CZ20021969A3 - Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy - Google Patents

Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy Download PDF

Info

Publication number
CZ20021969A3
CZ20021969A3 CZ20021969A CZ20021969A CZ20021969A3 CZ 20021969 A3 CZ20021969 A3 CZ 20021969A3 CZ 20021969 A CZ20021969 A CZ 20021969A CZ 20021969 A CZ20021969 A CZ 20021969A CZ 20021969 A3 CZ20021969 A3 CZ 20021969A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
neonicotinoid
formula
enzyme
sample
Prior art date
Application number
CZ20021969A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303174B6 (cs
Inventor
James Francis Brady
Dana Philip Simmons
Timothy Edward Wilson
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of CZ20021969A3 publication Critical patent/CZ20021969A3/cs
Publication of CZ303174B6 publication Critical patent/CZ303174B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/61—Halogen atoms or nitro radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká imunologických testů pro pesticidy a protilátky a reakčních činidel používaných pro provádění těchto testů. Vynález se dále týká metod provádění těchto testů a souprav obsahujících reakční činidla pro provádění těchto metod. Vynález je zejména použitelný pro detekci a kvantitativní stanovení neonikotinoidních insekticidů ve vzorku.
Dosavadní stav techniky
Insekticidy
Používání syntetických insekticidů pro kontrolu hmyzích škůdců v plodinách patří k obecné praxi. Tato praxe dosáhla vysokého stupně komerčního úspěchu, protože bylo možno prokázat, že tato kontrola může zvýšit výtěžek plodin. Avšak efektivní používání insekticidů vyžaduje solidní management z hlediska rezistence hmyzu, ekologie a rizika kterému jsou pracovníci vystavováni. Jedním z řešení tohoto problému je příprava nových insekticidů tak, aby se snížila potřeba starších akutně toxických insekticidů a snížilo se ekologické zatížení vysokými dávkami.
Jednou novou skupinou insekticidů, která získává signifikantní uznání na trhu jsou tak zvané neonikotinoidní insekticidy Sloučeniny této skupiny zahrnují například sloučeniny imidakloprid, acetamiprid, a thiamethoxam, které • · • 9 • ··· • β • 999 • 4 9 · 4 · 4 9 4 4 4 4 4
4 4 4 * 4 4 4 4 4 4 ·
49 99 99 ·* 9999 jsou popsány v US patentech č. 4742060 a 5304566 a EP580553A2, respektive.
Přímé ošetřování rostlinných materiálů pro množení (jako jsou semena) insekticidy jsou cílem aplikací, které ukazují potřebu pro snižování ekologické zátěže, vystavování pracovníků riziku a vytváření rezistence ať již při aplikaci samotné nebo ve spojeni s insekticidními aplikacemi na list nebo do brázdy. Je však nutný dohled, aby zařízení pro povlékání semen bylo dobře kalibrováno tak, aby insekticid byl stejnoměrně aplikován a zabránilo se tak problémům mezi jiným s insekticidním účinkem a fytotoxicitou semen. Analytické metody, které se používají pro stanovení zda je zařízení pro povlékání semen správně kalibrováno a správně pracuje a zda jednotlivé dávky semen se mohou uvolnit pro odeslání. Tradiční metody pro detekci insekticidních reziduí jsou extrémně časově náročné a nákladné, potože vyžadují vysoce specializované a nákladné analytické metody, jako jsou plynová chromatografie nebo kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností. Obě chromatografické techniky vyžadují nákladné přístrojové vybavení, které je drahé pro udržování a které musí být obsluhováno kvalifikovanými techniky. Zařízení pro ošetřování semen a pěstitelé obvykle takovéto přístrojové vybavení nebo technický personál nemají a tak se semena musí posílat mimo do analytických laboratoří. Jestliže se vzorky analyzují v laboratořích s rychlým obratem, pak zpracovatelské zařízení může dostat analytické výsledky přibližně dvacetčtyři hodin po zaslání. Méně rychlé laboratoře pak poskytují výsledky s větším odstupem. Tyto odklady mají za následek mnohahodinové odstávky strojového vybaveni zařízení pro povlékání. Odklady způsobené posíláním povlečených semen jsou také nezanedbatelné.
• · • φ v Φ φ φ • · · ·
V dosavadním stavu techniky existuje potřeba pro zlepšeni existující měřicí techniky tak, aby byla méně nákladná, účinější a snadněji zvládnutelná. Tyto požadované metody by měly být také použitelné mimo laboratoř za polních podmínek tak, aby poskytly pěstiteli nebo pracovníkům provádějícím ošetřování semen rychlou a spolehlivou informaci o přítomnosti a koncentraci použitých insekticidů ve vzorku semen. Z tohoto důvodu je důležité, aby metody odlišovaly aktivní pesticidní materiál od ostatních produktů a dovolovaly tak kvantitativní stanovení žádoucí aktivní složky přítomné v semenech. Existuje však stále řada vážných omezení v klasických analytických metodách. Některá tato omezení by bylo možno odstranit použitím technologie imunologických testů.
Imunologické testy a detekce pesticidů
Zatímco imunologické testy byly primárně vyvinuty pro lékařské a veterinární použití, mají imunologické testy čím dál více použití v oblasti zemědělství. Například imunologické testy se používají pro detekci a kvantifikaci onemocněni plodin, aflatoxinů a některých antibiotik. Přestože imunologické testy jsou popsány ve vědecké literatuře (viz níže), jsou dostupné na komerční bázi pouze v poslední dekádě.
Imunologické testy se opírají o vysoce specifické protilátky a relativně jednoduché analytické aparatury pro detekci a kvantifikaci širokého rozsahu cílových materiálů. Protilátky, spíše než přístroj nebo podmínky provedení poskytuje analytickou specificitu. Imunologické testy se proto mohou provádět na relativně surových vzorcích. Dále byly imunologické testy optimalizovány pro použití ve vzdálených ne-laboratorních podmínkách, které umožňují jejich použití v polních podmínkách, stejně jako ve specializovaných laboratořích.
• 9 • « ♦ 9·· ·
··· · ·. « .. · ····
Imunologické metody jsou známé pro detekci některých herbicidů, včetně 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70: 874-878 (1986)), chlorsulfuronu (Kelley, M. a j., J. Agric. Food Chem. 33: 962965 (1985)), haloacetamidů (Winzenburger, P. A. a j.. (Evropská patentní publikace EP 340198,1989), a řady jiných pesticidů, včetně diflubenzuronu (Wie, S. 1. a j., J. Agric. Food Chem. 30: 949-957 (1982)), metalaxylu (Newsome, W. H., J. Agric. Food Chem. 33: 528-530 (1985)) a parathionu (Ercegovich, C. D. a j., J. Agric. Food Chem. 29: 559-563 (1981)). Byla popsána také methoda pro imunologickou detekci atrazinu (U.S. patent č. 4,530,786). Jsou také známé imunologické testy pro cyanazin, diclofop-methyl, phentachlorfenol, 2,4,5-T a terbutryn.
Veškeré tyto výše uvedené imunologické metody využívají polyklonálniho antiséra, které bylo získáno z hostitelských zvířat (typicky králíků imunizovaných příslušným antigenem (imunogenem). Nedávno byly objeveny monoklonální protilátky (mAbs) specifické pro atrazin a jeho deriváty a produkty jeho štěpení a použití těchto mAbs v imunologických testech je nárokováno (Schlaeppi ea j., Evropská patentní publikace EP 365818 (1990)).
Vzhledem k jejich nízké molekulární hmotnosti, nejsou insekticidy imunogenní a nevyvolávají specifické protilátky z těla zvířecího hostitele. Proto vývoj insekticidniho imunologického testu vyžaduje řadu stupňů počínaje vytvoření haptenů, to je derivátů insekticidů, které si udržují strukturální specificitu insekticidní molekuly a které současně umožňují připojení na výšemolekulární imunogenní proteinový nosič. Dále pro sledování protilátek během postupu jejich produkce se mohou také připravit další hapteny, « * « ««· «·«« • · ·*· · « ··· · · * jejichž chemické struktury mohou být odlišné od haptenů používaných pro imunizaci zvířat. Konečně, jakmile se získá preparát protilátky (buď polyklonální nebo monoklonální, musí se vyvinout dostatečně citlivý imunologický test.
Základní strategie používané v moderních imunologických testech jsou popsány v řadě odkazů (viz například Voliér, A. a j., eds., Immunoassays For The 80's, University Park, 1981; Voliér, A.,'The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voliér, A. a j., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.}, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boča Raton, Fla., 1980). Základem každého postupu je vytvoření kalibrační křivky použitím známých množství požadovaného analytu.
Metoda značené protilátky se v běžném použití označuje jako imunosorbční test vázaného enzymu (ELISA) . Při něm se proteinový konjugát pesticidu (nazývaný jako coating nebo screening antigen) se připraví použití proteinu, který je strukturně nesouvisející s proteinovým nosičem používaným u pesticidního imunogenu, proti kterému se antipesticidní protilátka má vyvinout. Povlak konjugátu protilátky se imobilizuje na pevné fázi nosiče, jako je povrch jamky mikrodesky, což vede k neměnému množství pevné fáze pesticidu na reakci. Přidá se známé množství protilátky spolu s testovaným vzorkem. Imobilizovaný pesticid konkuruje s volným pesticidem v neznámém vzorku o omezené množství vazebných mist protilátky. Interakce mezi protilátkou a analytem v kapalné fázi inhibuje vazbu protilátky k pesticidu v pevné fázi. Protilátka vázaná na pevnou fázi se detekuje enzymem s konjugovanou sekundární protilátkou specifickou pro konstantní * · • ··· • · • ··· «« «· ·* .« «» «·«· oblast antipesticidnich protilátek s řetězcem o velké hmotnosti. Mnohé sekundární protilátky spojené s enzymem jsou komerčně dostupné pro toto použití. Po vymytí nevázané sekundární protilátky se imobilizovaná sekundární protilátka detekuje typicky přidáním chromogenního substrátu pro enzym, což vede k barevné reakci produktu vzniklého v přímé proporci k množství vázané sekundární protilátky. Množství reakčního produktu je tak nepřímo úměrné k množství analytu v neznámém vzorku.
Modifikace metody značené protilátky eliminuje použití povlečené protilátky. Enzymový imunologický test (EIA) imobilizuje anti-pesticidní protilátku na pevné fázi. Pesticidní hapten se kovalentně váže na enzym, a vzniklý enzymový konjugát se inkubuje se vzorkem v jamkách mikrodesky nebo v kultivačních zkumavkách potažených anti-pesticidní protilátkou. Pesticid ve vzorku konkuruje s pesticidním konjugátem hapten-enzym o vazbu na ímobilizovanou protilátku. Pevná fáze se promývá, aby se odstranila nevázaná látka a protilátka vázaná na enzymový konjugát se detekuje přidáním chromogenního substrátu. Viz například, Bushway, R. J., L. P. Perkins, S. A. Savage, S. L. Lekousi, a B. S. Ferguson. 1988. Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40: 647-654;
Fleeker, J. R. a L. W. Cook. 1991. Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water. str. 7885 v M. Vanderlann, L. H. Stanker, B. E. Watkins, a D. W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington, D. C. : American Chemical Society. Stále však existuje potřeba v oblasti zemědělských metod pro analýzu semen ošetřovaných aktivními látkami, jako jsou insekticidy, které by bylo možno provádět v polních
• · • 0 0 0 0
0 000 0 • 00· 0 0
V · · · · · 0 · 00·
00 *0 ·0 0* 0000 podmínkách nebo v zařízeních, ve kterých se toto ošetření semen provádí.
