JPH10262663A - オキソリン酸に結合する新規な抗体及びそれを使用するオキソリン酸の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 魚介類などの生体試料（血液、各組織など）
中の微量のオキソリン酸を簡便に、再現よく高感度で測
定できる方法を提供すること。 【解決手段】 オキソリン酸を免疫抗原として用いて生
産したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
ならびに該抗体を使用することを特徴とする魚介類など
の生体試料中のオキソリン酸の測定方法。オキソリン酸
に結合する新規なモノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体を用いた酵素免疫測定法により測定することを特
徴とする魚介類などの生体試料中のオキソリン酸の測定
方法。オキソリン酸を化学的に測定機器に固定化し、オ
キソリン酸に結合する新規なモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体を用いて表面プラズモン共鳴法により
測定することを特徴とする魚介類などの生体試料中のオ
キソリン酸の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オキソリン酸（以下、
「ＯＸＡ」とも記す。）に結合することを特徴とする新
規な抗体及び該抗体を使用するオキソリン酸の測定方法
に関する。

【０００２】

【従来技術】生体試料中に含まれているＯＸＡを測定す
る方法としては、これらを生体試料中から抽出、精製
し、液体クロマトグラフィーなどによって測定する方法
があるが、従来の方法は、抽出、精製などの前処理が複
雑で、ポンプ、検出器など精密機器の使用、不純物の影
響など問題があり、いまだ実用し得る方法はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、魚介類など
の生体試料（血液、各組織など）中の微量のオキソリン
酸を簡便に、再現よく高感度で測定できる方法を提供す
ることを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、オキソリン酸
を免疫抗原として用いて生産したモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体、ならびに該抗体を使用するこ
とを特徴とする魚介類などの生体試料中のオキソリン酸
の測定方法を要旨としている。また、本発明はオキソリ
ン酸に結合する新規なモノクローナル抗体及びポリクロ
ーナル抗体を用いた酵素免疫測定法により測定すること
を特徴とする魚介類などの生体試料中のオキソリン酸の
測定方法を要旨としている。さらにまた、本発明はオキ
ソリン酸を化学的に測定機器に固定化し、オキソリン酸
に結合する新規なモノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体を用いて表面プラズモン共鳴法により測定するこ
とを特徴とする魚介類などの生体試料中のオキソリン酸
の測定方法を要旨としている。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明の測定の対象とするオキソ
リン酸は、畜魚肉に残留が問題となり注目されている物
質の１つである。家畜の飼育や魚の養殖には様々な動物
用医薬品が用いられている。生産向上のための感染症の
予防や治療がその主な目的である。薬剤としては抗生物
質、サルファ剤等の抗菌性物質が多い。現在ではこれら
薬物の使用は畜水産経営にとって不可欠なものとなって
いる。オキソリン酸はこれらの薬剤の中の代表的な１つ
であり、様々な魚の養殖に用いられている。特に近年、
その残留が問題となり注目されている物質の１つであ
る。

【０００６】本発明によればＯＸＡに特異的に結合する
抗体及び該抗体を用いたＯＸＡの簡便かつ高感度な免疫
測定法が提供される。本発明のＯＸＡに結合するモノク
ローナル抗体及びポリクローナル抗体は、以下に示すよ
うに既に確立されている方法により得ることができる。

【０００７】ＯＸＡをアミノ酪酸などの炭素数４〜８個
のスペーサーを介して卵白アルブミンなどの高分子担体
に結合させハプテン抗原を作製し、その１０〜１００μ
ｇを完全フロイントアジュバントなどとの懸濁液として
マウスあるいはラットなどに腹腔内投与する。不完全フ
ロイントアジュバントを用いて２〜４週間毎に１〜数回
追加免疫を行った後、最終免疫としてハプテン抗原の生
理食塩水溶液を腹腔内投与する。最終免疫の３〜４日後
に脾臓を摘出し、その脾臓細胞とミエローマ細胞を融合
させ、ハイブリドーマを得る。ミエローマ細胞としてマ
ウスではｓｐ−２、ＮＳ−１、Ｐ３−Ｕ１ラットではＹ
３．Ａｇ１．２．３などが使用される。ハイブリドーマ
は、前期の細胞融合処理後の細胞を通常のハイブリドー
マ選択培地（ＨＡＴ培地：ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することによって
得られる。

