PT1235805E

PT1235805E - Imunodoseamento para insecticidas neonicotinílicos

Info

Publication number: PT1235805E
Application number: PT00989956T
Authority: PT
Inventors: James Francis Brady; Dana Philip Simmons; Timothy Edward Wilson
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CZ20021969A3; MA25635A1; KR20020065554A; ATE343564T1; IL150009A; PL205061B1; DE60031570T2; NZ519152A; AU778677B2; CA2393084A1; ZA200204582B; US7148029B2; MXPA02005514A; WO2001042787A2; NO20022684D0; EA200200620A1; ES2272357T3; PL355630A1; KR100752536B1; US20030108970A1

Description

ΡΕ1235805 1 DESCRIÇÃO "IMUNODOSEAMENTO PARA INSECTICIDAS NEONICOTINÍLICOS"

Esta invenção relaciona-se com imunodoseamentos para pesticidas e com anticorpos e reagentes para a realização destes doseamentos. A invenção descreve ainda métodos para a realização destes doseamentos e estojos ("kits") que compreendem reagentes para a prática destes métodos. A invenção tem aplicação especial na detecção e quantificação de insecticidas neonicotinóides numa amostra.

Insecticidas A utilização de insecticidas de sintese para o controle de pragas de insectos nas culturas é uma prática universal. Esta prática ganhou um grau elevado de sucesso comercial porque se demonstrou que este controle pode aumentar o rendimento da colheita. Contudo, a utilização eficaz de insecticidas requer uma gestão correcta sob ponto de vista da resistência do insecto e das questões de ambiente e da exposição do trabalhador. Uma solução aplicada a este problema foi o fornecimento de novos insecticidas mais fortemente activos, de modo a reduzir a necessidade dos insecticidas antigos mais gravemente tóxicos e para reduzir as proporções de agressão ambiental. 2 ΡΕ1235805

Uma nova classe de insecticidas que ganhou reconhecimento significativo no mercado são os designados por insecticidas "neonicotinóides". Os compostos desta classe incluem, por exemplo, os compostos de imidacloprida, de acetamiprida, e de tiametoxame que estão descritos em U.S. patent nos. 4742060 e 5304566 e EP 580553A2, respec- tivamente.

Os tratamentos directos de materiais de propagação de plantas (tais como as sementes) são as aplicações pretendidas que orientam para uma necessidade de redução de exposição do trabalhador e do ambiente e do desenvolvimento de resistência à praga quando aplicado isolado ou em conjunção com aplicações insecticidas foliares ou na lavra. Contudo, deverá haver o cuidado de assegurar que o equipamento de revestimento das sementes esteja devidamente calibrado para que o insecticida seja uniformemente aplicado ao material de semente para evitar problemas na performance do insecticida e de fitotoxicidade, entre outros. Podem ser utilizadas determinações analíticas para determinar se o equipamento de revestimento das sementes foi devidamente calibrado, se funciona bem e se os lotes tratados podem ser encaminhados para a expedição. Contudo, os métodos tradicionais para a detecção de resíduos de insecticidas nas sementes são extremamente morosos e dispendiosos, quando requerem procedimentos analíticos altamente especializados e onerosos tais como a cromatografia gás-líquido e cromatografia liquida de alta resolução. Ambas as técnicas cromatográficas requerem equipamento caro 3 ΡΕ1235805 que é de manutenção onerosa e que devem ser manipulados por pessoal técnico altamente qualificado. As instalações de tratamento e de desenvolvimento de sementes geralmente não têm equipamento ou pessoal no staff e por isso as amostras têm de ser levadas para laboratórios de análise externos. Quando as amostras são analisadas na base de ida e volta rápida por estes laboratórios, as instalações de tratamento podem receber os dados das análises aproximadamente vinte e quatro horas após a expedição. Análises menos rápidas resultam em demoras mais longas. Estas demoras resultam em muitas horas no tempo das instalações de máquinas antiquadas e nas instalações de revestimento. Também se incorre na demora de expedição das sementes revestidas. Há uma necessidade urgente na arte de melhorar as técnicas de determinação tornando-as menos dispendiosas, mais eficientes e mais facilmente manipuláveis. Os métodos desejados deverão ser úteis fora do laboratório em condições de campo, tais que possam rápida e seguramente proporcionar um tratamento ou desenvolvimento da semente por pessoal com informação na presença e concentrações de um determinado insecticida numa amostra de semente. Neste ponto, é importante que os métodos diferenciem o material pesticida activo de outros produtos permitindo a determinação quantitativa da substância activa presente na semente. Contudo, podem permanecer diversas limitações graves dos métodos de análise clássica. Algumas destas limitações poderão surgir na utilização da tecnologia de imunodoseamento. 4 ΡΕ1235805

Imunodoseamentos e Detecçao de Pesticidas

Apesar de principalmente desenvolvidos para utilização médica e veterinária, os imunodoseamentos começaram a ter mais aplicações na área da agricultura. Por exemplo, os imunodoseamentos estão disponíveis para a detecção e quantificação de doenças das culturas, aflatoxinas e alguns antibióticos. Enquanto os imunodoseamentos para a detecção de pesticidas foram descritos na literatura cientifica (ver abaixo), estes tornaram-se disponíveis numa base comercial, apenas numa década decorrida.

Os imunodoseamentos assentam em reagentes de anticorpos altamente específicos e aparelhos de análise relativamente simples para detectar e/ou quantificar uma grande variedade de substâncias pretendidos. 0 anticorpo, mais do que o instrumento ou as condições de funcionamento, proporciona a especificidade analítica. Por isso os imunodoseamentos podem ser realizados em amostras relativamente em bruto. Para além disso, os métodos de imunodoseamentos foram optimizados para a utilização remota em ambientes não-laboratoriais, permitindo a sua utilização no campo bem como no laboratório especializado.

Os métodos imunológicos que são conhecidos para a detecção de alguns herbicidas, compreendendo o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (Fleeker, J.,J. Assoe. Off. Anal. Chem. 70:874-878 (1986), clorsulfuron (Kelley, M. et al. , 5 ΡΕ1235805 J. Agric. Food Chem. 33:962-966 (1985), halogenoacetamidas (Winzenburger, P.A. et al. (European Patent Publication EP 340198, 1989), e uma diversidade de pesticidas, que compreendem o difluobenzuron (Wie, S. I. et ai., J. Agric. Food Chem 30:949-957 (1982), o metalaxil (Newsome, W. H., J. Agric. Food Chem. 33:528-530 (1985)) e o paratião (Ercegovich, C. D. et al., J. Agric. Food Chem. 29:559-563 (1981)). Também foi descrito um método para a detecção imunológica de atrazina (U.S. Pat. N°. 4 530 786). Também são conhecidos os imunodoseamentos para a cianazina, diclofop-metilo, pentaclorofenol, 2,4,5-T e terbutrino. A US 5 723 306 descreve anticorpos monoclonais selectivos para as piretrinas e piretróides.

Todos os métodos imunológicos acima citados utilizaram anti-soros policlonais que foram obtidos a partir de animais hospedeiros (tipicamente coelhos) imunizados com um antigénio apropriado (imunogénio). Mais recentemente, foram descritos anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para a atrazina e seus derivados e produtos deteriorados, e a utilização destes mAbs em imunodoseamentos (Schlaeppi et al., European Patent Publication EP 365818 (1990)).

Devido ao seu peso molecular baixo, os insec-ticidas não são imunogénicos e não elegem anticorpos específicos a partir dos animais hospedeiros. Por isso, o desenvolvimento do imunodoseamento de um insecticida requer um número de passos, começando com o design de haptenos, derivados do insecticida que mantêm a especificidade 6 ΡΕ1235805 estrutural da molécula do insecticida enquanto permite a conjugação com uma proteína "veículo" imunogénica de peso molecular elevado. Para além disso, para a protecção dos anticorpos durante o processo da sua produção, podem ser preparados haptenos adicionais cujas estruturas químicas variam a partir do hapteno utilizado para imunizar os animais. Finalmente, uma vez obtida a preparação do anticorpo (quer policlonal quer monoclonal), deve ser desenvolvido um imunodoseamento suficientemente sensível.

As estratégias básicas utilizadas nos imunodo-seamentos modernos foram descritas em diversas referências (Ver, por exemplo, Voller, A. et al., eds., Iinmunoassays For The 80's, University Park, 1981; Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio. E. (ed.,) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fia., 1980) . Para cada uma das abordagens é essencial a produção das curvas de calibração utilizando quantidades do analito.