Podstata vynálezu
Vynález se týká neonikotinoidních haptenů a imunogenů pro vytváření antineonikotinoídních protilátek, jakož i protilátek, metod, reakčních činidel a souprav pro stanovování přítomnosti jednoho nebo více neonikotinoidních insekticidů ve vzorku imunologickým testem. Vynález má zejména použití při stanovování koncentrace neonikotinoidních insekticidů aplikovaných na materiály pro rozmnožování rostlin, jako jsou semena.
Metoda imunologického testu podle vynálezu umožňuje zaměstnacům v zařízeních pro ošetřování semen, ve kterých se neonikotinoidní insekticidy aplikují na semena, aby mohli kvantitativně měřit množství aplikované množství aktivní složky. Metoda zahrnuje rychlou extrakci aktivní složky ze semen a rychlé měření extrahovaného roztoku imunologickým testem. Tato měření se mohou použít pro stanovování zda zařízení pro povlékání je dobře kalibrováno, dobře funguje a zda ošetřená násada semen se může uvolnit pro expedici. Test je označen jako jednoduchý pro provádění vyžadující pouze běžné laboratorní přístroje a reagencie. Proto osoby, které mají zkušenosti s prováděním imunologických testů, jsou schopné úspěšně provádět testy po několika praktických pokusech.
Bylo nalezeno, že antigenní neonikotinoidní konjugáty (imunogeny) se mohou připravit konjugací neonikotinoidního pesticidního haptenu s molekulou nosiče, jako je vyčištěný proteinový derivát (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, • 4 4*
4 • ·· « · · 444· 444
4« 44 44 44 44·· albumin z hovězího séra, albumin z lidského séra, albumin nebo hemocyanin z mořského plže, na neonikotinoidní hapten. Mohou se také připravit konjugáty s derivátizovánými materiály, jako je derivatizovaný albumin z hovězího séra, kationizovaný albumin z hovězího séra a podobně. Víz A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce a J. G. Michael (1987) J. Immunol. 138: 833837. Tyto ímunogeny se mohou injikovat do hostitelských zvířat, které pak vytvářejí protilátky na neonikotinoidní hapten, který je možno sklidit. Tyto protilátky se mohou pak použit v řadě imunologických testů pro detekci odpovídajících neonikotinoídních insekticidů, použitím různých známých značení pro označení buď insekticidu nebo protilátky. V některých provedeních imunologických testů se buď neonikotinoidní insekticidní derivát nebo protilátka imobilizuje. Jak polyklonální a monoklonální protilátky se mohou použít při praktickém provedení podle tohoto vynálezu. Protilátky mohou vykazovat selektivní vazbu na požadovaný neonikotinoidní insekticid (insekticidy) i v přítomnosti jiných pesticidně aktivních složek, včetně neonikotinoídních insecticidů inkorporovaných do formulace pro povlékání semen.
Detekční metody se v praxi podle -tohoto vynálezu mohou aplikovat pro měření neonikotinoídních insekticidů ve vzorcích, včetně v biosenzorech a enzymatických, fluorescenčních a radiometrických systémech. Tyto testy mohou používat heterogenní nebo homogenní úpravu a mohou používat mikrojamkové desky, kultivační zkumavky a latexové kapky nebo částečky pevných fází. .
Imunologické testy podle tohoto vynálezu se používají pro stanovení koncentrací neonikotinoídních insekticidních sloučenin, jako jsou imidacloprid, ni-tenpyram, acetamiprid,
I « · ··· · · ··♦ · · * thiamethoxam, thiacloprid a clothiadin ve vzorcích, jako jsou materiály pro množení rostlin.
Tento vynález poskytuje imunologické testy pro testování vzorků na přítomnost neonikotinoidních insekticidů. V takovémto imunologickém testu se neonikotinoidní reakce (antigen)/protilátka může detekovat různými metodami, použitím různých značkovačů pro označení buď antigenů nebo protilátky, které umožňují detekci reakčního produktu. Dále imobilizace buď antigenů nebo protilátky v mnoha případech usnadňuje detekci
Testy antigen/protilátka se mohou obecně klasifikovat do dvou kategorií, heterogenní a homogenní. Heterogenní testy vyžadují separaci vázané označené složky před detekcí reakčního produktu. Homogenní testy nevyžadují tento separační stupeň. Testy mohou být dále (1) kompetitivní, například, kdy antigen konkuruje s označeným antigenem o protilátku na pevném nosiči (2) nekompetitivní, kde je přímý vztah mezi protilátkou a antigenem.
Metody imunologických testů, které se mohou použít v praxi podle tohoto vynálezu pro stanovení neonikotinoidních insekticidů ve vzorku, zahrnují enzymatický, fluorescenční, chemiluminiscenční a biosensorový imunologický test, jakož i radioimunologický test. V enzymatických imunologických testech (ELISA) , se podle tohoto vynálezu zainteresované hapteny neonikotinoidního insekticidu (insekticidů) mohou značit přímo enzymem nebo nepřímo použitím enzymem značených protilátek, které za vhodných reakčních podmínek katalýzují reakci se substrátem. Enzymová aktivita se běžně detekuje tvorbou barevného reakčního produktu, například, koncového bodu, který • ··· • · • ··· fe · může být snadno detekovaný očima nebo měřitelný spektroskopicky nebo refraktometricky.
Při použití fluoroscenčních imunologických technik podle tohoto vynálezu se hapteny odpovídající zainteresovanému neonikotinoidnímu insekticidu (insekticidům) mohou značit přímo fluorochromem nebo nepřímo fluorochromem značenými protilátkami. Fluorochromy jsou barvivá, která absorbují záření (například ultrafialové světlo) a jsou jim excitovány a emitují světlo (například viditelné světlo).
Při jednom konkrétním provedení podle tohoto vynálezu metoda pro stanovení neonikotinoidního insekticidu ve vzorku zahrnuje stupně:
(a) opatření pevné fáze s imobilizovanou protilátkou selektivní pro tento neonicotinoidní insekticid;
(b) uvedení vzorku ve styk s imobilizovanou protilátkou v přítomnosti známého množství konjugátu neonikotinoidního insecticidu s hapten-enzymem;
(c) promytí pevné fáze ze stupně (b) tak, aby se odstranil jakýkoli nevázaný konjugát nebo vzorek, (d) reakci chromogenního substrátu specifického pro uvedený konjugát hapten-enzym s promytou pevnou fází ze stupně (c) tak, aby se generoval chromogen; a (e) změření množství chromogenu vzniklého ve stupni (d) tak, aby se stanovilo množství protilátky vázané na konjugát hapten-enzym a tak množství neonicotinoidního insekticidu v uvedeném vzorku.
Podle jednoho konkrétního provedení se imunologický test dodává ve formě soupravy zahrnující protilátkou povlečených • · · fc fcfcfcfc fc · · · • · · · fcfc fcfc ·
• fc·· • fcfc · • fc ·· · fcfc • fc· fcfc · fcfcfc • fc fcfcfcfc zkumavek, nikotinoidní hapten-enzymový konjugát, enzymový substrát a roztok pro ukončení produkce kolorimetrického signálu.
Zatímco vynález je často popsán s odkazem na použití polyklonálních protilátek, je odborníkům v oboru známo, že se také mohou použít monoklonální protilátky jako alternativa pro polyklonální protilátky. Výraz protilátky jak je zde použit se týká jak polyklonálních tak monoklonálních protilátek.
Monoklonální protilátky neonikotinoidních insekticidů se při praktickém použití podle tohoto vynálezu připraví použitím imunizace a hybridomových kultivačních technik, dobře známých odborníkům v oboru. Vhodné buněčné linie hybridom se s výhodou připravují fúzí buněk produkujících protilátku a buněk myelomu myších druhů. Buňky produkující protilátky jsou především buňky sleziny. Jakékoli vhodné buněčné linie myelomu se mohou použít, avšak je žádoucí aby se použily dobře charakterizované buněčné linie, z nichž řada se běžně používá.
Stejně tak polyklonální protilátky se mohou také v praxi podle tohoto vynálezu použít pro neonikotinoidní insekticidy technikami známými odborníkům v oboru.
Tento vynález se také týká přípravy polyklonálních IgG protilátek, které váží alespoň jeden neonikotinoidní insekticid, protilátka se připravuje metodou, která zahrnuje:
(a) aplikaci hostiteli předem stanoveného množství směsi obsahující neonicotinoidní insekticid nebo imunologický ekvivalent vázaný na biologicky přijatelný proteinový nosič, (b) odebrání séra z hostitele a (c) čištění IgG protilátky ze séra. Imunologický ekvivalent antigenu má schopnost, jestliže se zavede do hostitele, způsobit tvorbu protilátek na antigen.
• 9 • ··· *V 9· ·♦ 99 * 9 · · 9 9 • · 99« · 9 ·
9 « 9 · 9 9 9 999 9 9 • 99« 9999 999
99 99 9« 99 9999
Jak bylo uvedeno výše, imunologický test podle tohoto vynálezu je zejména aplikovatelný při detekci množství neonikotinoidního insekticidu, který byl aplikován na materiál pro množení rostlin. Pod pojmem materiál pro množeni rostlin se rozumí veškeré generativní části rostlin, které se mohou použít , jako jsou semena, která se mohou použit pro jejich násobení a vegetativní rostlinné materiály, jako jsou řízky a hlízy, například brambory. Je možno uvést například semena (ve striktním slova smyslu), kořeny, plody, hlízy, oddenky a části rostlin. Je možno také uvést klíčící rostliny a mladé rostliny, které se mohou přesazovat po vyklíčení nebo po vynoření z půdy. Tyto mladé rostliny se mohou chránit před přesazením úplným nebo částečným ošetřením ponořením.
Podle jedné konkrétní formy je neonikotinoidní insekticid, který se detekuje testem podle vynálezu reprezentován obecným vzorcem
R2 R1
I I
ve kterém
A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5-ylová skupina,
R a R3 jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,
R' a R2 jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R'a R2 dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny tvoří imidazolidinový nebo oxadiazinový kruh, a «
X je skupina N-NO2 nebo skupina N-CN,
Podle jiné konkrétní formy je neonikotinoidní insekticid detetekovatelný testem podle vynálezu, který je reprezentován obecným vzorcem III ve kterém
A, R3 a X nají význam uvedený ve vzorci I.
Ve výhodném provedení imunologický test podle tohoto vynálezu používá polyklonální protilátky pro neonikotinoidní insekticidy. Tyto protilátky se mohou připravit ze séra imunizovaných zvířat. Imunizace se může provádět tak, že se injikuje imunogen (hapten-PPD antigenní konjugát) do druhu, který produkuje protilátku, běžně savcům a s výhodou králíkům a ovcím. Běžně je počáteční injekce následovaná sérií druhých injekcí tak, aby se maximalizovala tvorba protilátek. Optimálně se injekční režim několika dávek podává samicím bílých Novozélandských králíků. Množství injikovaného imunogenu je proměnlivé, ale musí vyvolávat adekvátní odpověď detekovatelného množství protilátky. Produkce protilátky se může ověřovat analýzou séra získaného v pokusných odběrech krve za použití testů EIA, ELISA nebo nepřímým fluorescenčním imunologickým testem.