【０００８】すなわち、脾臓細胞はＨＡＴ培地中では増
殖不可能であり、ミエローマ細胞はヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ）欠損株であるためアミノプテリンを含むＨＡＴ培地
中では生育できない。従って、脾臓細胞から遺伝子を導
入され、ＨＡＴ培地中で生育できた細胞がハイブリドー
マである。目的の抗体を産生するハイブリドーマを酵素
免疫測定法（ＥＩＡ、後述）により選択後、限界希釈法
により単一クローン化を行い、増殖及び抗体の産生能に
おいて安定した株を確立する。

【０００９】一方、ポリクローナル抗体をとるためには
通常大量に血中抗体を採取できる大型動物、例えばウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどが用いられる。ハプ
テン抗原数ｍｇを完全フロイントアジュバントなどとの
懸濁液としてウサギなどに腹腔内投与する。不完全フロ
イントアジュバントを用いて１日おきに数回追加免疫を
行った後、最終免疫としてハプテン抗原の生理食塩水溶
液を腹腔内投与する。最終免疫の１週間後に採血を行
う。

【００１０】このようにして得られた本発明のモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマは、通常の培地で継代で
き、液体窒素中で容易に長期間の保存が可能である。な
お、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（抗血
清）の精製は硫酸アンモニウムなどの塩析、ＤＥＡＥセ
ルロースなどを用いるカラムクロマトグラフィー、ゲル
濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一般的
な蛋白質の単離、精製法を用いて行われる。

【００１１】このようにして得られた本発明のＯＸＡに
結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は
ＯＸＡに強い結合を有するものであり、本抗体を用いた
酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射線免疫測定法、
表面プラズモン共鳴測定法を行うことにより微量のＯＸ
Ａを特異的にかつ正確に測定することが可能となる。

【００１２】本発明のＯＸＡに結合する抗体を用いたＯ
ＸＡの測定には、例えば石川英治他著「酵素免疫測定
法」第２版、医学書院、１９８２年発行等に記載されて
いる公知の方法を用いることができる。ここではＥＩＡ
に基づく競合法及び表面プラズモン共鳴法に基づく競合
法について簡単に説明する。なお、放射線免疫測定法、
蛍光線免疫測定法に基づく競合法においても、ＥＩＡと
表面プラズモン共鳴法と同様な原理によるものである。

【００１３】競合ＥＩＡ法では、特異抗体を固定化抗原
との反応に先立ち遊離抗原（標準または検体）と反応さ
せることにより、もしくは特異抗体と固相化抗原との反
応時に遊離抗原を共存させることにより、特異抗体と固
相化抗原との反応が遊離抗原の用量依存的に阻害され
る。ここで、固相化抗原に結合した特異抗体を測定する
必要があるが、その方法としては、酵素標識した特異抗
体を用いて酵素活性として測定する方法と、酵素標識し
た二次抗体を用いて酵素活性として測定する方法があ
る。このいずれの場合においても酵素活性は、固相化抗
原に結合している抗体量を反映している。検体中の抗原
量は、既知濃度の標準遊離抗原を用いて作成した検量線
から算出することができる。

【００１４】抗体を標識する酵素としては、ペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼなどがあり、これらの酵
素を石川英治他著「酵素免疫測定法」第２版、医学書
院、１９８２年発行等に記載されている方法で抗体に標
識することができる。特異抗体を標識せず標識二次抗体
を用いる場合は、アルカリフォスファターゼ標識の抗ラ
ット免疫グロブリンＧなどの市販されている二次抗体を
用いることができる。また、感度を上げるためにＡｖｉ
ｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ
ｏｍｐｌｅｘ（ＡＢＣ）法、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ａ
ｎｔｉ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＡＰ）法なども使用
される。一方、固相の支持体としては、シリコン、ナイ
ロン、プラスチック、ビーズ、マイクロプレートもしく
は試験管などが使用される。本発明のＯＸＡに結合する
抗体は、組織、血液などからのＯＸＡの分離、精製にも
使用することができる。

