JP2003516423A

JP2003516423A - ネオニコチン殺虫剤のイムノアッセイ

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Publication number: JP2003516423A
Application number: JP2001544026A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズ・フランシス・ブレイディ; ダナ・フィリップ・シモンズ; ティモシー・エドワード・ウィルソン
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2003-05-13
Anticipated expiration: 2020-12-06
Also published as: PT1235805E; AR026735A1; MA25635A1; ES2272357T3; CZ20021969A3; NO331464B1; PL355630A1; KR100752536B1; AU2672101A; DE60031570T2; CA2393084C; HUP0203499A2; ZA200204582B; MXPA02005514A; EP1235805B1; AU778677B2; WO2001042787A2; HUP0203499A3; CN100379725C; US20030108970A1

Abstract

(57)【要約】【化１】本発明は、抗ネオニコチノイド抗体を産生するための免疫原並びにイムノアッセイによってサンプル中の１または２以上のネオニコチノイド殺虫剤の存在を検出するための、抗体、方法、試薬、およびキットを提供する。本発明は、植物繁殖材料、例えば種子へ適用されたネオニコチノイド殺虫剤の濃度の決定への特定の適用を有し、当該抗体は式（Ｉ）の化合物に選択性であり、ここで、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イルであり；Ｒ^１およびＲ^３は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり；Ｒ^１およびＲ^２は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルでありまたはＲ^１およびＲ^２は付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し；そしてＸはＮ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮである。また、式（ＩＡ）の化合物および式（ＩＩ）のタンパク質コンジュゲートを請求し、ここにＰＲは、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択される担体分子のタンパク質残基；またはアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される酵素残基である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、農薬のイムノアッセイに、およびそのようなアッセイを実施する抗
体および試薬に関する。本発明は、そのようなアッセイを実施する方法に、およ
びそのような方法を実施するための試薬を含むキットにさらに関する。本発明は
、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の検出および定量への特定の適用を有す
る。

【０００２】殺虫剤作物で害虫を制御するための合成殺虫剤の使用は、広く実施されている。この
実施は高く商業上の成功を得ており、これはそのような制御によって作物収量が
増加できることが示されたからである。しかし、殺虫剤の有効な使用は、害虫の
抵抗性および環境へ、および作業者への曝露の問題の観点から健全な管理を必要
とする。この問題に適用される１つの解決は、在来の急性毒性殺虫剤の必要性を
減少させるために、そして環境負荷率を減少させるために、新しい、より高活性
の殺虫剤を供給することである。

【０００３】市場で顕著な認知を得ている、ある新しいクラスの殺虫剤は、いわゆる「ネオ
ニコチノイド」殺虫剤である。このクラスの化合物は、例えば、イミダクロプリ
ド、アセタミプリド、およびチアメトキサムであってそれぞれ米国特許番号４７
４２０６０および５３０４５６６およびＥＰ５８０５５３Ａ２に記載されたもの
を含む。

【０００４】殺虫剤を植物繁殖材料（plant propagation materials）（例えば種子）に直
接に処理することは、単独で、または茎葉またはうねへの殺虫剤の適用と組み合
わせて適用されるときに、環境へのおよび作業者への曝露、および害虫の抵抗性
の確立の減少の必要性と取り組む適用の対象である。しかし、種子コーティング
器具を正確にキャリブレーションし、殺虫剤を斉一に種子材料に適用し、とりわ
け殺虫剤の成績および種子ファイトトキシンによる問題を回避することを確保す
るために、注意が払われなければならない。分析的測定を使用して、種子コーテ
ィング装置が正確にキャリブレーションされているか、正確に作動しているか、
そして種子の処理されたロットが出荷され得るか決定することができる。

【０００５】しかし、種子の殺虫剤の残留の検出のための伝統的な方法は、極端に時間消費
性で高価で有り、なぜなら、それらは高度に特別な高価な分析手法、例えば、ガ
ス−液体または高速液体クロマトグラフィーを要するからである。両方のクロマ
トグラフィー的技術は、高価な装置であって維持するために費用がかかり、そし
て高度に熟練した技術によって操作されなければならないものを要する。種子処
理施設および栽培者は、通常はそのような装置または常勤の人員を有せず、した
がって種子サンプルを外部分析実験室に発送しなければならない。サンプルがそ
のような実験室によって即答式に分析されるとき、処理施設は発送のおよそ２４
時間後に分析データを受け得る。より迅速でない分析では、より長い遅延がある
。これらの遅延は、機械の長時間の無駄な時間をコーティング施設にもたらす。
コーティングされた種子の発送がまた遅延する。

【０００６】当業界に、既存の測定技術をより低廉に、より効率的そしてより容易に管理可
能にする緊急の必要性が存在する。望まれる方法はまた、圃場条件下の実験室外
で有用であり、したがってそれらは栽培者または種子処理人員に、種子サンプル
上の所定の殺虫剤の存在および濃度についての情報を速やかに容易に提供する。
この点で、当該方法が他の産物からの活性農薬材料を識別し、そして種子上に存
在する所望の活性成分の定量的決定を可能とすることが重要である。しかし、古
典的な分析方法の多くの深刻な限界がいまだ存在する。これらの限界のあるもの
を、イムノアッセイ技術の使用によって克服する。

【０００７】農薬のイムノアッセイおよび検出医学的および獣医学的使用が先ず発達したが、イムノアッセイは農業上の領域
でのより多くの応用が見出され始めた。例えば、イムノアッセイは、作物病害、
アフラトキシンおよびある種の抗生物質の検出および定量に利用可能である。農
薬検出のためのイムノアッセイは、科学文献に記載され（以下参照）、これらは
ほんの過去１０年内で商業ベースで利用可能となった。

【０００８】イムノアッセイは、高度に特異的な抗体試薬および比較的単純な分析器具によ
り、広範囲の標的材料を検出および／または定量する。装置または操作条件より
抗体が、分析特異性を提供する。イムノアッセイはしたがって比較的粗サンプル
について実施することができる。さらに、イムノアッセイ法を、遠隔の、非実験
室セッティングでの使用のために最適化し、特別な実験室だけでなく圃場での使
用も可能とする。

【０００９】免疫学的方法は、ある種の除草剤の検出について既知であり、これらは２，４
−ジクロロフェノキシ酢酸（Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874
-878(1986)）、クロスルフロン（Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem. 33
:962-965(1985)）、ハロアセトアミド（Winzenburger, P. A.et al.(欧州特許公
開EP340198, 1989)）、およびジフルベンズロン（Wie, S. I.et al., J. Agric.
Food Chem. 30:949-957(1982)）、メタラキシル（Newsome, W. H., J. Agric.
Food Chem. 33: 528-530(1985))およびパラチオン（Ercegovich, C. D. et al.,
J. Agric. Food Chem. 29:559-563(1981)）を含む種々の農薬を含む。アトラジ
ンの免疫学的検出についての方法がまた記載されている（米国特許番号4530786
）。シアナジン、ジクロホップ−メチル、フェンタクロルフェノール、２，４，
５−Ｔおよびテルブトリンについての免疫学的アッセイもまた既知である。