Stejná značení, jaká se používají ve známých imunometrických testech, se mohou použít pro značení haptenu používaného v tomto vynálezu. Z nich je možno uvést reportér • · • ···
4 1 9
41
4
44 « · *· ···· molekuly (RM) včetně enzymů, jako jsou alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza a β-galaktozidáza. Kromě toho se mohou použít florescenční, luminiscenční nebo radioaktivní značení, jako je značení fluoresceinem, rhodaminem, luminolem, akridiem a radioaktivními izotopy 251, a podobně, nebo koloidními částečkami, jako je zlato a selenium. Konečně se pro generování časově rozlišitelných signálů také mohou použít lanthanidové chelátové fluorofóry, jako jako je europium a terbium. Nejběžnějším enzymatickým značením je značení křenovou peroxidázou (HRP) a alkalickou fosfatázou.
Podle jedné konkrétní formy se pro detekci množství neonikotinoidu ve vzorku používá spektrofotometr. Avšak metody podle tohoto vynálezu se mohou upravovat odborníky v oboru tak, že se mohou použít i jiné typy chromogenních detektorů. Obdobně detekovatelný reakční produkt není omezen jen na chromofor, ale zahrnuje i jiné značení, jak bylo popsáno výše.
Hapten následujících vzorců I A, I B a II A byly nalezeny jako použitelné při přípravě antigenních neonikotinoidních konjugátů:
Hapten (I A)
CH ve kterém
A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5-ylová skupina, • to • ··· toto •to * to • to·· ·· to »
•to to··· · ·· · toto toto ·· d· ··· •to toto··
R3 je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, R'a R2 jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R’a R2 dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolidinový kruh nebo oxadiazinový kruh, n je celé číslo od 1 do 5 (s výhodou od 3 do 5) a
X je atom kyslíku, skupina N-NO2 nebo N-CN.
Hapten (I B)
Ve kterém A, R', R2, R3 a X mají význam uvedený ve vzorci I A a
E je jednoduchá kovalentní vazba nebo spojující část vzorce - (CH2)m-, kde m je celé číslo od 1 do 3.
Hapten (III A)
A. M .S
:iii a)
Ff X ve kterém A, R3, X a n mají význam definovaný u vzorce (IA) .
Hapten (IIIB) • 4 · » • *
ve kterém
A, R3 a X mají význam definovaný u vzorce (I A) a E má význam definovaný u vzorce (I B).
Hapteny vzorců (III A) a (III B) se mohou připravit analogicky podle následující metodologie:
co,h
Z, hschch2nh2
derivát
2-aminoethanthiolu
N-kyano-imido)karbonát (HIC)
K2C03
-► substituovaný 2-(N-kyanoimino)thiazolidin
Požadovaný hapten (III A) nebo (III B) se připraví použitím příslušného derivátu 2-aminoethanthiolu vybraného ze hschch2nh2 (IIID) jCH2)n
COjR
* · · « ·· ·· • « • ♦ ·· b · · 1 ·· ·· ve kterých
R má význam uvedený u vzorce I.
Bylo nalezeno, že následující hapteny jsou použitelné v praxi podle tohoto vynálezu:
ve kterých n je v každém případě celé číslo od 1 do 5, s výhodou od 3 do
5.
Antigenní neonikotinoidní konjugáty (imunogeny) a konjugáty pro testy se mohou připravit konjugací neonikotinoidního pesticidního haptenu na molekulu nosiče nebo na molekulu přenašeče, jak tomu může být v případě použiti technik známých odborníkům v oboru. Mohou se použít dva základní přístupy. Prvý používá vazeb, které se stájí částí konjugátu. Tyto vazby jsou homobifunkční nebo heterobifunkční a zahrnují ty, které jsou schopné tvorby, například disulfidové vazby přes thiolové skupiny cysteinových částí molekuly v proteinovém substrátu nebo tvorby amidových vazeb
Β « ·· * ·*· řetězce nebo zbytkem lysinu a aktivovanými acylovými částmi, jako jsou sukcinimidylové estery.
Obecně tento přístup zahrnuje vysoce reaktivní funkční skupiny na spojovací části a je dostatečně snadný z hlediska substrátu pro konjugaci. Je však často nutné používat i funkční skupiny, které jsou méně reaktivní, jako jsou ty, které jsou schopné tvorby hydrazonu.
Druhý přístup, který je zejména vhodný pro konjugaci dvou proteinových částí používá dehydratační činidlo, jako je karbodiimid pro vytvoření nové peptidické vazby reakcí karboxylové části molekuly na jednom členu konjugátu a volné aminoskupiny na druhém. V tomto případě reakční činidlo se nestane částí konjugátu. Reakce není příliš snadná protože karboxylová skupina není aktivovaná, karbodiimid poskytuje aktivní meziprodukt a posunuje rovnováhu tím, že se odstraňuje voda za vytvoření peptidické vazby.
Oba přístupy pro vytvoření konjugátu se provádějí ve vodných rozpouštědlech protože proteinový materiál tvořící konjugát se snadno denaturuje. Proteiny jsou stabilní ve vodném prostředí a je známo, že se denaturují i v rozpouštědlech, jako je ethanol, o kterém by bylo možno uvažovat jako o přiměřeně analogickým k vodnému prostředí. Také proteinové konjugátové komponenty mají tendenci být poměrně nerozpustné v nevodných rozpouštědlech.
Bylo nalezeno, že haptenové konjugáty následujícího obecného vzorce II jsou užitečné v praxi podle tohoto vynálezu:
• «·· • 9 * 9·· · 99 9 9
R2 R1
JY X (II)
ΙΉ—FR ve kterém A, R1, R2, Rs, n a X mají významy uvedené u vzorce I A výše a PR je zbytek proteinu:
(1) molekuly nosiče, jako je vyčištěný derivát proteinu (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin hovězího séra, lidský sérový albumin, albumin nebo klíčový hemokyanin mořského plže v případě imunogenu, nebo (2) přenosová molekula (RM), jako je alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza, a β-galaktosidáza.
Kromě toho jsou obdobně použitelné haptenové konjugáty následujícího vzorce II A :
ve kterém A, Rl, R2, R3, £ a X mají významy uvedené ve vzorci II B: výše.
Bylo nalezeno, že následující konjugáty jsou v praxi podle tohoto vynálezu zejména užitečné:
Cl
NH—PR i
O • ··· * · • ··· • ·
N, NH—PR
N i _
O ve kterých ve všech případech n je celé číslo od 1 do 5, s výhodou je n celé číslo od 3 do 5.
Neznačené polyklonáíní protilátky používané v postupu podle tohoto vynálezu pro vázání antigennních neonikotinoidů nebo hapten-RM konjugátů ve vzorku, který má být testován se mohou imobilizovat na jakýkoli nosič běžně používaný při ímunometrických testech. Z těchto použitelných nosičů je možno jmenovat filtrační papír, latex, polystyrénové částečky, polyethylen, polystyren, polypropylen nebo jiné vhodné mikrojamkové desky nebo zkumavky. Tento nosič může být jakýkoli polymer přírodního nebo syntetického původu nebo amorfní materiál, jako je sklo. S výhodou pro testovací proužky se používají membrány z nitrocelulózy nebo nylonu a polyvinylové, polypropylenové, polystyrénové nebo jiné plastické materiály pro částečky nebo mikrojamkové desky. Také se mogou použít gely nebo částečky na bázi agarózy, akrylamidu nebo latexu. Kromě toho se pro postup podle tohoto vynálezu může upravit jakékoli imuno-chromatografické zařízení, známé odborníkům v oboru. Mezi vhodné laterální průtokové zařízení, které je možno uvést, je například laterální průtokové zařízení nárokované v US patentu č. 4,366,241. Technika pro vázání protilátek na tyto materiály je dobře známá odborníkům v oboru. Vhodným zdrojem pro získání protilátek vázaných na • 9 • * • «·· « 9 • 9 ·· ·· ·· v oboru. Vhodným zdrojem pro získání protilátek vázaných na nosič je například Beacon Analytical Systems, lne. (Portland,
Maine).
Pro přípravu vzorku semen pro použití v testu podle tohoto vynálezu se reprezentativní vzorky semen ošetřených neonikotinoidem (například, 5 až 100 g olej ovité rostliny canola, z 10 až 200 g semen čiroku, pšenice, bavlny, krmné kukuřice nebo sladké kukuřice) se disperguje ve vhodném rozpouštědle, jako je aceton, acetontril, ethanol, isopropanol, methanol, nebo jejich směsi s různým procentem vody. Vhodné směsi rozpouštědel s vodou jsou například směsi 1 až 50 % methanol/voda a 1 až 20 % acetonitril/voda.
Dispergovaná semena se zvíří a pak se umístí na 20 minut do ultrazvukové lázně, načež se znovu zvíří. Obsah se nechá usadit. Známá Část kapalného extraktu se oddělí a přidá ke známému množství roztoku, například směsi 1 % acetonitril/voda. Extrakt se dále zředí tak, aby koncentrace extrahovaného neonikotinoidu byla v rozsahu kalibrační křivky. Bylo nalezeno, že vhodné ředění je jedna tisícina až šedesát tisícin. Imunologický test trvá 35 minut. Extrakce a příprava extraktu pro analýzu trvá přibližně třicet minut. Proto vzorek semen se může extrahovat a analýzovat během jedné hodiny a pěti minut. Podle konkrétního provedení se až do dvou vzorků semen (s až pěti podvzorky semen na jedno semeno) se mohou analyzovat současně.
Imunologickými testy podle tohoto vynálezu se mohou detekovat koncentrace neonicotinoidních insekticidů od asi desetitisíc částí na million do jedné poloviny části per billion. Metoda je však vhodná pro jakékoli množství neonikotinoidního insekticidu pokud množství neonikotinoidního insekticidu ve vzorku nebo ve vzorku extraktu spadá nebo se « 0 009 • 0 0 0 0 9
00* 0 · ·
0« ·· 00 0000 může příslušně zředit, aby spadalo do rozsahu kalibrační křivky.
Příprava antigenu, produkce polyklonálních protilátek a imunologický test jsou blíže podrobně objasněny v následujících příkladech, které vynález žádným způsobem neomezují.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Syntetický postup pro přípravu thiametoxam haptenu
OMe
H2SO(
Ν N 2
O-melhyl isourea sulfaie
HNOyHjSO,
->
O OMe o'N'n^n aqNaOH
OMe
1.4
1.5 • 4 • 44 «
444 • 4 · 4 4 4 44 4 4 4 · 4
444* *444 4*4
4* 44 44 44 ·· 4444
1.1 2-methyl-l-nitroisomočovina
Sulfát O-methylisomočoviny (38,5 g) se rozpustí ve směsi kyseliny dusičné (120 ml) a kyseliny sírové (280 ml) při teplotě 0° C a reakční směs se míchá při této teplotě 2 hodiny. Směs se opatrně naleje za míchání na ledovou drť, načež se zbylá ledová tříšť odfiltruje. Jehičkové krystaly se rozpustí v ethylacetátu a roztok se zalkalizuje přidáním uhličitanu draselného. Roztok se vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Získá se bílý práškovitý produkt (5 g) .
