CN115093347A - 氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用，具体涉及一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其制备方法，本发明还公开了所述半抗原在抗体、试剂盒方面的应用。针对氯氰菊酯含量检测半抗原建立的酶联免疫试剂盒能实现快速大批量待检测产品的检测，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于农产品尤其是烟草中氯氰菊酯的现场监控和大量样本的筛查。

Description

氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用
技术领域
本申请涉及农药残留检测技术领域，特别是一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用。
背景技术
氯氰菊酯(Cypermethrin)是一种高效的广谱杀虫剂，由于其杀虫效率高和效果持久，被经常用于小麦、玉米、水果、蔬菜和烟草等农产品的害虫防治。起初该农药一直被认为是毒性较低、无蓄积性的安全农药，但是近年来研究发现，氯氰菊酯是一类亲脂型化合物，可通过鱼鳃进入水生生物中，对水体系统造成损害；而且该物质对哺乳动物的中枢神经系统、内分泌系统等也存在显著的危害。当环境中存在该物质的残留物时，仍然可能对人体机能造成伤害，因此美国环境保护局将其确定为潜在的内分泌干扰物，而氯氰菊酯引起的环境污染问题和食品安全问题也日益受到重视。我国针对不同作物，制定了对应的氯氰菊酯最大残留限量标准，其中烟草中该物质的最大残留限量为1m/kg。
目前，现有文献中只出现对谷物、水果、蔬菜中这类杀虫剂残留量的检测报道，而没有见到有关烟叶中残留量的测定方法的报道。国内外对氯氰菊酯残留的现有检测方法主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱法(GC)等。
此类仪器分析方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。
免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已被药物残留检测领域广泛应用，与仪器检测方法相比具有很多优势。但现有技术中缺乏对氯氰菊酯具有特异性反应的检测试剂，阻碍了免疫分析检测法在氯氰菊酯检测中的运用。
在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测氯氰菊酯时，关键技术在于能够获取特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要合成、制备出合适的氯氰菊酯半抗原。
现有技术中公开了CN202110159937.3氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，所公开的半抗原在其抗体交叉反应性测定中，采用间接竞争ELISA方法测定该氟氯氰菊酯单克隆抗体对氯氰菊酯的交叉反应率＜1％。说明该半抗原并不能与氯氰菊酯发生特异性免疫反应，无法用于对氯氰菊酯含量的检测。
发明内容
本申请提供了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用，用于解决现有技术中存在的氯氰菊酯检测方法样本处理繁琐，检测效率低，无法实现快速大批量检测；缺乏针对氯氰菊酯具有特异性的酶联免疫检测半抗原的技术问题。
本申请提供了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原，化学名称为：(E)4-((4-(含氰基的((3-(2,2-二氯乙烯基)2、2-二甲基环丙基甲酰氯)氧)甲基)苯基)二氮烯基-3-羟基苯甲酸；化学结构式为：
Figure BDA0003703672450000021
所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
以氨基苯乙腈为原料经重氮化反应得到反应物，所述反应物与3-羟基苯甲酸进行偶合反应后再与二氯菊酸进行缩合反应，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含的氯氰菊酯产生特异性反应。根据该特性可对氯氰菊酯标准品梯度稀释获得不同浓度氯氰菊酯标准品溶液，采用酶标仪在450nm下测量各标准品溶液的OD值得到标准曲线后，对待测样本进行预处理，测定相同波长下的OD值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含氯氰菊酯含量的定量有效、快速检测。
采用该反应能获得纯度较高的半抗原。该制备方法中所用试剂及反应条件，可按现有重氮化、偶合、缩合反应所需的试剂和条件进行选择。
本申请提供该半抗原制成试剂盒后用于对烟叶中所含氯氰菊酯进行检测时，样本灵敏度为9μg/L，说明该半抗原制成试剂盒后，对氯氰菊酯的检测灵敏度较高；按现有方法制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的检测限为900μg/kg，满足氯氰菊酯的国标检出限要求，可以用于对烟草样本中所含氯氰菊酯含量的有效检测；该半抗原制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的回收率为100％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％，具有显著特异性，能满足检测需要。
所得半抗原制成试剂盒后，对其他具有类似结构的农药的交叉反应性均小于1％，对氯氰菊酯则可达100％，说明该半抗原可特异性地检出氯氰菊酯并避免其他类似结构农药对检测结果的干扰。能很好地填补现有技术中缺乏针对氯氰菊酯具有明显特异性的半抗原。
