CN106754741A - 一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株2G9A3‑35H11，保藏编号为CCTCC NO:C2015141。本发明以AHD‑CP与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后得到的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株在体外培养时可大量分泌的抗AHD衍生化产物的特异性抗体，可用于呋喃妥因代谢物的快速、准确免疫检测和免疫分析。

Description

一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及 其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
呋喃妥因(Nitrofurantoin，CAS No.67-20-9)，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。
由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物1-氨基-乙内酰脲(AHD)作为残留标示物判定动物养殖过程是否使用呋喃妥因。
目前，AHD残留的检测方法主要有液相-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)，LC-MS/MS法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入和产地准出制度实施后对检测方法时效性的需求。ELISA和GICT是利用抗体与抗原的高特异性、高灵敏度反应为核心发展起来的免疫学检测方法。ELISA方法的优点是灵敏度高、设备简单、可实现高通量定量检测；缺点是试剂盒需冷藏保存、反应过程需控制温度，主要适用于大批量样品的检测和基层实验室应用。GICT法检测灵敏度略低于ELISA法，但具有操作简便、快速、且试剂盒可在常温保存等优点，尤其适合开展快速检测。
开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果出现假阳性或假阴性问题，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，如CN 105586316 A公开了的一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体制备方法，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗1-氨基-乙内酰脲的单克隆抗体。
一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015141；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒或试纸条中的应用。
本发明提供了一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞。
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
所述1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～60:1；所述偶联物的偶联率为3～20:1。
具体地，步骤(1)中，利用对醛基苯甲酸对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)进行衍生化，衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(AHD-CP)与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联生成AHD-CP-BSA，高分辨率离子肼质谱法对联物进行验证。
作为优选，AHD-CP与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30:1；所述偶联物的偶联比平均值为5.48:1。
步骤(2)中，所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，用AHD-CP与AHD-CP–OVA(AHD-CP与卵清蛋白偶联物)进行竞争法筛选、经克隆后，获得所述杂交瘤细胞株。
作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。所述骨髓瘤细胞为复壮的SP2/0细胞。
所述杂交瘤细胞株的抗体基因型：重链(IgG)V基因为Musmus IGHV6-6*02F，J基因为Musmus IGHJ1*03F，D基因为Musmus IGHD2-5*01F；轻链(kappa)V基因为Musmus IGKV9-124*01F。
本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1k链，与呋喃妥因代谢物有特异性反应。
作为优选，所述单克隆抗体通过杂交瘤细胞株或其传代细胞株体外培养的方式获得。
具体地，本发明采用杂交瘤细胞株或其传代细胞在1640培养基中培养，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，再利用硫酸铵沉淀法和透析法获得初步纯化的抗体。
本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留1-氨基-乙内酰脲中的应用。
本发明还提供了一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒，含有所述的单克隆抗体。
具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、酶标板、1-氨基-乙内酰脲标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有呋喃妥因代谢物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的1-氨基-乙内酰脲量成反比。根据1-氨基-乙内酰脲标准品做出的标准曲线，计算出样品中的呋喃妥因代谢物的含量。