1.2
Připraví se roztok z 3 g hydrochloridu methyl 4aminobutyrátu (1.1 a) a 15 ml vody. Hodnota pH se upraví na hodnotu 11, přikapáním 2N hydroxidu sodného, přičemž se roztok chladí v lázni s ledem. Reakční baňka se opatří pH elektrodou a teploměrem a k vzniklému čirému bazickému roztoku se přidává po malých částech za intenzivního 2-methyl-l-nitroisomočovina (2.38 g), přičemž teplota se udržuje pod 2° Po skončení přidávání se reakční směs míchá 1,5 hodiny při teplotě 0° C a pH se přitom stabilizuje na 9,6. Přidá se tetrahydrofuran (1 ml) a reakční směs se míchá další dvě hodiny. Reakční směs se zředí vodou a naleje do ethylacetátu. Organická fáze se oddělí, vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Zahuštěním filtrátu se získá čirý olej. Rychlou chromatografii surového oleje na silikagelu použitím směsi 3 : 1 dichlormethan/acetonitril se získá 750 mg požadovaného produktu ve formě bilé pevné látky.
1.3
Produkt z odstavce 1.2 (1,44 g) s paraformaldehydem (422 mg), methansulfonovou kyselinou (0,023 ml), a kyselinou mravenčí (10 ml) se zahřívá na 55° C po dobu 15 hodin. Reakční
9 9 9 9 9 999 • 9 · • 9 999 • 9 9 9 9 9 9
• 9 9 99 • 9 9 9 • 999
směs se pak zahustí ve vakuu a vzniklý hnědý olej se suspenduje v toluenu a azeotropickou destilací se produkt vysuší Vzniklý olej se rozpustí ve směsi 1: 1: 1 tetrahydrofuran/dioxan/acetonitril a nechá se reagovat s přebytkem diazomethanu. Roztok se míchá 30 minut, načež se reakční směs zpracuje s kyselinou octovou. Zahuštěním se získá olej, který se rozpustí v ethylacetátu, promyje zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší síranem sodným a znovu zahustí na olej. Tento olej se čistí rychlou chromatografií ve směsi 3 : 1 dichlormethan/acetonitril a získá se 658 mg požadovaného methylesteru oxadiazinamin máselné kyseliny (1.3) ve formě čirého oleje.
1.4
Produkt z odstavce 1.3 (1,1 g) se rozpustí v acetonitrilu (50 ml) a přidají se 3g of uhličitanu draselného.
V jedné dávce se přidá chlormethyl chlorthiazol a reakční směs se zahřívá 20 hodin na 55° C. Po ochlazení na teplotu místnosti se odfiltrují pevné podíly. Zahuštěním získaného hnědého filtrátu se získá olej, který se Čistí rychlou chromatografií 3 : 1 dichlormethan/acetonitril a získá se 894 mg požadované sloučeniny ve formě žlutohnědého oleje.
1.5
Rozpustí se sloučenina z odstavce 1.4 (372 mg) v 8ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 1 ml vody a reakční směs se míchá 6 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se pak zředí vodou a opatrně se zalkalizuje přidáním 1 N roztoku hydroxidu sodného až se dosáhne pH 4,5. Extrakcí ethylacetátem a vysušením organické fáze síranem hořečnatým se získá olej, který se čistí rychlou chromatografií na silikagelu směsí 1 :
dichlormethan/acetonitril a získá se požadovaný produkt 1.5 (100 mg).
* * • · • ··· • · » » · • * • · •
• · ··«
·· ·· ··
Příklady 2-5
Thiamethoxam hapteny
Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících thiamethoxam haptenů uvedených v tabulce 1 náhradou meziproduktu 1.1 za příslušnou analogickou sloučeninu vzorce NH2 (CH2)nCO2R (1.1 b), kde n je celé číslo od 1 do 5 a R je atom vodíku nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku.
Tabulka 1
Cl >=
Příklad n
2 1
3 2
4 4
5 5
Příklady 6-9
Thiamethoxam hapteny
Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících thiamethoxam haptenů uvedených v • · * ·*»
Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících thiamethoxam haptenů uvedených v tabulce 2 náhradou meziproduktu 1.1.a za příslušnou analogickou sloučeninu vzorce (l.l.c) • i • ··· »· *· • · · · » « · • 9 94 «· 91
NHj a* X-COjR v
kde E je kovalentní jednoduchá vazba nebo spojující skupina
-(CH2)m-< kde m je celé číslo od 1 do 3 a R je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku
Tabulka 2
Cl
Λ ΝγΝχ4 TA
I _ o
Příklad R4
6 u
7
8 '-TJ-co,
9 ΆΑ
Příklad 10
Syntetický postup pro přípravu des-nitroamino thiamethoxam haptenu fcfc • fc • fcfcfc • fc fcfc fc fcfc fc fc ··· •fc fc fcfc • fc fc* fc fc •fc ···
Postup:
Hapten thiamethoxam máselné kyseliny (100 mg, 0,275 mmol) a anisol (6,5 ml) se smísí v 10 ml kulaté baňce opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem. Baňka se umístí do olejové lázně a zahřívá se 2 hodiny na 165° C. Anisol se odstraňuje za sníženého tlaku při 50° C po dobu 5 hodin. Vzniklý olejovitý produkt (90,2 mg) má podle HPLC analýzy čistotu 93 %.
Spektroskopická data pro charakterizaci:
HPLC: Keystone Scientific Aquasil Ο-18,5μ (25 x 0,46 cm); acetonitril/20 mM kyselina fosforečná (40 : 60); 1,0 ml/min.; T=40C ; UV @ 240 nm (BW = 100 nm) ; doba záznamu: 13 minut; retenční čas: 4,6 minut.
TLC: (diolový gel) dichlormethan/acetonitril, 2 : 1 Rf =
0,25.
JH NMR (CD3CN, 300MHz): δ 7,43 (t, 1H), 4,78 (s, 4H) , 4,75 (s, 4H), 4,48 (d, 2H), 3,29 (t, 2H) , 2,27 (t, 2H) , 1,73 (q, 2H).
EI/DEP hmotové spektrum : m/z 319 (M+) .
Analýza: vypočteno: C, 41,32; H, 4,41; N, 13,14;
nalezeno: C, 40,13; H, 4,43; N, 12,99 «« ·· ·· • * · · · • · ··· · · ··· • » » · · · · · · • » · ft · « · t ·· · · *· · · «* *· • · · · • · * • · · • · · »· »···
Příklady 11-18 des-nitroimino thiamethoxam hapteny
Synthetický postup podle příkladu 10 se použije pro přípravu následujících des-nitroimino thiamethoxam haptenů, uvedených v tabulce 3 náhradou sloučenin připravených v příkladu 1 za příslušné analogické sloučeniny příkladů 2=9,.
Tabulka 3
Cl
O
Příklad R5
11 -CH2CO2H
12 -CH2CH2CO2H
13 -CH2CH2CH2CO2H
14 -CH2CH2CH2CH2CO2H
15 v CO.H V
16
17
Příklady 19-27
Imidacloprid hapteny
Syntetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících haptenů imidaclopridu uvedených v tabulce 4. Použijí se nitroguanidylové deriváty připravené v odstavci 1.2 nebo jejich analogy připravené náhradou meziproduktu 1.1 za příslušný analog vzorce 1.1 b nebo vzorce 1.1 c, jak jsou uvedeny v příkladech 2-9.
Tabulka 4 Clv%
Příklad R6
19 -CH2CO2H
20 -CHzCH2CO2H
21 -ch2ch2ch2co2h
22 -ch2ch2ch2ch2co2h
23 -ch2ch2ch2ch2ch2co2h
24 . CO,H v
46 64 ·· » *4
646 466 644«
4 44« 4 4 446 4 · 4 ·64444·4··4 w 44 4* ·· 44 46 664·
25
26 -^”-^co2h
27 íO'
Příklady 28-36 des-nitroimino imidacloprid hapteny
Synthetickým postupem podle příkladu 10 se připraví následující des-nitroimino imidacloprid hapteny uvedené v tabulce 5 náhradou sloučeniny připravené v příkladu 1 za příslušnou analogickou sloučeninu podle příkladů 19-27,
Tabulka 5
O
Příklad R7
28 -CH2CO2H
29 -CH2CH2CO2H
30 -CH2CH2CH2CO2H
«· »4 44 «4 44 «4
4*4 4 4 4 4·»· • · 444 4 4 ··· 4 · « • 4» 4 · 4 4 444 · 4
4 4 444« · 4 4 •4 44 44 «4 ·« 4444
31 -CH2CH2CH2CH2CO2H
32 -ch2ch2ch2ch2ch2co2h
33 u
34
35
36
Příklady 37-45
Clothiadinové hapteny
Synthetický postup podle příkladu 1 se použije pro přípravu následujících haptenů clothiadinů uvedených v tabulce 6 použitím derivátů nitroguanidylu připravených podle odstavce 1.2 nebo jeho analogů náhradou meziproduktu 1.1 za příslušné analogy vzorce 1.1 b nebo 1.1 c, jak jsou uvedeny v příkladech 2-9.
Tabulka 6
Cl ** «fc • · · • · ·· • « · ft «» ·· »· ·· • ♦ · • · • · * • t 944« ΝΗ/%» v
Ιο
Příklad Re
37 -CH2CO2H
38 -ch2ch2co2h
39 -ch2ch2ch2co2h
40 -ch2ch2ch2ch2co2h
41 -ch2ch2ch2ch2ch2co2h
42 \ CO.H v
43 χχεο,Η
44
45 O™
« ·· · « · ♦ · *·· · · • · · · ··«· ··· ·· 9» 9« ·· 99 9*9·
Příklady 46-54 des-nitroimino clothiadinové hapteny
Synthetický postup podle příkladu 10 se použije pro přípravu následujících des-nitroimino clothiadin haptenů uvedených v tabulce 7 náhradou sloučenin připravených podle příkladu 1 za analogické sloučeniny podle 37-45.
Tabulka 7
Cl
NH .NH —R9 r
o
Příklad R9
46 -ch2co2h
47 -ch2ch2co2h
48 -ch2ch2ch2co2h
49 -ch2ch2ch2ch2co2h
50 -ch2ch2ch2ch2ch2co2h
51 v
52
• to toto*· • to to to·* to «
53
54 O'
Příklady 55-63
Thiacloprid hapteny
Synthetický postup specifikovaný pro hapteny vzorců (IIIA) a (IIIB) se použije pro přípravu následujících haptenů clothiadinu uvedených v tabulce 8
Tabulka 8
55 -CH2CO2H
56 -ch2ch2co2h
57 -ch2ch2ch2co2h
58 -ch2ch2ch2ch2co2h
59 -ch2ch2ch2ch2ch2co2h
60 v
· • 9 • ···
9 9 999
61
62
63 O>·“
Příklad 64
Příprava thiamethoxamového imunogenu
64.1
Připraví se roztok vyčištěného proteinového derivátu (Tuberculin, PPD) v 0,01 PBS, pH 7,4, a upraví se na koncentraci 1 mg/ml. Hodnota pH se upraví na 4,5 - 5,0 přidáním alikvotniho množství 0,5 ml 0,1 M kyseliny chlorovodíkové.
