JPH0799992A - ジフェニルエーテル誘導体に特異的なモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、及びジフェニルエーテル誘導体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式（１）： 【化１】 で表されるジフェニルエーテル誘導体に特異的なモノク
ローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ、及びそのジフェニルエーテル誘導体モノク
ローナル抗体を用いる免疫学的検出方法。 【効果】 従来の検出法と比較して、操作が簡略化さ
れ、時間が短縮し、しかも測定感度が上昇する。また、
有機溶媒耐性抗体を用いて、有機溶媒中でのジフェニル
エーテル誘導体の測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ジフェニルエーテル誘
導体に特異的なモノクローナル抗体、そのモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそのモノクロー
ナル抗体を用いるジフェニルエーテル誘導体の検出方法
に関する。本発明による前記モノクローナル抗体は、特
には、有機溶媒耐性抗体である。

【０００２】

【従来の技術】近年、環境中や食品中に残留する農薬
が、人体へ与える影響等の面で大きな社会問題として関
心を集めている。環境や食品に関する安全性確保のため
には、これらに含有される残留農薬の量を正確に測定す
ることが必要である。農薬の残留分析法は、従来農薬が
登録される時点において作物ごとに定められており、主
に試料から農薬を抽出し、精製後、ガスクロマトグラフ
ィーや高速液体クロマトグラフィー等を用いて抽出物中
の含有量を測定していた。これらの方法は、その感度や
精度の点では問題はないものの、試料の調製が煩雑で長
時間必要とすること、並びに測定装置や設備等に高額な
費用を要するという欠点があった。残留農薬の分析は、
その分析件数が多大であるため、精度面以外にも簡便性
や迅速性が重要である。また、高価な測定装置がなくて
も容易に分析できることが要求されていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来、ジフェニルエー
テル系除草剤の代表例である５−｛２−クロロ−４−
（トリフルオロメチル）フェノキシ｝−２−ニトロ安息
香酸〔５−｛２−Chloro−４−（trifluoromethyl ）−
phenoxy ｝−２−nitrobenzoic acid ；Ｃ₁₄Ｈ₇ ＣｌＦ
₃ ＮＯ₅ ：アシフルオルフェン；以下ＡＦともいう〕の
分析でも、主にその構造式中に含まれるカルボン酸基を
メチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィーを用
いて測定する方法が採用されていたが、その分析には相
当の時間と手間を要していた。また、例えば土壌中に残
留しているＡＦを測定する場合等では、抽出操作の段階
で有機溶媒の使用が避けられない。

【０００４】近年、生体試料以外の成分の測定において
も、免疫学的検出方法が応用されるようになり、多岐に
渡って応用検討されているが、ＡＦを始めとするジフェ
ニルエーテル系除草剤を免疫学的に検出することについ
ては、従来は一切検討されていなかった。そこで、本発
明者等はＡＦ等のジフェニルエーテル系除草剤を免疫学
的に検出することを目的とし鋭意検討を重ねた結果、本
発明を完成するに到った。

【０００５】即ち、本発明者は、残留農薬としてのジフ
ェニルエーテル系除草剤を測定する際には、土壌等の被
検試料からジフェニルエーテル誘導体を抽出する有機溶
媒の使用が避けられないので、迅速かつ簡便な操作工程
を開発するには、有機溶媒存在下で免疫反応を行うこと
が望ましいことに鑑み、前記ジフェニルエーテル誘導体
に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモ
ノクローナル抗体を見出すことに成功し、このモノクロ
ーナル抗体を用いると、有機溶媒存在下でも免疫学的に
迅速かつ特異的にジフェニルエーテル誘導体を検出する
ことができることを見出した。本発明は、こうした知見
に基づくものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、一般
式（１）：

【化２】 で表されるジフェニルエーテル誘導体に特異的なモノク
ローナル抗体に関する。また、本発明は、前記モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記モノク
ローナル抗体を用いることを特徴とする、一般式（１）
で表されるジフェニルエーテル誘導体の免疫学的検出方
法にも関する。