本发明还提供了一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金或酶标记的所述的单克隆抗体。
本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有AHD-CP-牛血清蛋白偶联物(AHD-CP-BSA)，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗选用羊抗鼠IgG。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明以AHD-CP与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后得到的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株在体外培养时可大量分泌抗AHD衍生化产物的特异性抗体，可用于呋喃妥因代谢物的快速、准确免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为免疫抗原(AHD-CP-BSA)的质谱图；
图2为生物膜干涉法验证阳性克隆抗原-抗体间亲和力；
图3为生物膜干涉法测试不同浓度AHD-CP对抗原-抗体反应的抑制效果；
图4为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11的染色体标本；
图5为单抗对AHD-CP竞争ELISA的标准曲线；
图6为重组纯化蛋白(Protein G)纯化抗体电泳图；
图7为免疫胶体金试剂条检测添标样本及同类药物交叉反应试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
杂交瘤细胞株2G9A3-35H11于2015年8月26日送达中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，该细胞株的存活性于2015年9月10日检测结果为存活，保藏编号CCTCC No:C2015141。
该杂交瘤细胞株通过呋喃妥因代谢物的衍生物(AHD-CP)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(AHD-CP-BSA)为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫后小鼠的脾脏细胞与经复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经过筛选和6次克隆获得。具体过程如下：
1、半抗原合成
称取300mg对4-羧基苯甲醛(4-Carboxybenzaldehyde,4-CBA)于1mL蒸馏水中，滴加二甲基亚砜(DMF)至4-CBA完全溶解，搅拌中加入100mg呋喃妥因代谢物1-氨基-2-乙内酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)，37℃反应16h，冷却至室温，过滤水洗得白色固体即为呋喃妥因代谢物的4-羧基苯甲醛衍生物(AHD-CP)。
2、抗原的合成
2.1免疫抗原合成
2.1.1称取28mg AHD-CP溶于2mL DMF，搅拌中加入30mg DCC，15mg NHS，4℃反应4h，4000r/min离心10min，上清液为A液。
2.1.2称取牛血清白蛋白(BSA)250mg，溶于10ml 0.1mol/L PBS(pH＝8.0)缓冲溶液中，加入DMF 1mL，溶解制备B液。
2.1.3搅拌下A液逐滴加入B液中，密封烧杯，4℃反应16h。
2.1.4将反应液5000r/min离心10min，取上清液，再用PBS(pH＝7.4)4～10℃透析，每天换PBS 3次，透析3天后收集免疫抗原(AHD-CP-BSA)溶液。
2.1.5用考马斯亮蓝染色法测定AHD-CP-BSA(抗原批号：130305-1)浓度为7.45mg/mL。
2.1.6抗原鉴定：用高分辨率离子肼质谱检测AHD-CP-BSA出现双峰，其主峰和次峰分子量分别为67284.7989、71220.4375(见图1)，以相同方法测得BSA分子量为66366.2578，计算偶联比为：
据此得出偶联比分布区间为3～20，且主要集中分布于3～4之间。
2.1.7将抗原分装，于－20℃冰箱保存。
2.1.8通过重复试验AHD-CP：BSA摩尔投料比为6：1～300：1合成的免疫抗原，结合后续的免疫试验结果，发现投料比为30：1～60：1可获得较抗体效价和抑制率较高的动物血清。
2.2包被原合成
将BSA换成100mg OVA，以同样的方法合成包被抗原(AHD-CP-OVA)。
3.免疫动物
首次免疫剂量约为100μg/只，例如取7.45mg/mL AHD-CP-BSA溶液40μL+110μLPBS+150μL弗氏完全佐剂，充分乳化后，免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，每只分4～5点(每点约0.2mL)皮下注射；第2次～第5次免疫抗原剂量为60μg/只，加弗氏不完全佐剂乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫与皮下免疫间隔实施；第5次免疫3周后，以100μg/只的剂量从尾静脉加免。
4.血清抗体的检测
从第3次免疫开始，每次免疫第10天从小鼠尾部或眼框少量采血，用竞争ELISA法检测血清抗体效价和AHD-CP对抗原抗体反应的抑制率。
ELISA检测方法：以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释将AHD-CP-OVA稀释成500ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用；将血清用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)做102～107倍梯度稀释测定抗体效价；用竞争ELISA方法检测抑制率，即在对照孔中加50μL PBS，在竞争孔中加50μL 100ng/mL AHD-CP标准溶液，将血清稀释至适当浓度，对照孔和竞争孔各加入50μL血清稀释液，后续步骤按间接ELISA方法操作；选对照孔OD值为0.8～1.2稀释度的一组计算抑制率。