64.2
Thiamethoxamový hapten z příkladu 1, (1 mg) se rozpustí v 250 μΐ 0,1 M 2-(N-morfolino)-ethansulfonové kyseliny, pH 4,5. Roztoky haptenu a PPD se pak spojí.
64.3 mg 1-(dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu (EDC) se rozpustí v 100 μΐ destilované deionizované vody a ihned se k hapten-PPD roztoku přidá roztok EDC. Roztoky hapten-PPD a EDC se míchají 2 hodiny při teplotě místnosti.
• · • · ΦΦ φ φ φ φφφ φ φ • ·· Φ Φ · ΦΦ · * V » · * ·· ·· ·· ·· ···
Reakční směs se umísti do dialyzačního sáčku odstraňujícího molekulovou hmotnost 1000-2000 Daltonů. Dialýza se provádí proti 2 litrům PBS při teplotě 4°C 48 hodin při třech výměnách.
Příklad 65
Příprava imidaclopridového imunogenu
Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu se provede příprava imidaclopridového imunogenu.
Příklad 66
Příprava clothiadinového imunogenu
Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu se provede příprava clothiadinového imunogenu
Příklad 67
Příprava thiaclopridového imunogenu
Postupem podle příkladu 64 a použitím haptenu z příkladu se provede příprava clothiadinového imunogenu
Příklad 68
Imunizační rozpis a sklízení protilátek
Pro počáteční imunizaci se imunogen z příkladu 64
rozpustí v kompletní Freundově přísadě a tímto roztokem se
naočkuj i samice Novozélandských bílých králíků. Injikuje se
přibližně, , 25 gg imunogenu na každou stranu. Obdobně se
imunizují ovce, kterým se na každou stranu aplikuje 38 μςτ
imunogenu •
Po následných imunizacích se imunogen rozpustí ve
Freundově nekompletní přísadě. Zvířata se ponechají odpočívat čtyři týdny mezi imunizacemi a odběr krve se provede deset dní po imunizaci. Druhé injekce a odběry krve se provádějí po devět měsíců kdy se pak nechají vykrvácet. Polyklonální » «4 * 4 4 ··
9 • ··· ·· ·» 4« 9« 40444« protilátky se sklidí použitím technik, které jsou odborníkům v oboru známé.
Příklad 69
Příprava konjugátů hapten-enzym
69.1
Thiamethoxamový hapten z příkladu 1 (3,1 mg), Nhydroxysukcinimid (NHS) (4,0 mg), a EDC (4,6 mg) se v malé vialce smísí. Tyto materiály se suší mírným proudem dusíku po 15 minut při teplotě místnosti.
69.2
Přidá se suchý dimethylformamid (2,0 ml) a směs se sonikuje 1 minutu. Vzniklý roztok se inkubuje přes noc při teplotě místnosti.
69.3
Křenová peroxidéza (8,5 mg) se rozpustí v malé vialce v uhličitanovém pufru (2,0 ml, 0,05M pH 9,6). Vialka se umístí do ledové lázně.
69.4
Celkové množství 100 μΐ roztoku hapten-NHS-EDC z odstavce 6.2 se pomalu během 1 hodiny přidává a směs se inkubuje za míchání po dobu 2 hodin. Reakční směs se prolije přes kolonu Sephadexu G-25M ekvilibrované PBS (0,01 M, pH 7,2). V prvých 3,0 ml eluátu se vymyje enzymový konjugát a k němu se přidá stejný objem glycerolu a roztok se skladuje při -20° C.
Příklad 70
Imunologický test canola ošetřené thiamethoxamem.
• · * ··· • 9 • · • <«·
Část extraktu semen se zředí 1 % roztokem methanol/voda, až očekávaná koncentrace thiamethoxamu je v rozmezí kalibrační křivky, 0,5 až 120 částí na bilion. Zkumavky potažené protilátkou se označí a umístí do stojanu na zkumavky tak, že první a poslední zkumavka jsou standardy a zbylé standardy a vzorky jsou promíšeny. Stojan drží zkumavky tak, že se mohou převrátit, aniž by došlo k vypadnutí zkumavky. Do všech zkumavek se přidá alikvotní množství (0,5 ml) standardu nebo vzorku. Pak se do všech zkumavek přidá (0,5 ml) roztoku enzymového konjugátu. Stojan se jemně třepe aby se obsah všech zkumavek promísil. Zkumavky se inkubují 20 minut při teplotě místnosti. Stojan se převrátí, aby se dekantoval obsah všech zkumavek. Do všech zkumavek se přidá střičkou voda až do přetečení a promývací roztok se dekantuje. Zkumavky se promyjí ještě třikrát. Po konečném promytí se stojan obrátí a všechny zkumavky se se jemně vytřou čistým papírovým ubrouskem aby se odstranil zbylý promívací roztok. Enzymový substrát (0,5 ml) se přidá do všech zkumavek, které se pak inkubují 10 minut při teplotě místnosti. Stojan se během inkubace mírně třepe každých 2,5 minut. Pro ukončení reakce se do každé zkumavky přidá kyselý roztok (1 M HCl, 0,5 ml). Jak je patrné z tabulky 10, měří se absorbance reakčního produktu při 450 nm. Absorbance standardů se použijí pro konstrukci kalibrační křivky s regresní funkcí ve formě Y = mLn(X) + B. Absorbance každého vzorku se vynese do funkce pro stanovení koncentrace neonikotinoidního pesticidu v zředěném vzorku. Získané koncentrace se násobí zřeďovacím faktorem a vypočítá se množství neonicotinoidního pesticidu v původním vzorku.
• ·
Tabulka 10
Typická standardní křivka pro thiamethoxamový imunologický test.
* 0
0 00
0 *00
0*00
koncentrace Absorbance at 450 nm
thiamethoxamu (Analytická odezva)
120 0,3145
20 0,6636
3 1,0283
0 5 1.3618
1 jednotky v dílech na bilion
Funkce popisující odezvu na thiamethoxamové standardy se vytváří z regresní analýzy. Tato data vznikají ze standardní křivky Y = -0,191 Ln (X) + 1,23, r = -0,999 kde Y = analytická odezva a X = koncentrace thiamethoxamových standardů.
Příklad 71
Test křížové reaktivity u semen ošetřených thiamethoxamem.
71.1 Extrakce semen
Vzorky ošetřených semen se náhodně rozdělí na podvzorky tak, že se po 50 g bavlníkových semen, krmné kukuřice, čiroku, sladké kokuřice a pšenice nebo 40 g canola se umístí do 0,25 1 širokohrdlé láhve. Canola se rozdělí na čtyři podvzorky a pět podvzorků se připraví z ostatních typů semen Do laždé láhve se přidá 150 ml rozpouštědla a nádoba se dokonale uzavře. Bavlníková semena se extrahují 5% směsí acetonitril/voda, zatímco ostatní semena se extrahují směsí 20% methanol/voda. Nádoby se dobře protřepou 30 vteřin v ruce a pak se umístí při teplotě místnosti do sonikované vodní lázně na dobu 20 minut.
• 0 ··· • 0 ·
0 0·· »* ·· ·· ·· ·· ·«
Vzorky se třepou ještě jednou jak bylo popsáno. Obsah každé nádoby se nechá asi 5 minut usadit a alikvotni pódii (0,10-ml) se odebere pro analýzu. Alikvotni podíl se zředí ve směsi 1 % methanol/voda tak, aby odparek spadal do rozsahu standardní křivky.
71.2 Imunologická analýza
Protilátkou povlečené polystyrénové kultivační zkumavky se označí a umístí do stojanu na zkumavky tak, že první a poslední zkumavka obsahuje standardy a zbylé zkumavky se standardy a vzorky se promíchají. Do odpovídajících zkumavek se přidají roztoky vzorků a standardů (0,50-ml) Pak se přidá obdobný objem konjugétu enzymu. Stojan se jemně protřepe, aby se roztoky promíchaly a nechá inkubovat 20 minut při teplotě místnosti. Pak se obsahy všech zkumavek odstraní obrácením stojanu na pánev z nerezové oceli. Každá zkumavka se promyje naplněním destilovanou vodou. Stojan se obrací pro naplnění a vylití promývací vody. Promývání se provádí čtyřikrát. Pak se stojan obrátí a jemně vytře papírovým kapesníkem, aby se odstranila převážná část promývalí lázně. (Trochu kapaliny, která zbyde ve zkumavkách testu nevadí). Roztok enzymového substrátu (0,50 ml) se přidá do každé zkumavky a tyto se pak inkubují 10 minut při teplotě místnosti. Stojan se přitom třepe v 2,5 minutových intervalech, aby se zajistilo, že enzym je dostatečně ve styku se substrátem Tvorba modře zbarveného signálu se ukončí přidáním kyselého roztoku (0,50-ml). Absorbance roztoku v každé zkumavce se měří spektrofotometricky při 450 nm.
Koncentrace analytu ve vzorcích se stanoví z regresní funkce ve formě y = m ln(x) + b.
• * • 000
4 4 • 4 ··· ·4 ·
0 0 0 · · 0 · 0 · 0 0 0 • •«0 0 0 · 0 0 0 00 00 00 00 00 004«
71.3
Stanovení křížové reaktivity
Křížová reaktivita, nebo specificita, imunologického testu se vyhodnocuje tak, aby se stanovilo zda ostatní látky přítomné v povlaku semen by byly na překážku měření thiamethoxamu. Testované látky se rozpustí v 1 % směsi methanol/voda na koncentrace v rozmezí od 1000 do 0,01 ng/ml. Alikvotní podíly každé koncentrace se analyzují postupem popsaným výše. Reaktivita každé testované látky v tomto rozmezí se stanoví jak bylo dříve popsáno Brady, J. F; Turner, J.; Skinner, D. H. Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water samples.J. Agric. Food Chem. 1995, 43: 2542-2547.
71.4
Výsledky
Ze všech testovaných látek bylo nalezeno, že pouze thiamethoxam je signifikantně reaktivní při imunologickém testu (Tabulka 9, níže). Proto tento imunologický test je specifický na thiamethoxam.
Pod-vzorky ošetřených dávek semen se analyzují imunologickým testem a HPLC. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11 zobrazuje korelaci průměrných výsledků imunologického testu při použití polyklonálních protilátek a HPLC analýz 40 vzorků semen na thiamethoxam. Dobrá shoda regresní linie ukazuje, že oběma metodami byly získány obdobné výsledky.
• · · • « fefe· fe · · · fefe fe fe fefe fe fe fefe· • * 9 9 9 · · 9 9 9 9 fe fe fefefefe ♦··· fefe* «· fefe 9fe ·· · ··
Tabulka 9
Krizová reativita thiamethoxamového imunologického testu
Testovaná 1Procenta reaktivity
látka relativně na thiamethoxam
Thiamethoxam 100
Clothiadin < 1,0
Imidacloprid 2NR
Chlorpyrifos NR
Difenoconazole NR
Fludioxonil NR
Pentachloronitrobenzene NR
Metalaxyl NR
Mefenoxam (R- NR
Metalaxyl)
Fluxofenim NR
Carboxin NR
Captan NR
Systhane (Myclobutanil) NR
TCMTB NR
Primifos-methyl NR
Thiophanate-methyl NR
Neaktivity testovaných látek relativně k reaktivitě thiamethoxamu,vyjádřeno jako procenta.
