CN105601730A - 呋喃妥因半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呋喃妥因代谢物半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述呋喃妥因代谢物半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白连接可以得到呋喃妥因代谢物抗原。所述呋喃妥因代谢物抗原可应用于制备呋喃妥因代谢物特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的呋喃妥因代谢物人工抗原，呋喃妥因代谢物特异性抗体，可用于制备检测呋喃妥因代谢物残留的化学发光酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

呋喃妥因半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原、抗原及其制备方法，具体涉及一种呋喃妥因半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。

背景技术

硝基呋喃类物质（Nitrofurans）是一类人工合成的具有5-硝基呋喃环基本结构的广谱抗菌药物，主要包括呋喃西林（Nitrofurazone）、呋喃妥因（Nitrofurantion）、呋喃唑酮（Furazolidone）和呋喃它酮（Furaltadone）。硝基呋喃类物质对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，在畜禽养殖、水产养殖上应用非常广泛。但硝基呋喃类物质对畜禽有一定的毒性，动物大剂量或长期连续服用硝基呋喃类物质易引起中毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥或瘫痪等，中毒严重时甚至可以引起动物死亡。同时硝基呋喃类物质也是一类具有潜在致癌性和诱导有机体产生突变的物质。1990年7月欧盟颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类物质及其代谢物列为A类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为1.0μg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995年起，欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。欧盟从1997年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。目前，国内外都对呋喃类物质的控制相当严格，各国对于呋喃类物质测定的标准都有明确的规定。

由于呋喃妥因在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时要经常分析其代谢后的产物，检测监管部门就以检测代谢产物为手段达到检测呋喃妥因残留的目的。

呋喃妥因的检测方法分为物理化学法和免疫化学法，前者有液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)，检测的灵敏度均达到ppb(μg/kg)级别。近几年，国内外学者又研发出液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱电喷雾电离质谱法(LC-EITMS)、微生物分析等物理检测新方法，对ELISA方法的应用也有了进一步研究。

化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6~18个月)等优点，其检测限比ELISA和理化检测方法高几个数量级。

发明内容

本发明的目的是提供一种呋喃妥因半抗原及其制备方法和在化学发光试剂盒中的应用。

本发明提供的呋喃妥因半抗原，为式1所示的化合物；

式1。

本发明还公开了式1所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

①10ml单口瓶中投入呋喃妥因代谢物AHD115mg，吡啶2ml，搅拌5min；

②全溶解后降温至0度，加入间羧基苯磺酰氯250mg，0度搅拌1h，恢复至室温反应过夜；

③TLC检测AHD反应完全后，将反应液加入15ml冰水中，搅拌30min，过滤，水洗滤饼，干燥得260mgAHD半抗原。

本发明提供的AHD抗原，是将式1所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述式1所示化合物与BSA偶联得到的AHD抗原的结构示意图见图1。

本发明还公开了所述AHD抗原的制备方法，包括如下步骤：

　　①取上述半抗原115.7mg溶于10.7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应3h；

②称取144.1mgBSA溶于15ml0.1M碳酸缓冲溶液（pH=9.6）中，搅拌10min，充分溶解；

　　③将步骤1的活化液3.6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室温磁力搅拌（400rpm）反应24h；

　　④将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm），1LPB（1×，pH7.2）室温搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用；

所述呋喃妥因代谢物抗原可以作为免疫原制备呋喃妥因代谢物特异性抗体，也可以作为包被原制备化学发光微孔板。

应用呋喃妥因代谢物抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

所述呋喃妥因代谢物抗原、所述特异性抗体均可应用于检测呋喃妥因代谢物。

本发明还公开了应用呋喃妥因代谢物抗原和呋喃妥因代谢物特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫试剂盒。

所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括：包被有呋喃妥因代谢物代谢物抗原的化学发光微孔板、酶标抗体工作液、呋喃妥因代谢物代谢物标准溶液、发光底物液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分析物。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对呋喃妥因代谢物样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的呋喃妥因代谢物抗原，通过免疫动物可产生了针对呋喃妥因代谢物的特异性抗体，用于快速检测食品中的呋喃妥因代谢物残留，具有操作简单、快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。