优选的，所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
1)加乙醇溶解氨基苯乙腈后，加入强酸溶液和水充分搅拌后，冷却到0～5℃，加入亚硝酸钠水溶液搅拌1h，得到原料液；
2)加氢氧化钠水溶液溶解3-羟基苯甲酸，加入水充分搅拌后，冷却到0～5℃，滴加全部所述原料液，保持0～5℃下反应4h后停止反应，对所得溶液进行分离纯化，得到中间产物；
3)溶解二氯菊酸后加入三氯甲烷，冷却至0～5℃，再加入草酰氯搅拌2h，加入全部中间产物并继续搅拌1h，恢复至室温，继续搅拌2h后停止反应，加入水并补加三氯甲烷，得到反应液；
4)对所得反应液进行分离纯化得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
本申请半抗原制备方法的反应方程式如式(2)所示：
Figure BDA0003703672450000041
由上可知，该反应可以正常发生，并制得具有上述结构的半抗原。
具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含的氯氰菊酯产生特异性反应。
根据该特性可对氯氰菊酯标准品梯度稀释获得不同浓度氯氰菊酯标准品溶液，采用酶标仪在450nm下测量各标准品溶液的OD值得到氯氰菊酯标准曲线。对具体样本进行检测时，对待测样本进行预处理，采用包括上述半抗原的试剂盒对处理后样本，采用酶标仪在450nm波长处测定相同OD值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含氯氰菊酯含量的定量有效、快速检测。
例如对于待测样本的预处理，以烟叶为例，具体包括以下步骤：将烟叶样本捣碎，称取1.0g±0.05g捣碎的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，用涡旋混合仪涡动3min，混匀，3000×g室温(20～25℃)离心5min；移取50μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶液，涡动20s，混匀；取50μL用于分析(稀释倍数：100)。
优选的，该制备方法中步骤1)中所述强酸溶液为1mol/L HCl溶液。
优选的，步骤2)中所述分离纯化操作包括以下步骤：用酸溶液调节pH值到6，以乙酸乙酯为溶剂萃取三次后合并所得有机相，旋蒸蒸干，用体积比为10:1的1,2-二氯乙烷-正己烷混合溶液重结晶，得到中间产物；更进一步的，所用酸溶液为6mol/L HCl溶液，每次萃取所用溶剂的体积为100mL。
优选的，步骤4)中所述分离纯化操作包括以下步骤：对所得反应液充分震荡，静置，分去水相，水洗有机相加100mL水充分震荡，静置，分去水相，浓缩蒸干，上硅胶柱，用体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱分离，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
为实现对半抗原的有效应用，可进行以下应用：
本申请另一方面还提供了一种氯氰菊酯含量检测用抗原，为由上述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。采用以上种类的载体蛋白能有效发挥半抗原的检测作用。
本发明中所用半抗原与载体蛋白偶联方法可以为现有常用由半抗原制备抗原的方法，例如以牛血清白蛋白为载体蛋白的偶联方法可以为：
取上述半抗原36.4mg，加1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解澄清，加N-羟基丁二酰亚胺(NHS)17.1mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)28.6mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)100mg，加0.1mol/L pH 9.1的CB缓冲液9mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的氯氰菊酯抗原，分装，-20℃保存。
以卵清蛋白为载体蛋白的偶联方法包括以下步骤：
取上述半抗原21.6mg，加1mL DMF溶解澄清，加NHS 10.1mg、EDC 16.97mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白(OVA)100mg，加0.1mol/L pH 9.5的CB缓冲液9mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与卵清蛋白偶联的氯氰菊酯抗原，分装，-20℃保存。
本发明另一方面还提供了一种氯氰菊酯含量检测用抗体，为由上述抗原经动物免疫得到的抗体；所述抗体与氯氰菊酯发生特异性免疫反应。
优选的，所述抗体为氯氰菊酯单克隆抗体。
本方面中所用由上述抗原制备抗体的方法可以为本领域常用动物免疫方法，例如包括以下步骤：
(1)动物免疫：将与牛血清白蛋白偶联的氯氰菊酯抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。
(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏：将氯氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×109个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射氯氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株6×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(64000～120000)。