【００１５】表面プラズモン共鳴を利用した免疫センサ
の概要を以下に示す。金薄膜をガラス表面にコーティン
グしておくと、全反射させるように入射した光のうちあ
る角度で入射したものは吸収されてしまうため、それに
対応する反射光の強度が減少するという現象が起こる。
これは光がガラスとの界面で全反射するとき、その界面
にエバネッセント波といわれる波が生ずるが、金属薄膜
上の表面プラズモン波との波数が一致すると共鳴が起こ
り、光のエネルギーの一部が表面プラズモン波を励起す
るために使用され、反射光として戻る分が減るのであ
る。この共鳴現象は金属薄膜のごく近く（実際には１μ
ｍ以内）の状態を反映する。金属表面に抗体あるいは抗
原を固定化しておくことにより、試料溶液中の抗原ある
いは抗体の金属表面への結合を、無標識で測定すること
ができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１７】実施例１ 《抗原の調製》ＯＸＡは低分子物質であるため、免疫に
先立ちＯＸＡのハプテン化を行った。低分子・ハプテン
間に炭素数４〜８からなるフレキシブルな炭素鎖が存在
すると抗原として認識されやすいという例がある。そこ
でＯＸＡ中のカルボキシル基を用いて４−アミノ酪酸、
６−アミノヘキサン酸を介してあるいは直接的に鶏卵白
アルブミン（ＯＶＡ）、キトサンに結合させ６種類の抗
原を得た。実際にはこれらの中で４−アミノ酪酸を介し
たＯＸＡ−ＯＶＡが最も抗原性が高かったため、以降の
試験にはこれを用いた。４−アミノ酪酸を介したＯＸＡ
−ＯＶＡ製法を以下に示す。キトサンあるいは６−アミ
ノヘキサン酸を介した抗原もこれに準じて調製した。直
接ＯＸＡとＯＶＡあるいはキトサンを結合させる方法に
ついてはオキソリン酸・血清アルブミンコンジュケート
の調製に準じて行った。

【００１８】《スペーサーを介した抗原の調製法》次の
２段階の反応に分けて、免疫抗原（ＯＸＡ−ＯＶＡ）を
調製した。 （反応１）メタノール２０ｍｌをアルゴン下に−１０℃
に冷却し、攪拌しながら塩化チオニル２．６ｍｌを滴下
した。滴下終了後、−１０℃で更に１０分間攪拌した。
この溶液に４−アミノ酪酸１．０７ｇを加え、室温で終
夜攪拌した。この溶液を濃縮し、メタノール２０ｍｌを
加えて再び減圧下で濃縮した。この操作を３回行った
後、残さをヘキサンに溶かし、生じた沈殿を濾集し、ヘ
キサンで洗浄した。この沈殿をクロロホルムから再結晶
し、メチル−４−アミノブチレートハイドロクロライド
１．２５ｇを得た。メチル−４−アミノブチレートハイ
ドロクロライド４９９．７ｍｇにトリエチルアミン５６
０μｌを加え、乾燥テトラヒドロフラン５ｍｌに懸濁し
た。オキソリン酸２１５．４ｍｇにＮ−メチルモルホリ
ン２０μｌを加え、乾燥テトラヒドロフラン５ｍｌに懸
濁した。これをアルゴン下０℃に冷却し、イソブチルク
ロロカーボネート２１０μｌを加えて５分間攪拌した。
この溶液に先に調製したメチル−４−アミノブチレート
ハイドロクロライド／テトラヒドロフラン溶液を加え、
０℃〜室温にて２時間攪拌した。この溶液を濃縮し、塩
化メチレン／飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分配した。
有機相を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し
た。残さを塩化メチレンに溶解し、０．５Ｎ ＮａＯＨ
／ＭｅＯＨ ａｑ．（５：１）に溶解し、室温で終夜攪
拌した。有機相を水、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナト
リウムで乾燥、濃縮した。得られた固体を０．１Ｎ Ｎ
ａＯＨ水溶液に溶解し、塩酸を滴下した。生じた沈殿を
濾取、減圧下に乾燥して化合物Ａを１４２．６ｍｇ得
た。

【００１９】（反応２）化合物Ａ１００ｍｇをジメチル
スルホキサイド４ｍｌに溶かし、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド３３ｍｇ、水溶性カルボジイミド５５ｍｇを加
えた。ＯＶＡ ２６ｍｇを純水１．５ｍｌに溶かし、ジ
メチルスルホキサイド３ｍｌを加えた。この溶液に超音
波を照射し、先に調製した化合物Ａ／ジメチルスルホキ
サイド溶液を加えて室温にて終夜攪拌した。反応混合物
を遠心分離し、沈殿をジメチルスルホキサイドで２回洗
浄した。残った沈殿を純水に分散し、水溶性画分と不溶
性画分とに分割した。水溶性画分には未反応のＯＶＡが
含まれていた。不溶性画分を凍結乾燥し、ＯＸＡ−ＯＶ
Ａを得た。