附图说明

图1为呋喃妥因代谢物抗原的结构示意图。

图2为呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、呋喃妥因代谢物半抗原的制备

呋喃妥因代谢物半抗原的制备方法，具体操作步骤包括：

①10ml单口瓶中投入呋喃妥因代谢物AHD115mg，吡啶2ml，搅拌5min；

②全溶解后降温至0度，加入间羧基苯磺酰氯250mg，0度搅拌1h，恢复至室温反应过夜；

③TLC检测AHD反应完全后，将反应液加入15ml冰水中，搅拌30min，过滤，水洗滤饼，干燥得260mgAHD半抗原。

半抗原的结构式见式1：

式1。

实施例2、呋喃妥因代谢物人工抗原的制备

一、呋喃妥因代谢物免疫抗原的合成

①取上述半抗原115.7mg溶于10.7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应3h；

②称取144.1mgBSA溶于15ml0.1M碳酸缓冲溶液（pH=9.6）中，搅拌10min，充分溶解；

③将步骤1的活化液3.6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室温磁力搅拌（400rpm）反应24h；

④将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm），1LPB（1×，pH7.2）室温搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

免疫原的结构式见图1。

二、呋喃妥因代谢物包被抗原的合成

①取上述半抗原115.7mg溶于10.7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应3h。

②称取96.8mgBSA溶于15ml0.1M碳酸缓冲溶液（pH=9.6）中，搅拌10min，充分溶解。

③将步骤1的活化液3.6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室温磁力搅拌（400rpm）反应24h。

④将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm），1LPB（1×，pH7.2）室温搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

实施例3、呋喃妥因特异性抗体制备

一、呋喃妥因代谢物多克隆抗体的制备

取实施例1制备的免疫原溶液，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用新西兰大白兔作为免疫动物。

免疫过程如下：

首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为2.5mg/只；

加强免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各进行一次加强免疫，将免疫原稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为2.5mg/只；

末次免疫：首次免疫16周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释液，免疫剂量为2.5mg/只。

末次免疫1周后，采血并分离血清，即为免疫原对应的多克隆抗体。

二、呋喃妥因代谢物单克隆抗体的制备

①取实施例1制备的免疫原溶液，按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

②按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

③细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光微孔板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的呋喃妥因等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光微孔板中。同时用PBS取代呋喃妥因作对照，其余步骤同上。若经呋喃妥因阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

④将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×10⁶/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

三、酶标抗体的制备

①称取辣根过氧化物酶（HRP）2mg溶解于0.5mL水中，加入0.5mL0.06mol/LNaIO₄溶液，4℃避光作用30min；

②加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30min；

③加入步骤一制备的呋喃妥因代谢物多克隆抗体或步骤二制备的呋喃妥因代谢物单克隆抗体2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；

④透析液吸至10mL的离心管中，加0.25mL5g/L的NaBH₄溶液，混匀后置4℃2h；

⑤加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后4℃下3000r/min离心25min，弃上清；

⑥将沉淀溶于1.5mL0.02mol/LpH7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/LpH7.4PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS3次)；

⑦将透析袋中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。

四、酶标呋喃妥因代谢物抗体效价的测定

呋喃妥因代谢物标准品购自Sigma公司。

用方阵滴定法确定呋喃妥因代谢物包被抗原和制备的呋喃妥因特异性酶标抗体的工作浓度，呋喃妥因代谢物包被抗原的工作浓度为2μg/L，酶标多克隆抗体的工作浓度为1:5000，酶标单克隆抗体的工作浓度为1:65000。

实施例4、检测呋喃妥因代谢物的化学发光酶联免疫试剂盒及其制备方法

①包被呋喃妥因抗原的化学发光微孔板；

取实施例2制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释，得到蛋白浓度为2ng/mL的包被原稀释液。按每孔100μL包被96孔化学发光微孔板，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6，0.05mo1/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：将BSA10g、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。

②酶标抗体工作液：

将实施例3制备的多克隆抗体用抗体稀释液稀释5000倍或将实施例3制备的单克隆抗体用抗体稀释液稀释65000倍，得到呋喃妥因代谢物抗体工作液。

抗体稀释液：取BSA10mg，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000mL，得到抗体稀释液。

③呋喃妥因代谢物标准溶液：将呋喃妥因代谢物溶于pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0.01μg/L、0.03μg/L、0.09μg/L、0.27μg/L和0.81μg/L的标准溶液。将pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液作为标准溶液的阴性对照溶液，称为0溶液。