Em linguagem vulgar um método de "anticorpo marcado" é referido como o de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Aqui, preparou-se um conjugado da proteína do pesticida (designado por um "revestimento" ou "antigénio de rastreio") utilizando uma proteína que não está estruturalmente relacionada com a proteína de transporte 7 ΡΕ1235805 utilizada no imunogénio pesticida, contra o qual foram gerados os anticorpos anti-pesticidas. 0 conjugado do antigénio do revestimento está imobilizado num suporte de fase sólida, tal como a superfície de um poço de microplaca, que resulta numa quantidade fixa de pesticida de fase sólida por reacção. Adicionou-se uma quantidade conhecida de anticorpo juntamente com a amostra de doseamento. 0 pesticida imobilizado compete com o pesticida livre na amostra desconhecida num número limitado de sítios de ligação do anticorpo. A interacção entre o anticorpo e o analito na fase liquida inibe a ligação do anticorpo ao pesticida de fase sólida. 0 anticorpo ligado à fase sólida é detectado por um anticorpo secundário do conjugado da enzima especifico para a região constante da cadeia pesada do anticorpo anti-pesticida. Muitos anticorpos secundários de enzima de ligação estão disponíveis no mercado para esta utilização. Após retirar por lavagem o anticorpo secundário, o anticorpo secundário é detectado tipicamente por adição de um substrato cromogénico para a enzima, que resulta num produto corado formado na reacção na proporção directa da quantidade de anticorpo secundário ligado. A quantidade de produto da reacção é por isso, inversamente proporcional à quantidade de analito na amostra desconhecida . A modificação do método do "anticorpo marcado" elimina a utilização do antigéneo de revestimento. 0 imunodoseamento enzimático (EIA) imobiliza o anticorpo anti-pesticida numa fase sólida. Um hapteno pesticida está ΡΕ1235805 covalentemente ligado a uma enzima, e o conjugado da enzima resultante é incubado com as amostras nos micropoços ou tubos de cultura revestidos de anticorpo de anti-pesticida. 0 pesticida na amostra compete com o conjugado de hapteno da enzima do pesticida na ligação com o anticorpo imobilizado. Lavou-se a fase sólida para remover o material não ligado e o anticorpo ligado à enzima conjugada é detectado por adição de substrato cromogénico. Ver, e.g., Bushway, R. J., L.P. Perkins, S. A. Savage, S.L. Lekousi, and B.S. Ferguson. 1988. Determination of atrazine residues in water and soil. Buli. Environ. Cotam. Toxicol. 40: 647-654; Fleeker, J.R. e L. W. Cook 1991. Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water P. 78-85 in M.Vanderlann, L.H. Stanker, B.E.Watkins, and D.W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Séries 451. Washington, D.C.: American Chemical Society.

Existe uma necessidade no âmbito da agricultura de um método de análise de sementes tratadas com substâncias activas tais como os insecticidas que pode ser realizado no campo ou numa instalação de tratamento de sementes. A presente invenção proporciona haptenos neonico-tinóides e imunogénios para gerar anticorpos anti-neoni-cotinóides bem como anticorpos, métodos, reagentes, e estojos ("kits") para a determinação da presença de um ou mais insecticidas neonicotinóides numa amostra por imunodo- 9 ΡΕ1235805 seamento. A presente invenção tem especial aplicação na determinação da concentração de insecticidas neonicotinói-des nos materiais de propagação da planta tais como as sementes. 0 método de imunodoseamento da invenção permite ao pessoal das instalações de sementes onde são aplicados alguns insecticidas às sementes determinar quantitativamente a quantidade de substância activa aplicada. 0 método envolve uma extracção rápida das substâncias activas a partir das sementes e um imunodoseamento célere baseado na medição do extracto da solução. Estas medições podem ser utilizadas para determinar se o equipamento de revestimento das sementes foi calibrado adequadamente, e se os lotes tratados podem ser libertados para a expedição. 0 doseamento está projectado para ser de simples operacionalidade requerendo apenas equipamento e reagente correntes de laboratório. Assim, o pessoal com falta de conhecimentos próprios de realização de imunodoseamentos poderá ser capaz de conduzir com êxito o ensaio depois de praticar alguns testes.

Verificou-se que os conjugados neonicotinóides antigénicos (imunogénios) podem ser obtidos por conjugação de um hapteno neonicotinóide pesticida com uma molécula de transporte tal como o derivatizado da proteína purificada (PPD, Tuberculina) a partir do vírus Diptheria, albumina de soro bovino, ovalbumina ou hemocianina da lapa a um hapteno neonicotinóide . Também podem ser feitos conjugados 10 ΡΕ1235805 dos materiais derivatizados da albumina de soro bovino, catião da albumina de soro bovino e outros semelhantes. Ver A. Muckerheide, R. Apple, A., Pesce and J. G. Michael (1987) J. Immunol. 138:833-837. Estes imunogénios podem ser injectados nos animais hospedeiros que produzirão os anticorpos aos haptenos neonicotinóides que podem ser recolhidos. Estes anticorpos podem depois ser utilizados nos diversos procedimentos de imunodoseamentos para detectar os correspondentes insecticidas neonicotinóides, utilizando marcadores conhecidos para marcar quer o insec-ticida quer o anticorpo. Em algumas formas de realização de imunodoseamentos, quer um insecticida neonicotinóide quer um anticorpo está imobilizado. Ambos anticorpos policlonal ou monoclonal podem ser utilizados na prática da presente invenção. Os anticorpos podem demonstrar ligação selectiva ao(s) insecticida(s) neonicotinóide(s) mesmo na presença de outras substâncias activas pesticidas que compreendem outro insecticida neonicotinóide incorporado na formulação do revestimento da semente.

Os métodos de detecção podem ser aplicados à prática desta invenção para determinação de insecticidas neonicotinóides numa amostra que inclui bio-sensores e sistemas enzimáticos, fluorescentes, quimio-luminescentes, e radiométricos. Estes doseamentos podem utilizar formatos homogéneos ou heterogéneos e podem utilizar placas de micropoços, tubos de cultura, pérolas ou partículas de látex como fases sólidas. 11 ΡΕ1235805

Os imunodoseamentos da presente invenção são utilizados para determinar a concentração de compostos de insecticidas neonicotinóides definidos tais como o imida-cloprida, nitenpiram, acetamiprida, tiametoxame, tiaclo-prida e clotiadina numa amostra tal como um material de propagação da planta. A presente invenção proporciona imunodoseamentos para testar numa amostra a presença de determinados insecticidas neonicotinóides. Nestes imunodoseamentos, a reacção do antigénio/anticorpo neonicotinóide pode ser detectada por uma diversidade de métodos, utilizando diversos marcadores para marcar quer o antigénio quer o anticorpo que permite a detecção do produto da reacção. Adicionalmente, a imobilização do antigénio ou do anticorpo facilitarão a detecção em muitos casos.

Os doseamentos de antigénio/anticorpo podem ser classificados geralmente em duas categorias, heterogéneos e homogéneos. Os doseamentos heterogéneos requerem a separação do componente marcado e ligado do componente marcado e livre antes da detecção do produto da reacção. Os doseamentos homogéneos não requerem este passo de separação. Além disso, os doseamentos podem ser (1)competitivos, por exemplo, onde o antigénio compete com um anticorpo marcado com um antigénio de fase sólida ou onde o antigénio compete com o antigéneo marcado com um anticorpo de fase sólida ou (2) não competitivo onde existe uma relação directa entre o marcador e anticorpo ou antigénio. 12 ΡΕ1235805

Os métodos de imunodoseamento podem ser utilizados na prática da presente invenção para detectar insec-ticidas neonicotinóides numa amostra que inclui o imunodoseamento enzimático, quimio-luminescente, fluorescente e bio-sensor, assim como o rádioimunodoseamento. Em imunodoseamentos de enzima ligado (ELISA), de acordo com a presente invenção, os haptenos correspondentes aos insec-ticidas neonicotinóides de interesse podem ser marcados directamente por utilização de anticorpos de enzimas marcados que em determinadas condições catalizam uma reacção com um substrato. A actividade da enzima é tipicamente detectada pela formação de um produto de reacção corado i.e., um final colorido que pode ser facilmente detectado ao olho ou determinado por meios espectroscópicos ou de reflectância.

