JP2003516423A - ネオニコチン殺虫剤のイムノアッセイ - Google Patents
ネオニコチン殺虫剤のイムノアッセイInfo
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Abstract
Description
体および試薬に関する。本発明は、そのようなアッセイを実施する方法に、およ
びそのような方法を実施するための試薬を含むキットにさらに関する。本発明は
、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の検出および定量への特定の適用を有す
る。
実施は高く商業上の成功を得ており、これはそのような制御によって作物収量が
増加できることが示されたからである。しかし、殺虫剤の有効な使用は、害虫の
抵抗性および環境へ、および作業者への曝露の問題の観点から健全な管理を必要
とする。この問題に適用される1つの解決は、在来の急性毒性殺虫剤の必要性を
減少させるために、そして環境負荷率を減少させるために、新しい、より高活性
の殺虫剤を供給することである。
ニコチノイド」殺虫剤である。このクラスの化合物は、例えば、イミダクロプリ
ド、アセタミプリド、およびチアメトキサムであってそれぞれ米国特許番号47
42060および5304566およびEP580553A2に記載されたもの
を含む。
接に処理することは、単独で、または茎葉またはうねへの殺虫剤の適用と組み合
わせて適用されるときに、環境へのおよび作業者への曝露、および害虫の抵抗性
の確立の減少の必要性と取り組む適用の対象である。しかし、種子コーティング
器具を正確にキャリブレーションし、殺虫剤を斉一に種子材料に適用し、とりわ
け殺虫剤の成績および種子ファイトトキシンによる問題を回避することを確保す
るために、注意が払われなければならない。分析的測定を使用して、種子コーテ
ィング装置が正確にキャリブレーションされているか、正確に作動しているか、
そして種子の処理されたロットが出荷され得るか決定することができる。
性で高価で有り、なぜなら、それらは高度に特別な高価な分析手法、例えば、ガ
ス−液体または高速液体クロマトグラフィーを要するからである。両方のクロマ
トグラフィー的技術は、高価な装置であって維持するために費用がかかり、そし
て高度に熟練した技術によって操作されなければならないものを要する。種子処
理施設および栽培者は、通常はそのような装置または常勤の人員を有せず、した
がって種子サンプルを外部分析実験室に発送しなければならない。サンプルがそ
のような実験室によって即答式に分析されるとき、処理施設は発送のおよそ24
時間後に分析データを受け得る。より迅速でない分析では、より長い遅延がある
。これらの遅延は、機械の長時間の無駄な時間をコーティング施設にもたらす。
コーティングされた種子の発送がまた遅延する。
能にする緊急の必要性が存在する。望まれる方法はまた、圃場条件下の実験室外
で有用であり、したがってそれらは栽培者または種子処理人員に、種子サンプル
上の所定の殺虫剤の存在および濃度についての情報を速やかに容易に提供する。
この点で、当該方法が他の産物からの活性農薬材料を識別し、そして種子上に存
在する所望の活性成分の定量的決定を可能とすることが重要である。しかし、古
典的な分析方法の多くの深刻な限界がいまだ存在する。これらの限界のあるもの
を、イムノアッセイ技術の使用によって克服する。
でのより多くの応用が見出され始めた。例えば、イムノアッセイは、作物病害、
アフラトキシンおよびある種の抗生物質の検出および定量に利用可能である。農
薬検出のためのイムノアッセイは、科学文献に記載され(以下参照)、これらは
ほんの過去10年内で商業ベースで利用可能となった。
り、広範囲の標的材料を検出および/または定量する。装置または操作条件より
抗体が、分析特異性を提供する。イムノアッセイはしたがって比較的粗サンプル
について実施することができる。さらに、イムノアッセイ法を、遠隔の、非実験
室セッティングでの使用のために最適化し、特別な実験室だけでなく圃場での使
用も可能とする。
−ジクロロフェノキシ酢酸(Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874
-878(1986))、クロスルフロン(Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem. 33
:962-965(1985))、ハロアセトアミド(Winzenburger, P. A.et al.(欧州特許公
開EP340198, 1989))、およびジフルベンズロン(Wie, S. I.et al., J. Agric.
Food Chem. 30:949-957(1982))、メタラキシル(Newsome, W. H., J. Agric.