【０００７】以下、モノクローナル抗体、ハイブリドー
マ及び免疫学的検出方法の順に説明する。本発明による
モノクローナル抗体及びハイブリドーマの調製は常法、
例えば、続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生
化学会編）に記載の方法で行うことができる。具体的に
は、免疫原としては、一般式（１）で表されるジフェニ
ルエーテル誘導体に特異的なモノクローナル抗体をもた
らすものを任意に用いることができるが、例えば、一般
式（１）で表されるジフェニルエーテル誘導体、特には
５−｛２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノ
キシ｝−２−ニトロ安息香酸（アシフルオルフェン；Ａ
Ｆ）、５−｛２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）
フェノキシ｝−２−ニトロ安息香酸メチルエステル（ア
シフルオルフェンメチル；ＡＦＭ）、５−｛２−クロロ
−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ｝−２−アミ
ノ安息香酸（アシフルオルフェンアミン；ＡＦ−ＮＨ
₂ ）、２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフ
ェノキシ）−４−（トリフロオロメチル）ベンゼン（オ
キシフルオルフェン；ＯＸＹ）、若しくは５−（２，４
−ジクロロフェノキシ）−２−ニトロ安息香酸メチルエ
ステル（ビフェノックス；ＢＦＸ）、又はこれらの塩
類、更にはこれらを生体高分子（例えば、ウシ血清アル
ブミン又は免疫グロブリン）担体に結合させたものを用
いるのが好ましい。

【０００８】これらの免疫原溶液を用いて哺乳動物（例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をイン
・ビボ免疫法により免疫する。例えば、免疫原溶液を等
量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュバ
ントと乳化混合し、マウスの皮下に投与する（第１回免
疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数
回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り
出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞
を調製し、細胞融合工程に用いる。

【０００９】細胞融合のもう一方の親細胞であるミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞
株、例えば、ｐ３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）〔Nature,
256,495-497 (1975)〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics i
n Microbiology and Immunology, 81;1-7 (1978)〕、Ｎ
Ｓ−１〔Eur. J. Immunol., 6;511-519 (1976)〕、ＭＰ
Ｃ−１１〔Cell，8;405-415 (1976)〕、ＳＰ２／０〔Na
ture, 276;269-270 (1978)〕、ＦＯ〔J. Immunol. Met
h., 35;1-21 (1980) 〕、×６３．６．５５．３〔J.Imm
unol., 123;1548-1550 (1979)〕、Ｓ１９４〔J. Exp. M
ed., 148;313-323(1978)〕、又はラットにおけるＲ２１
０〔Nature, 277; 131-133 (1979) 〕などを使用するこ
とができる。

【００１０】細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融
合促進剤（ポリエチレングリコールなど）及び場合によ
り補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を用いて行うこ
とができ、使用比率も常法と同様に、例えば、脾臓細胞
に対してミエローマ細胞を約１〜１０倍程度の量で用い
る。融合用培地としては、例えば、４０％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコールを含むダルベッコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）を用いることができる。融合は、前記の
培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合す
ることによって行う。

【００１１】続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培
地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体（前記ジフェニルエーテル誘
導体、特には、ＡＦ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、ＯＸＹ又
はＢＦＸ）に特異性を示すモノクローナル抗体）産生の
有無を、例えばＥＬＩＳＡ法によって検出・測定し、目
的とするハイブリドーマを分離する。特に、有機溶媒に
対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選別する場合には、各種濃度で有機溶媒を
含む有機水性溶液又は無水有機溶液に前記ジフェニルエ
ーテル誘導体（特には、ＡＦ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、
ＯＸＹ又はＢＦＸ）を添加し、これに抗体を加えた後
に、抗原抗体反応が正常に進行することを確認すること
によって、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを選別する。

【００１２】こうして得られた、目的のモノクローナル
抗体を分泌する本発明のハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することができ、また液体窒素等の中で容易
に長期間保存することができる。ハイブリドーマを培養
する培地としては、ハイブリドーマに適した任意の培地
を用いることができ、好適にはイスコフ改変ＤＭＥＭ
（ＩＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培
地が用いられる。ハイブリドーマの培養は、イン・ビト
ロの場合、例えば培地中で５％二酸化炭素濃度及び３７
℃で培養し、またイン・ビボの場合には例えばマウスの
腹腔中で培養するのが好ましい。