【００２０】《オキソリン酸・血清アルブミンコンジュ
ケート（ＯＸＡ／ＢＳＡ）の調製》抗体の評価系である
ＥＬＩＳＡ法では、オキソリン酸をプレートに固相化す
る必要がある。この系では蛋白質をキャリアーとして固
相化する方が容易であるため、ＯＸＡ／ＢＳＡの調製を
行った。オキソリン酸６５ｍｇをジオキサン１．２ｍｌ
に懸濁し、Ｎ−メチルモルホリン２８μｌを加えた。こ
の溶液にイソブチルクロロカーボネート３４μｌを加え
て攪拌、室温１５分間放置した。牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）３２ｍｇを０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液
１．６ｍｌに溶かし、５分間、超音波にかけた。このＢ
ＳＡ溶液に先に調製した活性化オキソリン酸４００μｌ
を混合し、更に３分間超音波を照射した。室温に５分間
放置し、得られた溶液を透析、ゲル濾過した。ＢＳＡへ
のオキソリン酸導入比率は蛍光を測定して判定した。そ
の結果、ＢＳＡ１分子当たり１１分子のオキソリン酸が
導入されていた。

【００２１】《ポリクローナル抗体の調製》先に調製し
た各種抗原１０ｍｇを完全フロイントアジュバントとと
もにウサギの数カ所に皮下投与した。１週間おきに３
回、同様の注射を行った。ウサギを固定器に固定し採血
を行った。テスト用の採血は０．５ｍｌで行い、抗体価
を下記の抗体価の評価系によりチェックした。その後、
大量採血を１日おきに１回、１００ｍｌ、３回採血し
た。採血した血液は試験管、あるいはビーカーなどに入
れ室温に数時間置き凝血させた。凝血塊を試験管壁から
スパテール、ガラス棒などを用いてはがし、更に数時間
放置した。十分凝血塊が収縮したらこれをていねいに取
り出し、血清を遠沈し、血清を集めた。

【００２２】《抗体産生能確認》追加免疫１週間後のウ
サギ血中抗体をＥＬＩＳＡ法で確認した。マイクロタイ
タープレートに０．１μｇ／ｍｌの抗原（牛血清アルブ
ミン結合ＯＸＡ）を５０μｌずつ投入し、４℃で１晩放
置した。抗原を除いて１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
／ＰＢＳを３００μｌずつ投入、３７℃で１時間放置し
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを３００μｌず
つ投入し洗浄後、血中抗体（抗血清）を希釈液（１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ）で２０００〜３００００倍に段階希釈
し、５０μｌずつ投入、３７℃で２時間放置した。０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、３００μｌで３回洗浄
した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体溶
液と１時間反応させた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液による
洗浄後、発色基質を加え、１０分間反応後、４０５ｎｍ
の吸光度を測定した。その結果、ＯＸＡ−ＯＶＡ（４−
アミノ酪酸使用）について十分な抗体価が得られたた
め、以下の試験にはこれを用いた。この結果を図１に示
した。

【００２３】《抗原免疫（モノクローナル抗体の調
製）》ポリクローナル抗体の調製の際、ＯＸＡ−ＯＶＡ
（４−アミノ酪酸使用）が最も抗原性が高かったため、
以降の試験にはこれを抗原として用いた。ＯＸＡ−ＯＶ
Ａ ０．１ｍｇを完全フロイントアジュバントとともに
ＢＡＬＢ／ｃ（４週令・雄）マウスの数カ所に皮下投与
した。２週間後、同抗原０．１ｍｇを完全フロイントア
ジュバントとともに免疫マウスに皮下投与した。更に２
週間後、同抗原０．１ｍｇを不完全フロイントアジュバ
ントとともに免疫マウスに皮下投与した。最終免疫後４
日目に免疫マウスを屠殺し、免疫マウスより脾臓を採取
した。

【００２４】《抗体産生能確認》追加免疫１週間後のマ
ウス血中抗体をウサギ抗血清の場合と同様にＥＬＩＳＡ
法で確認した。その結果、ＥＬＩＳＡ法で抗ＯＸＡ抗体
ができていることを確認した。また、１μｇ／ｍｌの抗
体溶液に各濃度のオキソリン酸を添加して、同様に阻害
試験を行った。その結果より、遊離のＯＸＡによりプレ
ート固定化ＯＸＡと競合することを確認した。