Nas técnicas de imunodoseamento fluorescente para utilização na presente invenção, os haptenos correspondentes aos insecticidas neonicotinóides de interesse podem ser marcados directamente com fluorocromos, ou indirec-tamente com anticorpos marcados com fluorocromo. Os fluorocromos são pigmentos que absorvem a radiação (e.g., luz ultravioleta), que sendo excitados por ela emitem luz (e.g., luz visível).

Numa forma de realização da presente invenção, o método para a determinação da concentração do insecticida neonicotinóide numa amostra compreende os passos de: 13 - ΡΕ1235805 (a) proporcionar uma fase sólida com um anticorpo imobilizado selectivo para o referido insecti-cida neonicotinóide; (b) contactar a referida amostra com o anticorpo imobilizado na presença de uma quantidade conhecida de um conjugado da enzima-hapteno do insecticida neonicotinóide; (c) lavar a fase sólida (b) para remover qualquer parte não ligada do conjugado da enzima-hapteno ou da amostra; (d) reagir com um substrato cromogénico especifico para o referido conjugado da enzima-hapteno com a fase sólida do passo (c) para gerar um cromogénio; e (e) medir a quantidade do cromogénio produzido no passo (d) de modo a determinar a quantidade de anticorpo ligado ao conjugado da enzima-hapteno e portanto a quantidade de insecticida neonicotinóide na referida amostra.

Numa forma de realização, o imunodoseamento é fornecido na forma de estojo ("kit") que compreende tubos revestidos de anticorpos, o conjugado da enzima-hapteno neonicotinóide, o substrato da enzima, e a solução para concluir a produção do sinal colorimétrico.

Embora a invenção seja descrita frequentemente com referência à utilização de anticorpos policlonais, os 14 ΡΕ1235805 especialistas na matéria também reconhecerão que os anticorpos monoclonais podem ser utilizados como uma alternativa à utilização de anticorpos policlonais. 0 termo "anticorpos" aqui utilizado refere-se genericamente aos anticorpos monoclonais ou policlonais.

Os anticorpos monoclonais para os insecticidas neonicotinóides para a utilização na prática da presente invenção são obtidos utilizando técnicas de cultura de hibridoma e de immunização bem conhecidas pelos especialistas na matéria. As linhas de células de hibridoma adequado são preferencialmente produzidas pela fusão de um anticorpo que produz a célula e uma célula derivada de mieloma a partir de espécies murino. As células produzidas pelo anticorpo são preferencialmente as células do baço. Qualquer linha de células de mieloma adequada pode ser utilizada, contudo, é desejável utilizar um poço caracterizado por uma linha de células das quais muitas são utilizadas para fins correntes.

De igual modo, os anticorpos policlonais para os insecticidas neonicotinóides para a utilização na prática da presente invenção são também obtidos utilizando técnicas conhecidas por especialistas na matéria. A presente invenção proporciona uma preparação de anticorpo IgG policlonal que liga a pelo menos um insec-ticida neonicotinóide, preparação essa de anticorpo produzida por um método que compreende os passos de: (a) 15 ΡΕ1235805 administração a um hospedeiro de uma quantidade de uma composição que compreende um insecticida neonicotinóide ou um equivalente imunológico acoplado a uma proteína de transporte bioloqicamente aceitável, (b) recolha de soros a partir do hospedeiro, e (c) purificação do anticorpo IgG a partir do soro. Um equivalente imunológico de um antigénio tem a capacidade, quando introduzido num hospedeiro, de causar a produção de anticorpos para o antigénio.

Tal como acima referido, o imunodoseamento da presente invenção tem aplicação especial na detecção de quantidade de um insecticida neonicotinóide que foi aplicado ao material de propagação de uma planta. 0 termo "material de propagação de uma planta" é entendido como referindo a todas as partes generativas da planta tais como as sementes que podem ser utilizadas para a multiplicação desta e material de planta vegetativo tais como as mudas e tubérculos (por exemplo as batatas). Podem ser referidas, e.g., as sementes (no sentido estrito), raízes, frutos, tubérculos, bolbos, rizomas, e partes das plantas. Também podem ser mencionadas as plantas germinadas e as plantas jovens que estão a ser transplantadas após a germinação, ou após a emergência a partir do solo. Estas plantas jovens podem ser protegidas antes do transplante por tratamento total ou parcial por imersão.

Numa forma de realização, o insecticida neonicotinóide detectável por doseamento da presente invenção está representado pela fórmula 0) ΡΕ1235805 16

Λ, em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R e R3 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazo-lidina ou um anel de oxadiazina; e X é N-N02 ou N-CN.

Numa outra forma de realização, o insecticida neonicotinóide detectável por doseamento da presente invenção está representado pela fórmula

A

(BI) em que A, R3 e X estão definidos como acima pela fórmula (I) ·

Numa forma de realização preferida, o imunodosea-mento da presente invenção utiliza anticorpos policlonais para um insecticida neonicotinóide. Estes anticorpos podem 17 ΡΕ1235805 ser obtidos a partir do soro de um animal imunizado. A imunização pode ser completada por injecção do imunogénio (conjugado antigénico de hapteno-PPD) em espécies que produzem anticorpos, tipicamente num mamífero e preferencialmente num coelho ou ovelha. Tipicamente, uma injecção inicial é seguida por uma série de subsequentes injecções de revacinação para maximizar a resposta de anticorpos. Optimamente, o regime de injecção é dado em doses múltiplas a coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas. A quantidade de imunogénio injectada varia mas deve ser adequada para eleger uma quantidade detectável de anticorpos. A produção de anticorpo pode ser verificada por análise do soro obtido nos testes de sangue utilizando o EIA, ELISA ou Doseamento Indirecto por Imunodoseamento de Fluorescência.

Os mesmos marcadores utilizados nos doseamentos imunométricos podem ser utilizados para marcar o hapteno utilizado na presente invenção. Entre estes podem ser mencionadas as moléculas repórter (RM) que compreendem as enzimas, tais como a fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano silvestre, e a β-galactosidade. Adicionalmente, podem ser utilizados marcadores fluorescentes, lumines-centes ou radioactivos tais como a f luoresceína, a roda-mina, o luminol, o acrídio e os isótopos radioactivos 125I, etc., ou as partículas coloidais tais como o ouro e o selénio, etc. Finalmente, os quelatos de lantanídeos flouróforos tais como o európio e o térbio podem ser utilizados para gerar sinais fluorescentes resolvidos no tempo. Os marcadores enzimáticos mais correntes são a peroxidase do rábano silvestre (PRS) e a fosfatase alcalina. 18 ΡΕ1235805

Numa forma de realização, o espectrofotómetro é utilizado para detectar a quantidade de neonicotinóide numa amostra. Contudo, os métodos da presente invenção podem ser adaptados por especialistas na matéria utilizando outros tipos de detectores cromogénicos. Igualmente, o produto de reacção detectável não está limitado a um cromóforo mas inclui outros marcadores tal como acima descrito.

Verificou-se que os haptenos das fórmulas seguintes (IA), (IB) e (IIA) são úteis na produção de conjugados neonicotinóides antigénicos (imunogénios) e conjugados de doseamento: HAPTENO (IA)

Pf R* i i

em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazil-5-ilo; R3 é hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto ao qual estão ligados para formar um anel de imidazolidina ou um anel de oxadiazina; n é um número inteiro desde 1 até 5 (preferencialmente um inteiro desde 3 até 5); e X é 0, N-N02 ou N-CN. ΡΕ1235805 19 ΗΑΡΤΕΝΟ (ΙΒ)

em que A, R1, R2, e R3 e X sao tal como definidos na fórmula (IA); e E é uma ligação covalente simples ou é uma unidade de ligação de fórmula -(CH2)m_ em que m é número inteiro a partir de 1 até 3.

em que A, R3 e X estão definidos tal como para a fórmula (IA) . ΗΑΡΤΕΝΟ (IIIB) 20 ΡΕ1235805 Ο

em que A, R3 e X e n são tal como definidos para a fórmula (IA) e E é tal como definido para a fórmula (IB).