【００１３】前記のハイブリドーマを常法によって培養
した培養液から、あるいはハイブリドーマを投与した適
当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、
目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製すること
が可能である。培養液又はマウスの腹水からモノクロー
ナル抗体を分離、精製する場合にはタンパク質の単離、
精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能であ
る。そのような方法としては硫安塩析、イオン交換クロ
マトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロ
マトグラフィー、プロテインＡ又はプロテインＧ結合多
糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、
凍結乾燥の方法等がある。こうして得られた本発明のモ
ノクローナル抗体は、前記一般式（Ｉ）で表されるジフ
ェニルエーテル誘導体の少なくとも１種、特には、Ａ
Ｆ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、ＯＸＹ又はＢＦＸの少なく
とも１種に特異的に結合することができる。

【００１４】本発明による、前記一般式（Ｉ）で表され
るジフェニルエーテル誘導体（以下、単にジフェニルエ
ーテル誘導体と称する）の検出方法は、前記の本発明の
モノクローナル抗体（即ち、ジフェニルエーテル誘導体
に特異性を示すモノクローナル抗体）を用いて実施する
ので、ジフェニルエーテル誘導体を正確に検出すること
ができる。また、本発明検出方法の好ましい態様では、
有機溶媒耐性モノクローナル抗体を用いるので、検査対
象のジフェニルエーテル誘導体を充分に溶解することの
できる量の有機溶媒を含有する有機水性系中で正確な抗
原抗体反応を進行させることができる。

【００１５】本発明方法は、前記ジフェニルエーテル誘
導体（特には、ＡＦ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、ＯＸＹ又
はＢＦＸ）の少なくとも１種に特異性を示すモノクロー
ナル抗体を用いること、そして好ましくは有機溶媒耐性
抗体を用いること（従って、有機溶媒の存在下で抗原抗
体反応を実施すること）を除けば、それ以外の点では従
来公知の免疫学的検出方法にそのまま適用することがで
きる。検出方法には、例えば、前記ジフェニルエーテル
誘導体に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に耐
性を有する抗体を直接標識して、固相化した前記ジフェ
ニルエーテル誘導体及び試料中の前記ジフェニルエーテ
ル誘導体と競合反応させる、通常、抗体標識法の内、直
接競合法と呼ばれるものや、或いは、上記抗体を固相化
し、標識化した前記ジフェニルエーテル誘導体及び試料
中の前記ジフェニルエーテル誘導体と競合させる、通
常、抗原標識法と呼ばれるものなどがあるが、本発明方
法を、通常、抗体標識法の内、間接競合法と呼ばれる検
出法について以下に説明する。

【００１６】本発明方法は、具体的には例えば土壌中等
に存在する、前記ジフェニルエーテル誘導体（特には、
ＡＦ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、ＯＸＹ又はＢＦＸ）を検
出する場合、 （１）前記ジフェニルエーテル誘導体と生体高分子（例
えば、牛血清アルブミン又は免疫グロブリン等）との結
合体を固相化する工程 （２）試料を有機溶媒（特には、水混和性有機溶媒）で
処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、 （３）前記ジフェニルエーテル誘導体に対して特異性を
有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体
と、前記有機溶媒抽出液並びに固相化した前記結合体と
を接触させる工程、 （４）固相化した前記結合体と結合した前記抗体と、試
料中の前記ジフェニルエーテル誘導体と結合した前記抗
体とを分離する工程、（５）標識を有する第２抗体（例
えば、抗マウスＩｇＧ抗体）を、固相化した前記結合体
と結合した前記抗体と接触させる工程、 （６）前記抗体と結合した標識化抗体と、前記抗体と結
合していない標識化抗体とを分離する工程、 （７）前記工程（６）で分離したいずれか一方、好まし
くは前記抗体と結合した標識化抗体が有する標識からの
信号を検出する工程を含む、試料中の前記ジフェニルエ
ーテル誘導体（特には、ＡＦ、ＡＦＭ、ＡＦ−ＮＨ₂ 、
ＯＸＹ又はＢＦＸ）の検出方法からなる。

【００１７】なお、水試料中の前記ジフェニルエーテル
誘導体を測定する場合は、（２）の工程は省略され、前
記ジフェニルエーテル誘導体に対して特異性を有する
（有機溶媒耐性を有する必要はない）抗体を用い、試料
を直接前記抗体並びに固相化した前記結合体と接触させ
ることができる。前記ジフェニルエーテル誘導体と結合
体を形成する生体高分子としては、前記の他に、例え
ば、オバルブミンやヘモシアニン等も用いることができ
る。