【００１０】前記のすべての免疫学的方法は、適当な抗原（免疫原）で免疫化された宿主動
物（典型的にはウサギ）から得られたポリクローナル抗血清を利用した。より最
近に、アトラジンおよびその誘導体に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）
および分解産物、およびそのようなｍＡｂｓのイムノアッセイにおける使用が開
示された（Schlaeppi et al., 欧州特許公開EP365818(1990)）。

【００１１】その低分子量のために、殺虫剤は、免疫原性でなく、そして動物宿主から特異
的抗体を誘発しない。ゆえに、殺虫剤イムノアッセイの開発は多くのステップ、
ハプテンの設計の開始、より高分子量の免疫原性「キャリアー」タンパク質への
のコンジュゲーションを許容しながら殺虫剤分子の構造的特異性を維持する殺虫
剤の誘導体を要する。さらに、これらの生産のプロセス中の抗体のスクリーニン
グのために、化学的構造が動物を免疫化するために使用されるハプテンと異なる
、さらなるハプテンをまた調製し得る。最終的にひとたび抗体調製を得られれば
（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）、十分に感受性のイムノア
ッセイが開発されるはずである。

【００１２】現代のイムノアッセイで使用される基本的な戦略は、多くの引用文献に記載さ
れた（例えば、Voller, A. et al., eds., Immunoassays For The 80's, Univer
sity Park, 1981; Voller, A., ''The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELI
SA)'', Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associate Quarte
rly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A et al., J. Clin. Pathol. 3
1: 507-520(1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio
, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980）参照
。既知の量の所望のアナライトを使用するキャリブレーション曲線の作成が、そ
れぞれのアプローチに不可欠である。

【００１３】一般に使用される「標識抗体」法は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）と称される。こ
こで、農薬のタンパク質コンジュゲート（「コーティング」または「スクリーニ
ング抗原」と呼ばれる）は、抗農薬抗体が生成される、農薬免疫原中に使用され
るキャリアータンパク質と構造的に関係のないタンパク質を使用して調製する。
コーティング抗原コンジュゲートは固相支持体、例えば、マイクロプレートウェ
ルの表面上に固定され、反応当たりの固相農薬の固定化量を生じる。既知の量の
抗体を試験サンプルと共に添加する。

【００１４】固定された農薬は、限定された数の抗体結合部位について、未知のサンプル中
の遊離の農薬と競合する。液体相中の抗体とアナライトの間の相互作用は、抗体
の固相農薬への結合を阻害する。固相に結合した抗体は、抗農薬抗体の重鎖の定
常領域に特異的な、酵素がコンジュゲートされた第２抗体によって検出される。
多くの、酵素が結合した第２抗体は、そのような使用のために、商業的に入手可
能である。非結合第２抗体を洗浄後、固定された第２抗体を、結合した第２抗体
の量に直接比例的に形成される呈色反応産物を生じる、酵素のための色原性基質
を添加することによって典型的には検出する。こうして反応産物の量は、未知サ
ンプル中のアナライトの量に反比例的である。

【００１５】「標識抗体」法の修飾は、コーティング抗原の使用を排除する。酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）は抗農薬抗体を固相上に固定する。農薬ハプテンは、酵素に共
有結合し、そして得られた酵素コンジュゲートを、抗農薬抗体でコートされたマ
イクロウェルまたは培養管中のサンプルとインキュベーションする。サンプル中
の農薬は、固定された抗体に結合する農薬ハプテン−酵素コンジュゲートと競合
する。固相を洗浄して非結合材料を除去し、そして抗体が結合した酵素コンジュ
ゲートを色原性基質の添加によって検出する。例えば、Bushway, R.J., L.P.Per
kins, S.A.Savage, S.L. Lekousi, and B. S.Ferguson. 1988. Determination o
f atrazine residue in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Enviro
n. Contam. Toxicol. 40:674-654; Fleeker, J. R. and L.W. Cook. 1991. Reli
ability of Commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in wat
er. P. 78-85 in M.Vanderlann, L.H. Stanker, B.E, Watkins, and D.W. Rober
ts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series
451. Washington D.C.: American Chemical Society参照。

【００１６】圃場または種子処理施設で実施できる、活性成分、例えば殺虫剤で処理した種
子を分析する方法の農業分野での必要性が存在する。

【００１７】本発明は、抗ネオニコチノイド抗体を生成するためのネオニコチノイドハプテ
ンおよび免疫原、並びにイムノアッセイによるサンプル中の１または２以上のネ
オニコチノイド殺虫剤の存在を定量するための抗体、方法、試薬、およびキット
を提供する。本発明は、植物繁殖材料、例えば、種子に適用されるネオニコチノ
イド殺虫剤の濃度の定量への特定の適用を有する。

【００１８】本発明のイムノアッセイ方法によって、種子処理施設での人員が、適用される
活性成分の量を定量的に測定することが可能となり、ここで、ネオニコチノイド
殺虫剤が種子に適用される。該方法は、種子から活性成分の迅速な抽出および迅
速な抽出溶液のイムノアッセイに基づく測定に関係する。これの測定を使用して
種子コーティング装置が正確にキャリブレーションされたか、正確に作動してい
るか、および種子の処置されたロットが出荷され得るか決定することができる。
このアッセイを、通常の実験室的装置および試薬のみを必要として、操作するほ
ど簡単であるように設計する。したがって、イムノアッセイを実施する経験のな
い人員が、少しの練習試行の後に、試験を首尾よく実行できる。

【００１９】抗原性ネオニコチノイドコンジュゲート（免疫原）を、ネオニコチノイド農薬
ハプテンのキャリアー分子、例えば、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質
誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、
オバアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのネオニコチノイドハ
プテンへのコンジュゲーションによって作成することができることが見出された
。誘導された材料、例えば、誘導されたウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血
清アルブミン等のコンジュゲートをまた生成することができる。A. Muckerheide
, R. Apple, A. Pesce and J. G. Michael(1987)J. Immunol. 138:833-837参照
。これらの免疫原を次いで、収集され得るネオニコチノイドハプテンに対する抗
体を産生する宿主動物に注射することができる。これらの抗体を次いで種々のイ
ムノアッセイ手法に利用し、殺虫剤または抗体のいずれかを標識するための種々
の既知のマーカーを使用して、対応するネオニコチノイド殺虫剤を検出し得る。
イムノアッセイのある実施態様では、ネオニコチノイド殺虫剤誘導体または抗体
のいずれかを固定する。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を、本
発明の実施で使用することができる。該抗体は、種子コーティング製剤に含まれ
る他のネオニコチノイド殺虫剤を含む他の農薬活性成分の存在下でさえも、所望
のネオニコチノイド殺虫剤（複数含む）に選択的に結合することを示すことがで
きる。