抑制率(％)＝[1﹣(OD竞争孔-OD空白)/(OD对照孔-OD空白)]×100。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株的脾细胞来源于经6次免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法测得其效价为6.4×105，对100ng/mL AHD-CP标准溶液的抑制率为56％，10天后，以100μg/只的剂量从尾静脉进行第六次免疫，3天后取小鼠脾细胞用于细胞融合。
5.SP2/0骨髓瘤细胞的复壮
将5×106个/mL的SP2/0细胞分多点注入Balb/c小鼠背部皮下，每点0.1～0.2mL，当瘤体膨大至直径为0.3～0.5cm时，融合当天将小鼠引椎处死，在无菌条件下取出瘤体，将其制成细胞悬液，采用密度梯度离心法纯化SP2/0细胞。
6.细胞融合
饲养细胞准备：融合前1天，取一只6周龄的空白小鼠引椎处死，在无菌条件下先后取腹水和脾脏；腹水用1640培养基稀释→400g离心8min→沉淀用1640培养基(含10％胎牛血清)制成40mL细胞悬液；将脾脏研碎→过筛→400g离心8min，沉淀用培养基重新制成悬液，再离心1次→用1640培养基(含10％胎牛血清)制成160mL细胞悬液；取40mL脾脏细胞悬液与40mL腹水细胞悬液混合，以200μl/孔铺4块细胞培养板；其余的脾脏细胞悬液再以200μl/孔，铺6块板；将10板饲养细胞在37℃，5％CO2条件下培养24h。
细胞融合：融合当天，将AHD-CP-BSA免疫后的小鼠引椎处死→在无菌条件下取脾脏→取5.8×107个脾细胞与6.3×106个SP2/0细胞在0.8mL 50％PEG4000介导下融合→经200g，12min低速离心去除PEG后，向融合细胞中慢慢加入40mL 1640培养基(含20％胎牛血清+10％HAT)，小心混匀后→以40μL/孔加入含饲养细胞的培养板中，共铺了10块板。
7.细胞培养
细胞在37℃，5％CO2条件下培养；融合后第1～2周，用1640培养基+12％胎牛血清+2％HAT的选择培养基；第3～4周，将2％HAT改为加2％HT的过渡培养基；第5周后，停用HT，并将胎牛血清添加量降为10％。筛选板在第10天和第20天各补充一次饲养细胞，为了提高细胞活力和分泌抗体的特异性，在细胞培养过程中不添加任抗菌素。
8.阳性孔筛选
细胞融合后第三天开始，每天观察杂交瘤细胞状况，第4天在显微镜观察到已有少量杂交瘤细胞开始增殖→第6天，第一次半换液，即每孔吸取100μL培养基上清用于检测抗体，加入100μL新鲜的HAT选择培养基→第7天，阳性孔再取培养基做竞争ELISA检测，根据AHD-CP对抗体-包被抗原(AHD-CP-OVA)ELISA反应的抑制率筛选阳性孔→根据细胞增殖情况，每2～4天做一次半换液，换出了旧培养基用ELISA方法测抗体效价→检出抗体阳性孔，再取样做适当梯度稀释后，检测AHD-CP对ELISA反应的抑制率→选一部分阳性孔用生物膜干涉法验证抗体对抗原亲和力(见图2)和不同浓度AHD-CP对抗体-抗原反应的抑制效果(见图3)。
9、单克隆细胞株的建立
细胞融合后第7天所采集细胞上清中，竞争ELISA检出2G9阳性孔100ng/mL AHD-CP抑制率为85.6％，第8天对其进行单克隆→2G9克隆后第6天，测得A3孔100ng/mL AHD-CP抑制率为88％，10ng/mL AHD-CP抑制率为79％，对其进行亚克隆→2G9A3亚克隆后第10天，测得F1孔1ng/mL AHD-CP抑制率为69％→再经过3次亚克隆获得本次融合的杂交瘤细胞株2G9A3-35H11。
2G9A3-35H11细胞株扩增后，将其F1代冻存10管，F2代冻存35管，F3代冻存80管。其中10管F2代细胞于2015年8月26日送中国典型培养物保藏中心，该培养物的存活性由保藏中心于2015年9月10日检测完毕，结果为存活，保藏编号为CCTCC No:C2015141。
10、杂交瘤细胞染色体标本的制作
取一瓶处于对数生长期的2G9A3-35H11细胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至终浓度为0.1μg/mL，在37℃，5％CO2条件下培养约30min后，刮下细胞，离心去上清，收集细胞；加入8mL 0.075mol/L的氯化钾，低渗处理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)进行预固定，用吸管轻轻吹打混匀细胞，200g离心6min，去上清；再加入8mL固定液，用吸管轻轻吹打混匀细胞，室温下静置30min后，200g离心6min，弃上清液，依法重复固定2次；弃上清液，视细胞数量余留适量固定液，轻轻吹散细胞制备成细胞悬液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的洁净载玻片上，在酒精灯上过火，室温下阴干。将阴干的玻片标本加入Giemsa染液，并进一步做G显带处理。选35个分裂象做众数分析，染色体数目为72-94条，平均染色体数为85条(图4)。
11、杂交瘤细胞抗体基因型检测
刮取处于对数生长期的2G9A3-35H11细胞→离心，去上清→沉淀中加入Trizol裂解细胞→提取RNA→5’RACE反转录cDNA→PCR获得抗体重链/轻链可变区基因→重链及轻链可变区基因克隆测序→3’RACE反转录cDNA→PCR获得抗体重链/轻链恒定区基因→恒定区基因克隆测序→分析测序结果(表1)。
表1抗体基因型分析及等位基因一致性的比较
实施例2
2G9A3-35H11细胞株的F3代用于生产单克隆抗体，抗体的制备方法可采用体内制备法或体外制备法。
1、AHD单克隆抗体的体内制备
6周龄的雄性Balb/c小鼠，提前2周在其腹腔注射0.5mL液体石腊→取2×106的F3代杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔→7～12天后，当小鼠稍有膨大时，再次注射1×106的杂交瘤细胞→2～5天后，当小鼠腹部膨大时，用大号针头抽取腹水→将小鼠引椎处死，用PBS冲洗其腹腔，收集冲洗液，合并入腹水→纯化抗体，每只小鼠可获得5～15mg抗体。
2、AHD单克隆抗体的体外→制备