【００１８】本発明で用いる有機溶媒は、アルコール類
又はケトン類であって、検査対象の試料から前記ジフェ
ニルエーテル誘導体を抽出する際に用いる溶媒である。
水混和性の有機溶媒を用いると、有機水性溶媒で抽出工
程を行ったり、場合により有機溶媒抽出液を水で適当に
希釈してから、抗原抗体反応を有機水性溶媒中で実施す
ることができるので好ましい。有機溶媒としては、例え
ば、アルコール化合物（例えば、炭素原子１〜３個の低
級アルコール、特には、メチルアルコール、エチルアル
コール、イソプロピルアルコール）、ケトン化合物（例
えば、炭素原子３〜５個の低級脂肪族ケトン、特には、
メチルエチルケトン、アセトン又はジエチルケトン）あ
るいはこれらの混合物を挙げることができる。本発明方
法では、前記ジフェニルエーテル誘導体を含有するおそ
れのある任意の試料を検体として用いることができる
が、例えば、土壌、農作物、食品、あるいは水田水、河
川や池、沼等の水等を挙げることができる。

【００１９】本発明の検出方法を具体的に実施する際
（特には土壌を試料として用いる場合）には、最初に試
料を前記の有機溶媒で抽出する。得られた有機抽出液を
そのまま又は水で希釈して次の接触工程に用いる。例え
ば、マウスモノクローナル抗ジフェニルエーテル誘導体
抗体であって、有機溶媒に対し耐性を有する抗体と、固
相化した前記ジフェニルエーテル誘導体−牛血清アルブ
ミン結合体と、前記有機溶媒抽出液とを接触させると、
その有機溶媒抽出液に前記ジフェニルエーテル誘導体
（抗原）が存在する場合には、有機溶媒存在下で競合的
に抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、有機溶
媒存在下で実施することを除けば、通常の抗原抗体反応
と同様に行うことができる。また、水試料の場合には、
これを直接、抗体及び固相化した前記結合体と接触させ
ることにより、競合的抗原抗体反応が起きる。

【００２０】本発明方法を実施する場合には、既知量の
標識化第２抗体を用いて前記ジフェニルエーテル誘導体
の存在の確認又は定量を行うことができる。抗体の標識
には、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、
³²Ｐ、³⁵Ｓ、 ³Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ）、ビタミン（例えば、
ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光
物質（例えば、アクリジニウム）を用いることができ
る。

【００２１】標識化第２抗体は、前記抗体と有機溶媒抽
出液と固相化ジフェニルエーテル誘導体−牛血清アルブ
ミン結合体との接触工程が終了してから（即ち、前記抗
体と有機溶媒抽出液中並びに固相抗原との抗原抗体反応
が終了してから）反応系に加えることができる。前記抗
体（第１抗体）を前記有機溶媒抽出液及び固相化した前
記結合体と接触させた後、固相化抗原と結合しなかった
第１抗体を洗浄除去してから標識化第２抗体を加える
と、第１抗体と固相化抗原との複合体に対して標識化第
２抗体が結合する。

【００２２】本発明方法では、第１抗体、前記抽出液中
の前記ジフェニルエーテル誘導体及び固相化した前記結
合体との反応が終了した後で、固相化した前記結合体に
結合した第１抗体を分離する。分離は、例えば、濾過、
遠心処理又は緩衝液による洗浄によって行うことができ
る。更に、固相化した前記結合体に結合した第１抗体と
標識化第２抗体との反応が終了した後で、第１抗体と結
合しなかった標識化第２抗体を除去し、続いて、第１抗
体と結合した標識化第２抗体の標識からの信号を検出又
は測定する。

【００２３】こうして分離した第１抗体と結合した標識
化第２抗体の標識に由来する信号を検出又は測定する。
信号を検出又は測定する際には、標識化第２抗体を含む
反応系を信号検出又は信号測定に好ましい条件に変える
のが好ましい。例えば、標識として蛍光又は化学発光物
質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を検
出又は測定する。

