CN103360321A - 呋喃妥因代谢物半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呋喃妥因代谢物半抗原，其分子结构式如式（1）所示，

Description

呋喃妥因代谢物半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及呋喃妥因代谢物半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

呋喃妥因，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。

由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示物。目前用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS、LC-MS/MS)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。而以抗原抗体特异性反应为基础的免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已在食品安全检测领域得到广泛应用，这为呋喃妥因代谢物的检测提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种呋喃妥因代谢物半抗原及其制备方法。

本发明提供的呋喃妥因代谢物半抗原，分子结构式为：

本发明提供的呋喃妥因代谢物半抗原的制备方法，包括如下步骤：

取呋喃妥因代谢物(AHD)1.15g和20ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，得到A液；取对苯二甲醛2.68～5.36g和50～100ml DMF混合，得到B液；室温下将A液缓慢滴加入B液中，滴加完毕后室温至60℃反应2～4h，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色物质，即为呋喃妥因代谢物半抗原。

本发明的另一个目的是上述呋喃妥因代谢物半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到的呋喃妥因代谢物抗原，及由所得呋喃妥因代谢物抗原免疫动物制备得到的呋喃妥因代谢物抗体，

其中所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，

所述抗体为呋喃妥因代谢物单克隆抗体。

本发明还提供由上述呋喃妥因代谢物抗体制备的酶联免疫试剂盒及其在检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的应用。

本发明提供的呋喃妥因代谢物半抗原既最大程度地保留了呋喃妥因代谢物的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的-CHO，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的呋喃妥因代谢物半抗原在呋喃妥因代谢物的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：呋喃妥因代谢物半抗原合成路线图

图2：呋喃妥因代谢物半抗原核磁共振氢谱图

图3：呋喃妥因代谢物酶联免疫试剂盒标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1  呋喃妥因代谢物半抗原的合成和鉴定

一、呋喃妥因代谢物半抗原的合成(合成路线如图1)

取呋喃妥因代谢物(AHD)1.15g和20ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，得到A液；取对苯二甲醛2.68～5.36g和50～100ml DMF混合，得到B液；室温下将A液缓慢滴加入B液中，滴加完毕后室温至60℃反应2～4h，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色物质，即为呋喃妥因代谢物半抗原。

二、呋喃妥因代谢物半抗原的鉴定

取合成的呋喃妥因代谢物半抗原经核磁共振氢谱测定，如图2所示，图谱中8.0ppm左右的峰为引入苯环上4个H的信号峰，8.4ppm左右的峰为醛基上H的信号峰，9.9ppm左右的峰为烯胺双键上C-H的信号峰，说明半抗原合成成功。

实施例2  呋喃妥因代谢物抗原

将呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白进行偶联得到呋喃妥因代谢物抗原。

一、免疫原的制备——呋喃妥因代谢物半抗原-牛血清白蛋白偶联物合成

取呋喃妥因代谢物半抗原12mg用1ml DMF溶解，得到溶液I；取牛血清白蛋白(BSA)40mg用6ml水溶解，得到溶液II；将溶液I滴加入溶液II中，室温反应24h，得到溶液III；取NaBH414mg用0.2ml 0.1mol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4℃反应2h；用0.01mol/L PBS4℃透析3d，每天换3次透析液，即得到呋喃妥因代谢物免疫原；分装，于-20℃保存备用。

二、包被原的制备——呋喃妥因代谢物半抗原-卵清蛋白偶联物合成

取呋喃妥因代谢物半抗原10mg用1ml DMF溶解，得到溶液I；取卵清蛋白(OVA)36mg用7ml水溶解，得到溶液II；将溶液I滴加入溶液II中，室温反应24h，得到溶液III；取NaBH416mg用0.2ml 0.1mol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4℃反应2h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，即得到呋喃妥因代谢物包被原；分装，于-20℃保存备用。

三、呋喃妥因代谢物抗原的鉴定

将载体蛋白、呋喃妥因代谢物半抗原、呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、呋喃妥因代谢物半抗原、呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联成功，半抗原与牛血清白蛋白的结合比为(18～23)∶1，与卵清蛋白的结合比为(16～20)∶1。

实施例3  呋喃妥因代谢物单克隆抗体

一、呋喃妥因代谢物单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将呋喃妥因代谢物的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射呋喃妥因代谢物的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1∶(50000～100000)。

间接竞争ELISA方法：用呋喃妥因代谢物半抗原-卵清蛋白偶联物包被酶标板，将单克隆抗体工作液与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体混合，室温平衡30min后，与呋喃妥因代谢物标准品溶液同时加入酶标板小孔中，4℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

三、单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将呋喃妥因代谢物标准品、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：呋喃妥因代谢物100％，呋喃妥因13％，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林＜1％，呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物＜0.1％。本发明抗体与呋喃妥因代谢物类似物的交叉反应率较小，说明该单克隆抗体具有较强的特异性。