Food Chem. 33: 528-530(1985))およびパラチオン(Ercegovich, C. D. et al.,
J. Agric. Food Chem. 29:559-563(1981))を含む種々の農薬を含む。アトラジ
ンの免疫学的検出についての方法がまた記載されている(米国特許番号4530786
)。シアナジン、ジクロホップ−メチル、フェンタクロルフェノール、2,4,
5−Tおよびテルブトリンについての免疫学的アッセイもまた既知である。
物(典型的にはウサギ)から得られたポリクローナル抗血清を利用した。より最
近に、アトラジンおよびその誘導体に特異的なモノクローナル抗体(mAbs)
および分解産物、およびそのようなmAbsのイムノアッセイにおける使用が開
示された(Schlaeppi et al., 欧州特許公開EP365818(1990))。
的抗体を誘発しない。ゆえに、殺虫剤イムノアッセイの開発は多くのステップ、
ハプテンの設計の開始、より高分子量の免疫原性「キャリアー」タンパク質への
のコンジュゲーションを許容しながら殺虫剤分子の構造的特異性を維持する殺虫
剤の誘導体を要する。さらに、これらの生産のプロセス中の抗体のスクリーニン
グのために、化学的構造が動物を免疫化するために使用されるハプテンと異なる
、さらなるハプテンをまた調製し得る。最終的にひとたび抗体調製を得られれば
(ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか)、十分に感受性のイムノア
ッセイが開発されるはずである。
れた(例えば、Voller, A. et al., eds., Immunoassays For The 80's, Univer
sity Park, 1981; Voller, A., ''The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELI
SA)'', Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associate Quarte
rly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A et al., J. Clin. Pathol. 3
1: 507-520(1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio
, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980)参照
。既知の量の所望のアナライトを使用するキャリブレーション曲線の作成が、そ
れぞれのアプローチに不可欠である。
こで、農薬のタンパク質コンジュゲート(「コーティング」または「スクリーニ
ング抗原」と呼ばれる)は、抗農薬抗体が生成される、農薬免疫原中に使用され
るキャリアータンパク質と構造的に関係のないタンパク質を使用して調製する。
コーティング抗原コンジュゲートは固相支持体、例えば、マイクロプレートウェ
ルの表面上に固定され、反応当たりの固相農薬の固定化量を生じる。既知の量の
抗体を試験サンプルと共に添加する。
の遊離の農薬と競合する。液体相中の抗体とアナライトの間の相互作用は、抗体
の固相農薬への結合を阻害する。固相に結合した抗体は、抗農薬抗体の重鎖の定
常領域に特異的な、酵素がコンジュゲートされた第2抗体によって検出される。
多くの、酵素が結合した第2抗体は、そのような使用のために、商業的に入手可
能である。非結合第2抗体を洗浄後、固定された第2抗体を、結合した第2抗体
の量に直接比例的に形成される呈色反応産物を生じる、酵素のための色原性基質
を添加することによって典型的には検出する。こうして反応産物の量は、未知サ
ンプル中のアナライトの量に反比例的である。
ッセイ(EIA)は抗農薬抗体を固相上に固定する。農薬ハプテンは、酵素に共
有結合し、そして得られた酵素コンジュゲートを、抗農薬抗体でコートされたマ
イクロウェルまたは培養管中のサンプルとインキュベーションする。サンプル中
の農薬は、固定された抗体に結合する農薬ハプテン−酵素コンジュゲートと競合
する。固相を洗浄して非結合材料を除去し、そして抗体が結合した酵素コンジュ
ゲートを色原性基質の添加によって検出する。例えば、Bushway, R.J., L.P.Per
kins, S.A.Savage, S.L. Lekousi, and B. S.Ferguson. 1988. Determination o
f atrazine residue in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Enviro
n. Contam. Toxicol. 40:674-654; Fleeker, J. R. and L.W. Cook. 1991. Reli
ability of Commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in wat
er. P. 78-85 in M.Vanderlann, L.H. Stanker, B.E, Watkins, and D.W. Rober
ts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series
451. Washington D.C.: American Chemical Society参照。
子を分析する方法の農業分野での必要性が存在する。
ンおよび免疫原、並びにイムノアッセイによるサンプル中の1または2以上のネ
オニコチノイド殺虫剤の存在を定量するための抗体、方法、試薬、およびキット
を提供する。本発明は、植物繁殖材料、例えば、種子に適用されるネオニコチノ
イド殺虫剤の濃度の定量への特定の適用を有する。
活性成分の量を定量的に測定することが可能となり、ここで、ネオニコチノイド
殺虫剤が種子に適用される。該方法は、種子から活性成分の迅速な抽出および迅
速な抽出溶液のイムノアッセイに基づく測定に関係する。これの測定を使用して