【００２４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作
成 ５−｛２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノ
キシ｝−２−ニトロ安息香酸２５ｍｇを無水ジオキサン
２ｍｌに溶解した後、Ｎ−メチルモルホリン５０μｌを
添加し、１０℃で２０分間攪拌した。イソブチルクロロ
カーボネイト２０μｌを少しずつ添加し１５分間攪拌し
た。一方、牛血清アルブミン８０ｍｇを蒸留水４．３ｍ
ｌに溶解した後、１ＮのＮａＯＨでｐＨ９．５に調整
し、更に１０℃でジオキサン２．６ｍｌを滴下した。こ
の牛血清アルブミン溶液に、先に調製したＡＦ溶液を１
ＮのＮａＯＨでｐＨ９に保ちながら徐々に滴下し、４℃
で４時間反応させた後、蒸留水に対して透析した。こう
して得たＡＦと牛血清アルブミンとの結合体を免疫原及
び分析用抗原として用いた。

【００２５】免疫原は、牛血清アルブミン量として１０
０μｇを、ダルベコのＰＢＳ（−）（以下ＰＢＳともい
う）５０μｌに溶解し、等量のフロイントの完全アジュ
バントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下接種し
た。１ケ月後及び２ケ月後にそれぞれ前記の量の１／５
量を追加免疫した。

【００２６】血清中の抗ＡＦ抗体の力価が高くなったマ
ウスの脾臓を摘出し、ＩＭＥＭ培地によりシャーレ内で
摘出脾臓を３回洗浄した後、注射針で傷を付けてから、
絞り出すようにして単細胞の懸濁液を調製した。単細胞
懸濁液をメッシュで濾過して大きな固形物を除いた。得
られた濾液に、マウスのミエローマ細胞Ｐ３Ｘ−６３−
Ａｇ８−６を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾
臓細胞）になるように混ぜ、遠心（３００×ｇ，４分）
して細胞を集めた。次に、ＩＭＥＭ培地に前記の沈殿細
胞を再懸濁し、同じ条件で遠心し、遠心管を指で弾いて
沈渣を攪拌してから、３７℃に暖めておいた５０％ポリ
エチレングリコール（分子量1,500 ）溶液１ｍｌを、遠
心管を回転させながら、６０秒かけてゆっくり加えた。
細胞融合の停止は、細胞融合が進行している遠心管に、
ＩＭＥＭ培地１０ｍｌを１ｍｌ当たり３０秒かけて添加
した後、牛胎児血清１ｍｌを添加することにより行っ
た。添加が終了した後に遠心し、得られた細胞を細胞数
が５×１０⁵ 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地に懸濁し
た。この細胞懸濁液を９６穴のプラスチックプレートに
１００μｌ／ウエルの量で分注して、３７℃にて５％二
酸化炭素−９５％空気の気相で１０日間から１４日間培
養した。培養液中の抗ＦＡ抗体の活性を調べ、目的とす
る抗体を産生しているウエルの細胞について、９６穴の
プラスチックプレートで、ＨＴ培地を用い、限界希釈法
によりハイブリドーマのクローニングを行った。クロー
ニングした結果、抗ＡＦ抗体を産生しているハイブリド
ーマ（融合細胞）１８株を得た。

【００２７】実施例２：モノクローナル抗体の調製 実施例１で選抜したハイブリドーマ１８株の各々を、Ｉ
ＭＥＭに１０％牛胎児血清を含む培地で培養し、その遠
心上清を抗体溶液とした。

【００２８】実施例３：モノクローナル抗体の選定 作成した１８株のハイブリドーマに由来するモノクロー
ナル抗体は、その培養上清をＰＢＳで段階希釈して抗原
固相化ＥＬＩＳＡ法により反応性を調べた。即ち、９６
穴マイクロプレートにＡＦ−牛血清アルブミン結合体
（４．０μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルの量でコー
トし、３％スキムミルクでブロッキングした後、上記の
抗体希釈液を１００μｌ／ウェルで添加して１時間反応
させた。更に、ウェルを洗浄した後、パーオキシダーゼ
を結合した抗マウスイムノグロブリン（ウサギ抗体）を
１００μｌ／ウェルの量で添加して反応させ、再び洗浄
した後、最後に３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢＺ）発色試薬（ＴＭＢＺ１ｍｇをｐＨ
５．０の０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌに溶解
し、更に３％過酸化水素２０μｌを添加して調製）を１
００μｌ／ウェルで加え、１０分間反応させて発色させ
た。その後直ちに等量の１Ｎ硫酸を添加して反応を停止
し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。この結果、各モ
ノクローナル抗体間でＡＦ−牛血清アルブミン結合体と
の反応性に差異が見られた。その結果を表１に示す。表
１のハイブリドーマ株名、即ちモノクローナル抗体名に
続く（ ）内は、マウスＩｇＧサブクラス識別用ビオチ
ン標識抗体（Ｉｇ、ＩｇＭ、ＩｇＧ₁ 、ＩｇＧ_2a、Ｉｇ
Ｇ_2b、ＩｇＧ₃ 、ＩｇＡ、λ型Ｌ鎖、κ型Ｌ鎖）を用い
てＥＬＩＳＡ法で調べた各モノクローナル抗体のサブク
ラスを示している。