【００２０】本発明の実施に適用することができる、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤
の測定のための検出方法は、バイオセンサーおよび酵素的、蛍光、化学発光およ
びラジオイメトリックシステムを含む。そのようなアッセイは、異種性または同
種性フォーマットを使用し得、そしてマイクロウェルプレート、培養管、および
固相としてのラテックスビーズまたは粒子を使用し得る。

【００２１】本発明のイムノアッセイを使用し、サンプル、例えば植物繁殖材料におけるネ
オニコチノイド殺虫剤化合物、例えばイミダクロプリド、ニテンピラム、アセタ
ミプリド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンの濃度を決定す
る。

【００２２】本発明は、ネオニコチノイド殺虫剤の存在についてサンプルを試験するための
イムノアッセイを提供する。そのようなイムノアッセイでは、ネオニコチノイド
（抗原）／抗体反応を、反応産物の検出を可能とする、抗原または抗体のいずれ
かを標識する種々のマーカーを使用して、種々の方法によって検出することがで
きる。さらに、抗原または抗体のいずれかの固定は、多くの場合に検出を容易化
する。

【００２３】抗原／抗体アッセイを、異種性および同種性の、２種のカテゴリーに一般に分
類することができる。異種性アッセイは、反応産物の検出に先立ち、結合標識成
分の遊離標識成分からの分離を要する。同種性アッセイは、そのような分離ステ
ップを要しない。該アッセイはさらに（１）例えば、抗原が標識抗体について固
相抗原と競合する場合、または抗原が標識抗原と、固相抗体について競合する場
合、競合的であり、または（２）標識と抗体または抗原の間に直接的な関連性が
ある場合、非競合的であることができる。

【００２４】本発明の実施でイムノアッセイ法を使用して、サンプル中のネオニコチノイド
殺虫剤を検出することができ、これらは酵素、蛍光化学発光およびバイオセンサ
ーイムノアッセイ、並びにラジオイムノアッセイを含む。エライザ（ＥＬＩＳＡ
）において、本発明に従って、所望のネオニコチノイド殺虫剤（複数含む）に対
応するハプテンを、酵素で直接的に標識し、または酵素で標識された抗体であっ
て適当な条件で基質との反応を触媒するものの使用によって間接的に標識するこ
とができる。酵素活性は典型的には、呈色反応産物、すなわち、目によって容易
に検出され、または分光器または反射率的手段によって測定され得る呈色終点の
形成によって検出する。

【００２５】本発明での使用のための蛍光イムノアッセイ技術では、所望のネオニコチノイ
ド殺虫剤（複数含む）に対応するハプテンを、蛍光色素で直接的に、または蛍光
色素標識抗体で間接的に標識することができる。蛍光色素は、放射（例えば、紫
外線）を吸収し、それによって励起され、そして光（例えば可視光）を放射する
色素である。

【００２６】本発明のある実施態様では、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の濃度を決
定する方法は以下のステップを含む：

【００２７】（ａ）当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相
を提供するステップ、（ｂ）当該サンプルを、既知の量のネオニコチノイド殺虫剤ハプテン−酵素コン
ジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュ
ゲートおよびサンプルを除去するステップ、（ｄ）当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステ
ップ（ｃ）の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合した
ハプテン−酵素コンジュゲートの量、およびそれゆえに当該サンプル中のネオニ
コチノイド殺虫剤の量を決定するステップ。

【００２８】ある実施態様ではこのイムノアッセイを、抗体がコーティングされた管、ネオ
ニコチノイドハプテン−酵素コンジュゲート、酵素基質、および比色シグナルの
生成を終結させる溶液を含んでいる、キットの形態で供給する。

【００２９】ポリクローナル抗体の使用に言及して本発明をしばしば説明する一方、当業者
はまた、ポリクローナル抗体の使用への別形として、モノクローナル抗体を使用
し得ることを認識する。用語「抗体」はここでは一般に、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を意味するために使用する。

【００３０】本発明の実施での使用のためのネオニコチノイド殺虫剤へのモノクローナル抗
体は、当業者に周知の、免疫化およびハイブリドーマ培養技術を使用して作成す
る。好適なハイブリドーマ細胞株は、抗体を産生している細胞およびハツカネズ
ミ種から誘導したミエローマ細胞の融合によって好ましくは生産する。抗体を産
生している細胞は好ましくは脾臓細胞である。任意の好適なミエローマ細胞株を
使用し得るが、しかしナンバーが一般に利用されるよく特性把握された細胞株の
使用が望ましい。

【００３１】同様に、本発明の実施での使用のためのネオニコチノイド殺虫剤へのポリクロ
ーナル抗体をまた、当業者に周知の技術を使用して作成する。

【００３２】本発明はまた、少なくとも１種のネオニコチノイド殺虫剤に結合するポリクロ
ーナルＩｇＧ抗体であって：（ａ）ネオニコチノイド殺虫剤または生物学的に許
容されるキャリアータンパク質に結合された免疫学的に等価なものを含む予め決
定された量の組成物を宿主に投与するステップ、（ｂ）宿主から血清を収集する
ステップ、および（ｃ）該血清からＩｇＧ抗体を精製するステップ、を含む方法によって産生される、抗体調製を提供する。

【００３３】前記の様に、本発明のイムノアッセイには、植物繁殖材料に適用されたネオニ
コチノイド殺虫剤の量を検出するときの特定の適用を有する。用語「植物繁殖材
料」は植物のすべての発生部分、例えば後者の増殖に使用することができる種子
および栄養植物体、例えば挿し木および塊茎（例えばジャガイモ）を意味すると
理解される。例えば、種子（厳格な意味で）、根、果実、塊茎、球根、根茎、お
よび植物の一部を言及し得る。発芽後または土壌から出芽後に移植されるべき発
芽した植物および幼植物をまた言及し得る。浸漬による全体または一部の処理に
よって移植の前に幼植物を保護し得る。

【００３４】ある実施態様では、本発明のアッセイによって検出可能なネオニコチノイド殺
虫剤は以下の式によって表され、

【化１０】ここで、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イ
ルであり、ＲおよびＲ^３は、独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２は、独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、またはＲ^１およびＲ^２は、付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンまたはオ
キサジアジン環を形成し、そしてＸはＮ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮである。