2NR, ne-reaktivní.
Rozumí se, že odborníci v oboru mohou provést řadu obměn a modifikací aniž by došlo k odchýlení od široce popsaného duchu tohoto vynálezu.
• · * ··» * · * * *· ·· * · • ♦·· > · · * ·· ·· • · · ·· ···· υ
φ «η >
r \ 1 ιο σ to o CN CN Γ0 o i—1 ta CN CN to t—1 r—1 1—1 1 >1 β s
,Ί 1 CM γΗ CD r- CN ta ta tn Γ- tO CN CN 1—1 i—1 'T ca ΓΊ ta 1 44 W (X
ΗΗ dl t σ Γ- co σ r- r~ 00 ΟΟ 00 σ CD r* r* r- r- r- r- 1 0 Φ (X
X ! η I ra ra ca ca i—l r-l rd ι—1 i—1 i—1 ! a Ό Li Oc rtl II
φ
* I 1 I 1 v 43 Li >h υ
υ ι ι 1 1 ►j
β ι 1 Η 1 1 >1 Φ IX
IX ι ι >Φ 1 CN CN Γ- ca ΙΟ ca ca o o CD CN CN 00 CD r—1 CD r- 1 β X τ> X
X ι 1 § 1 CT) rH CD ΙΟ ca LO θ’ ιο sr o O CN CD o CN σ o CN 1 Ll X
I 1 ®ί3 ι lQ σι η ra Γ- Γ- Γ- σ o 00 CD CD r- OD CD σ Γ— 1 )φ 0 0
(0 1 1 Μ 1 m η η η ca r-l r—1 -I r-l CN t—1 1 N O 43
1 1 dl 1 1 •Β > 'ř *Φ
>1 1 1 1 1 Μ β
44 | 1 1 1 CM O II Φ
ω ι 1 1 1 44 N
Φ I 1 1 1 a >1 S Φ
44 1 1 1 1 g 44 ι—1
1 1 1 1 φ v
•Η 1 1 1 οο τ ΙΟ σ σ 00 σ o m CD CN i—l o 00 CD LO σ 1 4J 0 CD β
£ ι 1 1 CM —1 m β O CN σ r- ca CD CN r-l i—l σ o β σ 1 10 Lt Γ-
'S I 1 1 co Γ- CN Τ θ’ σ σ σ σ 1-4 CD CD Γ- Γ— 00 co CO ιθ 1 φ a σ β
X 1 1 1 ΤΡ τ ’Τ ta ca r-l ι-Ι r-l 1-4 CN r-1 1 -U *b £
υ ι 1 1 1 >1 O Iti
Ή tn
Ο f—1 ο
β β
&
Η β
υ β
(ti
X ω
£ (ti
X ο
β β
Φ £
iti
Ή β
+4
4-1
W
Φ
Jí? Φ U 1-1 •Η « • X
II ο 43
Ll 4-) Φ σι
1—1 3· o lO 1-1 i-l i-l Γ- ta σ ca o o CO J n > σ to
σ ta CD 00 CD Γ- 00 co CD to Γ- CD lO σ o lO I r-l s. •rl
m LO CO CD CD Ι'- σ σ r— 00 ιο LO Γ- r~ t— Γ- CD I o u o 43
cn ta ta ta 1—I 1—1 l—1 I—1 Γ—1 i— 1 c β r4 44
(X ω
>1 β
+ 2 IX
X IX
II
Ή I Λ 1 44 Φ 1 Γ0 ta Γ— Γ- CN 00 i—1 CD θ’ CD i—1 to o iO ra θ’ 1 rt) Nti - X
N 1 £ 1 G 1 ο S)· 00 i-M 1“1 CD Γ- O CD -ti· 1—1 CO LO σ CN σ o 1 i—l
1 dn 1 >1 Μ f0 1 «σ' CD CD CD CD CD CD CD σ CN r- CD CD CD CD CD 00 CD 1 o > (ti
β I λΦ 1 r-l 1 X 1 η ta CN ta ta i—l t—l i—l i—l CN i—l 1 II
X -o i G Φ M ι υ 1 -rl Ή G 1 1 1 1 w κ £ ÍW Q)
Φ (—1 1 ! Λ 1 01 1 o > 1 1 1 1 5 > 44 Η m
w 1 1 H ο 1 1 Sh ή υ φ
'>1 > : 1 o 1 β Λί ίθ 1 1 1 1 n >,X 44 42 β
1 tí 1 β Οι 1 to CD σ rT r- (O N* lO O 1—1 M· CO CN r- LO i—l 1 3 β £
β J δ ι £ Q 1 co rH σ o CD CD m Lf) LO co CN CD OO ta i—1 CD σ CD 1 X ·* Ή '>
υ 1 o 1 Η ι—1 1 Ι_Γ> CN i—l ta 00 CD 00 O 00 co CD CD Γ- co lO σ co 1 u ω X
'> 1 1 CM ta ta ta ta t-l i-l i-l CN i-l 1-1 1 O Ή U
X 1 1 1 1 N O β -rl
υ 1 1 1 1 > N W Cn
Ή 1 1 ι 1 Φ 0
44 1 1 1 1 o β ι—1
> 1 1 1 1 β '>1 C7I 0
i—l 1 1 1 1 •φ Ό Φ β
(ti 1 1 1 1 -o >N Μ β
β 1 1 1 Γ* ι—1 β i-l σ ta CO Γ- ca CN 1—1 CO o o Γ- Γ- LO 1 >N U £
Φ 1 1 1 r4 σ ta CD CD to i—1 ,—1 r- lO CN σ ra ΙΟ ΙΟ i—l 1 iti Si ·Η
1 1 1 LQ t-l o CN Γ- co CD ra Γ- σ σ co CD CD σ Γ- o σ 1 X i—1
»rl 1 1 1 n ca ca CN —1 i—1 i—1 1—1 i—1 i—l i—1 1 0 tti Ο
β 1 1 1 1 r-. > β
'(ti 1 1 1 1 4J CU Ο 'φ
β 1 1 1 1 >φ β β
> 1 1 1 1 Ο. ’β >1 Φ
0 1 1 1 1 ~ 44 X Ν
Li 1 1 1 1 to W Φ
ca 1 1 X 1 1 N U 0 Γ-Ι
1 1 φ 1 CM i—1 (N ca θ’ ta ta to CD Γ- CO T σ σ o i—1 CN CN 1 '>Ί -L5 a to
1 1 Li 1 'šT co 00 00 CO 'T a1 co CO ΟΟ CD θ’ CO co σ σ σ σ 1 —1 β
i—I 1 1 ο 1 to co CD CD co co CD co CO co CO co CD CD CD CD CD CD 1 rt β 0
i—1 1 1 Ν 1 T T 'T •ír 'rr sr *3· T rr =r 1 β υ β β
1 1 > 1 σι σ m σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ 1 > £
(ti 1 1 1 CM CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN 1 ™ X Εη tti
X 1 1 1 1 -4 υ X
1—1 1 1 β 1 1 β -r4 • 0
β 1 1 Φ 1 1 •β β β
42 1 1 £ 1 Φ 1 s Ο 0 β
(ti t 1 Φ 1 fU U 1 Ο Ν Φ
Ε-ι 1 1 UJ 1 r-H X -r| 1 X Ο '> £
1 1 1 0 0 β 1 tti G β tti
1 1 a 1 G Li Φ 1 a 2 Π) ·Η
1 1 >1 1 rú Ή >n 1 ο S β β
1 1 Ε-ι 1 (J >υ (X 1 Jr ·η tti β
• · · ··· ···· • * ·** · · ♦·· * * * · · · · · · · * · * » » · ·· ·· ·· «· «««·
Tabulka 11 Srovnání analytických výsledků získaných imunologickými testy a HPLC (pokračování).
e (0
X o
Λ
4J
CU e
Ή
J3
4J
O
Λ 'Φ 3 CU N CU i—I 3 c g
CU
Cm
u 1 1 σι Γ r- n oi N* o r- co CN Ml O cn r· CN Ol
1 <T> CN O mi oi oi Ol σι Ch CD θ' CD co mi Ol Ml
1-1 1 OO 01 r· 01 σι CD Ol Ol ω 01 01 CD r~ CD
Pm W 1 CM 1 CN CN CN CN CN CN r*> Ol 01 Ol
>0)
CM mi
Γ
CN
CN
O Lil i—1 O CO O
rd 01 <3 OO CN [-
01 co C O Γ CD
CN CN CN CN CN CN
Ml o
mi
CN
01 Ol 00 σι 1—L Ol
CN Ml 01 rd CO N*
Ol 00 Ml i-i Ν’ CD
Ol CN CN CN CN CN
O ffl O Lil co 7 co cx] c£) r- σ, m n -št fT, tn ω r- o θ', h pj Ol CN CN CN CN Ol co -τ 01 H N OT H 01 ΓΓ U-; o>
mi σι 1-1 C' ° Lf) Ch 00 00 1-1 ω τ
U-, CD CN CO r H N H !D p·) Q) CP *3 Ol mi σι o
Ν’
CO Ml r* co
Ch co co
θ' co Ml CO
Ν' Ol n1 Ol
Γ CO Γ CN co οι σι σι σι
CN CN CD CD vj, lt> oi 'T pj CD Ml ΓΟΟ CO ΓΌ CO ΟΊ o CN CO O Ol ς-
tí N I
V3 nj ΣΤ I | CPi CN Ml rd Ml O Ml ’νΓ o CO Γ Ml o 00 CD CD i—1
TÍ | O O «cp r~ Ml τ-1 CO o 00 θ' Γ Ml Ml Γ~ Ν’ CD
fo | P) CD Ch n* CN Ml 00 m N* N· Ol Ol Ol Ml i-d CN CD
'> 3 I CM CN CN CN CN CN CN Ν' Ν' Ol N* CN
Aí I
d Ή I
TÍ £ I
? '3 I
0 > I
n 9 I
O Q β M I I i-1 θ' θ' Ml CD O CD co o o Ol Ml CO r- 00 r-l
3 n | 0Ί θ' CO [ O Ml O- CM 01 1 N* N1 CN Ml co CN o
β n | o Ν’ Ml CN O Ml Ol 1 N1 01 CD O Ml Ν’ Ol
I CM CN Ol Ol CN CN CN Ol Ml Ol Ml Ν'
(j, o [ Γ oo ui
Γ Ol Ol CO CO H ,_i r-~ cN σι σι <-i (X! CN CN CN rd CN CN
Q! o CD CO LQ un lil 'T <g. p U1 ·Γ «Τ rd Ol Γ (T) in cn r- o cr, oo oi h rq οι mi oi
A!