【００２９】

【表１】 分離したモノクローナル抗体の反応性 モノクローナル抗体 反応性 モノクローナル抗体 反応性 AF 9- 58(IgG₁） ＋＋＋ AF 83-162(IgG₁） ＋＋ AF 19- 11(IgG_2a ) ＋ AF 86-182(IgG_2a ) ＋＋ AF 31- 87(IgG_2b ) ＋ AF 88- 15(IgG₁） ＋＋＋ AF 40- 91(IgG₁） ＋＋＋ AF110- 31(IgG₁） ＋＋＋ AF 51- 7(IgG₁） ＋＋＋ AF135- 38(IgG₁） ＋＋＋ AF 62-117(IgG_2b ) ＋＋ AF138- 48(IgG_2b ) ＋ AF 66-135(IgG_2a ) ＋＋＋ AF141- 38(IgG_2b ) ＋＋ AF 75-144(IgG₁） ＋＋＋ AF149- 64(IgG₁） ＋ AF 81-159(IgG₁） ＋＋＋ AF151- 67(IgG₁） ＋＋＋ ＋：反応性小、 ＋＋：反応性中、 ＋＋＋：反応性大

【００３０】また、前記の培養上清をメチルアルコール
と等量混合してから、前記と同様に反応させ比較したと
ころ、各ハイブリドーマ株の産生するモノクローナル抗
体間のメチルアルコールに対する耐性に差異が確認され
た。結果を表２に示す。

【００３１】

【表２】 分離したモノクローナル抗体の５０％メチルアルコール耐性 耐性の程度（％） 株数 ０〜 ３０ ２ ３０〜 ７０ ５ ７０〜１００ １１

【００３２】そこでＡＦ−牛血清アルブミン結合体との
反応性が＋＋＋であり、且つ５０％メチルアルコールへ
の耐性度が７０％以上のモノクローナル抗体（７種）に
ついて、間接競合ＥＬＩＳＡを用いてＡＦによる阻害の
程度を調べたところ、特にハイブリドーマＡＦ８３−１
６２株の産生する抗体が最も強く反応を阻害することが
確認され、以後このハイブリドーマＡＦ８３−１６２株
が産生するＡＦ８３−１６２抗体を用いてＡＦの検出を
実施した。

【００３３】実施例４：間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＡ
Ｆの測定 免疫原と同様に調製したＡＦ−牛血清アルブミン結合体
を０．１μｇ／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳに溶解
し、９６穴のポリスチレンプレートに１００μｌ／ウェ
ルで添加した後、４℃で１晩静置した。次に３％スキム
ミルク溶液２５０μｌ／ウェルで置き換え、室温で１時
間ブロッキングした。このウェルを、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を添加したＰＢＳ（以下洗浄液ともいう）で洗
浄した。次に、各種濃度のＡＦを含む０％〜６０％のメ
チルアルコール溶液をサンプル溶液として加え、更にＡ
Ｆ８３−１６２株の培養上清の希釈液（培養上清を洗浄
液で３２０倍に希釈）を加えて攪拌し、室温で１時間反
応した。再び洗浄液で３回洗浄してから、洗浄液で１０
００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ
抗体（ダコ社製）を１００μｌ／ウェルで加え、１時間
反応した。洗浄液で３回洗浄した後、上記抗原固相化Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【００３４】この間接競合ＥＬＩＳＡ法を用い、０％〜
６０％のメチルアルコール溶液をサンプル溶液として各
々測定したＡＦの阻害曲線を図１（図中に示したメチル
アルコールの濃度は、抗体との反応時の最終濃度）に示
す。ＡＦ８３−１６２株の産生する抗体は、メチルアル
コール濃度の上昇と共に、ＡＦの検出感度は低下する
が、ＡＦ無添加サンプルの場合には、メチルアルコール
の最終濃度が２５％まで、０％と変わらぬ吸光度を維持
した。従って、図１から明らかなように、ＡＦの検出限
界は、例えばＡＦを水系緩衝液に溶解したサンプルの場
合には約５ｎｇ／ｍｌまでであり、５０％メチルアルコ
ールに溶解したサンプルの場合でも約１００ｎｇ／ｍｌ
となった。