实施例4由呋喃妥因代谢物单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

(1)包被呋喃妥因代谢物偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)呋喃妥因代谢物单克隆抗体工作液；

(4)呋喃妥因代谢物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.6μg/L、1.2μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)浓缩洗涤液为pH值为7.1～7.6，含有0.8％～1.1％吐温-20、0.02‰～0.04‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH值为7.3～7.9，含有8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，同时采用一步法，节省了检测时间。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样品前处理

(1)猪肉、鸡肉、鱼、虾样本前处理方法

用均质器均质样本后，取(1.0±0.05)g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml去离子水、0.5ml 1mol/L盐酸溶液和100μl衍生化试剂(向15.1mg 2-硝基苯甲醛中加甲醇溶解并定容至10ml)，用振荡器充分振荡2min，37℃过夜孵育(大约16h)；加入5ml 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4ml 1mol/L氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心10min；取2.5ml上层有机相至10ml干燥玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷用涡旋仪涡动1min，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀后转入2ml聚苯乙烯离心管中，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析。

(2)蜂蜜样本前处理方法

称取(1.0±0.05)g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml的去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；加入0.5ml 1mol/L盐酸溶液和100μl衍生化试剂(向15.1mg 2-硝基苯甲醛中加甲醇溶解并定容至10ml)，用振荡器振荡30s，37℃过夜孵育(大约16h)；加入5ml 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4ml 1mol/L氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心10min；取2.5ml上层有机相至10ml干燥玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml的正己烷(或正庚烷)用涡旋仪涡动1min，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀后转入2ml聚苯乙烯离心管中，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析。

(3)牛奶样本前处理方法

取1.0ml牛奶样本，加入4ml去离子水，用涡旋仪涡动混匀，加入0.5ml 1mol/L盐酸溶液和100μl衍生化试剂(将15.1mg 2-硝基苯甲醛溶解于10ml甲醇中)，用振荡器充分振荡，37℃过夜孵育(大约16h)；加入5ml 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4ml 1mol/L氢氧化钠溶液、10ml乙酸乙酯、0.5ml 0.36mol/L二水合亚硝基铁氰化钠溶液和0.5ml 1mol/L七水合硫酸锌溶液，用振荡器剧烈振荡30s，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心10min；取5ml上层有机相至10ml干燥玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷用涡旋仪涡动1min，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀后转入2ml聚苯乙烯离心管中，4000r/min，室温(20～25℃/68～77°F)离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有呋喃妥因代谢物偶联抗原的酶标板微孔中加入呋喃妥因代谢物标准品溶液或样品溶液50μl，再加入呋喃妥因代谢物单克隆抗体工作液与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体浓缩液的混合液(预先将两者按10∶1体积比混合并混匀)50μl/孔，用盖板膜封板，4℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μl，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以呋喃妥因代谢物标准品浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出呋喃妥因代谢物的含量。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本呋喃妥因代谢物浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对动物组织、蜂蜜、牛奶样本的最低检测限均为0.1μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白样本，以0.2、0.4、0.8μg/kg三个浓度的呋喃妥因代谢物对其进行添加回收试验，结果得该方法对动物组织、蜂蜜、牛奶样本的回收率为90％±15％，批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

经测定本发明试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。

Claims (8)

1.一种呋喃妥因代谢物半抗原，其特征在于分子结构式为：

2.一种制备权利要求1所述呋喃妥因代谢物半抗原的方法，其特征在于包括如下步骤：取呋喃妥因代谢物1.15g和20ml N，N-二甲基甲酰胺混合，得到A液；取对苯二甲醛2.68～5.36g和50～100ml N，N-二甲基甲酰胺混合，得到B液；室温下将A液缓慢滴加入B液中，滴加完毕后室温至60℃反应2～4h，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色物质，即为呋喃妥因代谢物半抗原。

3.一种呋喃妥因代谢物抗原，其特征在于由权利要求1所述的呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到，分子结构式为：

4.一种制备如权利要求3所述的呋喃妥因代谢物抗原的方法，其包括如下步骤：

取呋喃妥因代谢物半抗原10～15mg用1ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液I；取载体蛋白30～55mg用5～10ml水溶解，得到溶液II；将溶液I滴加入溶液II中，室温反应24h，得溶液III；取NaBH₄10～20mg用0.2ml 0.1mol/L NaOH溶解后加入溶液III中，4℃反应2h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到呋喃妥因代谢物抗原。

5.一种呋喃妥因代谢物抗体，其特征在于由权利要求3所述的呋喃妥因代谢物抗原免疫动物制备得到。

6.如权利要求5所述的呋喃妥因代谢物抗体，其特征在于所述抗体为呋喃妥因代谢物单克隆抗体。

7.由权利要求6所述的抗体制备的呋喃妥因代谢物酶联免疫试剂盒。

8.权利要求7所述的呋喃妥因代谢物酶联免疫试剂盒在检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的应用。

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