2G9A3-35H11细胞株接入玻璃细胞瓶，加1640培养基(含10％胎牛血清)，在37℃，5％CO2条件下培养→当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，并将1瓶细胞分成2～4瓶，并加入新鲜培养基；约48小时后，再收集细胞上清液；此后，约2～3天收集1次细胞上清液，并将培养量扩大2～4倍，控制细胞量不超过60％培养瓶底面积。收集细胞上清液立即加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置2～16小时，10000g离心30min；弃上清，沉淀用0.02mol·L- 1PBS溶解，再加入50％试样体积的饱和硫酸铵，摇匀后4℃放置2小时，10000g离心30min，弃沉淀，取上清；加饱和硫酸铵至占总体积的42％，4℃放置2小时后10000g离心30min，弃上清，沉淀经透析后获得初步纯化抗体，测定蛋白浓度。通过10个工作日的培养，可获得2～5g抗体，相比之下，体外制备法的产量和均一性高于体内制备法。将抗体小管分装后，部分冷冻干燥后-20℃保存，其它直接-80℃保存。
将初步纯化抗体梯度稀释后用ELISA方法测定抗体效价为2.4×106；选取20000倍稀释度，分别用0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mLAHD-CP标准溶液做竞争ELISA，测得细胞培养基上清液中单克隆抗体(单抗)对AHD-CP的50％抑制浓度(IC50)为0.332ng/mL(图5)，该单抗与AHD-NP的交叉反应率为106％，与呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺嘧啶等其它类别的抗菌素交叉反应率＜0.5％。
3、抗体亚型的确定
通过IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP检测，本发明细胞株所产抗体亚型为IgG1kchain(kappa chain)。
4、抗体的纯化和保存
用Protein G对抗体进一步纯化，以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH2.8)洗脱抗体后，立即用1mol/L的Tris-HCl(pH＝9.0)将洗脱液pH值调至中性，获得高纯抗体。用间接ELISA方法检测纯化前、后抗体效价，流穿液(CT)中未检测到抗体效价。将纯化后抗体、CT和细胞上清做SDS-PAGE电泳检测，检测结果显示高纯抗体重链和轻链的分子量分别约为55kd和25kd(图6)，无其它杂带，电泳结果表明：抗体已高度纯化，流穿液和细胞上清中的杂蛋白主要是BSA。
将纯化的抗体用30K超滤离心管浓缩至2mg/mL，无菌分装，经冷冻干燥后，密封-20℃保存。
实施例3ELISA方法检测鸡肉中呋喃妥因代谢物(初步纯化抗体的应用)
(1)包被：以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释AHD-CP-OVA至300ng/mL，100μL/孔加入酶标板微孔条中，4℃过夜，洗板后每孔加200μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用。
(2)样本预处理：准备雪山麻鸡胸肌样本3个，称取1±0.05g的均质样本，每个样本称12份，以1-氨基-2-内酰脲(AHD)标准溶液分别做0、0.2、0.5、1.0μg/kg添加回收试验，每个浓度做3个平行。每份试样中加入4mL去离子水、0.5mL 1mol/L盐酸和100μL 0.01mol/L2-硝基苯甲醛(2-NP)溶液，置于56℃水浴2h，加入5mL 0.1mol/L K2HPO4、0.4mL 1mol/LNaOH和5mL乙酸乙酯，旋涡3min，4000r/min离心10min。取出2.5mL乙酸乙酯到另一试管中氮气吹干。用1mL正己烷溶解干燥物，用1mL PBS充分混合，在室温下，4000r/min离心10min，取50μL下层无机相用于分析。
(3)抗体准备：取经初步纯化的抗体，用PBS稀释1000倍，备用。
(4)测定：将样本液和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL的AHD-NP系列标准溶液对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；加系列标准溶液和样本液50μL到对应微孔中；每孔加50μL抗体溶液，用盖板膜盖板后，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板3次；加入100μL酶标二抗，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板6次，用吸水纸拍干；加入100μL显色液，室温避光显色20min；加入100μL终止液；用酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。
(5)结果计算：用标准溶液或样本液的吸光度值(B)比0标准溶液的吸光度值(B0)计算相对吸光度值，用相对吸光度值(％)对应AHD-NP标准溶液自然对数做半对数坐标系统曲线图；对应样本液中AHD-NP浓度从校正曲线算出；
相对吸光度值＝B/B0×100％；
式中A为样本液的相对吸光度值对应的AHD-NP浓度，n为样本稀释倍数，115为AHD的分子量，248为AHD-NP的分子量，m为样本质量。
(6)方法的灵敏度、准确度和精密度：方法最低定量限(LOQ)为0.1μg/kg。添加0.2μg/kg，回收率为69％～123％；添加0.5μg/kg，回收率为70％～110％；1.0μg/kg，回收率为72％～101％。样本变异系数小于20％。
实施例4免疫胶体金(GICT)法检测水产品中AHD残留(高纯抗体的应用)
(1)胶体金溶液的制备：胶体金颗粒的平均大小为30nm，制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入2mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。
(2)胶体金标记AHD抗体的制备：取1mg高纯AHD单抗冻干粉，加水1mL使其溶解，20,000rpm离心30min，取上清液备用→取100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.5→在600转/min搅拌条件下，逐滴加入500μL AHD单抗→搅拌5min，逐滴加入500μL5mg/mLBSA→10min后，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，再搅拌15min→20,000r/min离心15min，弃上清液，加入10mL pH＝7.4PBS缓冲液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH＝7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。