该抗体以单克隆抗体形式投入运用，其效价较高。
本发明另一方面还提供了一种氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒，包括：酶标板、抗体，所述酶标板包被有如上述的氯氰菊酯含量检测用抗原；所述抗体为如上述氯氰菊酯含量检测用抗体。
该试剂盒按现有方法制得，具体方法本领域技术人员可通过检索现有酶联免疫试剂盒生产方法制备得到。
优选地，所述氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒的检测样本为经过预处理的烟草样本；
所述烟草样本预处理包括以下步骤：
将烟叶样本捣碎，称取0.95～1.05g捣碎的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，用涡旋混合仪涡动3min，混匀，3000×g室温下离心5min；
移取50μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶液，涡动20s，混匀；
取50μL作为预处理样本用于检测。
采用上述方法对待检测烟叶样本进行处理，能有效提高检测准确性，使烟叶中所含氯氰菊酯充分溶解，便于进行检测。
优选的，所述氯氰菊酯酶联免疫检测试剂盒还包括：梯度浓度的氯氰菊酯标准品溶液、酶标二抗、底物液A液、底物液B液、终止液、洗涤液、复溶液。
优选地，梯度浓度的氯氰菊酯标准品溶液的梯度浓度为0μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L、243μg/L；
酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
底物液A液为过氧化脲，底物液B液为四甲基联苯胺；
终止液为2mol/L硫酸溶液；
洗涤液为pH 7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液；
复溶液为pH 7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。
采用上述各成分制成的试剂盒检测效率高、准确性好，适用于现场大批量样品进行检测。
本申请中室温温度范围为20～25℃，以操作当时温度计读数为准。
本发明能产生的有益效果包括：
1)本发明所提供的氯氰菊酯含量检测用半抗原，本申请提供该半抗原制成试剂盒后用于对烟叶中所含氯氰菊酯进行检测时，样本灵敏度为9μg/L，说明该半抗原制成试剂盒后，对氯氰菊酯的检测灵敏度较高；按现有方法制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的检测限为900μg/kg，满足氯氰菊酯的国标检出限要求，可以用于对烟草样本中所含氯氰菊酯含量的有效检测；该半抗原制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的回收率为100％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％。具有显著特异性，能满足检测需要。该半抗原能最大程度保留氯氰菊酯特征结构，以此半抗原制备人工抗体后，该抗体具有对氯氰菊酯检测灵敏度高和特异性强的特点。
2)本发明所提供的氯氰菊酯含量检测用半抗原，采用该半抗原为原料制备的抗体，由于以该半抗原为原料，显示针对氯氰菊酯残留检测较强的免疫原性；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的人工抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，针对氯氰菊酯残留样本的检测灵敏度可达9μg/L，满足现有国标对农产品中氯氰菊酯残留检测的要求。
3)本发明所提供的氯氰菊酯含量检测用抗体及试剂盒，检测操作简单，无需购置大型仪器分析设备，仅需通过试剂盒即可完成对样本的检测，适宜现场大批量检测。
4)本发明所提供的酶联免疫试剂盒，以所得抗体制成，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量样本，适于烟草中氯氰菊酯的现场监控和大量样本的筛查。
附图说明
图1为本发明实施例中所得酶联免疫检测试剂盒在烟叶样本检测的运用中采用本发明提供的抗体对梯度浓度的氯氰菊酯标准品溶液检测后所得标准曲线；
图2为本发明实施例1中制备得到的氯氰菊酯含量检测用半抗原实物照片；
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式及其附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明半抗原制备抗原、抗原制备抗体、抗体制备试剂盒中未详述内容均按现有技术中公开的方法进行，在此不累述。
实施例
以下实施例中所用物料及仪器如非特殊说明，均为商业渠道购得。
实施例1氯氰菊酯含量检测用半抗原制备
按如下步骤制备氯氰菊酯检测用抗原：
1)取1.48g氨基苯乙腈加10mL乙醇溶解，加入3mL 1mol/L HCl溶液和20mL水充分搅拌后，冰浴下冷却到3℃，加入含有0.81g亚硝酸钠的水溶液1mL搅拌1h，得到原料液；
2)取1.46g 3-羟基苯甲酸加15mL 1mol/L氢氧化钠水溶液溶解，加入20mL水充分搅拌后，冷却到1℃，滴加步骤1)所得全部原料液，保持1℃反应4h后停止反应，用6mol/LHCl溶液调节pH值到6，加溶剂乙酸乙酯100mL×3萃取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，用体积比为10:1的1,2-二氯乙烷-正己烷混合溶液30mL重结晶，得到中间产物；