Φ
M o
N >
U-, C 00 Ch O O LQ [ Γ- Γ- oo oo U3 CD cd CD CD CD CD
-ΓΡ Ν' Ν’ Ν' ch ci Ch σι σι ch pj CN CN CN CN (N CN
ρ. CO Ol o 0Ί crt σι σι o pj pj CN CN oi co ® ^0 ® σι (j! σι σι σι
Oj Oj <N CN (N ,_l CN Ol N* Ml θ o o o o m n m π m
CO CO CO 00 co m σι σι σι σι
Ol CN CN CN CN
Φ 1 3 '3 •H
w 1 G Aí
1 —l b 3
CU 1 > 3 Aí
S 1 3 iH 3
f-t 1 PQ w Aí
>1
-P o
b o
n 'CU
G >Φ
CM
4J w
CU +J
Aí
U
H
Ch o
1—I o
G g
G
Φ b
φ >
o a
o i-H >1 ja
Aí
O
N >
b
-Φ b
>N
Aí
4J >φ
CU
N ·>.
rH
G
Ή
G '3 >
O
Aí
CU o
všech imunologických testů pro každý vzorek byly srovnány s HPLC výsledky pro tyto vzorky regresní analýzou * * · * · ··» * · · · » · · · · ·· * * ··· · · * • ·· * · · » · • · · · · * * ·· v· ·* ····
Tabulka 11 Srovnáni analytických výsledků získaných imunologickými testy a HPLC (pokračování).
S fl
X o
JZ
X
Φ g
fl ♦H
Λ
X o
x
Φ c
φ
N
Φ
X fl β
g a
a υ
χ a
κ ρ
>φ
P
P-l
P-l x
w φ
x '>1 14 U X CP O i—I
O fl g
X
N '>.
X (0 β
β .Η β
Ά >
ο
X φ
a ο
CM ΟΊ o ω ω
CM CO o β- αο
V co v* ω ω
χ> CM ω β- β-
Ο β- kD χ>
ω ω
CM 0 ω Μ 00
CM 00 ω X) σι
SP ω ω lD ω
(—1 CM 00 (Μ
V) CM β- γΗ Ο
κρ <Τ ω
β- σι 00 ω β-
<0 ο 0 σι ο
X -q* ω ω
’Τ CO X β-
0 0 ο σι ο
X ω 'Τ ω
σι σ σ αο ο
0 ο β- CM CM
X X ω X ω
00 σ ι—1 CM ι—1
ω CM 00 t—l kD
ο X) 0 β- kD
ω ω ω ω
ο rH 10 ω CM
0 rH X) CM 0
ω lO χ> ιη β-
ω (Ό ω ω τ
(— X) CM β- ω
CM 00 β~ ω β-
00 i—1 Ch ο 00
ω ω ω
(Μ β- XI ω ο
<Ν σ χ σι
0 ω ο ω
ω ω ω ω
ω X X τ“Η 00
χ X) ο β- rH
10 σ 00 CM rd
CM CM ω ω Lf)
10 -šP β- X ω
X) σ χ* ο ο
10 0 ω ω σ
ω ω ω ω X
ο Os] CM ω 0
X) <Ν Ο 0 CM
ο ΟΊ 0 X) ω
ω *ίΡ ω ω X
x υ
φ >V) ř>
X
O β
Ό
O
X!
-Φ β
P >Φ w
φ ρ
φ ρ
>1 x
ρ o
N >
o
X) >1
X o
P g Φ X $ a g * U m ,_i to CP 'ξ1 o o
β
ÉS
Ή β
φ
Ό
Φ >
Ο
Ρ a
o
X
Pj w
io >.
β >(β β
>
ο
Ρ
W
X * Ρ ο ο Ν ο > ” -β '£
'.φ
Ό ’ΰ * Ο „ ρ
4J a
ι ι 13 χ
1 X 1 Γ ω σ ο X CM ω χ* X) 0 ι to ι Μ
Φ 1 ο ο ο X X —1 τ—1 X X ι—1 1 '>Ί
Ρ 1 ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω 1 χ
0 1 0 ω ω 0 0 0 0 0 0 0 ι a kJ
Ν | σ σ σ σ σ σ σ σ σ σ 1 fl υ
> 1 CM ΓΜ CM CM CM ΓΜ ΓΜ ΓΜ ΓΜ ΓΜ ι a
1 1 χ
1 1 χ υ
β 1 1 β -Η
Φ 1 Φ 1 -fl tP 3
g 1 υ ι > ο 0
Φ 1 Ρ ι 0 Η Ν
10 1 X >Ρ 1 X 0 '>
1 β 3 1 fl S X
a ι X 14 1 a 2 fl
>1 1 0 3 ι ο β β
X 1 Ρ< X Γ-t X fl
··*

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protilátka použitelná v imunologickém testu vzorku pro stanovení množství neonikotinoidního insekticidu, v y z na-čující se tím, že tato protilátka je (1) polyklonální protilátka produkovaná imunizovanými zvířaty konjugovaná neonikotinoidním haptenem na imunogenní proteinový nosič a (2) specificky se váže na neonikotinoidní insekticid.
  2. 2. Protilátka podle nároku 1, vyznačující se tím, že protilátka je selektivní na sloučeniny obecného vzorce I ve kterém
    A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5ylová skupina,
    R a R3 jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku,
    R’a R2 jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R’a R2 tvoří dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, imidazolinový nebo oxadiazinový kruh a
    X je skupina N-NOj nebo skupina N-CN.
    • ··· ·· • · · » • i * ·· ·· ·· a· ··*»
  3. 3. Protilátka podle nároku 1, vyznačují se tím, že uvedená protilátka je selektivní na sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující imidacloprid, nitenpyram, acetamiprid, thiamethoxam, thiacloprid a clothiadin.
  4. 4. Sloučenina obecného vzorce I A (I A) ve kterém
    A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5ylová skupina
    R3 je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,
    R'a R2 jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R'a R2 dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolinový kruh nebo oxadiazinový kruh, n je celé číslo od 1 do 4 a
    X je skupina N-NO2 nebo skupina N-CN.
  5. 5. Sloučenina podle nároku 4, vzorce
    Cl • » to • · ··· • to « · ♦ · · to ·< ·· * toto * to to»* * · · · • ·· to to· ·· to to to · t »to toto··
  6. 6. Sloučenina podle nároku 5, vzorce
  7. 7. Sloučenina podle nároku 6 vzorce i _ O
  8. 8. Sloučenina podle nároku 7 vzorce /NO, N 2
  9. 9. Proteinový konjugát obecného vzorce
    ve kterém
    A je 2-chlorpyrid-5-ylová skupina nebo 2-chlorthiazol-5ylová skupina
    R3 je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku.
    44 444 444*
    4 44» 4 4 444 4 4 *
    4 · 4 • 4 44»
    4 4 4 • 4 4
    44 4· • 4 4
    4·
    4 4 4 4 ·· 44
    4 4 4
    44 4444
    R'a R2 jsou na sobě nezávisle atomy vodíku nebo alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R’a R2 dohromady spolu s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří imidazolinový kruh nebo oxadiazinový kruh, n je celé číslo od 1 do 4
    X je skupina N-NO2 nebo skupina N-CN a
    PR je proteinový zbytek molekuly nosiče vybraný ze skupiny obsahující vyčištěný proteinový derivát (PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z kationizovaného hovězího séra, albumin z lidského séra, albumin a klíčový hemokyanin z mořských mlžů nebo zbytek enzymu vybraný ze skupiny obsahující alkalickou fosfatázu, křenovou peroxidázu a β-galaktosidázu.
  10. 10. Proteinový konjugát podle nároku 9 vzorce
    I
    NH—PR
  11. 11. Proteinový konjugát podle nároku 9 vzorce
    O
    NH-PR • »9
    9 9*99 • 9 9
    9 9 999
    9 9 9 ·
    9 9 9
    9 99 · 9 9 »9 9 * 9 9 9
    9*99 >999 9 9 9
    99 99 99 99 99 9994
  12. 12. Způsob stanovení koncentrace neonikotinoidního insekticidu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:
    (a) připravení pevné fáze s imobilizovanou protilátkou selektivní pro daný neonikotinoidní insekticid, (b) uvedení tohoto vzorku ve styk s imobilizovanou protilátkou v přítomnosti známého množství neonikotinoidního insekticidu s konjugátem hapten-enzymem, (c) promytí pevné fáze ze stupně (b) aby se odstranil nevázaný konjugát hapten-enzym nebo vzorek, (d) reakci chromogenního substrátu specifického pro tento konjugát hapten-enzym promytou pevnou fází ze stupně (c) tak, aby se generoval chromofor a (e) změří se množství chromogenu vzniklého ve stupni (d) a stanovilo se tak množství na protilátku vážného konjugátu hapten-enzym a tak se stanovilo množství neonikotinoidního insekticidu ve vzorku.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený vzorek se připraví extrakcí rostlinných materiálů pro množení vhodným rozpouštědlem.
  14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ícíse tím, uvedený rostlinným materiálem pro množení jsou semena.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedená semena jsou vybraná ze skupiny zahrnující
    canolu, čirok, pšenici, bavlník, kukuřici nebo sladkou kukuřici. 16. Způsob podle nároku 12, v y značující se tím, že uvedená protilátka je polyklonální protilátka
    • 4 4 4 · 4 « 4 « 4
    ΑΊ 4 4« «44 «4 Alt » « *444 4444 444
    44 44 44 4· 44 4444 produkovaná imunizovanými zvířaty s neonikotinoidním insekcticidem konjugovaným na imunogenní proteinový nosič.
  16. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený imunogenní proteinový nosič v molekule nosiče je vybraný ze skupiny obsahující vyčištěný proteinový derivát {PPD, Tuberculin) z Diptheria viru, albumin z hovězího séra, albumin z kationizovaného hovězího séra, albumin z lidského séra, albumin a klíčový hemokyanin mořských mlžů.
  17. 18. Souprava použitelná pro imunologický test vzorku pro stanovení množství neonikotinoidního insekticidu, vyznačující se tím, že souprava obsahuje kombinaci jednoho nebo vice zásobníků sestávající z (a) pevné fáze s imobilizovanou protilátkou, která je selektivní na uvedený neonikotinoidní insekticid, (b) konjugát enzymu obsahující enzym konjugovaný na neonikotinoidní hapten.
  18. 19. Souprava podle nároku 18, vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální protilátkou produkovanou imunizovanými zvířaty s neonikotinoidem konjugovaným na imunogenní proteinový nosič.
  19. 20. Souprava podle nároku 19, vyznačující se tím, že enzymem je křenová peroxidáza.
  20. 21. Souprava podle nároku 18, vyznačující se tím, že protilátka, která se specificky váže na neonikotinoidní insekticid je vybraná ze skupiny zahrnující imidacloprid, nitenpyram, acetamiprid, thiamethoxam, thiacloprid a clothiadin.