【００３５】別の実施態様では、本発明のアッセイによって検出可能なネオニコチノイド殺
虫剤は、以下の式によって表され、

【化１１】ここで、Ａ、Ｒ^３およびＸは上記式（Ｉ）と同じ意味である。

【００３６】好ましい実施態様では、本発明のイムノアッセイはネオニコチノイド殺虫剤に
ついてのポリクローナル抗体を使用する。これらの抗体は、免疫化した動物の血
清から得ることができる。免疫化を免疫原（ハプテン−ＰＰＤ抗原性コンジュゲ
ート）を、抗体を産生する種、典型的には哺乳動物および好ましくはウサギまた
はヒツジに注射することによって達成することができる。典型的には、当初に注
射し、次いで一連の次の追加免疫注射をし、抗体応答を最大化する。最適には、
注射養生法（injection regime）は、ニュージーランドホワイトラビットに与え
られる複数投与である。注射される免疫原の量は変化され、しかし、抗体の検出
可能な量を誘発するのに十分でなければならない。抗体産生を、ＥＩＡ、ＥＬＩ
ＳＡまたは間接蛍光イムノアッセイアッセイを使用して試行採血で得られる血清
を分析することによって確認することができる。

【００３７】既知のイムノメトリックアッセイで使用されるのと同じ標識を使用し、本発明
で使用するハプテンを標識することができる。これらのうち、酵素、例えばアル
カリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラ
クトシダーゼを含むレポーター分子（ＲＭ）を述べ得る。加えて、蛍光、発光ま
たは放射活性標識、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ルミノール、アクリ
ジウムおよび放射活性同位体、^１２５Ｉ等、またはコロイド粒子、例えば金およ
びセレニウム等を使用することができる。最後に、ランタニドキレートフルオロ
フォア、例えば、ユーロピウムおよびテルビウムを使用し、時間分解性蛍光シグ
ナルを発生させることができる。最も一般的な酵素的マーカーは、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリフォスファターゼである。

【００３８】ある実施態様では、分光光度計を使用して、サンプル中のネオニコチノイドの
量を検出する。しかし、本発明の方法を、当業者は適合させ、色原性ディテクタ
ーの他の型で使用することができる。同様に、検出可能反応産物は、発色団に限
定されず、前記のような他の標識を含む。

【００３９】以下の式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＩＡ）のハプテンが、抗原性ネオニコ
チノイドコンジュゲート（免疫原）およびアッセイコンジュゲートを生成するの
に有用であると見出された。ハプテン（ＩＡ）

【化１２】

【００４０】ここで、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イ
ルであり、Ｒ^３は、水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、またはＲ^１お
よびＲ^２は、それらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンま
たはオキサジアジン環を形成し、ｎは１ないし５の整数（好ましくは３ないし５の整数）であり、そしてＸはＯ、Ｎ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮである。

【００４１】ハプテン（ＩＢ）

【化１３】ここで、Ａ、Ｒ^１、Ｒ^２およびＸは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味であり、
そしてＥは、共有単結合であり、または式−（ＣＨ_２）ｍ−の連結部分であり、ここで
ｍは１ないし３の整数である。

【００４２】実施例１：ハプテン（ＩＩＩＡ）

【化１４】ここで、Ａ、Ｒ^３、Ｘおよびｎは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味である。

【００４３】ハプテン（ＩＩＩＢ）

【化１５】ここで、Ａ、Ｒ^３、およびＸは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味であり、Ｅは
式（ＩＢ）で定義したの同じ意味である。

【００４４】式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）のハプテンを以下の方法論と類似するよう
に調製することができる：

【化１６】

【００４５】所望のハプテン（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）を以下の式の化合物から選択
される適当な２−アミノエタンチオール誘導体を使用することによって調製し：

【化１７】ここでＲは前記式（Ｉ）についてと同じ意味である。

【００４６】以下のハプテンが本発明の実施で特に有用であるとわかり：

【化１８】ここで、ｎはそれぞれの場合に、１ないし５の整数であり、好ましくは３ないし
５の整数である。

【００４７】抗原性ネオニコチノイドコンジュゲート（免疫原）およびアッセイコンジュゲ
ートを、それぞれの場合に応じて、ネオニコチノイド農薬ハプテンのキャリアー
分子またはレポーター分子へのコンジュゲーションによって作成することができ
、当業者に既知の技術を使用し得る。２つの基本的アプローチをとった。その第
１は、コンジュゲートの一部となるリンカーの使用である。これらのリンカーは
、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり、そして例えば、基質タンパク質中
のシステイン部分のチオール基を介してジスルフィド結合を形成することのでき
るもの、またはＮ−末端アミノ基またはアミノ側鎖またはリジン残基および活性
化アシル部分の間のアミド結合、例えばスクシンイミジルエステルの形成のでき
るものを含む。一般に、このアプローチは、リンカー上の高度に反応性の官能基
に関係し、そしてコンジュゲーションのための基質に関して妥当に軽便である。
しかしより反応性の小さいことがある官能基、例えば、ヒドラゾン形成の可能で
あるものを使用することがしばしば有用である。

【００４８】２種のタンパク質部分をコンジュゲートさせるの特に有用である、第２のアプ
ローチは、例えば、コンジュゲートの１のメンバーのカルボキシル部分の、他方
の遊離アミノ基との反応によって、新しいペプチド結合の形成をもたらすカルボ
ジイミドのような脱水剤を使用する。この場合に、該試薬はコンジュゲートの一
部とならない。

【００４９】カルボキシル基は活性化されないから、この反応は特に容易ではない；カルボ
ジイミドは、活性中間体を提供し、そして水のエレメントを除去することによっ
て平衡を移動させ、ペプチド結合を形成する。

【００５０】コンジュゲーションへの両方のアプローチは、一般に水性溶媒中で実行され、
なぜなら、コンジュゲートを形成しているタンパク質材料は容易に変性されるか
らである。タンパク質は、水性環境中で安定であるべく設計し、そして溶媒、例
えば、水性媒体にかなり類似であると考えられる、エタノール中でさえも変性す
ると知られる。また、タンパク質コンジュゲート構成要素は、非水性溶媒中で比
較的不溶性である傾向がある。

【００５１】以下の式のハプテンコンジュゲートは、本発明の実施に有用であると見出され
：

【化１９】ここで、Ａ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、ｎおよびＸは前記式（ＩＡ）中と同じ意味であ
り、そしてＰＲはタンパク質残基であり：（１）キャリアー分子、例えば、Dipt
heriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血
清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンまたはキーホールリンペッ
トヘモシアニンであって免疫原の場合におけるもの、または（２）レポーター分
子（ＲＭ）例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼである。

【００５２】加えて、以下の式のハプテンコンジュゲートは同様に有用であり：

【化２０】ここでＡ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、ＥおよびＸは上記式（ＩＢ）中と同じ意味である
。