Haptenos de fórmulas (IIIA) e (IIIB) que podem ser preparados por analoqia com a sequinte metodoloqia: j

CN * N ,S. HSCHCHj.m;, die 2—«mi π sr A' SCí K2CÔ3 í ST- ci. amsiBSLiiio )t

1 CO-;H \ /

V *QQSH (llíC)

Is 2- ÇS—e^LemttàsKÍiMsltiLi.aLeiSklíiáísa» g ^ staissti-ti^icSa, \

CM 0 hapteno desejado (IIIA) ou (IIIB) é preparado utilizando um derivado de 2-aminoetanotiol apropriado seleccionado a partir de um composto das fórmulas: a *pAcos ti HS^CHCHjMHg /™k\_ CO..FÍ ;eisê) ou 21 ΡΕ1235805 em que R tem o significado dado para a fórmula (I) acima.

Verificou-se que os haptenos seguintes são especialmente úteis na prática da presente invenção: □

N NS J o

«.·£> OH

Cl ...M.Ίί *1 |?1·· m π i n 1 L 1 L | *£>

P OH

O

Cl.

"SN ·£-{ .0

CS

OH

:S

N

R í 0 MH // Rv *<Q OH M \ _O em que n em cada caso é um número inteiro desde 1 até 5; preferencialmente n é um número inteiro desde 3 até 5.

Os conjugados neonicotinóides antigénicos (imu-nogénios) e conjugados de doseamento podem ser produzidos por conjugação de um hapteno de pesticida neonicotinóide com uma molécula de transporte ou molécula repórter, conforme for o caso, utilizando as técnicas conhecidas por especialistas na matéria. Foram realizadas duas abordagens básicas. A primeira utiliza ligantes que se tornam parte do conjugado. Estes ligantes são homo-bifuncionais ou hetero-bifuncionais, e compreendem os que são capazes de formar, 22 ΡΕ1235805 por exemplo, ligações dissulfito através dos grupos tiol das unidades cistina no substrato das proteínas, ou da formação de ligações amida entre o iV-terminal do grupo amino ou das cadeias laterais amino ou resíduos da lisina e unidades acilo activadas tais como os ésteres de succini-midilo. Em geral, esta abordagem envolve grupos funcionais altamente reactivos no ligante e é razoavelmente fácil a conjugação para os substratos. Contudo é frequentemente útil empregar grupos funcionais que podem ser menos reactivos, tais como os que são capazes de formação da hidrazona.

Uma segunda abordagem, especialmente útil na conjugação de duas unidades de proteína, utiliza um agente de desidratação tal como uma carbodiimida para possibilitar a formação de, por exemplo, novas ligações peptídicas por reacção de uma unidade carboxilo num membro do conjugado com um grupo amino livre no outro. Neste caso, o reagente não se torna parte do conjugado.

Esta reacção não é particularmente simples dado que o grupo carboxilo não está activado; a carbodiimida proporciona o intermediário activo e desloca o equilíbrio por remoção dos elementos da água para formar a ligação peptídica.

Ambas as abordagens para a conjugação foram conduzidas em solventes aquosos pelo facto do material proteico que forma o conjugado ser facilmente desnaturado. As proteínas são concebidas para serem estáveis em meio 23 ΡΕ1235805 aquoso e sabe-se que se desnaturam em solventes, tais como o etanol, que pode ser considerado ser razoavelmente análogo a um meio aquoso. Também, os componentes do conjugado da proteína tendem a serem relativamente insolúveis em solventes não aquosos.

Os conjugados de hapteno de fórmula seguinte podem ser considerados úteis na prática da invenção: pf Rs

O

em que A, Ri, R2, R3, n e X têm os significados dados para a fórmula (IA) acima e PR é um resíduo de proteína de: (1) uma molécula de transporte tal como um derivado de proteína purificado (PPD, Tuberculin) a partir do vírus Diphteria, albumina de soro bovino, albumina de soro humano, ovalbu-mina ou hemocianina de lapa no caso de um imunogéneo ou (2) uma molécula repórter (RM) tal como a fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, e β-galactosidase.

Adicionalmente, os conjugados do hapteno da fórmula seguinte são igualmente úteis:

24 ΡΕ1235805 em que A, Rlf R2, R3 E e X têm o significado dado na fórmula (IB)acima.

Verificou-se que os conjugados seguintes sao muito úteis na prática da presente invenção: f ""j ftL , N, //

Y

Nu NH—-PR

N t

O

e □

N,

R

D

*<0 NH—PR Ή ' i O em que n em cada caso é um número inteiro desde 1 até 5; preferencialmente n é um número inteiro desde 3 até 5.

Os anticorpos policlonais não marcados utilizados na presente invenção para ligarem-se ao neonicotinóide antigénico ou ao conjugado de hapteno-RM na amostra ensaiada devem estar imobilizados em alguns dos suportes 25 ΡΕ1235805 vulgarmente utilizados nos doseamentos imunométricos. Entre estes os que podem ser utilizados são o papel de filtro, látex ou pérolas de poliestireno e polietileno, poliestireno, propileno ou outros tubos de ensaio ou placas de micropoços adequados. Este suporte pode ser feito de qualquer polímero de origem natural ou de síntese, ou de um material amorfo tal como o vidro. Vantajosamente, são utilizadas as membranas de nitrocelulose ou nylon para as fitas reactivas, e polivinilo, polipropileno, poliestireno ou outros plásticos para as pérolas ou microplacas. Também podem ser utilizados os geles ou partículas com base em agarose, acrilamida ou látex. Adicionalmente, qualquer um dos dispositivos cromatográficos, fitas de ensaio e dispositivos de fluxo lateral conhecidos na técnica podem ser adaptados ao processo da presente invenção. Entre os dispositivos de fluxo lateral adequados, pode ser mencionado, por exemplo, o tipo de dispositivo de fluxo lateral descrito em US patent 4 366 241. As técnicas para a ligação dos anticorpos a estes materiais são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Uma fonte adequada para a obtenção de anticorpos ligados a um suporte é, por exemplo, Beacon Analytical Systems, Inc. (Portaland, Maine).

Para preparar uma amostra de sementes para a utilização no doseamento, sub-amostras de sementes representativas a partir de um lote tratado com neonicotinóide (por exemplo, a partir de cinco até 100 gramas de semente de canola; desde dez até 200 gramas de sorgo, trigo, algodão, milho de campo ou sementes de milho 26 ΡΕ1235805 doce) são dispersadas num solvente adequado tal como a acetona, acetonitrilo, etanol, isopropanol, metanol, ou misturas destes solventes com diversas percentagens de água. As misturas de solvente e água adequadas compreendem, por exemplo, a partir de 1 até 50% Me0H/H20 e desde 1 até 20% de acetonitrilo/H20. A semente dispersada é misturada com agitação num misturador de vórtex e depois colocado num banho com sonicação durante cerca de vinte minutos e seguido de um vórtex adicional. Deixou-se assentar os conteúdos. Retirou-se uma porção determinada do liquido extraído e adicionou-se a uma quantidade conhecida de uma solução de, por exemplo, 1% acetonitrilo/água. Diluiu-se mais o extracto para levar a concentração do neonicotinóide extraído a integrar-se numa gama da curva de calibração. Verificou-se que as diluições de um milhar até seis milhares de vezes foram úteis. Os imunodoseamentos levam aproximadamente trinta e cinco minutos a serem realizados. A extracção e a preparação do extracto para a análise leva aproximadamente trinta minutos. Assim, uma amostra de sementes pode ser extraída e analisada em aproximadamente uma hora e cinco minutos. Numa forma de realização, mais do que duas amostras de sementes (podem ser mais de cinco sub-amostras por amostra de doseamento) podem ser analisadas de uma só vez.

As concentrações de insecticidas neonicotinóides desde cerca de dez mil partes por milhão até meia parte por bilião podem ser detectadas nos imunodoseamentos de acordo com a presente invenção. Contudo, o método é adequado para 27 ΡΕ1235805 qualquer quantidade de insecticida neonicotinóide presente contanto que a quantidade de insecticida neonicotinóide numa amostra ou extracto da amostra caia ou possa ser apropriadamente diluído para cair dentro da gama da curva de calibração. A preparação do antigénio, produção de anticorpos policlonais e um imunodoseamento são ilustrados com mais pormenor pelos exemplos não-limitativos seguintes.