種子コーティング装置が正確にキャリブレーションされたか、正確に作動してい
るか、および種子の処置されたロットが出荷され得るか決定することができる。
このアッセイを、通常の実験室的装置および試薬のみを必要として、操作するほ
ど簡単であるように設計する。したがって、イムノアッセイを実施する経験のな
い人員が、少しの練習試行の後に、試験を首尾よく実行できる。
ハプテンのキャリアー分子、例えば、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質
誘導体(PPD、ツベルクリン)、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、
オバアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのネオニコチノイドハ
プテンへのコンジュゲーションによって作成することができることが見出された
。誘導された材料、例えば、誘導されたウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血
清アルブミン等のコンジュゲートをまた生成することができる。A. Muckerheide
, R. Apple, A. Pesce and J. G. Michael(1987)J. Immunol. 138:833-837参照
。これらの免疫原を次いで、収集され得るネオニコチノイドハプテンに対する抗
体を産生する宿主動物に注射することができる。これらの抗体を次いで種々のイ
ムノアッセイ手法に利用し、殺虫剤または抗体のいずれかを標識するための種々
の既知のマーカーを使用して、対応するネオニコチノイド殺虫剤を検出し得る。
イムノアッセイのある実施態様では、ネオニコチノイド殺虫剤誘導体または抗体
のいずれかを固定する。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を、本
発明の実施で使用することができる。該抗体は、種子コーティング製剤に含まれ
る他のネオニコチノイド殺虫剤を含む他の農薬活性成分の存在下でさえも、所望
のネオニコチノイド殺虫剤(複数含む)に選択的に結合することを示すことがで
きる。
の測定のための検出方法は、バイオセンサーおよび酵素的、蛍光、化学発光およ
びラジオイメトリックシステムを含む。そのようなアッセイは、異種性または同
種性フォーマットを使用し得、そしてマイクロウェルプレート、培養管、および
固相としてのラテックスビーズまたは粒子を使用し得る。
オニコチノイド殺虫剤化合物、例えばイミダクロプリド、ニテンピラム、アセタ
ミプリド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンの濃度を決定す
る。
イムノアッセイを提供する。そのようなイムノアッセイでは、ネオニコチノイド
(抗原)/抗体反応を、反応産物の検出を可能とする、抗原または抗体のいずれ
かを標識する種々のマーカーを使用して、種々の方法によって検出することがで
きる。さらに、抗原または抗体のいずれかの固定は、多くの場合に検出を容易化
する。
類することができる。異種性アッセイは、反応産物の検出に先立ち、結合標識成
分の遊離標識成分からの分離を要する。同種性アッセイは、そのような分離ステ
ップを要しない。該アッセイはさらに(1)例えば、抗原が標識抗体について固
相抗原と競合する場合、または抗原が標識抗原と、固相抗体について競合する場
合、競合的であり、または(2)標識と抗体または抗原の間に直接的な関連性が
ある場合、非競合的であることができる。
殺虫剤を検出することができ、これらは酵素、蛍光化学発光およびバイオセンサ
ーイムノアッセイ、並びにラジオイムノアッセイを含む。エライザ(ELISA
)において、本発明に従って、所望のネオニコチノイド殺虫剤(複数含む)に対
応するハプテンを、酵素で直接的に標識し、または酵素で標識された抗体であっ
て適当な条件で基質との反応を触媒するものの使用によって間接的に標識するこ
とができる。酵素活性は典型的には、呈色反応産物、すなわち、目によって容易
に検出され、または分光器または反射率的手段によって測定され得る呈色終点の
形成によって検出する。
ド殺虫剤(複数含む)に対応するハプテンを、蛍光色素で直接的に、または蛍光
色素標識抗体で間接的に標識することができる。蛍光色素は、放射(例えば、紫
外線)を吸収し、それによって励起され、そして光(例えば可視光)を放射する
色素である。
定する方法は以下のステップを含む:
を提供するステップ、 (b)当該サンプルを、既知の量のネオニコチノイド殺虫剤ハプテン−酵素コン
ジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、 (c)ステップ(b)の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュ
ゲートおよびサンプルを除去するステップ、 (d)当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステ
ップ(c)の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、 (e)ステップ(d)によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合した
ハプテン−酵素コンジュゲートの量、およびそれゆえに当該サンプル中のネオニ
コチノイド殺虫剤の量を決定するステップ。
ニコチノイドハプテン−酵素コンジュゲート、酵素基質、および比色シグナルの
生成を終結させる溶液を含んでいる、キットの形態で供給する。
はまた、ポリクローナル抗体の使用への別形として、モノクローナル抗体を使用
し得ることを認識する。用語「抗体」はここでは一般に、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を意味するために使用する。
体は、当業者に周知の、免疫化およびハイブリドーマ培養技術を使用して作成す