(3)呋喃妥因代谢物免疫胶体金快速检测试剂条的组装
试剂条的各部分组成成分和功能如下：
A、塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。
背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。
B、样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。
C、胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有呋喃妥因代谢物单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。
D、硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
E、吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。
用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记呋喃妥因代谢物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。
检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
(4)样品制备：取经LC-MS/MS检测AHD的南美白对虾、河蟹和青鱼样本各1个，称取2g匀质样本于50mL离心管中，加入4mL去离子水，0.5mL 1M盐酸，0.1mL样本衍生化试剂，充分混合3min；60℃水浴条件下孵育1h；取出后加入5mL 0.1M磷酸氢二钾，0.4mL 1M氢氧化钠，6mL乙酸乙酯，充分混合1min，4000r/min，离心5min；移取乙酸乙酯上层溶液3mL于5mL离心管中，60℃下空气吹干；向吹干的试管中加入1mL正己烷，加盖振荡1min，然后加入0.3mL复溶液，充分混匀，4000r/min，离心1min；吸取0.1mL下层溶液，待检。
(5)GICT法检测：从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；在5～10min读取结果，其他时间判读无效。同时用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测作为对比。
(6)用阴性南美白对虾样本做添标和交叉反应试验：分别添加0.5、1.0、5.0、50μg/kgAHD做添标试验；添加100μg/kgAOZ、SEM和AMOZ做同类药物交叉反应试验；添加200μg/kg青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺二甲嘧啶做不同类型抗菌素的交叉反应试验。添标样本和交叉反应试验样本预处理方法同上。
(7)结果判读
读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。
阴性(－)：T线显色比C线深或一样深，表示样品中呋喃妥因代谢物残留含量低于检出限。
阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中呋喃妥因代谢物残留含量高于检出限；T线显色比C线越浅，表示样品中呋喃妥因代谢物残留含量越高。
无效：未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。
(8)检测结果：所检测虾、蟹、鱼均为阴性样品，与LC-MS/MS检测结果相符；添标样本的检测结果和同类药物的交叉反应情况(见图7)；交叉反应试验表明试剂条上的T线显色均比C线略深，判断为阴性，因此该GICT试剂条与AOZ、SEM、AMOZ、青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺二甲嘧啶的交叉反应率＜1％。

Claims (10)

1.一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11，保藏编号为CCTCC NO:C2015141。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒或试纸条中的应用。
3.一种制备如权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞；
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
其特征在于，所述1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～60:1；所述偶联物的偶联率为3～20:1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
5.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株经体外培养获得所述单克隆抗体。
7.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型为IgG1k链。
8.如权利要求5所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留1-氨基-乙内酰脲中的应用。
9.一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求5所述的单克隆抗体。
10.一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，其特征在于，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的权利要求5所述的单克隆抗体。
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