④发光底物液：发光液由A液和B液组成，A液和B液各一瓶。

A液的制备方法：取0.2g鲁米诺单钠盐、0.1g对碘苯酚、0.16g氯化钠和0.18gEDTA-Na2，用pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液溶解并定容至1000mL。

B液：含0.3mMH2O2、5mMEDTA-Na2的pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液。

⑤浓缩洗涤液：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01MpH值为7.4；

⑥浓缩复溶液：0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液。

实施例5、检测呋喃妥因代谢物的化学发光酶联免疫试剂盒使用方法

一、组织（猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉）前处理方法

①准确称取1±0.01g均质后的组织样品于50mL离心管中；

②依次加入4mL去离子水、0.5mL1MHCl、80μL50mM邻硝基苯甲醛（见7.1），充分涡动至组织分散；

③60℃温箱孵育1h，从温箱中取出，剧烈涡动30s,；

④继续放入60℃温箱孵育0.5h；

⑤依次加入5mL缓冲溶液（见4.2）、400μL1MNaOH和6mL乙酸乙酯；

⑥室温（25±2℃）下，剧烈涡动1min，4000rpm以上，离心10min；

⑦取3mL上清液于新离心管中，50-60℃水浴中，氮气吹干；

⑧加入2mL正己烷，再加入1mL样品稀释液（见7.2），高速涡动30s；

⑨4000rpm以上，离心5min；

⑩完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50μL进行检测。

组织（猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉）样品稀释系数：2

二、应用化学发光试剂盒检测

将50μL各标准工作液/样品溶液分别加入对应的标准/样品孔中；在每孔中加入50μL酶标抗体工作液；盖好盖板膜，轻轻振荡化学发光微孔板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应20min；揭开盖板膜；倒掉板孔中液体，在每孔加入260μL洗涤工作液，浸泡15~30s；再重复上一步骤3次；倒掉板孔中液体，将化学发光微孔板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每孔中加入50μL发光底物A液、发光底物B液按体积1:1混合的混合液；盖好盖板膜，轻轻振荡化学发光微孔板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应5min；揭开盖板膜，放入化学发光仪内读取发光值。

三、标准曲线的制作

每个浓度的标准溶液的发光强度平均值（RLU）除以0溶液的发光强度平均值（RLU₀），再乘以100%，即抑制率。计算公式：抑制率（%）=RLU/RLU₀×100%。以标准溶液中的呋喃妥因代谢物浓度（μg/L）的半对数值为X轴，抑制率为Y轴，绘制标准曲线图。

根据标准曲线的回归方程可以求出待测样品溶液中呋喃妥代谢物的浓度。本发明中检测结果的分析可以利用专业软件，可以实现大量样品的快速分析，整个检测过程只需30分钟就可以完成。为方便检测人员计算结果，专业软件在绘制完成标准曲线后，再次以标准溶液中的呋喃妥因代谢物浓度（μg/L）替代标准溶液中的呋喃妥因浓度（μg/L）的半对数值。最终得到的标准曲线如图2所示。抑制率（RLU/RLU₀）为50%时对应的标准溶液中的呋喃妥因浓度即为IC₅₀值。根据标准曲线图，本发明所提供的呋喃妥因化学发光酶联免疫试剂盒IC₅₀=0.05μg/L。

四、样品中呋喃妥因浓度的测定

用每个检测样品溶液的发光强度平均值(RLU)除以0溶液的发光强度平均值(RLU₀)，再乘以100%，得到抑制率。相对应每一个检测样品溶液的抑制率，则可从标准曲线上读出检测样品溶液的半对数值，再根据样品溶液的半对数值换算出样品溶液中呋喃妥因代谢物的残留量，最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样品中呋喃妥因代谢物的浓度。

实施例6、呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫试剂盒检测效果评价

一、试剂盒灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样品，按实施例5的使用方法进行检测，计算空白样品发光强度值（RLU）的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的样品浓度，计算各对应浓度值的标准差（SD），由平均值加三倍标准差即为该样品的最低检测限（LOD），结果见表1。

表1试剂盒在猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉中的最低检测限

样品	样品平均值（μg/kg, n=20）	SD（n=20）	LOD（μg/kg）
				猪肉	0.019	0.003	0.028
鸡肉	0.020	0.003	0.029
				鱼肉	0.018	0.004	0.030
虾肉	0.017	0.005	0.032