る。好適なハイブリドーマ細胞株は、抗体を産生している細胞およびハツカネズ
ミ種から誘導したミエローマ細胞の融合によって好ましくは生産する。抗体を産
生している細胞は好ましくは脾臓細胞である。任意の好適なミエローマ細胞株を
使用し得るが、しかしナンバーが一般に利用されるよく特性把握された細胞株の
使用が望ましい。
ーナル抗体をまた、当業者に周知の技術を使用して作成する。
ーナルIgG抗体であって:(a)ネオニコチノイド殺虫剤または生物学的に許
容されるキャリアータンパク質に結合された免疫学的に等価なものを含む予め決
定された量の組成物を宿主に投与するステップ、(b)宿主から血清を収集する
ステップ、および(c)該血清からIgG抗体を精製するステップ、 を含む方法によって産生される、抗体調製を提供する。
コチノイド殺虫剤の量を検出するときの特定の適用を有する。用語「植物繁殖材
料」は植物のすべての発生部分、例えば後者の増殖に使用することができる種子
および栄養植物体、例えば挿し木および塊茎(例えばジャガイモ)を意味すると
理解される。例えば、種子(厳格な意味で)、根、果実、塊茎、球根、根茎、お
よび植物の一部を言及し得る。発芽後または土壌から出芽後に移植されるべき発
芽した植物および幼植物をまた言及し得る。浸漬による全体または一部の処理に
よって移植の前に幼植物を保護し得る。
虫剤は以下の式によって表され、
ルであり、 RおよびR3は、独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、 R1およびR2は、独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、またはR1 およびR2は、付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンまたはオ
キサジアジン環を形成し、そして XはN−NO2またはN−CNである。
虫剤は、以下の式によって表され、
ついてのポリクローナル抗体を使用する。これらの抗体は、免疫化した動物の血
清から得ることができる。免疫化を免疫原(ハプテン−PPD抗原性コンジュゲ
ート)を、抗体を産生する種、典型的には哺乳動物および好ましくはウサギまた
はヒツジに注射することによって達成することができる。典型的には、当初に注
射し、次いで一連の次の追加免疫注射をし、抗体応答を最大化する。最適には、
注射養生法(injection regime)は、ニュージーランドホワイトラビットに与え
られる複数投与である。注射される免疫原の量は変化され、しかし、抗体の検出
可能な量を誘発するのに十分でなければならない。抗体産生を、EIA、ELI
SAまたは間接蛍光イムノアッセイアッセイを使用して試行採血で得られる血清
を分析することによって確認することができる。
で使用するハプテンを標識することができる。これらのうち、酵素、例えばアル
カリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラ
クトシダーゼを含むレポーター分子(RM)を述べ得る。加えて、蛍光、発光ま
たは放射活性標識、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ルミノール、アクリ
ジウムおよび放射活性同位体、125I等、またはコロイド粒子、例えば金およ
びセレニウム等を使用することができる。最後に、ランタニドキレートフルオロ
フォア、例えば、ユーロピウムおよびテルビウムを使用し、時間分解性蛍光シグ
ナルを発生させることができる。最も一般的な酵素的マーカーは、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ(HRP)およびアルカリフォスファターゼである。
量を検出する。しかし、本発明の方法を、当業者は適合させ、色原性ディテクタ
ーの他の型で使用することができる。同様に、検出可能反応産物は、発色団に限
定されず、前記のような他の標識を含む。
チノイドコンジュゲート(免疫原)およびアッセイコンジュゲートを生成するの
に有用であると見出された。 ハプテン(IA)
ルであり、 R3は、水素またはC1−C4アルキルであり、 R1およびR2は独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、またはR1お
よびR2は、それらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンま
たはオキサジアジン環を形成し、 nは1ないし5の整数(好ましくは3ないし5の整数)であり、そして XはO、N−NO2またはN−CNである。
そして Eは、共有単結合であり、または式−(CH2)m−の連結部分であり、ここで
mは1ないし3の整数である。
式(IB)で定義したの同じ意味である。
に調製することができる:
される適当な2−アミノエタンチオール誘導体を使用することによって調製し:
5の整数である。
ートを、それぞれの場合に応じて、ネオニコチノイド農薬ハプテンのキャリアー
分子またはレポーター分子へのコンジュゲーションによって作成することができ
、当業者に既知の技術を使用し得る。2つの基本的アプローチをとった。その第
1は、コンジュゲートの一部となるリンカーの使用である。これらのリンカーは
、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり、そして例えば、基質タンパク質中
のシステイン部分のチオール基を介してジスルフィド結合を形成することのでき
るもの、またはN−末端アミノ基またはアミノ側鎖またはリジン残基および活性
化アシル部分の間のアミド結合、例えばスクシンイミジルエステルの形成のでき
るものを含む。一般に、このアプローチは、リンカー上の高度に反応性の官能基
に関係し、そしてコンジュゲーションのための基質に関して妥当に軽便である。
しかしより反応性の小さいことがある官能基、例えば、ヒドラゾン形成の可能で
あるものを使用することがしばしば有用である。
ローチは、例えば、コンジュゲートの1のメンバーのカルボキシル部分の、他方