【００３５】実施例５：回収率試験 所定濃度のＡＦを水道水又は水田水（３種）に添加して
調製したサンプル溶液５０μｌを用い、前記実施例４に
示した方法で吸光度を測定した。同時に５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下トリス緩衝液ともい
う）に溶解した既知濃度のＡＦを標準液として同様の測
定を行い、回収率を求めた。結果を表３に示す。回収率
は８８．８〜１０８．８％と良好な結果が得られた。

【００３６】

【表３】 水系サンプル中に添加したＡＦの回収率 水 ＡＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ） 回収率（％） 添加濃度 回収濃度 水道水 ８．０ ８．７ １０８．８ １６．０ １６．９ １０５．６ 水田水（Ａ） ８．０ ７．３ ９１．３ １６．０ １７．３ １０８．１ 水田水（Ｂ） ８．０ ７．１ ８８．８ １６．０ １５．５ ９６．９ 水田水（Ｃ） ８．０ ７．８ ９７．５ １６．０ １６．５ １０３．１

【００３７】また、水田土壌（２種）中に添加したＡＦ
の回収率を求めた。まず、メチルアルコールで溶解した
所定濃度のＡＦを土壌中に添加した後、土壌の２倍量の
メチルアルコールを加えた。１Ｎ塩酸でｐＨ３に調整し
た後、室温で１時間攪拌してＡＦを抽出した。抽出物
を、メチルアルコールの最終濃度が５０％となるように
メチルアルコールとトリス緩衝液で５倍に希釈し、更に
５０％メチルアルコールで２倍希釈してサンプル溶液を
調製した。このサンプル溶液を用い、前記実施例４に示
した方法で吸光度を測定した。同時に５０％メチルアル
コールに溶解した既知濃度のＡＦを標準液として同様の
測定を行い、回収率を求めた。結果を表４に示す。回収
率は８４．５〜１０５．０％と良好な結果が得られた。

【００３８】

【表４】 水田土壌中に添加したＡＦの回収率 土壌 ＡＦ濃度（μｇ／ｇ） 回収率（％） 添加濃度 回収濃度 土壌（Ａ） ２．０ ２．１ １０５．０ ２０．０ １６．９ ８４．５ 土壌（Ｂ） １０．０ ８．９ ８９．０

【００３９】

【発明の効果】従来のジフェニルエーテル誘導体の検出
では、主に必要によりカルボン酸をメチルエステル化し
た後、ガスクロマトグラフィーを用いて測定する方法が
採用されていたが、その分析には相当の時間と手間を要
していた。また、特願平４−２４４５３９号明細書に記
載の兎ポリクローナル抗体によるジフェニルエーテル誘
導体の測定法は、検出限界が１００ｎｇ／ｍｌなのに対
して、本発明方法の検出限界は５ｎｇ／ｍｌとなり、感
度を２０倍も上昇させることができた。また、有機溶媒
に耐性を有する抗体を用いることにより、有機溶媒中で
のジフェニルエーテル誘導体の測定が可能となり、抽出
溶媒をそのまま測定に供することができる。従って、高
精度の免疫学的測定方法を使用すると同時に、試験操作
の大幅な簡略化と試験時間の短縮が可能となり、多量の
検体を迅速に試験することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のモノクローナル抗体が各種濃度のメチ
ルアルコールにおいてＡＦ競合反応に与える影響を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｇ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１）： 【化１】 で表されるジフェニルエーテル誘導体に特異的なモノク
   ローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
   いることを特徴とする、請求項１記載の一般式（１）で
   表されるジフェニルエーテル誘導体の免疫学的検出方
   法。