二、准确度和精密度试验

向不含呋喃妥因代谢物的猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样品中添加呋喃妥因代谢物标准品，使呋喃妥因代谢物标准品在猪肉、鸡肉样品中的终浓度分别为0.15、0.3、0.6μg/kg；在鱼肉、虾肉样品中的终浓度分别为0.25、0.5、1.0μg/kg，将添加后的样品分别按照实施例5中所述方法进行前处理，得到检测样品溶液。

从3个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实施例5中所述，每个样品重复5次，分别计算批内批间变异系数。结果分别见表2~5。

结果表明：猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样品的平均添加回收率在75.0~100.0%，说明试剂盒的准确度良好；批内变异系数在4.2~10.0%，批间变异系数在4.5~8.1%。批内批间变异系数均＜10%，说明试剂盒的精密性良好。

表2猪肉中呋喃妥因代谢物检测准确度和精密度试验结果

表3鸡肉中呋喃妥因代谢物检测准确度和精密度试验结果

表4鱼肉中呋喃妥因代谢物检测准确度和精密度试验结果

表5虾肉中呋喃妥因代谢物检测准确度和精密度试验结果

三、试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2~8℃，经过15个月的测定，试剂盒的0溶液发光强度值，50%抑制浓度、样品添加回收率均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻9天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少可以保存12个月以上。

四、交叉反应率试验

选择与呋喃妥因结构或功能相似的其他药物按照实施例4所述方法配制标准溶液，并按照实施例5所述方法绘制标准曲线，通过各种药物的标准曲线分别计算其50%抑制浓度。用下列公式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明呋喃妥因化学发光酶联免疫检测试剂盒对呋喃妥因的检测特异性越好。结果见表6。

交叉反应率（%）=（呋喃妥因的IC₅₀值/待测药物的IC₅₀值）×100%

试验结果表明，本发明试剂盒对呋喃妥因交叉反应率100%；对呋喃西林代谢物、呋喃西林、呋喃唑酮代谢物、呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物、呋喃它酮的交叉反应率均小于0.1%，所以试剂盒对呋喃妥因的特异性好，即本发明试剂盒可以检测呋喃妥因代谢物。

表6呋喃妥因试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率（%）
		呋喃妥因	100.0
呋喃西林代谢物	<0.1
		呋喃西林	<0.1
呋喃唑酮代谢物	<0.1
		呋喃唑酮	<0.1
呋喃它酮代谢物	<0.1
		呋喃它酮	<0.1

Claims (10)

1.一种呋喃妥因代谢物半抗原，为式1所示化合物：

式1。

2.式1所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

①10ml单口瓶中投入呋喃妥因代谢物AHD115mg，吡啶2ml，搅拌5min；

②全溶解后降温至0度，加入间羧基苯磺酰氯250mg，0度搅拌1h，恢复至室温反应过夜；

③TLC检测AHD反应完全后，将反应液加入15ml冰水中，搅拌30min，过滤，水洗滤饼，干燥得260mgAHD半抗原。

3.一种呋喃妥因代谢物抗原，是将式1所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

4.根据权利要求3所述呋喃妥因代谢物抗原，其特征在于，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白。

5.权利要求3或4所述的呋喃妥因代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤：

①取上述半抗原115.7mg溶于10.7mlDMF中，搅拌使之充分溶解；加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应3h；

②称取144.1mgBSA溶于15ml0.1M碳酸缓冲溶液（pH=9.6）中，搅拌10min，充分溶解；

③将步骤1的活化液3.6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室温磁力搅拌（400rpm）反应24h；

④将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm），1LPB（1×，pH7.2）室温搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

6.权利要求3或4所述呋喃妥因代谢物抗原在制备呋喃妥因代谢物特异性抗体中的应用。

7.应用权利要求3或4所述呋喃妥因代谢物抗原制备得到的特异性抗体。

8.权利要求3或4所述呋喃妥因代谢物抗原、权利要求7所述特异性抗体在检测呋喃妥因代谢物中的应用。

9.应用权利要求3或4所述呋喃妥因代谢物抗原、权利要求7所述特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

10.权利要求9所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有呋喃妥因代谢物抗原的化学发光微孔板、酶标抗体工作液、呋喃妥因代谢物标准溶液、发光底物液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。