の遊離アミノ基との反応によって、新しいペプチド結合の形成をもたらすカルボ
ジイミドのような脱水剤を使用する。この場合に、該試薬はコンジュゲートの一
部とならない。
ジイミドは、活性中間体を提供し、そして水のエレメントを除去することによっ
て平衡を移動させ、ペプチド結合を形成する。
なぜなら、コンジュゲートを形成しているタンパク質材料は容易に変性されるか
らである。タンパク質は、水性環境中で安定であるべく設計し、そして溶媒、例
えば、水性媒体にかなり類似であると考えられる、エタノール中でさえも変性す
ると知られる。また、タンパク質コンジュゲート構成要素は、非水性溶媒中で比
較的不溶性である傾向がある。
:
り、そしてPRはタンパク質残基であり:(1)キャリアー分子、例えば、Dipt
heriaウイルスからの精製タンパク質誘導体(PPD、ツベルクリン)、ウシ血
清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンまたはキーホールリンペッ
トヘモシアニンであって免疫原の場合におけるもの、または(2)レポーター分
子(RM)例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼである。
。
整数である。
ンジュゲートを結合するための本発明のプロセスで使用する非標識ポリクローナ
ル抗体を、イムノメトリックアッセイで一般に使用される任意の支持体上に固定
化することができる。これらに含まれ得るのは、濾紙、ラテックまたはポリスチ
レンビーズおよびポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の適当
なマイクロウェルプレートまたは試験管である。この支持体を、天然または合成
起源の任意のポリマー、または非晶質材料、例えばガラスから作成することがで
きる。反応ストリッピングのためにニトロセロロースまたはナイロンの膜、そし
てビーズまたはマイクロプレートのためにポリビニル、ポリプロピレン、ポリス
チレンまたは他のプラスチックを使用するのが有利である。アガロース、アクリ
ルアミドまたはラテックスに基づくゲルまたは粒子もまた使用することができる
。加えて、当業界で既知の任意のイムノクロマトグラフィー装置、試験ストリッ
ピングおよびラテラルフロー装置を本発明のプロセスに適合させることができる
。好適なラテラルフロー装置には、米国特許4366241に開示されたラテラ
ルフロー装置の型を述べることができる。抗体をそのような材料に結合させる技
術は、当業者に周知である。支持体に結合された抗体を得る好適なソースは、例
えば、Beacon Analytical Systems, Inc.(Portland, Maine)である。
処理したロットからの種子の代表のサブサンプル(例えば、5ないし100グラ
ムのキャノーラ種子;10ないし200グラムのソルガム、コムギ、ワタ、トウ
モロコシまたはスイートコーン種子)を好適な溶媒、例えばアセトン、アセトニ
トリル、エタノール、イソプロパノール、メタノール、または種々のパーセンテ
ージの水とのこれらの溶媒の混合物に分散させる。好適な溶媒―水混合物は、例
えば、1ないし50% MeOH/H2Oおよび1ないし20% アセトニトリ
ル/H2Oを含む。分散した種子を、撹拌して混合し、それから約20分間超音
波バスに置き、次いでさらに撹拌する。内容物を処理に付する。既知の一部の液
体抽出物を取り、既知量の溶液、例えば、1%アセトニトリル/水に添加する。
抽出物をさらに希釈し、キャリブレーション曲線の範囲に抽出したネオニコチノ
イドの濃度をもっていく。1000ないし60000倍の希釈が有用であると見
出された。イムノアッセイは実行におよそ35分かかる。分析のため抽出物の抽
出および調製はおよそ30分かかる。したがって種子サンプルをおよそ1時間と
5分で抽出、分析することができる。ある実施態様では、2種の種子サンプル(
種子サンプルにつき5サブサンプルまで)を1度に分析することができる。
チノイド殺虫剤の濃度を検出することができる。しかし、該方法は、サンプルま
たはサンプル抽出物中のネオニコチノイド殺虫剤の量がキャリブレーション曲線
の範囲内に入り、または入るように適当に希釈され得る限り、存在する任意の量
のネオニコチノイド殺虫剤に好適である。
的実施例によってより詳細に例示する。
で2時間撹拌する。該混合物を破砕氷に注意深く撹拌しながら注ぎ、それから濾
過によって破砕氷を除去する。針状結晶dを酢酸エチルに溶解し、そして炭酸カ
リウムを添加して溶液をアルカリ性にする。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過する。濾液を濃縮し、白色粉末を得る(5g)。
lの水から溶液を調製する。pHを、溶液をアイスバスで冷却しながら、2N
NaOHの滴状の添加によって11に調節する。反応フラスコにpH電極および
温度計を装着し、そして得られた透明塩基性溶液を急速に撹拌し、2−メチル−
1−ニトロイソ尿素(2.38g)を小量ずつ添加し、溶液の温度を2℃以下に
保持する。添加を完了して、反応物を0℃で1.5時間撹拌する;pHは9.6
で安定化した。THF(1ml)を添加し、そしてさらに2時間撹拌する。反応
物を水で希釈し、酢酸エチルに注ぐ。有機相を分離の後、有機フラクションを硫
酸マグネシウムで乾燥し、溶液を濾過する。濾液を濃縮し、透明オイルを得る。
粗オイルを3:1のジクロロメタン/アセトニトリルで溶出させるシリカゲル上
でフラッシュクロマトグラフィーし、750mgの所望の産物を白色固体として
得る。
タンスルホン酸(.023ml)、および蟻酸(10ml)と合わせ、そして5
5℃で15時間加熱する。反応物を減圧で濃縮する。得られた褐色のオイルをト
ルエン中に懸濁し、そして溶液を共沸的にストリッピングし乾燥させる。得られ
たオイルを1:1:1のTHF/ジオキサン/アセトニトリルに溶解し、そして
過剰のジアゾメタンで処理する。この溶液を30分間撹拌し、反応物を酢酸と処
理する。反応混合物をオイルに濃縮する。酢酸エチル中にオイルを再構成し、薄