EXEMPLOS

Exemplo 1- Procedimento de síntese para o Hapteno de Tiametoxame ΡΕ1235805 28 ΟΜ« Ν" Νί

O QMs O N N 1.1 salf&ÍQ de Q—BBefeilisíBureia ,ΟΜί

N

fi i-w ÇS ?-«0.kJ o CH,$D,H ίχ-Λ'Γ. '&>p% ^ £êia±aJí 9 j 4* o

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O NO, 1.3 1,2 w,©o.

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J com BC! Corss ..NO,nX^

°-<J L. J N O H Ni

CO,M

M

l.S 1.1 2-metil-l-nitroisoureia

Dissolver a mistura de sulfato de O-metil isoureia (38,5 g) em ácido nítrico (120 mL)/ácido sulfúrico (280 mL) a 0°C e agitar durante 2 h a 0°C. Cuidadosamente verter a mistura sobre gelo triturado com agitação e depois remover o gelo triturado por filtração. Dissolver os cristais em forma de agulha em acetato de etilo e tornar a solução alcalina por adição de carbonato de potássio. Secar a solução sobre sulfato de magnésio e filtrar. Concentrar o filtrado para obter um pó branco (5 g). 1.2 29 ΡΕ1235805

Preparou-se uma solução a partir de 3 g de cloridrato de 4-aminobutirato de metilo (1.1a) e 15 mL de água. Ajustou-se o pH para 11 por adição gota a gota de NaOH 2N enquanto a solução foi arrefecida num banho de gelo. 0 recipiente da reacção está equipado com um eléctrodo de pH e termómetro e agitou-se rapidamente a solução básica límpida resultante enquanto se adicionou o 2-metil-l-nitroisoureia (2,38 g) em pequenas porções para manter a temperatura da solução abaixo dos 2°C. Quando a adição está completa, agitar a reacção durante 1,5 h a 0°C; notar que o pH estabilizou a 9,6. Adicionar THF (1 mL) e agitar durante 2 h adicionais. Diluir a reacção com água e verter sobre o acetato de etilo. Após a separação das fases, secar a fracção orgânica sobre sulfato de magnésio e filtrar a solução. Concentrar o filtrado para obter um óleo límpido. Por cromatografia flash em sílica gel eluída com 3:1 diclorometano/acetonitrilo do óleo em bruto obtêm-se 750 mg do produto desejado como um sólido branco. 1.3

Combinar o produto obtido em 1.2 (1,44 g) com para-formaldeído (422 mg), ácido metanossulfónico (0,023 mL), e ácido fórmico (10 mL) e aquecer a 55°C durante 15 h. Concentrar a reacção in vacuo. Suspender o óleo castanho resultante em tolueno e remover azeotropicamente a solução até à secura. Dissolver o óleo resultante em 1:1:1 THF/di- 30 ΡΕ1235805 oxano/acetonitrilo e tratá-lo com diazometano em excesso. Agitar a solução durante 30 min e tratar a reacção com ácido acético. Concentrar a mistura reaccional até obter um óleo. Reconstituir o óleo em acetato de etilo, lavar com solução de bicarbonato de sódio diluída, secar sobre sulfato de magnésio, e voltar a concentrar até um óleo. Purificar este óleo por cromatografia flash com 3:1 diclorome-tano/acetonitrilo para proporcionar 658 mg de éster butí-rico de oxadiazinamina (1.3) como um óleo límpido. 1.4

Dissolver o produto de 1.3 (1,1 g) d em acetoni-trilo (50 mL) e adicionar 3 g de carbonato de potássio. Adicionar o clorometilclorotiazole numa porção e aquecer a mistura reaccional a 55°C durante 20 h. Arrefecer a mistura até à temperatura ambiente e filtrar para remover os sólidos. Concentrar o filtrado castanho resultante para obter um óleo. Purificar o óleo por cromatografia flash com 3:1 diclorometano/acetonitrilo para proporcionar 894 mg do composto desejado como um óleo amarelo/castanho. 1.5

Dissolver o composto 1.4 (372 mg) em 8 mL de HC1 e 1 mL de água e agitar durante 6 h à temperatura ambiente. Diluir a mistura reaccional com água e alcalinizar cuidadosamente por adição de NaOH IN, até que o pH atinja 31 ΡΕ1235805 4,5. Extrair com acetato de etilo e secar a fracção orgânica sobre sulfato de magnésio. Concentrar a fracção orgânica seca para um óleo e purificar por cromatografia flash com 1:1 diclorometano/acetonitrilo para proporcionar o produto desejado 1.5 (100 mg).

Cl

COjH (1.5)

Exemplos 2-5- Haptenos de Tiametoxame

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 1 para preparar os haptenos de tiametoxame ilustrados na Tabela 1 substituindo o intermediário 1.1a com um composto análogo apropriado da fórmula NH2 (CH2) nCC>2R (1.1b) em que n é um número inteiro desde 1 até 5 e R é H ou Ci-C4alquilo.

Tabela 1

Nk OH H k

Exempl0 n 2 1 32 ΡΕ1235805

3 2 4 4 LO LO

Exemplos 6-9- Haptenos de Tiametoxame

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 1 para preparar os haptenos de tiametoxame ilustrados na Tabela 2 substituindo o intermediário 1.1a com um composto análogo apropriado da fórmula

em que E é uma ligação covalente simples ou uma unidade de ligação -(CH2)m- em que m é um número inteiro de 1 até 3; R é H ou Ci-C4alquilo

Tabela 2

t „ D

Exemplo n 6 \ 33 ΡΕ1235805 7 \ --- 8 X^C-O, _____ 9 V''\/

Exemplo 10 - Procedimento de síntese para o Hapteno__j^— nitroimino Tiametoxame

N

e^çu&eiBSfeíii-to a !S5*C 2 b

O N' k oo,h S^v,

JST V Λ*·* ···,, a 14 Ί4 u

Procedimento: 0 hapteno ácido tiametoxame-butírico (100 mg, 0,275 mmol) e o anisole (6,5 mL) foram combinados num balão de fundo redondo de 10 mL equipado com um agitador magnético e um condensador de refluxo. 0 recipiente foi colocado num banho de óleo e aquecido a 165 °C durante 2 h. 0 anisole foi removido sob pressão reduzida a 50°C durante 5 h. 0 produto oleoso resultante (90,2 mg) era 93% puro por análise de HPLC.

Dados espectroscópicos para a Caracterização: HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18 5u(25 x 0,46 cm); acetonitrilo: 20 mM Ácido Fosfórico (40:60); 1,0 mL/min".; 34 ΡΕ1235805 T=40 C; UV @ 240 nm (BW = 100 nm) ; Tempo de Desenvol vimento: 13 min; Tempo de Retenção: 4,6 min. TLC: (diol gel) Diclorometano/Acetonitrilo, 2:1 Rf = 0,25. -H NMR (CD3CN, 300 MHz) : δ 7,43 (t, 1H) , 4,78 (s, 4H) , 4,48 (d, 2H), 3,29 (t, 2H), 2,27 (t, 2H), l,73(q, 2H). EI/DEP Espectro de Massa: m/z 319 (M+).

Análise por combustão: Teórica: C, 41,32; H, 4,41; N, 13,14;

Encontrado: C, 40,13; H, 4,43; N, 12,99

Exemplos 11 - 18- Haptenos de des-nitroimino Tiametoxame

Utilizou-se a metodologia de sintese do Exemplo 10 para preparar os seguintes Haptenos de des-nitroimino Tiametoxame ilustrados na Tabela 3 por substituição do composto obtido no exemplo 1 com um composto análogo apropriado dos exemplos 2-9.

Tabela 3

Cf o M. íí-V m w o

Exemplo

R 5 35 ΡΕ1235805 11 -CH2C02H 12 -CH2CH2CO2H 13 -CH2CH2CH2CH2CO2H 14 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 15 C0>M 16 17 COsH 18 'x/ \ -COyH Exemplos 19 - 27- Haptenos de Imidacloprida

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 1 para preparar os Haptenos de imidacloprida seguintes ilustrados na Tabela 4 por utilização do derivado de nitro-guanidilo obtido em 1.2 ou um seu análogo obtido por substituição do intermediário 1.1 com um análogo apropriado de fórmula 1.1 b ou 1.1 c tal como nos exemplos 2-9.