【００５３】以下コンジュゲートが、本発明の実施に特に有用であると見出され：

【化２１】ここでそれぞれの場合のｎは１ないし５の整数であり、好ましくは３ないし５の
整数である。

【００５４】試験されるべきサンプル中の抗原性ネオニコチノイドまたはハプテン−ＲＭコ
ンジュゲートを結合するための本発明のプロセスで使用する非標識ポリクローナ
ル抗体を、イムノメトリックアッセイで一般に使用される任意の支持体上に固定
化することができる。これらに含まれ得るのは、濾紙、ラテックまたはポリスチ
レンビーズおよびポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の適当
なマイクロウェルプレートまたは試験管である。この支持体を、天然または合成
起源の任意のポリマー、または非晶質材料、例えばガラスから作成することがで
きる。反応ストリッピングのためにニトロセロロースまたはナイロンの膜、そし
てビーズまたはマイクロプレートのためにポリビニル、ポリプロピレン、ポリス
チレンまたは他のプラスチックを使用するのが有利である。アガロース、アクリ
ルアミドまたはラテックスに基づくゲルまたは粒子もまた使用することができる
。加えて、当業界で既知の任意のイムノクロマトグラフィー装置、試験ストリッ
ピングおよびラテラルフロー装置を本発明のプロセスに適合させることができる
。好適なラテラルフロー装置には、米国特許４３６６２４１に開示されたラテラ
ルフロー装置の型を述べることができる。抗体をそのような材料に結合させる技
術は、当業者に周知である。支持体に結合された抗体を得る好適なソースは、例
えば、Beacon Analytical Systems, Inc.(Portland, Maine)である。

【００５５】アッセイでの使用のための種子サンプルを調製するために、ネオニコチノイド
処理したロットからの種子の代表のサブサンプル（例えば、５ないし１００グラ
ムのキャノーラ種子；１０ないし２００グラムのソルガム、コムギ、ワタ、トウ
モロコシまたはスイートコーン種子）を好適な溶媒、例えばアセトン、アセトニ
トリル、エタノール、イソプロパノール、メタノール、または種々のパーセンテ
ージの水とのこれらの溶媒の混合物に分散させる。好適な溶媒―水混合物は、例
えば、１ないし５０％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏおよび１ないし２０％アセトニトリ
ル／Ｈ_２Ｏを含む。分散した種子を、撹拌して混合し、それから約２０分間超音
波バスに置き、次いでさらに撹拌する。内容物を処理に付する。既知の一部の液
体抽出物を取り、既知量の溶液、例えば、１％アセトニトリル／水に添加する。
抽出物をさらに希釈し、キャリブレーション曲線の範囲に抽出したネオニコチノ
イドの濃度をもっていく。１０００ないし６００００倍の希釈が有用であると見
出された。イムノアッセイは実行におよそ３５分かかる。分析のため抽出物の抽
出および調製はおよそ３０分かかる。したがって種子サンプルをおよそ１時間と
５分で抽出、分析することができる。ある実施態様では、２種の種子サンプル（
種子サンプルにつき５サブサンプルまで）を１度に分析することができる。

【００５６】本発明に従うイムノアッセイで、約１万ｐｐｍないし１／２ｐｐｂのネオニコ
チノイド殺虫剤の濃度を検出することができる。しかし、該方法は、サンプルま
たはサンプル抽出物中のネオニコチノイド殺虫剤の量がキャリブレーション曲線
の範囲内に入り、または入るように適当に希釈され得る限り、存在する任意の量
のネオニコチノイド殺虫剤に好適である。

【００５７】抗原の調製、ポリクローナル抗体の産生およびイムノアッセイを以下の非限定
的実施例によってより詳細に例示する。

【００５８】実施例実施例１チアメトキサムハプテンのための合成手法

【化２２】

【００５９】１．１２−メチル−１−ニトロイソ尿素Ｏ−メチルイソ尿素サルフェート（３８．５ｇ）を硝酸（１２０ｍｌ）／硫酸（２８０ｍｌ）混合物に０℃で溶解し、そして０℃
で２時間撹拌する。該混合物を破砕氷に注意深く撹拌しながら注ぎ、それから濾
過によって破砕氷を除去する。針状結晶ｄを酢酸エチルに溶解し、そして炭酸カ
リウムを添加して溶液をアルカリ性にする。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過する。濾液を濃縮し、白色粉末を得る（５ｇ）。

【００６０】１．２３ｇのメチル４−アミノブチレートヒドロクロリド（１．１ａ）および１５ｍ
ｌの水から溶液を調製する。ｐＨを、溶液をアイスバスで冷却しながら、２Ｎ
ＮａＯＨの滴状の添加によって１１に調節する。反応フラスコにｐＨ電極および
温度計を装着し、そして得られた透明塩基性溶液を急速に撹拌し、２−メチル−
１−ニトロイソ尿素（２．３８ｇ）を小量ずつ添加し、溶液の温度を２℃以下に
保持する。添加を完了して、反応物を０℃で１．５時間撹拌する；ｐＨは９．６
で安定化した。ＴＨＦ（１ｍｌ）を添加し、そしてさらに２時間撹拌する。反応
物を水で希釈し、酢酸エチルに注ぐ。有機相を分離の後、有機フラクションを硫
酸マグネシウムで乾燥し、溶液を濾過する。濾液を濃縮し、透明オイルを得る。
粗オイルを３：１のジクロロメタン／アセトニトリルで溶出させるシリカゲル上
でフラッシュクロマトグラフィーし、７５０ｍｇの所望の産物を白色固体として
得る。

【００６１】１．３１．２からの産物（１．４４ｇ）をパラホルムアルデヒド（４２２ｍｇ）、メ
タンスルホン酸（.０２３ｍｌ）、および蟻酸（１０ｍｌ）と合わせ、そして５
５℃で１５時間加熱する。反応物を減圧で濃縮する。得られた褐色のオイルをト
ルエン中に懸濁し、そして溶液を共沸的にストリッピングし乾燥させる。得られ
たオイルを１：１：１のＴＨＦ／ジオキサン／アセトニトリルに溶解し、そして
過剰のジアゾメタンで処理する。この溶液を３０分間撹拌し、反応物を酢酸と処
理する。反応混合物をオイルに濃縮する。酢酸エチル中にオイルを再構成し、薄
い重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そしてオイルに
再濃縮する。このオイルを３：１のジクロロメタン／アセトニトリルにおけるフ
ラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６５８ｍｇの所望のオキサジアジ
ンアミンブチルエステル（１．３）を透明オイルとして提供する。

【００６２】１．４１．３からの産物（１．１ｇ）ｄをアセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解し、そ
して３ｇの炭酸カリウムを添加する。クロロメチルクロロチアゾールを１度に添
加し、反応混合物を５５℃で２０時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、そ
して除去して固体を除去する。得られた褐色のろ液をオイルに濃縮する。オイル
を３：１のジクロロメタン／アセトニトリルにおけるフラッシュクロマトグラフ
ィーによって精製し、８９４ｇの所望の化合物を黄褐色オイルとして得る。