い重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そしてオイルに
再濃縮する。このオイルを3:1のジクロロメタン/アセトニトリルにおけるフ
ラッシュクロマトグラフィーによって精製し、658mgの所望のオキサジアジ
ンアミンブチルエステル(1.3)を透明オイルとして提供する。
して3gの炭酸カリウムを添加する。クロロメチルクロロチアゾールを1度に添
加し、反応混合物を55℃で20時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、そ
して除去して固体を除去する。得られた褐色のろ液をオイルに濃縮する。オイル
を3:1のジクロロメタン/アセトニトリルにおけるフラッシュクロマトグラフ
ィーによって精製し、894gの所望の化合物を黄褐色オイルとして得る。
、室温で6時間撹拌する。反応混合物を水で希釈し、そして4.5のpHとなる
まで1N NaOHの添加によって注意深く塩基性化する。酢酸エチルで抽出し
、そして有機フラクションを硫酸マグネシウムで乾燥する。乾燥有機フラクショ
ンをオイルに濃縮し、そして1:1のジクロロメタン/アセトニトリルのフラッ
シュクロマトグラフィーによって精製し、所望の産物1.5を得る(100mg
)。
O2R(1.1b)の適当なアナログ化合物で置換することによって、表1に示
す以下のチアメトキサムハプテンを調製し、ここでnは1ないし5の整数であり
、RはHまたはC1−C4アルキルである。
化合物(1.1c)
ないし3の整数であり、RはHまたはC1−C4アルキルである) で置換することによって、表2に示す以下のチアメトキサムハプテンを調製する
。
ニソール(6.5ml)を、マグネチックスターラーバーおよび還流コンデンサ
ーを備えた10ml丸底フラスコ中で合わせる。フラスコをオイルバスに置き、
そして2時間165℃で加熱する。アニソールを50℃で5時間減圧で除去する
。得られたオイル産物(90.2mg)はHPLC分析によれば93%純度であ
る。
適当なアナログ化合物で置き換えることによって、表3に示す以下のデス−ニト
ロイミノチアメトキサムハプテンを調製する。
は実施例2−9に示したような式1.1bまたは1.1cの適当なアナログで中
間体1.1aを置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表4
に示す以下のイミダクロプリドのハプテンを調製する。
7の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表5に示す以下のデス−ニ
トロイミノイミダクロプリドハプテンを調製する。
は中間体1.1aを実施例2−9に示すような式1.1bまたは1.1cの適当
なアナログで置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表6に
示す以下のクロチアジンのハプテンを調製する。
5の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表7に示す以下のデス−ニ
トロイミノクロチアジンハプテンを調製する。
て、表8に示すクロチアジンの以下のハプテンを調製する。
PPD)の溶液を1mg/mlの濃度に調製する。0.5mlアリコートのこの
溶液のpHを、0.1M HClで4.5−5.0に調節する。
H4.5中に、実施例1からのチアメトキサムハプテン(1mg)を溶解する。
ハプテンおよびPDD溶液を合わせる。
クロリド(EDC)を100μlの蒸留した、脱イオン水に溶解する。ただちに
EDC溶液を3.2のハプテン−PPD溶液に添加する。ハプテン−PPD−E
DC溶液をローテーションによって室温で2時間混合する。反応混合物を100
0−2000ダルトン分子量カットオフを有する透析バッグに移す。48時間、
3回交換/日で2リットルの4℃のPBSに対して徹底的に透析する。
プリド免疫原を調製する。
ン免疫原を調製する。
ン免疫原を調製する。
に溶解する。メスのニュージーランドホワイトラビットに、およそ25μgの免
疫原をそれぞれの部位に注射により接種する。同様にヒツジを免疫化し、ただし
およそ38μgの免疫原をそれぞれ部位に注射する。 次の免疫化で、免疫原をフロイントの不完全アジュバントに溶解する。動物を
免疫化の間に4週間休ませ、免疫化の10日後に集血する。追加免疫注射を投与
し、そして9月にわたり動物を集血し、それぞれの点で全採血する。 ポリクローナル抗体を当業者に既知の技術を使用して収集する。
シンイミド(NHS)(4.0g)、およびEDC(4.6g)を小さいバイア
ルにおいて合わせる。これらの材料を穏やかな流れの窒素下で15分間室温で乾
燥する。
理する。得られた溶液を終夜室温でインキュベーションする。
て、カルボネートバッファー(2.9mL、0.05M pH9.6)中に溶解
する。バイアルをアイスバスに置く。
と1時間かけて添加し、そして混合物を撹拌しながら2時間インキュベーション
する。 反応混合物を、PBS(0.01M、pH7.2)で平衡させたセファデック
スG−25Mカラムを通過させる。酵素コンジュゲートを最初3.0mLの溶出
液中において収集し、等体積のグリセロールを添加し、−20℃で貯蔵する。
曲線の範囲内、すなわち0.5ないし120ppbとなるように1% MeOH
/H2Oに希釈する。抗体でコートした管をラベルし、そして管ラックにおき、
その結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを
混ぜる。管ラックはそれぞれの管をつかんでおり、その結果ラックは管を失うこ
となくひっくり返し得る。アリコートの標準またはサンプル(0.5mL)をす
べての対応する管に添加する。酵素コンジュゲート溶液(0.5mL)をすべて
の管に添加する。ラックはおだやかに振とうし、すべての管の内容物を混合する
。管を室温で20分間インキュベーションする。ラックをひっくり返しすべての
管の内容物をデカンテーションさせる。蒸留H2Oをすべての管に添加し、反転