【００２５】《細胞融合》常法に従い単一細胞懸濁液
（５×１０７ｃｅｌｌｓ）を調整し、最終濃度４５％ポ
リエチレングリコール４０００を用い、ミエローマ細胞
ＮＳ−１（１×１０７ｃｅｌｌｓ）と細胞融合を行っ
た。増殖培地（１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥ／Ｆ−１２）に
脾臓細胞数にして１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよ
うに懸濁し、フィーダー細胞を加えて、培養プレートに
１ｗｅｌｌあたり１００μｌずつ分注した。翌日、培地
をＨＡＴ選択培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）に変更後、
週２回、ＨＡＴセレクションを行い、抗体産生能の高い
融合細胞６株（２Ａ７、５Ａ２、５Ｄ６、５Ｇ１２、８
Ｄ１、８Ｆ６）を樹立化した。

【００２６】《モノクローナル抗体の評価》上記ハイブ
リドーマを大量培養し、最終的に８×１０５ｃｅｌｌｓ
／ｍｌのハイブリドーマを１５ｍｌで３日間培養した。
培養液中のモノクローナル抗体はＭａｂ Ｔｒａｐ Ｇ
（ファルマシア社）で精製し、ＰＤ−１０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）で脱塩した。抗体のアイソタイプ
はＭｏｕｓｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）
で同定した。６クローンの産生するモノクローナル抗体
のアイソタイプはＩｇＧ１（５Ａ２）、ＩｇＧ２ａ（２
Ａ７、５Ｇ１２）、ＩｇＧ２ｂ（５Ｄ６、８Ｄ１、８Ｆ
６）であった。ＯＸＡとの競合ＥＬＩＳＡ法での５０％
阻害濃度は１０−５〜１０−６Ｍであった。

【００２７】実施例２ 固相をＯＸＡ−ＢＳＡとしたＯＸＡの競合法による測定 《ＯＸＡの競合法による測定》ＥＬＩＳＡ法を用いて、
前述の精製抗体の評価を行った。オキソリン酸・牛胎児
血清アルブミンコンジュケート（以下ＯＸＡ／ＢＳＡ）
を、９６穴マイクロプレートに室温、２時間物理吸着さ
せた。バッファー洗浄後、ＢＳＡを用いてブロッキング
を行った。１μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗体溶
液に各濃度のオキソリン酸をプレートに添加して１時間
反応、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、アルカリフォ
スファターゼ標識抗免疫グロブリンＧ抗体溶液と１時間
反応させた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液による洗浄後、発
色基質を加え、１０分間反応後、４０５ｎｍの吸光度を
測定した。また、オキソリン酸に対する特異性を確認す
るため、オキソリン酸と化学構造の類似のナリジクス酸
についても阻害試験を行った。この結果を図２に示し
た。この測定系ではおよそ３０〜１００００ｐｐｂの濃
度でオキソリン酸は定量的測定が可能であった。ナリジ
クス酸については、１００００ｐｐｂでようやく阻害を
示し始める程度の反応であった。つまり、今回、得られ
たポリクローナル抗体はオキソリン酸についての特異性
が高い抗体であることがわかった。

【００２８】実施例３ 表面プラズモン共鳴法による競合法 《装置》ＳＰＲ−２０〔電気化学計器（株）〕、シリン
ジポンプ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（ハー
バード社製）を用いた。

【００２９】《センサチップのカルボキシメチルデキス
トラン（ＣＭＤ）のコーティング》センサチップの金薄
膜を５ｍＭ １６−メルカプトヘキサデカン−１−オー
ル／８０％ ＥｔＯＨ溶液に一晩浸けた。水洗後、クロ
ロ−メチルオキシラン／０．４Ｎ ＮａＯＨ／ジエチレ
ングリコールジメチルエーテル溶液で４時間処理した。
水洗後、デキストラン／０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液で２０
時間処理した。再び水洗後、ブロモ酢酸／１Ｎ ＮａＯ
Ｈ溶液で１８時間処理後、水洗、風乾した。

【００３０】《抗原（オキソリン酸）の固定化》抗原で
あるオキソリン酸をセンサーチップ上に固定化した。ま
ず、ＮＨＳ／ＥＤＣ〔N−ヒドロキシサクシンイミド／
Ｎ，Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジエチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド〕の固定化法を用いてＢＳＡを固定
化した。オキソリン酸１９５０ｍｇをジオキサン３６ｍ
ｌに懸濁し、Ｎ−メチルモルホリン８４０μｌを加え
た。この溶液にイソブチルクロロカーボネート１０２０
μｌを加えて攪拌、室温１５分間放置した。こうして調
製した活性化オキソリン酸とセンサチップ上のＢＳＡの
遊離のアミノ基と結合させた。