【００６３】１．５８ｍｌの濃ＨＣｌおよび１ｍｌの水中に化合物１．４（３７２ｍｇ）を溶解し
、室温で６時間撹拌する。反応混合物を水で希釈し、そして４．５のｐＨとなる
まで１ＮＮａＯＨの添加によって注意深く塩基性化する。酢酸エチルで抽出し
、そして有機フラクションを硫酸マグネシウムで乾燥する。乾燥有機フラクショ
ンをオイルに濃縮し、そして１：１のジクロロメタン／アセトニトリルのフラッ
シュクロマトグラフィーによって精製し、所望の産物１．５を得る（１００ｍｇ
）。

【化２３】

【００６４】実施例２−５チアメトキサムハプテン実施例１の合成方法論を使用して、中間体１．１ａを式ＮＨ_２（ＣＨ_２）_ｎＣ
Ｏ_２Ｒ（１．１ｂ）の適当なアナログ化合物で置換することによって、表１に示
す以下のチアメトキサムハプテンを調製し、ここでｎは１ないし５の整数であり
、ＲはＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルである。

【００６５】表１

【表１】

【００６６】実施例６−９チアメトキサムハプテン実施例１の合成方法論を使用して、中間体１．１ａを適当な下記式のアナログ
化合物（１．１ｃ）

【化２４】（ここでＥは共有単結合または連結部分−（ＣＨ_２）_ｍ−であり、ここでｍは１
ないし３の整数であり、ＲはＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルである）で置換することによって、表２に示す以下のチアメトキサムハプテンを調製する
。

【００６７】表２

【表２】

【００６８】実施例１０デス−ニトロイミノチアメトキサムハプテンの合成手法

【化２５】

【００６９】手法チアメトキサム−酪酸ハプテン（１００ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）およびア
ニソール（６．５ｍｌ）を、マグネチックスターラーバーおよび還流コンデンサ
ーを備えた１０ｍｌ丸底フラスコ中で合わせる。フラスコをオイルバスに置き、
そして２時間１６５℃で加熱する。アニソールを５０℃で５時間減圧で除去する
。得られたオイル産物（９０．２ｍｇ）はＨＰＬＣ分析によれば９３％純度であ
る。

【００７０】特性把握のための分光学的データ

【表３】

【００７１】実施例１１−１８デス−ニトロイミノチアメトキサムハプテン実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例２−９の
適当なアナログ化合物で置き換えることによって、表３に示す以下のデス−ニト
ロイミノチアメトキサムハプテンを調製する。

【００７２】表３

【表４】

【００７３】実施例１９−２７イミダクロプリドハプテン実施例１の合成方法論を使用して、１．２で得たニトログアニジル誘導体また
は実施例２−９に示したような式１．１ｂまたは１．１ｃの適当なアナログで中
間体１．１ａを置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表４
に示す以下のイミダクロプリドのハプテンを調製する。

【００７４】表４

【表５】

【００７５】実施例２８−３６デス−ニトロイミノイミダクロプリドハプテン実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例１９−２
７の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表５に示す以下のデス−ニ
トロイミノイミダクロプリドハプテンを調製する。

【００７６】表５

【表６】

【００７７】実施例３７−４５クロチアジンハプテン実施例１の合成方法論を使用して、１．２で得たニトログアニジル誘導体また
は中間体１．１ａを実施例２−９に示すような式１．１ｂまたは１．１ｃの適当
なアナログで置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表６に
示す以下のクロチアジンのハプテンを調製する。

【００７８】表６

【表７】

【００７９】実施例４６−５４デス−ニトロイミノクロチアジンハプテン実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例３７−４
５の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表７に示す以下のデス−ニ
トロイミノクロチアジンハプテンを調製する。

【００８０】表７

【表８】

【００８１】実施例５５−６３チアクロプリドハプテン式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）のハプテンに特異的な合成方法論を使用し
て、表８に示すクロチアジンの以下のハプテンを調製する。

【００８２】表８

【表９】

【００８３】実施例６４チアメトキサム免疫原の調製６４．１０．０１ＭＰＢＳ、ｐＨ７．４中の精製タンパク質誘導体（ツベルクリン、
ＰＰＤ）の溶液を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製する。０．５ｍｌアリコートのこの
溶液のｐＨを、０．１ＭＨＣｌで４．５−５．０に調節する。

【００８４】６４．２２５０μｌの０．１Ｍ２−（Ｎ−モルフォリノ）−エタンスルフォン酸、ｐ
Ｈ４．５中に、実施例１からのチアメトキサムハプテン（１ｍｇ）を溶解する。
ハプテンおよびＰＤＤ溶液を合わせる。

【００８５】６４．３１ｍｇの１−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロ
クロリド（ＥＤＣ）を１００μｌの蒸留した、脱イオン水に溶解する。ただちに
ＥＤＣ溶液を３．２のハプテン−ＰＰＤ溶液に添加する。ハプテン−ＰＰＤ−Ｅ
ＤＣ溶液をローテーションによって室温で２時間混合する。反応混合物を１００
０−２０００ダルトン分子量カットオフを有する透析バッグに移す。４８時間、
３回交換／日で２リットルの４℃のＰＢＳに対して徹底的に透析する。

【００８６】実施例６５イミダクロプリド免疫原の調製実施例６４の方法論を使用して、実施例２１のハプテンを使用してイミダクロ
プリド免疫原を調製する。

【００８７】実施例６６クロチアジン免疫原の調製実施例６４の方法論を使用して、実施例３９のハプテンを使用してクロチアジ
ン免疫原を調製する。

【００８８】実施例６７チアクロプリド免疫原の調製実施例６４の方法論を使用して、実施例５７のハプテンを使用してクロチアジ
ン免疫原を調製する。

【００８９】実施例６８免疫化スケジュールおよび抗体の収集最初の免疫化のために、実施例６４の免疫原をフロイントの完全アジュバント
に溶解する。メスのニュージーランドホワイトラビットに、およそ２５μｇの免
疫原をそれぞれの部位に注射により接種する。同様にヒツジを免疫化し、ただし
およそ３８μｇの免疫原をそれぞれ部位に注射する。次の免疫化で、免疫原をフロイントの不完全アジュバントに溶解する。動物を
免疫化の間に４週間休ませ、免疫化の１０日後に集血する。追加免疫注射を投与
し、そして９月にわたり動物を集血し、それぞれの点で全採血する。ポリクローナル抗体を当業者に既知の技術を使用して収集する。