3)取2.09g二氯菊酸加50mL三氯甲烷溶解，冷却至2℃，加入0.93g草酰氯搅拌2h后，加入步骤2)所得全部中间产物继续搅拌1h，恢复至室温(25℃)，继续搅拌2h后停止反应，加入100mL水并补加100mL三氯甲烷，得到反应液；
4)对所得反应液充分震荡，静置，分去水相，有机相加100mL水充分震荡，静置，分去水相，浓缩蒸干，上硅胶柱，用体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱分离，得到重氮化苯甲酸氯氰菊酯0.46g，即为上述氯氰菊酯含量检测用半抗原样品1。
氯氰菊酯检测含量用半抗原的得率为17.3％。
实施例2氯氰菊酯含量检测用半抗原制备
与实施例1的区别在于：步骤1)中冷却到0℃；步骤2)中冷却到0℃，滴加步骤1)所得全部原料液，保持0℃；步骤3)中冷却到0℃，得到氯氰菊酯含量检测用半抗原样品2。
实施例3氯氰菊酯含量检测用半抗原制备
与实施例1的区别在于：步骤1)中冷却到5℃；步骤2)中冷却到5℃，滴加步骤1)所得全部原料液，保持5℃；步骤3)中冷却到5℃，得到氯氰菊酯含量检测用半抗原样品3。
实施例4与牛血清白蛋白偶联的氯氰菊酯含量检测用抗原制备
包括以下步骤：
取实施例1中制得的氯氰菊酯含量检测用半抗原36.4mg，加1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解澄清，加N-羟基丁二酰亚胺(NHS)17.1mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)28.6mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)100mg，加0.1mol/L pH 9.1的CB缓冲液9mL溶解，得到B液。
将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的氯氰菊酯抗原，分装，-20℃保存。
实施例5与卵清蛋白偶联的氯氰菊酯含量检测用抗原制备
包括以下步骤：
取实施例1制备的氯氰菊酯含量检测用半抗原21.6mg，加1mL DMF溶解澄清，加NHS10.1mg、EDC 16.97mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白(OVA)100mg，加0.1mol/L pH 9.5的CB缓冲液9mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与卵清蛋白偶联的氯氰菊酯抗原，分装，-20℃保存。
实施例6氯氰菊酯含量检测用单克隆抗体制备
包括以下步骤：
(1)动物免疫：将实施例2制备的与牛血清白蛋白偶联的氯氰菊酯抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。
(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏：将氯氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×109个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射氯氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株6×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(64000～120000)。
间接竞争ELISA方法：用实施例3制备的与卵清蛋白偶联的氯氰菊酯抗原包被酶标板，加入氯氰菊酯标准品溶液和单克隆抗体工作液，4℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，25℃反应30min，取出重复洗板步骤；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
实施例7氯氰菊酯含量检测用酶联免疫检测试剂盒制备
所得试剂盒包括：
(1)包被有与卵清蛋白偶联的氯氰菊酯抗原的酶标板；
(2)氯氰菊酯单克隆抗体工作液；
(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
(4)氯氰菊酯标准品溶液5瓶，浓度分别为0μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L、243μg/L；
(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L硫酸溶液；
(7)洗涤液为pH 7.2，含1.0％吐温-20、0.02‰硫柳汞防腐剂、0.2mol/L的碳酸盐缓冲液；
(8)复溶液为pH 7.6，含1.0％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。
本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。便于对采收的大批量烟叶进行快速批量化的检测。
实施例8所得酶联免疫检测试剂盒在烟叶样本检测中的运用及其性能检测：
一、实施例7中所得氯氰菊酯酶联免疫检测试剂盒的测试方法，包括如下步骤：
1、样品前处理
将烟叶样本捣碎，称取1.05g捣碎的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，用涡旋混合仪涡动3min，混匀，3000×g室温(22℃)离心5min；移取50μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶液，涡动20s，混匀；取50μL用于分析(稀释倍数：100)。