的洗浄ビン(flip-top wash bottle)を使用してオバーフローさせ、そして洗浄
液をデカンテーションする。管をさらに3回洗浄する。最後の洗浄の後、ラック
をひっくり返し、そして管を穏やかに清潔なペーパータオルでたたいて過剰の洗
浄液を除去する。
ュベーションする。ラックをこのインキュベーション中穏やかに2.5分ごとに
振とうする。酸性の停止溶液(1M HCl、0.5mL)をすべての管に添加
し、シグナル発生を終結させる。表10に示されるように、この反応産物の吸光
度を450nmで測定する。標準の吸光度を使用してキャリブレーション曲線、
Y=mLn(X)+Bの式の回帰関数を構成する。それぞれのサンプルの吸光度
を該関数に代入し、そして希釈したサンプル中のネオニコチノイド農薬の濃度を
決定する。得られた濃度に希釈ファクターを乗じてもとのサンプル中のネオニコ
チノイド農薬の量を算出する。
データセットは、Y=−.191 Ln(X)+1.23、r=−.999の標準
曲線をもたらし、ここにY=分析応答であり、X=チアメトキサム標準の濃度で
ある。
トコーンおよびコムギまたは40gのキャノーラを、6オンス広口ビンに無作為
に加えることによってサブサンプル化する。キャノーラを4回サブサンプル化し
、他の種子種類は5サブサンプルを使用する。溶媒(150ml)を添加し、硬
くフタをしシールする。ワタ種子は5%アセトニトリル/水で抽出し、一方、他
の種子では20%メタノール/水の溶媒系を使用する。ビンを手で30秒間強く
振とうし、室温で20分間ウォーターバスに超音波処理しながら置く。サンプル
を前記の様に2回およそ5分間振とうする。各ビンの内容物をおよそ5分間据え
、アリコート(0.10ml)を分析のために取る。アリコートを1%メタノー
ル/水に希釈し、標準曲線の範囲に止まるようにする。
結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを混合
する。サンプルおよび標準溶液(0.50ml)を対応する管に添加する。同じ
くらいの体積の酵素コンジュゲート溶液を添加する。ラックを穏やかに振とうし
、溶液およびセットを混合し、室温で20分間インキュベーションする。すべて
の管の内容物を、ラックをステンレススチールパンの上でひっくり返すことによ
って除去する。各管を蒸留水でオーバーフローしながら洗浄する。ラックを流し
の上でひっくり返し洗浄水を捨てる。洗浄を4回反復する。次いでラックをひっ
くり返し、そしてペーパータオルで軽くたたき、残りの洗浄液のほとんどを除去
する。(管に残っているいくらかの液体はアッセイの結果に影響を及ぼさない。
)酵素基質溶液(0.50ml)を管に添加し、これを室温で10分間インキュ
ベーションする。ラックを穏やかに2.5分間隔で振とうし、酵素へ基質の十分
な供給を維持することを確保する。青色呈色シグナルの発生を酸性停止溶液(0
.50ml)の添加によって終結させる。各管の溶液の吸光度を分光光度計的に
450nmで測定する。
ら決定する。
出される他の試験物質がチアメトキサムの測定を妨害するかどうか決定する。試
験物質を1%メタノール/水中に1000ないし0.01ng/mlの範囲の濃
度に溶解する。それぞれの濃度のアリコートを前記の様に分析する。この範囲の
それぞれの試験物質の反応性を、Brady, J. F; Turner, J.; Skinner, D. H.''A
pplication of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incur
red residues in soil and water sample''. J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2
542-2547に以前記載されたように決定する。
応性であると見出される(以下の表9)。したがってこのイムノアッセイはチア
メトキサムに特異的である。 種子の処理したロットのサブサンプルをイムノアッセイおよびHPLCによっ
て分析した。これらの分析結果を表11に示す。表11は、チアメトキサムにつ
いて、40種子サンプルの、ポリクローナル抗体を使用する平均値のイムノアッ
セイ結果およびHPLC分析の相関を記載する。最良の適合回帰線は、類似の結
果がそれぞれの方法によって得られたことを指摘している。
応性2 NR、非反応性
ることなく、前記の本発明について作成され得ることが、当業者によって認識さ
れる。
Claims (21)
- 【請求項1】 ネオニコチノイド殺虫剤の量を決定するための、サンプルの
イムノアッセイで有用な抗体であって、当該抗体が、(I)免疫原性キャリアー
タンパク質にコンジュゲートされたネオニコチノイドハプテンで動物を免疫化す
ることによって産生されたポリクローナル抗体であり、そして(II)ネオニコ
チノイド殺虫剤に特異的に結合する、抗体。 - 【請求項2】 当該抗体が式 【化1】 [式中、Aは2−クロロピリド−5−イルまたは2−クロロチアゾール−5−イ
ルであり、 RおよびR3は独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、 R1およびR2は独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、またはR1お
よびR2はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、そして XはN−NO2またはN−CNである] の化合物に選択性である、請求項1に記載の抗体。 - 【請求項3】 当該抗体が、イミダクロプリド、ニテンピラム、アセタミプ
リド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンからなる群より選択
される化合物に対して選択性である、請求項1に記載の抗体。 - 【請求項4】 下記式の化合物; 【化2】 [式中、Aは2−クロロピリド−5−イルまたは2−クロロチアゾール−5−イ