【００９０】実施例６９ハプテン−酵素コンジュゲートの調製実施例１からのチアメトキサムハプテン（３．１ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＨＳ）（４．０ｇ）、およびＥＤＣ（４．６ｇ）を小さいバイア
ルにおいて合わせる。これらの材料を穏やかな流れの窒素下で１５分間室温で乾
燥する。

【００９１】６９．２乾燥ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）を添加し、混合物を１分間超音波処
理する。得られた溶液を終夜室温でインキュベーションする。

【００９２】６９．３ホースラディッシュペルオキシダーゼ（８．５ｍｇ）を小さいバイアルにおい
て、カルボネートバッファー（２．９ｍＬ、０．０５ＭｐＨ９．６）中に溶解
する。バイアルをアイスバスに置く。

【００９３】６９．４６．２からの全部で１００μｌのハプテン−ＮＨＳ−ＥＤＣ溶液を、ゆっくり
と１時間かけて添加し、そして混合物を撹拌しながら２時間インキュベーション
する。反応混合物を、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）で平衡させたセファデック
スＧ−２５Ｍカラムを通過させる。酵素コンジュゲートを最初３．０ｍＬの溶出
液中において収集し、等体積のグリセロールを添加し、−２０℃で貯蔵する。

【００９４】実施例７０チアメトキサムで処理したキャノーラ種子のイムノアッセイ種子抽出物の一部を、予測された濃度のチアメトキサムがキャリブレーション
曲線の範囲内、すなわち０．５ないし１２０ｐｐｂとなるように１％ＭｅＯＨ
／Ｈ_２Ｏに希釈する。抗体でコートした管をラベルし、そして管ラックにおき、
その結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを
混ぜる。管ラックはそれぞれの管をつかんでおり、その結果ラックは管を失うこ
となくひっくり返し得る。アリコートの標準またはサンプル（０．５ｍＬ）をす
べての対応する管に添加する。酵素コンジュゲート溶液（０．５ｍＬ）をすべて
の管に添加する。ラックはおだやかに振とうし、すべての管の内容物を混合する
。管を室温で２０分間インキュベーションする。ラックをひっくり返しすべての
管の内容物をデカンテーションさせる。蒸留Ｈ_２Ｏをすべての管に添加し、反転
的洗浄ビン（flip-top wash bottle）を使用してオバーフローさせ、そして洗浄
液をデカンテーションする。管をさらに３回洗浄する。最後の洗浄の後、ラック
をひっくり返し、そして管を穏やかに清潔なペーパータオルでたたいて過剰の洗
浄液を除去する。

【００９５】酵素基質（０．５ｍＬ）をすべての管に添加し、これを室温で１０分間インキ
ュベーションする。ラックをこのインキュベーション中穏やかに２．５分ごとに
振とうする。酸性の停止溶液（１ＭＨＣｌ、０．５ｍＬ）をすべての管に添加
し、シグナル発生を終結させる。表１０に示されるように、この反応産物の吸光
度を４５０ｎｍで測定する。標準の吸光度を使用してキャリブレーション曲線、
Ｙ＝ｍＬｎ（Ｘ）＋Ｂの式の回帰関数を構成する。それぞれのサンプルの吸光度
を該関数に代入し、そして希釈したサンプル中のネオニコチノイド農薬の濃度を
決定する。得られた濃度に希釈ファクターを乗じてもとのサンプル中のネオニコ
チノイド農薬の量を算出する。

【００９６】表１０チアメトキサムイムノアッセイのための典型的標準曲線

【表１０】 ^１単位はｐｐｂ

【００９７】チアメトキサム標準の応答を記述する関数を回帰分析によって作成する。この
データセットは、Ｙ＝−.１９１Ｌｎ（Ｘ）＋１．２３、ｒ＝−.９９９の標準
曲線をもたらし、ここにＹ＝分析応答であり、Ｘ＝チアメトキサム標準の濃度で
ある。

【００９８】実施例７１チアメトキサムで処理した作物種子の交差反応性試験７１．１種子の抽出処理した種子のサンプルを、５０ｇのワタ、トウモロコシ、ソルガム、スイー
トコーンおよびコムギまたは４０ｇのキャノーラを、６オンス広口ビンに無作為
に加えることによってサブサンプル化する。キャノーラを４回サブサンプル化し
、他の種子種類は５サブサンプルを使用する。溶媒（１５０ｍｌ）を添加し、硬
くフタをしシールする。ワタ種子は５％アセトニトリル／水で抽出し、一方、他
の種子では２０％メタノール／水の溶媒系を使用する。ビンを手で３０秒間強く
振とうし、室温で２０分間ウォーターバスに超音波処理しながら置く。サンプル
を前記の様に２回およそ５分間振とうする。各ビンの内容物をおよそ５分間据え
、アリコート（０．１０ｍｌ）を分析のために取る。アリコートを１％メタノー
ル／水に希釈し、標準曲線の範囲に止まるようにする。

【００９９】７１．２イムノアッセイ分析抗体コートしたポリスチレン培養管をラベルし、そして管ラックに置き、その
結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを混合
する。サンプルおよび標準溶液（０．５０ｍｌ）を対応する管に添加する。同じ
くらいの体積の酵素コンジュゲート溶液を添加する。ラックを穏やかに振とうし
、溶液およびセットを混合し、室温で２０分間インキュベーションする。すべて
の管の内容物を、ラックをステンレススチールパンの上でひっくり返すことによ
って除去する。各管を蒸留水でオーバーフローしながら洗浄する。ラックを流し
の上でひっくり返し洗浄水を捨てる。洗浄を４回反復する。次いでラックをひっ
くり返し、そしてペーパータオルで軽くたたき、残りの洗浄液のほとんどを除去
する。（管に残っているいくらかの液体はアッセイの結果に影響を及ぼさない。
）酵素基質溶液（０．５０ｍｌ）を管に添加し、これを室温で１０分間インキュ
ベーションする。ラックを穏やかに２．５分間隔で振とうし、酵素へ基質の十分
な供給を維持することを確保する。青色呈色シグナルの発生を酸性停止溶液（０
．５０ｍｌ）の添加によって終結させる。各管の溶液の吸光度を分光光度計的に
４５０ｎｍで測定する。

【０１００】サンプル中のアナライトの濃度を、ｙ＝ｍｌｎ（ｘ）＋ｂの式の回帰関数か
ら決定する。

【０１０１】７１．３交差反応性決定イムノアッセイの交差反応性、または特異性を評価し、種子コーティングに見
出される他の試験物質がチアメトキサムの測定を妨害するかどうか決定する。試
験物質を１％メタノール／水中に１０００ないし０．０１ｎｇ／ｍｌの範囲の濃
度に溶解する。それぞれの濃度のアリコートを前記の様に分析する。この範囲の
それぞれの試験物質の反応性を、Brady, J. F; Turner, J.; Skinner, D. H.''A
pplication of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incur
red residues in soil and water sample''. J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2
542-2547に以前記載されたように決定する。