2.实施例7中所得试剂盒检测操作步骤如下：
向酶标板(包被有实施例5中所得卵清蛋白偶联的氯氰菊酯抗原)的微孔中加入待测溶液50μL/孔，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体50μL/孔和实施例6中制得的氯氰菊酯单克隆抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，25℃避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；
每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μL，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸溶液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。
3.检测及其结果分析
按上述操作步骤，分别以梯度稀释的氯氰菊酯标准品溶液、预处理烟叶样品为待检测溶液进行检测；
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。
以氯氰菊酯标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示。
用同样的方法计算检测所得预处理烟叶样品溶液的百分吸光度值，再从氯氰菊酯标准品的标准曲线上读出该预处理样本对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为该预处理样本中氯氰菊酯的实际浓度。
二、实施例7中所得试剂盒灵敏度测定：
本申请中灵敏度：指该试剂盒所能检出的待测物中氯氰菊酯的最低含量，定量试剂盒本身的灵敏度通常可以理解为试剂盒标准品中除“0”标准品外，浓度最小的标准品浓度值或建立标准曲线时所对应的最低标准品浓度。按现有方法计算本申请提供的试剂盒对氯氰菊酯的灵敏度为9μg/L。
三、实施例7中所得试剂盒检测限测定：
检测限：通常指试剂盒产品测定实际样本的最小检出量，其理论定义为：按照合理的前处理方法对20份阴性(空白)样本进行测定，算出平均值X和标准差(SD)，据公式X+3SD得出的结果即为该样本的检测(下)限。因此，根据上述现有方法测得本试剂盒对烟叶样本中氯氰菊酯的检测限为900μg/kg。
四、实施例7中所得试剂盒的准确度和精密度测定：
准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白烟叶样本，以900、1800、3600μg/kg三个浓度的氯氰菊酯对其按现有方法进行添加回收试验，实验结果：采用本申请提供半抗原制得的试剂盒对烟叶样本的回收率为100％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％。
说明本申请提供半抗原对氯氰菊酯具有较好的特异性，能准确检测样本中所含氯氰菊酯。
五、实施例7中所得试剂盒的抗体交叉反应性测定
采用与氯氰菊酯具有类似结构的：氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、联苯菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯分别采用现有间接竞争ELISA方法测定，结果显示除氯氰菊酯为100％外，其余均<1％。
说明本申请提供半抗原对氯氰菊酯具有较好的特异性，能准确检测样本中所含氯氰菊酯，且不受其他类似结构农药的影响。
六、实施例7中所得试剂盒的测定结果与现有仪器测量方法比较：
取采后待烤烟叶、初烤烟叶样本各20份，分别对待烤烟叶、初烤烟叶编号为1～20号，以同一份待烤烟叶、初烤烟叶等分后作为检测样本分别采用实施例7中所得试剂盒、对比例1中仪器检测方法进行检测。
对比例1
采用仪器检测方法对样本中氯氰菊酯含量进行检测。
仪器方法参照：“YC/T 405.2-2011烟草及烟草制品多种农药残留量的测定第2部分：有机氯及拟除虫菊酯农药残留量的测定气相色谱法”(氯氰菊酯检出限为0.005mg/kg)。
以中国烟草总公司企业标准YQ 50-2014《烟叶农药最大残留限量》中氯氰菊酯的最大残留限量(1mg/kg)为阳性判定线，低于1mg/kg，视为未检出，用“－”表示；高于1mg/kg的样品用实际结果表示。
实验组和对照组所得结果见下表1～2。
表1采后待烤烟叶样本试剂盒与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
样本编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
试剂盒 － 2.1 － － － － － － 3.6 －
气相色谱法(GC) － 1.7 － － － － － － 3.1 －
样本编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
试剂盒 － － － － 2.5 － － － － －
气相色谱法(GC) － － － － 2.2 － － － － －
表2初烤烟叶样本试剂盒与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
Figure BDA0003703672450000141
Figure BDA0003703672450000151
由上表1～2可知，本申请提供试剂盒的检测结果与仪器检测结果基本吻合，误差处于可接受范围内，说明采用本申请提供试剂盒能替代现有繁琐的仪器检测方法，提高检测效率的同时能获得准确的检测结果。
七、实施例7中所得试剂盒保存期限条件测试：
在2～8℃保存该试剂盒12个月后对其进行最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、氯氰菊酯实际测定值进行检测，各值均在正常范围内。
