US5395933A (en) * 1992-08-07 1995-03-07 Eastman Kodak Company Carbamazepine hapten analogues
UA76708C2 (uk) * 1999-12-08 2006-09-15 Сінгента Патисипейшонс Аг Антитіло, яке застосовується в імунологічному аналізі зразка для визначення неонікотиноїдного інсектициду, білковий кон'югат для одержання антитіла, спосіб визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набір для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду
US6958156B2 (en) 2000-12-15 2005-10-25 Vyrex Corporation Isoflavone derivatives
ATE380818T1 (de) * 2002-03-28 2007-12-15 Lilly Co Eli Piperazine-substituierte aryl-benzodiazepinen und ihre verwendung als dopaminrezeptor-antagonisten zur behandlung von psychose
PT1546134E (pt) * 2002-08-05 2007-08-10 Lilly Co Eli ''arilbenzodiazepinas substituídas com piperazina''
US7863441B2 (en) * 2003-09-23 2011-01-04 Fermion Oy Preparation of quetiapine
TW200616604A (en) 2004-08-26 2006-06-01 Nicholas Piramal India Ltd Nitric oxide releasing prodrugs containing bio-cleavable linker
CA2577490A1 (en) * 2004-08-26 2006-03-16 Nicholas Piramal India Limited Prodrugs containing alkyldisulfide linker groups
JP2010540920A (ja) * 2007-09-27 2010-12-24 ノバルティス アーゲー 薬物モニタリングアッセイ
US20100069356A1 (en) 2008-09-17 2010-03-18 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Dibenzothiazepine modulators of dopamine, alpha adrenergic, and serotonin receptors
AU2009305203B2 (en) 2008-10-14 2013-03-07 Entasis Therapeutics Limited Fused, spirocyclic heteroaromatic compounds for the treatment of bacterial infections
EP2194048A1 (en) 2008-12-02 2010-06-09 Dirk Sartor Nitrate esters for the treatment of vascular and metabolic diseases
JP5544024B2 (ja) 2009-12-31 2014-07-09 ケムファーム・インコーポレーテッド クエチアピンのアミノ酸結合体、その製造法及び使用法
PL2544536T3 (pl) 2010-03-11 2019-05-31 Kempharm Inc Koniugaty kwasów tłuszczowych z kwetiapiną, sposób ich wytwarzania i stosowania
US8088594B2 (en) * 2010-03-16 2012-01-03 Saladax Biomedical Inc. Risperidone immunoassay
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
JP5757497B2 (ja) * 2010-10-06 2015-07-29 公立大学法人大阪府立大学 シガトキシン類ｃｔｘ１ｂおよび５４−デオキシ−ｃｔｘ１ｂを認識するモノクローナル抗体およびそれを用いるシガトキシン類検出キット
US8969337B2 (en) * 2011-12-15 2015-03-03 Alkermes Pharma Ireland Limited Prodrugs of secondary amine compounds
PL2888269T3 (pl) * 2012-08-21 2019-06-28 Janssen Pharmaceutica Nv Hapteny olanzapiny

Also Published As

Publication number Publication date
PT2888269T (pt) 2019-01-17
WO2014031587A1 (en) 2014-02-27
JP6763000B2 (ja) 2020-09-30
AU2013306018A1 (en) 2015-03-12
JP6171014B2 (ja) 2017-07-26
CA2882454A1 (en) 2014-02-27
JP2017222671A (ja) 2017-12-21
CN104854110A (zh) 2015-08-19
HK1211933A1 (en) 2016-06-03
EP2888269B1 (en) 2018-10-24
JP6423490B2 (ja) 2018-11-14
ES2701062T3 (es) 2019-02-20
CN104854110B (zh) 2016-12-28
CA2882454C (en) 2020-08-11
PL2888269T3 (pl) 2019-06-28
US20140213766A1 (en) 2014-07-31
JP2019034955A (ja) 2019-03-07
EP3492473A1 (en) 2019-06-05
AU2013306018B2 (en) 2017-08-10
JP2015532645A (ja) 2015-11-12
US9303041B2 (en) 2016-04-05
EP2888269A1 (en) 2015-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201816378T4 (tr) Olanzapin haptenleri.
AU2018200435B2 (en) Antibodies to olanzapine haptens and use thereof
AU2017261581B2 (en) Antibodies to aripiprazole haptens and use thereof
CA2882449C (en) Haptens of aripiprazole and their use in immunoassays
EP2888257B1 (en) Haptens of quetiapine for use in immunoassays
EP2888286B1 (en) Antibodies to quetiapine haptens and use thereof
TR201809424T4 (tr) Risperidon ve paliperidon haptenleri.
TR201911272T4 (tr) Paliperidon haptenleri.