【００３１】《オキソリン酸の測定》流速２０μｌ／
分、移動相ｐＨ７．４ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３．４ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐ−２
０）を用いた。２０μｇ／ｍｌ抗体溶液を１００μｌイ
ンジェクションした。また、過剰の阻害を目的として、
オキソリン酸１ｐｐｍを加えた試験を行った。この結果
を図３に示した。オキソリン酸１ｐｐｍを加えることに
より、シグナル値は１／３程度に減少した。これらのこ
とにより、この系ではセンサチップ上のオキソリン酸、
抗体、溶液中のオキソリン酸の間で競合反応を行われて
いることが示された。次に、この方法により検量線を作
製したところ０．００３〜１ｐｐｍの範囲で、濃度依存
的にシグナルは減少していた。このときの検出限界はお
よそ０．０１ｐｐｍであった。

【００３２】《魚肉への添加回収試験》下記の方法で魚
肉への添加試験を行った。また、今回のＳＰＲセンサに
関しては、原理的にＨＰＬＣ法と比べて、簡便な前処理
で測定が可能となることが予想される。オキソリン酸
０．０ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ添加ギンザ
ケ筋肉５ｇをアセトニトリル２０ｍｌ中で無水硫酸ナト
リウム１０ｇと共にホモジナイズし、遠心分離を行い上
澄みを分取後、再度アセトニトリル抽出を行い、ヘキサ
ン２０ｍｌを加え分配し、脱脂を行った。アセトニトリ
ル層を減圧濃縮し、ＨＢＳ緩衝液に再懸濁し、０．４５
μｍニトロセルロースフィルターで濾過を行い、センサ
ー測定を行った。魚肉抽出試料溶液のみを加えた時、シ
グナル値は上昇するが、緩衝液（移動相）に置換すると
同時に、シグナル値も急速に減少していき、測定にはほ
とんど影響をもたらさない。オキソリン酸添加魚肉抽出
試料溶液の測定では、０．０、０．１、１．０ｐｐｍと
どの場合もスタンダードと同様の値を示した。この結果
を図４に示した。ＨＰＬＣ法の場合、ヘキサン脱脂の
後、ＯＤＳセップパックカラムによりカラム精製を行
い、再度ヘキサン脱脂を行い、ＨＰＬＣ測定を行うこと
になっている（食品衛生検査指針参照）。つまり、ＳＰ
Ｒセンサーを用いた免疫学的測定法ではＨＰＬＣ法と比
べて簡便な前処理でもオキソリン酸測定が可能となっ
た。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、オキソリン酸に結合する
新規なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使
用して免疫測定することにより、例えば、血液及び各組
織などの検体中の微量のオキソリン酸を簡便かつ高感度
に測定することが可能となった。本発明のオキソリン酸
に結合する抗体を用いることにより、魚介類などの生体
試料中のオキソリン酸の測定が可能となり、その成果は
養殖業界、水産業界などの領域に対して非常に重要な貢
献をもたらす。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＯＸＡ免疫ウサギ血清のタイトレーションを示
す図面である。

【図２】精製ＯＸＡポリクロナール抗体のＥＬＩＳＡ競
合試験を示す図面である。

【図３】オキソリン酸抗体固定化チップでのオキソリン
酸測定クロマトグラムを示す図面である。

【図４】ギンザケ筋肉を用いたオキソリン酸添加試験を
示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オキソリン酸を免疫抗原として用いて生
   産した抗体。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体またはポリクローナ
   ル抗体である請求項１の抗体。
3. 【請求項３】 請求項１または２の抗体を使用すること
   を特徴とする魚介類などの生体試料中のオキソリン酸の
   測定方法。
4. 【請求項４】 請求項１または２の抗体を用いた酵素免
   疫測定法により測定することを特徴とする魚介類などの
   生体試料中のオキソリン酸の測定方法。
5. 【請求項５】 オキソリン酸を化学的に測定機器に固定
   化し、請求項１または２の抗体を用いて表面プラズモン
   共鳴法により測定することを特徴とする魚介類などの生
   体試料中のオキソリン酸の測定方法。