经测定本申请提供的试剂盒至少可以保存12个月。
由以上检测结果可知，本发明提供的半抗原制得的抗体，并制成试剂盒后，在烟叶中氯氰菊酯残留量检测中具有较准确的检测效果，采用本发明提供的试剂盒，可以在各类经过预处理的农产品中进行有效检测。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，化学名称为：(E)4-((4-(含氰基的((3-(2,2-二氯乙烯基)2、2-二甲基环丙基甲酰氯)氧)甲基)苯基)二氮烯基-3-羟基苯甲酸；化学结构式为：
Figure FDA0003703672440000011
所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
以氨基苯乙腈为原料经重氮化反应得到反应物，所述反应物与3-羟基苯甲酸进行偶合反应后再与二氯菊酸进行缩合反应，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
2.根据权利要求1所述的氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
1)加乙醇溶解氨基苯乙腈后，加入强酸溶液和水充分搅拌后，冷却到0～5℃，加入亚硝酸钠水溶液搅拌1h，得到原料液；
2)加氢氧化钠水溶液溶解3-羟基苯甲酸，加入水充分搅拌后，冷却到0～5℃，滴加全部所述原料液，保持0～5℃下反应4h后停止反应，对所得溶液进行分离纯化，得到中间产物；
3)溶解二氯菊酸后加入三氯甲烷，冷却至0～5℃，再加入草酰氯搅拌2h，加入全部中间产物并继续搅拌1h，恢复至室温，继续搅拌2h后停止反应，加入水并补加三氯甲烷，得到反应液；
4)对所得反应液进行分离纯化得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
3.根据权利要求2所述的氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，所述步骤1)中所述强酸溶液为1mol/L的HCl溶液；
优选地，所述步骤2)中分离纯化操作包括以下步骤：用酸溶液调节pH值到6，以乙酸乙酯为溶剂萃取三次后合并所得有机相，旋蒸蒸干，用体积比为10:1的1,2-二氯乙烷-正己烷混合溶液重结晶，得到所述中间产物；
优选地，所述步骤2)中所用酸溶液为6mol/L HCl溶液；每次萃取所用溶剂的体积为100mL；
优选地，所述步骤4)中所述分离纯化操作包括以下步骤：对所得反应液充分震荡，静置，分去水相，水洗有机相加100mL水充分震荡，静置，分去水相，浓缩蒸干，上硅胶柱，用体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱分离，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
4.一种氯氰菊酯含量检测用抗原，其特征在于，为由如权利要求1～3中任一项所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
5.根据权利要求4所述的氯氰菊酯含量检测用抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。
6.一种氯氰菊酯含量检测用抗体，其特征在于，为由如权利要求4或5所述抗原经动物免疫得到的抗体；所述抗体与氯氰菊酯发生特异性免疫反应；
优选地，所述氯氰菊酯含量检测用抗体为氯氰菊酯单克隆抗体。
7.一种氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：酶标板、抗体，所述酶标板包被有如权利要求4或5所述的氯氰菊酯含量检测用抗原；
所述抗体为如权利要求6中所述氯氰菊酯含量检测用抗体。
8.根据权利要求7所述的氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒的检测样本为经过预处理的烟草样本；
所述烟草样本预处理包括以下步骤：
将烟叶样本捣碎，称取0.95～1.05g捣碎的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，用涡旋混合仪涡动3min，混匀，3000×g室温下离心5min；
移取50μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶液，涡动20s，混匀；
取50μL作为预处理样本用于检测。
9.根据权利要求7所述的氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒，其特征在于，还包括：梯度浓度的氯氰菊酯标准品溶液、酶标二抗、底物液A液、底物液B液、终止液、洗涤液、复溶液。
10.根据权利要求9所述的氯氰菊酯含量检测用酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述梯度浓度的氯氰菊酯标准品溶液的梯度浓度分别为0μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L、243μg/L；
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
所述底物液A液为过氧化脲，底物液B液为四甲基联苯胺；
所述终止液为2mol/L硫酸溶液；
所述洗涤液为pH 7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述复溶液为pH 7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。
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