【０１０２】７１．４結果分析した試験物質のなかで、チアメトキサムのみがイムノアッセイに有意に反
応性であると見出される（以下の表９）。したがってこのイムノアッセイはチア
メトキサムに特異的である。種子の処理したロットのサブサンプルをイムノアッセイおよびＨＰＬＣによっ
て分析した。これらの分析結果を表１１に示す。表１１は、チアメトキサムにつ
いて、４０種子サンプルの、ポリクローナル抗体を使用する平均値のイムノアッ
セイ結果およびＨＰＬＣ分析の相関を記載する。最良の適合回帰線は、類似の結
果がそれぞれの方法によって得られたことを指摘している。

【０１０３】表９チアメトキサムのイムノアッセイの交差反応性試験物質 ^１チアメトキサムに対するパーセント反応性チアメトキサム１００クロチアジン＜１．０イミダクロプリド ^２ＮＲクロルピリフォスＮＲジフェノコナゾールＮＲフルジオキソニルＮＲペンタクロロニトロベンゼンＮＲメタラキシルＮＲメフェノキサム（Ｒ−メタラキシル）ＮＲフルクソフェニウムＮＲカルボキシンＮＲキャプタンＮＲシスタン（ミクロブタニル）ＮＲＴＣＭＴＢＮＲプリミフォス−メチルＮＲチオファネート−メチルＮＲ ^１パーセンテージとして表されるチアメトキサムの反応性に対する試験物質の反
応性^２ＮＲ、非反応性

【０１０４】多くの別形態および修飾形態が、広く記載の本発明の精神または範囲から離れ
ることなく、前記の本発明について作成され得ることが、当業者によって認識さ
れる。

【０１０５】

【表１１】

【０１０６】

【表１２】

【０１０７】

【表１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/76 Ｃ０７Ｋ 14/76 Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 9/08 9/16 9/16 Ｂ 9/38 9/38 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｚ 33/15 33/15 Ｃ 33/53 33/53 Ｓ 33/543 ５４５ 33/543 ５４５Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ダナ・フィリップ・シモンズアメリカ合衆国27358ノースカロライナ州サマーフィールド、イーグル・ネスト・ドライブ6507番 (72)発明者ティモシー・エドワード・ウィルソンアメリカ合衆国27358ノースカロライナ州サマーフィールド、チャッカー・コート 6010番Ｆターム(参考） 2G054 AA10 AB10 CA30 CE01 EA04 GB01 4B050 CC07 DD01 DD07 LL03 4C033 AD06 4C063 AA01 BB03 CC23 CC62 DD12 DD59 EE03 4H045 AA11 CA50 DA70 EA50 【要約の続き】ト血清アルブミン、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択される担体分子のタンパク質残基；またはアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ− ガラクトシダーゼからなる群より選択される酵素残基である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ネオニコチノイド殺虫剤の量を決定するための、サンプルの
イムノアッセイで有用な抗体であって、当該抗体が、（Ｉ）免疫原性キャリアー
タンパク質にコンジュゲートされたネオニコチノイドハプテンで動物を免疫化す
ることによって産生されたポリクローナル抗体であり、そして（ＩＩ）ネオニコ
チノイド殺虫剤に特異的に結合する、抗体。
【請求項２】当該抗体が式【化１】 [式中、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イ
ルであり、ＲおよびＲ^３は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、またはＲ^１お
よびＲ^２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、そしてＸはＮ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮである] の化合物に選択性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】当該抗体が、イミダクロプリド、ニテンピラム、アセタミプ
リド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンからなる群より選択
される化合物に対して選択性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】下記式の化合物；【化２】 [式中、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イ
ルであり、Ｒ^３は水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、またはＲ^１お
よびＲ^２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、ｎは１ないし４の整数であり、そしてＸはＮ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮである]。
【請求項５】下記式の請求項４に記載の化合物。【化３】
【請求項６】下記式の請求項５に記載の化合物。【化４】
【請求項７】下記式の請求項４に記載の化合物。【化５】
【請求項８】下記式の請求項７に記載の化合物。【化６】
【請求項９】下記式のタンパク質コンジュゲート；【化７】 [式中、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イ
ルであり、Ｒ^３は水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^１およびＲ^２は独立的に水素またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、またはＲ^１お
よびＲ^２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたは
オキサジアジン環を形成し、ｎは１ないし４の整数であり、ＸはＮ−ＮＯ_２またはＮ−ＣＮであり、そしてＰＲはDiptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン
）、ウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン
、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択
されるキャリアー分子のタンパク質残基であり；またはアルカリフォスファター
ゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼからな
る群より選択される酵素残基である]
【請求項１０】下記式の請求項９に記載のタンパク質コンジュゲート。【化８】
【請求項１１】下記式の請求項９に記載のタンパク質コンジュゲート。【化９】
【請求項１２】サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の濃度を決定する方
法であって、（ａ）当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相
を提供するステップ、（ｂ）当該サンプルを、既知の量のネオニコチノイド殺虫剤ハプテン−酵素コン
ジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュ
ゲートおよびサンプルを除去するステップ、（ｄ）当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステ
ップ（ｃ）の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合した
ハプテン−酵素コンジュゲートの量、およびそれゆえに当該サンプル中のネオニ
コチノイド殺虫剤の量を決定するステップ、の各ステップを含む、方法。
【請求項１３】当該サンプルが、好適な溶媒中で植物繁殖材料を抽出する
ことによって得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】当該植物繁殖材料が種子である、請求項１３に記載の方法
。
【請求項１５】当該種子が、キャノーラ、ソルガム、コムギ、ワタ、トウ
モロコシまたはスイートコーンからなる群より選択される、請求項１４に記載の
方法。
【請求項１６】当該抗体が、免疫原性キャリーアータンパク質にコンジュ
ゲートされたネオニコチノイド殺虫剤で動物を免疫化することによって産生され
るポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】当該免疫原性キャリアータンパク質が、Diptheriaウイル
スからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン
、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンおよび
キーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択されるキャリアー分子で
ある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】ネオニコチノイド殺虫剤の量を決定するための、サンプル
のイムノアッセイに有用であるキットであって、１または２以上の容器中に、（ａ）当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相
、（ｂ）ネオニコチノイドハプテンにコンジュゲートされた酵素を含む酵素コンジ
ュゲート、を組み合わせて含む、キット。
【請求項１９】当該抗体が、免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲ
ートされたネオニコチノイドで動物を免疫化することによって産生されるポリク
ローナル抗体である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】該酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】該抗体が、イミダクロプリド、ニテンピラム、アセタミプ
リド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンからなる群より選択
されるネオニコチノイド殺虫剤に特異的に結合する、請求項１８に記載のキット
。