ルであり、 R3は水素またはC1−C4アルキルであり、 R1およびR2は独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、またはR1お
よびR2はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、 nは1ないし4の整数であり、そして XはN−NO2またはN−CNである]。 - 【請求項5】 下記式の請求項4に記載の化合物。 【化3】
- 【請求項6】 下記式の請求項5に記載の化合物。 【化4】
- 【請求項7】 下記式の請求項4に記載の化合物。 【化5】
- 【請求項8】 下記式の請求項7に記載の化合物。 【化6】
- 【請求項9】 下記式のタンパク質コンジュゲート; 【化7】 [式中、Aは2−クロロピリド−5−イルまたは2−クロロチアゾール−5−イ
ルであり、 R3は水素またはC1−C4アルキルであり、 R1およびR2は独立的に水素またはC1−C4アルキルであり、またはR1お
よびR2はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、 nは1ないし4の整数であり、 XはN−NO2またはN−CNであり、そして PRはDiptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体(PPD、ツベルクリン
)、ウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン
、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択
されるキャリアー分子のタンパク質残基であり;またはアルカリフォスファター
ゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼからな
る群より選択される酵素残基である] - 【請求項10】 下記式の請求項9に記載のタンパク質コンジュゲート。 【化8】
- 【請求項11】 下記式の請求項9に記載のタンパク質コンジュゲート。 【化9】
- 【請求項12】 サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の濃度を決定する方
法であって、 (a)当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相
を提供するステップ、 (b)当該サンプルを、既知の量のネオニコチノイド殺虫剤ハプテン−酵素コン
ジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、 (c)ステップ(b)の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュ
ゲートおよびサンプルを除去するステップ、 (d)当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステ
ップ(c)の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、 (e)ステップ(d)によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合した
ハプテン−酵素コンジュゲートの量、およびそれゆえに当該サンプル中のネオニ
コチノイド殺虫剤の量を決定するステップ、 の各ステップを含む、方法。 - 【請求項13】 当該サンプルが、好適な溶媒中で植物繁殖材料を抽出する
ことによって得られる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 当該植物繁殖材料が種子である、請求項13に記載の方法
。 - 【請求項15】 当該種子が、キャノーラ、ソルガム、コムギ、ワタ、トウ
モロコシまたはスイートコーンからなる群より選択される、請求項14に記載の
方法。 - 【請求項16】 当該抗体が、免疫原性キャリーアータンパク質にコンジュ
ゲートされたネオニコチノイド殺虫剤で動物を免疫化することによって産生され
るポリクローナル抗体である、請求項12に記載の方法。 - 【請求項17】 当該免疫原性キャリアータンパク質が、Diptheriaウイル
スからの精製タンパク質誘導体(PPD、ツベルクリン)、ウシ血清アルブミン
、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンおよび
キーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択されるキャリアー分子で
ある、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 ネオニコチノイド殺虫剤の量を決定するための、サンプル
のイムノアッセイに有用であるキットであって、1または2以上の容器中に、 (a)当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相
、 (b)ネオニコチノイドハプテンにコンジュゲートされた酵素を含む酵素コンジ
ュゲート、 を組み合わせて含む、キット。 - 【請求項19】 当該抗体が、免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲ
ートされたネオニコチノイドで動物を免疫化することによって産生されるポリク
ローナル抗体である、請求項18に記載のキット。 - 【請求項20】 該酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
請求項19に記載のキット。 - 【請求項21】 該抗体が、イミダクロプリド、ニテンピラム、アセタミプ
リド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンからなる群より選択
されるネオニコチノイド殺虫剤に特異的に結合する、請求項18に記載のキット
。
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