Tabela 4

Exemplo

O

R 6 36 ΡΕ1235805

19 -CH2C02H 20 -CH2CH2CO2H 21 -CH2CH2CH2CO2H 22 -CH2CH2CH2CH2CO2H 23 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 24 25 U 2 6 y— CO^H 27 Λχ/Λ CÕ?tH

Exemplos 28-36 - Haptenos de des-nitroimino Imidacloprida

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 10 para preparar os seguintes Haptenos de des-nitroimino Imidacloprida ilustrados na Tabela 5 por substituição do composto obtido no exemplo 1 com um composto análogo apropriado dos exemplos 19-27.

Tabela 5

T * o

Exemplo R7 28 -CH2CO2H ΡΕ1235805 37 29 -CH2CH2CO2H 30 -CH2CH2CH2CO2H 31 -CH2CH2CH2CH2CO2H 32 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 33 \ GOJ*f \-/ u 34 λ. ,CO,K Ti 35 1 36 w

Exemplos 37-45 - Haptenos de Clotiadina

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 10 para preparar os seguintes Haptenos de clotiadina ilustrados na Tabela 6 por utilização do derivado de nitro-guanidilo obtido em 1.2 ou um seu análogo obtido por substituição do intermediário 1.1a com um análogo apropriado de fórmula 1.1 b ou 1.1c tal como nos exemplos 2-9.

Tabela 6

Cl

fk ,-o Ni.. O

Exemplo

R 38 ΡΕ1235805

Exemplos 46-54 - Haptenos de des-nitroimino Clotiadina

Utilizou-se a metodologia de síntese do Exemplo 10 para preparar os seguintes Haptenos de des-nitroimino clotiadina ilustrados na Tabela 7 por substituição do composto obtido no exemplo 1 com um composto análogo apropriado dos exemplos 37-45.

Tabela 7

O

NH“RS

O

Exemplo R9 46 -ch2co2h 39 ΡΕ1235805

Exemplos 55-63 - Haptenos de Tiacloprida haptenos seguintes os os

Utilizou-se a metodologia de sintese para de fórmulas (IIIA) e (IIIB) para preparar haptenos de clotiadina ilustrados na Tabela 8

Tabela 8

40 ΡΕ1235805

58 -CH2CH2CH2CH2CO2H 59 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 60 V td 61 Tj 62 63 ^^ yoOjW

Exemplo 64- Preparação de Imunogénio de Tiametoxame 64.1

Preparar uma solução de derivado de proteína purificada (Tuberculina, PPD) em 0,01 M PBS, pH 7,4, para uma concentração de 1 mg/mL. Ajustar o pH de uma alíquota de 0,5 mL desta solução para 4,5-5,0 com HC1, 0,1 M. 64.2

Dissolver o hapteno de tiametoxame do Exemplo 1 (1 mg) em 250 μΕ de ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico 0,1 M, pH 4,5. Combinar o hapteno e as soluções de PPD 64.3

Dissolver 1 mg de 1-(dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDC) em 100 μ]1 de água destilada e desio 41 ΡΕ1235805 nizada. Adicionar imediatamente a solução de EDC à solução de hapteno-PPD de 3.2. Misturar a solução de hapteno-PPD com rotação durante 2 h à temperatura ambiente. Transferir a mistura reaccional para uma manga de diálise com um peso molecular de 1000-2000 Dalton e isolar. Dializar extensivamente contra 2 litros de PBS a 4°C com três mudanças/dia durante 48 horas.

Exemplo 65 - Preparação do Imunogénio de Imidacloprida

Utilizou-se a metodologia do Exemplo 64 para preparar um imunogénio utilizando o hapteno do Exemplo 21.

Exemplo 66 - Preparaçao do Imunogénio de Clotiadina

Utilizou-se a metodologia do Exemplo 64 para preparar um imunogénio utilizando o hapteno do Exemplo 39.

Exemplo 67 - Preparação do Imunogénio de Tiacloprida

Utilizou-se a metodologia do Exemplo 64 para preparar um imunogénio utilizando o hapteno do Exemplo 57.

Exemplo 68 - Programa de Imunização e Recolha de Anticorpos

Para a imunização inicial, dissolver o imunogénio do Exemplo 64 em "Freund's Complete Adjuvant". Inocular coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas. Injectar aproxima- 42 ΡΕ1235805 damente 25 μg de imunogénio de cada lado. Imunizar igualmente ovelhas com a excepção de ser injectado 38 μg de imunogénio de cada lado.

Nas imunizações subsequentes, dissolver o imuno-géneo em "Freund's Incomplete Adjuvant". Deixar os animais em repouso durante 4 semanas entre as imunizações e sangrar dez dias após a imunização.

Administrar as injecções de revacinação e sangrar os animais durante nove meses, ao fim do que estes ficam sem sangue. Os anticorpos policlonais são recolhidos utilizando as técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria.

Exemplo 69 - Preparação de Conjugados de Enzimas-Haptenos 69.1

Combinou-se o hapteno de tiametoxame do Exemplo 1 (3,1 mg), com N-hidroxisuccinimida (NHS) (4,0 mg), e EDC (4,6 mg) num frasco pequeno. Estas substâncias foram secas sob uma corrente suave de azoto durante 15 min à temperatura ambiente. 69.2

Adicionou-se dimetilformamida (2,0 mL) seca e a mistura foi sonicada durante 1 min. Incubou-se a solução 43 ΡΕ1235805 resultante de um dia para outro à temperatura ambiente. 69.3

Dissolveu-se peroxidase de rábano silvestre (8,5 mg) em tampão de carbonato (2,0 mL, 0,05 M pH 9,6), num frasco pequeno. Colocou-se o frasco num banho de gelo. 69.4

Adicionou-se lentamente durante lh um total de 100 μ!1. da solução de hapteno-NHS-EDC a partir de 6.2 e incubou-se a mistura com agitação durante 2 h.

Fez-se passar a mistura reaccional por uma coluna de Sephadex G-25M equilibrada com PBS (0,01 M, pH 7,2). O conjugado da enzima foi recolhido nos primeiros 3,0 mL do eluido e adicionou-se um volume igual de glicerol; guardou-se a -20°C.

Exemplo 70 - Imunodoseamento de Semente de Canola Tratada com Tiametoxame

Dilui-se uma porção de extracto de semente em Me0H/H20 1%, até obter uma concentração de tiametoxame dentro da gama da curva de calibração, 0,5 até 120 partes por bilião.

Marcaram-se tubos revestidos de anticorpos e 44 ΡΕ1235805 colocaram-se numa grade de tubos de modo que o primeiro e o último tubo fossem padrões e os padrões restantes e as amostras ficaram misturados. A grade de tubos prende cada tubo tal modo que a grade pode ser invertida sem que haja perda dos tubos. Adicionou-se uma alíquota de um padrão ou amostra (0,5 mL) a todos os tubos correspondentes. Adici-onou-se a solução de conjugado de enzima (0,5 mL) a todos os tubos. A grade foi agitada suavemente a fim de misturar os conteúdos de todos os tubos. Incubaram-se os tubos durante 20 min à temperatura ambiente. Inverteu-se a grade para decantar os conteúdos de todos os tubos. Adicionou-se H2O a todos os tubos para transbordar utilizando um esguicho de lavagem e decantou-se a água de lavagem. Lavaram-se os tubos mais três vezes. Após a lavagem final, inverteu-se a grade e os tubos foram escorridos suavemente sobre uma toalha de papel limpa para remover o excesso da água de lavagem. Adicionou-se o substrato da enzima (0,5 mL) a todos os tubos que incubaram durante 10 min à temperatura ambiente. A grade foi agitada suavemente durante a incubação todos os 2,5 min. Adicionou-se a solução ácida de paragem (HC1, 1M; 0,5 mL) a todos os tubos para terminar a geração de sinal. Tal como está ilustrado na Tabela 10, a absorvância do produto da reacção é medido a 450 nm. As absorvâncias dos padrões são utilizados para construir a curva de calibração, a função de regressão na forma Y = m Ln(X) + B. A absorvância de cada amostra é inserida na função para determinar a concentração do pesticida neonico-tinóide na amostra diluída. A concentração resultante é multiplicada pelo factor de diluição para calcular a 45 ΡΕ1235805 quantidade pesticida neonicotinóide na amostra diluída na amostra original.

Tabela 10. Curva de padrao típica para o imunodoseamento com o tiametoxame

Concentração de Tiametoxame Absorvância a 450 nm (resposta analítica) 120 0,3145 20 0,6636 3 1,0283 0,5 1,3618 1Unidades de partes por bilião A função que descreve a resposta dos padrões de tiametoxame é gerada por análise de regressão. Este conjunto de dados produziu uma curva padrão de Y = - 0,191 Ln(X) + 1,23, r = -0, 999 em que Y = resposta analítica e X = concentração dos padrões de tiametoxame.