CZ20021969A 1999-12-08 2000-12-06 Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy CZ303174B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45678299A 1999-12-08 1999-12-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20021969A3 true CZ20021969A3 (cs) 2002-08-14
CZ303174B6 CZ303174B6 (cs) 2012-05-16

Family

ID=23814141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021969A CZ303174B6 (cs) 1999-12-08 2000-12-06 Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy

Country Status (26)

Country Link
US (1) US7148029B2 (cs)
EP (1) EP1235805B1 (cs)
JP (1) JP4980536B2 (cs)
KR (1) KR100752536B1 (cs)
CN (1) CN100379725C (cs)
AR (2) AR026735A1 (cs)
AT (1) ATE343564T1 (cs)
AU (1) AU778677B2 (cs)
BR (1) BR0016265B1 (cs)
CA (1) CA2393084C (cs)
CZ (1) CZ303174B6 (cs)
DE (1) DE60031570T2 (cs)
DK (1) DK1235805T3 (cs)
EA (1) EA005380B1 (cs)
ES (1) ES2272357T3 (cs)
HU (1) HU229490B1 (cs)
IL (2) IL150009A0 (cs)
MA (1) MA25635A1 (cs)
MX (1) MXPA02005514A (cs)
NO (1) NO331464B1 (cs)
NZ (1) NZ519152A (cs)
PL (1) PL205061B1 (cs)
PT (1) PT1235805E (cs)
UA (1) UA76708C2 (cs)
WO (1) WO2001042787A2 (cs)
ZA (1) ZA200204582B (cs)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763433B2 (en) 2004-07-01 2010-07-27 Forsite Diagnostics Limited Analyte detection system
JP2006282547A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Horiba Ltd ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法
JP4841856B2 (ja) * 2005-03-31 2011-12-21 株式会社堀場製作所 クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法
MX363423B (es) * 2005-05-18 2019-03-22 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
KR100696615B1 (ko) 2005-10-06 2007-03-19 충북대학교 산학협력단 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템
US8323904B2 (en) * 2005-12-16 2012-12-04 Bayer Cropscience Ag Kit for measurement of termite insecticide active ingredient by immunoassay method
JP2007187650A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Horiba Ltd 免疫測定法を用いたフィプロニルの測定キット
WO2007091392A1 (ja) * 2006-02-10 2007-08-16 Mitsui Chemicals, Inc. Ｏ－メチル－ｎ－ニトロイソ尿素の製造方法
CN100402522C (zh) * 2006-02-13 2008-07-16 中国农业大学 一种净化常山酮的方法及其专用免疫亲和色谱柱
KR100879222B1 (ko) 2006-05-09 2009-01-15 재단법인서울대학교산학협력재단 제초제 메타미포프 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법
KR100879223B1 (ko) 2007-05-22 2009-01-15 재단법인서울대학교산학협력재단 살충제 비스트리플루론 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법
KR100876435B1 (ko) 2007-05-22 2008-12-31 재단법인서울대학교산학협력재단 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체
US9207240B2 (en) * 2007-11-14 2015-12-08 Arbor Vita Corporation Method of efficient extraction of protein from cells
CN101880325A (zh) * 2010-06-22 2010-11-10 南京农业大学 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体
EP2705366B1 (en) 2011-05-04 2017-07-12 Pop Test LLC Diagnostic device
CN102636643A (zh) * 2012-04-06 2012-08-15 上海交通大学 用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法
TR201910347T4 (tr) 2012-08-21 2019-07-22 Janssen Pharmaceutica Nv Olanzapin haptenlerine yönelik antikorlar ve bunların kullanımı.
US9504682B2 (en) 2012-08-21 2016-11-29 Janssen Pharmaceutica Nv Haptens of aripiprazole
PL2888373T3 (pl) 2012-08-21 2018-08-31 Janssen Pharmaceutica Nv Przeciwciała dla arypiprazolu i ich zastosowanie
TR201816378T4 (tr) * 2012-08-21 2018-11-21 Janssen Pharmaceutica Nv Olanzapin haptenleri.
ES2807902T3 (es) 2012-08-21 2021-02-24 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos para olanzapina y uso de los mismos
CN110054694B (zh) 2012-08-21 2024-02-20 詹森药业有限公司 阿立哌唑半抗原的抗体及其用途
CN102942519B (zh) * 2012-10-31 2014-08-13 天津科技大学 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN104974256B (zh) * 2015-04-10 2018-06-05 南京农业大学 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途
CN105037344A (zh) * 2015-06-16 2015-11-11 环境保护部南京环境科学研究所 一种噻虫啉半抗原的合成方法
CN105087498B (zh) * 2015-09-07 2018-01-09 江南大学 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105572376B (zh) * 2016-03-07 2017-07-11 中国烟草总公司贵州省公司 一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法
KR102225307B1 (ko) 2017-10-19 2021-03-11 경북대학교 산학협력단 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도
CN109813894A (zh) * 2017-11-18 2019-05-28 镇江亿特生物科技发展有限公司 一种检测大米中乙虫腈的化学发光免疫检测试剂盒
CN108998422A (zh) * 2018-08-14 2018-12-14 江南大学 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN109061158B (zh) * 2018-09-21 2021-09-03 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN109111394B (zh) * 2018-09-21 2021-09-03 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种啶虫脒半抗原与抗原的制备方法及应用
CN109917126A (zh) * 2019-02-27 2019-06-21 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法
CN111646959B (zh) * 2020-05-14 2022-07-15 广州海关技术中心 一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置
CN112111011B (zh) * 2020-07-28 2022-04-19 浙江大学 一种特异性抗噻虫嗪抗体的可变区序列及其重组全长抗体
CN113009057B (zh) * 2020-10-22 2023-11-07 重庆医科大学 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法
CN112595850A (zh) * 2020-11-18 2021-04-02 北京勤邦生物技术有限公司 一种噻虫胺人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN113281501B (zh) * 2021-05-12 2023-07-07 北京勤邦科技股份有限公司 一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN113979994A (zh) * 2021-12-28 2022-01-28 信达安检测技术(天津)有限公司 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及其合成与应用
CN114397441A (zh) * 2022-01-25 2022-04-26 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用
CN114636768B (zh) * 2022-03-23 2023-11-07 广西-东盟食品检验检测中心 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5334528A (en) * 1989-10-30 1994-08-02 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same
JPH0580553A (ja) 1991-09-24 1993-04-02 Mita Ind Co Ltd 電子写真感光体
TW240163B (en) * 1992-07-22 1995-02-11 Syngenta Participations Ag Oxadiazine derivatives
GB9304191D0 (en) * 1993-03-02 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Process for the preparation of aqueous nicotinaldehyde
DE4329952C1 (de) * 1993-09-04 1994-08-04 Draegerwerk Ag Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung
US5553209A (en) 1994-01-28 1996-09-03 Hughes Aircraft Company Method for automatically displaying map symbols
US5849758A (en) * 1995-05-30 1998-12-15 American Cyanamid Company Herbicidal 2, 6-disubstituted pyridines and 2, 4-disubstituted pyrimidines
EP0854721B1 (en) * 1995-08-02 2001-10-24 Smithkline Beecham Corporation Endothelin receptor antagonists
US5972842A (en) * 1996-12-12 1999-10-26 American Cyanamid Company Herbicidal cyanopyridines
ES2251747T3 (es) * 1996-12-19 2006-05-01 Syngenta Participations Ag Procedimiento para la preparacion de derivados de tiazol.
JP2993902B2 (ja) * 1997-02-26 1999-12-27 株式会社環境免疫技術研究所 トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法
JP3188641B2 (ja) * 1997-03-18 2001-07-16 株式会社環境免疫技術研究所 ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法
JP3188642B2 (ja) * 1997-03-19 2001-07-16 株式会社環境免疫技術研究所 イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法
AU749237B2 (en) * 1997-10-27 2002-06-20 Isk Americas Incorporated Substituted benzene compounds, process for their preparation, and herbicidal and defolient compositions containing them
US6121202A (en) * 1997-11-07 2000-09-19 American Cyanamid Company Thienyloxypyridines and-pyrimidines useful as herbicidal agents
DE19831246A1 (de) * 1998-07-11 2000-01-13 Clariant Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arylpyridinen
JP3884586B2 (ja) 1998-12-24 2007-02-21 株式会社堀場製作所 イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法
US6960595B2 (en) * 2001-03-23 2005-11-01 Bristol-Myers Squibb Pharma Company 5-6 to 5-7 Heterobicycles as factor Xa inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
PT1235805E (pt) 2007-01-31
AR026735A1 (es) 2003-02-26
MA25635A1 (fr) 2002-12-31
ES2272357T3 (es) 2007-05-01
NO331464B1 (no) 2012-01-09
PL355630A1 (en) 2004-05-04
KR100752536B1 (ko) 2007-08-29
AU2672101A (en) 2001-06-18
DE60031570T2 (de) 2007-06-28
CA2393084C (en) 2013-05-14
HUP0203499A2 (hu) 2003-03-28
ZA200204582B (en) 2003-07-30
MXPA02005514A (es) 2002-09-02
EP1235805B1 (en) 2006-10-25
AU778677B2 (en) 2004-12-16
WO2001042787A2 (en) 2001-06-14
HUP0203499A3 (en) 2004-12-28
CN100379725C (zh) 2008-04-09
US20030108970A1 (en) 2003-06-12
PL205061B1 (pl) 2010-03-31
KR20020065554A (ko) 2002-08-13
NZ519152A (en) 2004-02-27
NO20022684D0 (no) 2002-06-06
IL150009A0 (en) 2002-12-01
EA005380B1 (ru) 2005-02-24
DK1235805T3 (da) 2007-02-26
AR064873A2 (es) 2009-04-29
UA76708C2 (uk) 2006-09-15
BR0016265B1 (pt) 2015-01-20
WO2001042787A3 (en) 2001-12-13
US7148029B2 (en) 2006-12-12
CZ303174B6 (cs) 2012-05-16
BR0016265A (pt) 2002-08-13
IL150009A (en) 2008-08-07
DE60031570D1 (de) 2006-12-07
JP4980536B2 (ja) 2012-07-18
NO20022684L (no) 2002-06-25
HU229490B1 (en) 2014-01-28
JP2003516423A (ja) 2003-05-13
CA2393084A1 (en) 2001-06-14
EA200200620A1 (ru) 2002-10-31
CN1413195A (zh) 2003-04-23
ATE343564T1 (de) 2006-11-15
EP1235805A2 (en) 2002-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20021969A3 (cs) Imunologický test pro neonikotinylové insekticidy
US5654178A (en) Immunoassay for tetrachloroisophthalonitrile (chlorothalonil), its derivatives and breakdown products
CN109061169B (zh) 一种检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒及其应用
CN108535474A (zh) 一种检测氯菊酯的时间分辨荧光试纸条及其应用
Elissalde et al. Development of an improved monoclonal antibody‐based elisa for fumonisin b1–3 and the use of molecular modeling to explain observed detection limits
CN107250795B (zh) 带有对背景信号的补偿的均相免疫测定
Ramon-Azcon et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for determination of the miticide bromopropylate
CN108459000A (zh) 一种检测氟吡菌酰胺的时间分辨荧光试纸条及其应用
Bellemjid et al. Analysis of carbamates pesticides: immunogical technique by local development of enzyme-linked immuno-sorbent assay
Kolár et al. Production and characterization of generic antibodies against s-triazine and sulfonylurea herbicides
CN113717255A (zh) 一种多粘菌素b和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN106754736B (zh) 一种抗福莫特罗单克隆抗体及其应用
CN114317450B (zh) 一株分泌氟苯虫酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN109856091A (zh) 一种检测久效磷的时间分辨荧光试纸条及其应用
CN118702647A (zh) 一种灭草松半抗原、抗体、杂交瘤细胞株及其应用
CN115093347A (zh) 氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用
CN118638058A (zh) 一种甲苯咪唑半抗原、人工抗原和甲苯咪唑单克隆抗体及其制备与应用
CN116535515A (zh) 一种抗吡蚜酮的单克隆抗体及其应用
CN112485430A (zh) 一种甲草胺人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN113831253A (zh) 一种二甲戊灵半抗原及其制备方法和应用
Bhattacharya et al. IMMUNODETECTION OF FENTHION IN FOOD SAMPLES USING AVIAN ANTIBODIES

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20131206