Exemplo 71 - Ensaio de Reactividade Cruzada de Sementes de Cultura Tratadas com o Tiametoxame 71.1 Extracçao de sementes

Das amostras de sementes tratadas obtiveram-se sub-amostras por adição aleatória de 50 g de algodão, milho de campo, sorgo, milho doce, e trigo ou 40 g de canola para frascos de boca larga de 8 onças. A canola originou sub- 46 ΡΕ1235805 amostras por quatro vezes; são utilizadas cinco sub-amostras de outros tipos de semente. Adicionou-se solvente (150 mL) e o recipiente é selado suavemente. Extraiu-se o algodão em acetonitrilo/água a 5% enquanto as outras sementes utilizaram um sistema de solventes metanol/água a 20%. Agitou-se o frasco vigorosamente com as mãos durante 30 segundos e colocou-se num banho de água com sonicação à temperatura ambiente durante 20 minutos. As amostras foram agitadas pela segunda vez tal como previamente descrito. Deixaram-se os conteúdos de cada frasco repousarem durante aproximadamente 5 minutos retirando-se uma aliquota (0,10 mL) para a análise. Diluiu-se a aliquota em metanol/água a 1% para fazer com que os resíduos fiquem na gama da curva padrão. 71.2 Análises de Imunodoseamento

Os anticorpos revestidos de poliestireno dos tubos de cultura foram marcados e colocados numa grade de tubos de modo que o primeiro e o último tubo fossem padrões e os padrões restantes e as amostras ficaram misturados. Adicionaram-se as amostras e as soluções padrões aos tubos correspondentes. Adicionou-se igual volume de solução de conjugado de enzima. A grade foi agitada suavemente a fim de misturar as soluções e incubaram-se os tubos durante 20 min à temperatura ambiente. Os conteúdos de todos os tubos foram removidos por inversão da grade sobre um recipiente de inox. Cada um dos tubos foi lavado até transbordar de água destilada. Inverteu-se a grade sobre um tanque para verter a água das lavagens. A lavagem foi repetida quatro 47 ΡΕ1235805 vezes. Depois a grade foi invertida e escorrida suavemente numa toalha de papel para remover a água de lavagem remanescente. (Algum liquido remanescente nos tubos não afecta o resultado do doseamento.) Adicionou-se a solução de substrato da enzima (0,50 mL) aos tubos que incubaram durante dez minutos à temperatura ambiente. A grade foi suavemente agitada em intervalos de 2,5 min para garantir que a enzima mantenha um fornecimento amplo de substrato. 0 aparecimento de sinal colorido azul termina por adição de uma solução de paragem ácida (0,50 mL) . A absorvância de cada solução em cada tubo é medida espectrofotometricamente a 450 nm. A concentração de analisado nas amostras é determinada a partir da função de regressão na forma de y = m ln(X) + b. 71.3 Determinação da reactividade cruzada

Avaliou-se a reactividade cruzada, ou a especificidade, de imunodoseamento para determinar se as outras substâncias encontradas nos revestimentos das sementes interferem com a determinação do tiametoxame. Dissolveram-se as substâncias a ensaiar em metanol/água a 1% para as concentrações cairem na gama de a partir de 1000 até 0,01 ng/mL. Analisaram-se as aliquotas de cada uma das concentrações tal como foi descrito anteriormente. Determinou-se a reactividade de cada uma das substâncias a ensaiar sobre esta gama tal como foi anteriormente descrito em Brady, 48 ΡΕ1235805 J.F; Turner, J.; Skinner, D.H. "Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the incurred residues in soil and water samples." J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2542-2547.

71.4 RESULTADOS

Entre as substâncias de ensaio analisadas, apenas verificou-se ser o tiametoxame significativamente reactivo com o imunodoseamento (Tabela 9 seguinte) . Por isso, este imunodoseamento é especifico para o tiametoxame.

As sub-amostras dos lotes tratados foram analisadas por imunodoseamento e por HPLC. Os resultados destas análises estão ilustrados na Tabela 11. A Tabela 11 representa a correlação dos resultados de imunodoseamento médios utilizando um anticorpo policlonal e uma análise de HPLC de quarenta amostras de sementes para o tiametoxame. A melhor linha de regressão ajustada indica que foram obtidos resultados semelhantes para cada método.

Tabela 9

Reactividade cruzada do imunodoseamento do tiametoxame

Substância ensaiada Percentagem de Reactividade Relativa ao Tiametoxame Tiametoxame 100 Clotiadina <1, 0 49 ΡΕ1235805

Imidacloprida 2nr Clorpirifos NR Difenoconazole NR Fludioxonil NR Pentacloronitrobenzeno NR Metalaxil NR Mefenoxame(R-Metalaxil) NR Fluxofenim NR Carboxina NR Captan NR Sistano (Miclobutanilo) NR TCMTB NR Primifos de metilo NR Tiofanato de metilo NR

Reactividade das substâncias de ensaio relativa à reactividade de tiametoxam expressa como uma percentagem 2 NR, não-reactivo. _ 0 âmbito da invenção está determinado pelas reivindicações anexas.

Tabela 11. Comparaçao de resultados analíticos obtidos por Imunodoseamento e por HPLC.

Partes Por Milhão de Tiametoxame Encontradas por Imunodoseamento HPLC Tipo de semente Amostra Análises Replicadas 1Média

Canola 294642 3517 2586 3403 4139 4327 3594 3724 294681 4191 3416 3643 3591 4718 3912 3915 294682 3034 3299 2687 3534 4254 3362 3769 294683 3264 3104 3614 3860 3445 3457 3875 50 294684 2761 3367 3617 3685 3409 3368 294643 1659 1865 1662 1661 1929 1755 294643 1613 1654 1678 1771 1998 1743 294685 1348 1855 1601 1984 1979 1753 294686 1717 2054 1966 1981 1980 1940 294687 1943 1880 2244 1767 2165 2000 294688 1972 1821 1746 1864 1626 1806 294644 651 66 4 611 573 612 622 294689 628 688 684 569 741 662 294689 690 732 655 753 710 708 294690 930 817 690 794 898 826 294691 757 565 625 700 806 691 294692 1057 994 893 740 845 906 294692 915 861 604 658 599 727 294645 2149 2091 2309 2320 2505 2275 294677 2774 2477 2602 3369 3329 2910 294678 2220 3587 2945 2870 2853 2895 294679 2427 3275 2471 2795 2538 2701 294680 1967 2006 2255 2056 2119 2080 294680 2963 2750 2510 2934 2481 2728 294645 2115 2576 2865 3146 2649 2670 298296 469 428 364 375 455 418 298297 750 390 480 514 499 527 298298 554 — 476 426 481 484 298299 456 440 377 412 387 414 298300 448 343 375 388 410 393 298301 3931 3625 4350 4083 4485 4095 298302 4854 5058 4558 4286 5237 4798 298303 3431 3587 3176 3835 4296 3665 298304 5379 5428 4246 4084 3697 4567 298305 3107 4301 2881 4397 4692 3876 ΡΕ1235805 51 (continuação)

Milho de campo 298307 469 464 567 451 422 475 424 298308 409 384 409 422 386 402 389 298309 379 408 368 378 333 373 400 298310 428 395 493 417 552 367 373 298311 320 407 307 402 398 457 383 298312 3050 3656 2645 3622 3827 3360 3038 298313 4322 3694 2955 3397 3185 3511 3529 298314 3602 3347 3804 3055 3972 3556 3681 298315 3563 3301 3271 3445 4037 3523 3712 298316 4326 4903 5118 4590 4873 4762 3661

Partes Por Milhão de Tiametoxame Encontradas por Imunodoseamento HPLC Tipo de semente Amostra Análises Replicadas ^édia 1As análises replicadas (cinco) foram realizadas por imunodoseamento. O valor médio de todas análises por imunodoseamento para cada amostra foi comparado com o resultado para a amostra por análise de regressão. Isto originou uma função de regressão de Y = 1,00 X + 10,9, r = 0,976, N = 40 em que Y = PPM Tiametoxame encontrado por doseamento imunológico e X = PPM Tiametoxame encontrado por HPLC. 1As análises replicadas (cinco) foram realizadas por imunodoseamento. O valor médio de todas análises por imunodoseamento para cada amostra foi comparado com o resultado para a amostra por análise de regressão.

Lisboa, 19 de Dezembro de 2006

Claims

ΡΕ1235805 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo útil num imunodoseamento de uma amostra para determinar a quantidade de um insecticida neonicotinóide, em que o referido anticorpo (I) é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com um hapteno de neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica e (II) especificamente se liga ao insecticida neonicotinóide, e em que o referido anticorpo é selectivo para um composto da fórmula

G> em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R e R1 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazolina ou um anel de oxadiazina; e X é N-N02 ou N-CN. 1 seleccionado a partir do grupo que consiste em imidaclo-prida, tiametoxame e clotiadina.
2 Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é selectivo para um composto ΡΕ1235805 2
3. Composto da fórmula Y ti x

<£A) em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R3 é hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazolina ou um anel de oxadiazina; n é um número inteiro desde 1 até 4; e X é N-N02 ou N-CN.
4. Composto de acordo com a reivindicação 3 de fórmula O >=? c q OH -O M f , £>
5. Composto de acordo com a reivindicação 4 de fórmula K' a* S N N N" O d COjH
6. Composto de acordo com a reivindicação 3 de fórmula ΡΕ1235805 3

OH Η t _ Ο
7. Composto de acordo com a reivindicação 6 da fórmula

α n
8. Conjugado de proteína da fórmula

em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R3 é hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazolina ou um anel de oxadiazina; n é um número inteiro desde 1 até 4; e X é N-N02 ou N-CN; e PR é um resíduo de proteína de uma molécula de transporte seleccionada de um grupo que consiste de um derivado de proteína purificado (PPD, Tuberculin) a partir do vírus Diphteria, albumina de soro bovino, albumina de soro huma- 4 ΡΕ1235805 no, ovalbumina ou hemocianina de lapa no caso de um imunogénio ou um resíduo de enzima seleccionada a partir de um grupo que consiste de fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, e β-galactosidade.
9. Conjugado de proteína de acordo com a reivindicação 8 da fórmula €í ,Ov >=f Γ 1 0 Nk *£> NK—“PR N O
10 . Conjugado de proteína de acordo com a reivindicação 9 de fórmula NH—H* N S 0"
11. Método de determinação de concentração de um insecticida neonicotinóide numa amostra, que compreende os passos de: (a) proporcionar uma fase sólida com um anticorpo imo bilizado selectivo para o referido insecticida neo nicotinóide, em que o referido anticorpo é selec tivo para o composto da fórmula 5 ΡΕ1235805 R* R*

em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R e R3 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazolina ou um anel de oxadiazina; e X é N-N02 ou N-CN. (b) contactar a referida amostra com o anticorpo imobilizado na presença de uma quantidade conhecida de um conjugado de hapteno-enzima do insecticida neonicotinóide; (c) lavar a fase sólida do passo (b) para remover qualquer parte não ligada do conjugado do hapteno-enzima ou amostra; (d) reagir com um substrato cromogénico especifico para o referido conjugado do hapteno-enzima com a fase sólida do passo (c) para gerar um cromogénio; e 6 ΡΕ1235805 (e) medir a quantidade do cromogénio produzido no passo (d) de modo a determinar a quantidade de anticorpo ligado ao conjugado hapteno-enzima e portanto a quantidade de insecticida neonicotinóide na referida amostra.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a referida amostra é obtida por extracção de um material de propagação da planta num solvente adequado.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a referido material de propagação da planta é uma semente.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a referida semente é seleccionada a partir do grupo que consiste em canola, sorgo, trigo, algodão, milho de campo ou milho doce.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a referido anticorpo é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com um insecticida neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a referida proteína de transporte imunogénica é uma molécula de transporte seleccionada do grupo que consiste em derivado de proteína purificada (PPD, Tuberculin) a 7 ΡΕ1235805 partir do vírus Diptheria, albumina de soro bovino, albumina de soro bovino na forma catiónica, albumina de soro humano, ovalbumina, e hemocianina da lapa.
17. Estojo ("kit") útil para um imunodoseamento de uma amostra para determinar a quantidade de um insecti-cida neonicotinóide, em que o estojo ("kit") compreende em combinação num ou mais recipientes de: (a) uma fase sólida com um anticorpo imobilizado selec-tivo para o referido insecticida neonicotinóide, em que o referido anticorpo é selectivo para o composto da fórmula

em que A é 2-cloropirid-5-ilo ou 2-clorotiazol-5-ilo; R e R3 independentemente são hidrogénio ou Ci- C4alquilo; R1 e R2 independentemente são hidrogénio ou Ci-C4alquilo ou R1 e R2 são tomados conjuntamente com os átomos de azoto aos quais estão ligados para formar um anel de imidazolina ou um anel de oxa-diazina; e X é N-N02 ou N-CN. 8 ΡΕ1235805 (b) um conjugado de enzima que compreende uma enzima conjugada com um hapteno de neonicotinóide.
18. Estojo ("kit") de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica.
19. Estojo ("kit") de acordo com a reivindicação 17, em que a enzima é a peroxidase de rábano silvestre.
20. Estojo ("kit") de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo se liga especificamente a um insec-ticida neonicotinóide seleccionado a partir do grupo que consiste em imidacloprida, tiametoxame e clotiadina.
21. Anticorpo útil no imunodoseamento de uma amostra para determinar a quantidade de um insecticida neonicotinóide, em que o referido anticorpo (I) é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com um hapteno neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica e (II) se liga especificamente a um insecticida neonicotinóide, e em que o referido anticorpo é selectivo para um composto seleccionado a partir do nitenpiram, acetamiprida e tiacloprida.
22. Método de determinação de concentração de um insecticida neonicotinóide numa amostra, que compreende os passos de: 9 ΡΕ1235805 (b) providenciar uma fase sólida com um anticorpo imobilizado selectivo para o insecticida neonicoti-nóide, em que o referido anticorpo é selectivo para um composto seleccionado a partir do nitenpiram, acetamiprida e tiacloprida; (b) contactar a referida amostra com o anticorpo imobilizado na presença de uma quantidade conhecida de um conjugado de enzima-hapteno de um insecticida neonicotinóide; (c) lavagem da fase sólida do passo (b) para remover qualquer conjugado de enzima-hapteno ou amostra não ligado. (d) reacção de um substrato cromogénico específico cromogénico para o referido conjugado de enzima-hapteno com a fase sólida lavada do passo (c) para originar um cromogénio; e (e) medição da quantidade de cromogénio produzida pelo passo (d) de modo a determinar a quantidade de anticorpo ligado ao conjugado de enzima-hapteno e portanto a quantidade de insecticida neonicotinóide na referida amostra.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a referida amostra é obtida por extracção de um material de propagação da planta num solvente adequado.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a referido material de propagação da planta é uma semente. 10 ΡΕ1235805
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a referida semente é seleccionada a partir do grupo que consiste em canola, sorgo, trigo, algodão, milho de campo ou milho doce.
26. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a referido anticorpo é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com um insecticida neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica.
27. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a referida proteína de transporte imunogénica é uma molécula de transporte seleccionada a partir de um grupo que consiste em derivado de proteína purificado (PPD, Tuberculin) a partir do vírus Diptheria, albumina de soro bovino, albumina de soro bovino na forma catiónica, albumina de soro humano, ovalbumina, e hemocianina do orifício da lapa.
28. Estojo ("kit") útil para imunodoseamento de uma amostra para determinar a quantidade de um insecticida neonicotinóide, em que o estojo ("kit") compreende em combinação num ou mais contentores: (a) uma fase sólida com um anticorpo imobilizado selec-tivo para o insecticida neonicotinóide, em que o referido anticorpo é selectivo para um composto 11 ΡΕ1235805 seleccionado a partir do nitenpiram, acetamiprida e tiacloprida; (b) um conjugado de enzima que compreende uma enzima conjugada com um hapteno de neonicotinóide.
29. Estojo ("kit") da reivindicação 28, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal produzido por imunização de um animal com um insecticida neonicotinóide conjugado com uma proteína de transporte imunogénica.
30. Estojo ("kit") da reivindicação 28, em que a enzima é a peroxidase de rábano silvestre. Lisboa, 19 de Dezembro de 2006