JP3576184B2 - 下痢性貝毒特異的モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び下痢性貝毒検出方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそのモノクローナル抗体を用いる下痢性貝毒の検出方法に関する。本発明による前記モノクローナル抗体は、特には、有機溶媒耐性抗体である。
【0002】
【従来の技術】
オカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3(即ち、7−O−アシル−ジノフィシストキシン−1)の4種の下痢性貝毒の内、オカダ酸は黒磯海綿の一種(Halichondria okadai 及び Halichondria melanodocia)が、ジノフィシストキシン−1は渦鞭毛藻 (Dinophysis fortii ) が産生する脂溶性化合物である。また、ジノフィシストキシン−3は、前記ジノフィシストキシン−1が貝の体内で変換されて生成する脂溶性化合物であり、7−O−アシルオカダ酸は合成によって得られたジノフィシストキシン−3の類縁物質である。これらの化合物は、或る任意の時期又は地域の食用二枚貝の中腸腺に蓄積し、貝を毒化する。食中毒の発生件数ではフグに次いで二位であるが、患者数では第一位であり、食品衛生上、大きな問題である。
【0003】
従来、下痢性貝毒の検査法としてはマウスを用いた致死活性測定法が公定法として用いられているが、動物の管理、検出感度、精度及び特異性等の面で問題があった。一方、この検査を、高感度で、簡便かつ短時間に行うことを目的とした手法の開発が試みられている。
【0004】
例えば特開平1−96199号公報には、オカダ酸群に対するモノクローナル抗体及びその製法が開示されている。しかしながら、該抗体は、下痢性貝毒のうち、オカダ酸及びジノフィシストキシン−1に対して特異的に反応する抗体ではあるが、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−3を検出・測定することはできない。また、前記特開平1−96199号公報には、有機溶媒存在下で活性を維持することのできるモノクローナル抗体を得ることに関して一切記載がなく、それを示唆する記載もない。
【0005】
本発明者は、日本における下痢性貝毒による食中毒の主原因はジノフィシストキシン−3であること、及び、前記の各貝毒はいずれも脂溶性物質であるので、被検試料から貝毒成分を抽出するには有機溶媒の使用が避けられず、操作工程を簡略化するには、有機溶媒存在下で免疫反応を行うことが望ましいことに鑑み、前記下痢性貝毒本体のオカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモノクローナル抗体を見出し、PCT/JP92/01021号に開示した。
【0006】
本発明者は、更に、ジノフィシストキシン−3の合成類縁化合物である7−O−アシル−オカダ酸に対する反応性、並びにアルコール類及びケトン類以外の有機溶媒中での反応性、更には前記の4種類の貝毒に対する反応性の比較を目的として鋭意研究したところ、オカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモノクローナル抗体を見出すことに成功し、このモノクローナル抗体を用いると、有機溶媒存在下でも免疫学的に迅速かつ特異的に下痢性貝毒を検出することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【0007】
従って、本発明は、オカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3(即ち、7−O−アシル−ジノフィシストキシン−1)に特異的に反応し、メチルアルコール中ベンゼンの濃度が20%の溶液に耐性を示すことを特徴とする、モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする下痢性貝毒の免疫学的検出方法にも関する。
【0008】
以下、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的検出方法の順に説明する。
本発明によるモノクローナル抗体及びハイブリドーマの調製は常法、例えば、続生化学実験講座、免疫生化学研究法(日本生化学会編)に記載の方法で行うことができる。具体的には、免疫原としては、オカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3に特異的なモノクローナル抗体をもたらすものを任意に用いることができるが、特にはオカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1若しくはジノフィシストキシン−3、又は、これらの塩類、更にはこれらを生体高分子(例えば、ウシ血清アルブミン又は免疫グロブリン)担体に結合させたものを用いるのが好ましい。これらの免疫原溶液を用いて哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ)をイン・ビボ免疫法により免疫する。例えば、免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳化混合し、マウスの皮下に投与する(第1回免疫)。以後、2〜4週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。
【0009】
なお、本明細書で「アシル」とは、芳香族アシル基、及び飽和又は不飽和で、直鎖又は分枝鎖の脂肪族アシル基のいずれでもよく、例えば、炭素数8〜30個、好ましくは8〜24個の飽和又は不飽和脂肪酸(具体的には、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸又はリノレン酸など)から誘導されるアシル基である。
【0010】
細胞融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細胞(骨髄腫細胞)としては、各種の公知の細胞株、例えば、p3(p3/×63−Ag8)[Nature, 256,495−497 (1975)]、p3−U1[Current Topics in Microbiology and Immunology, 81;1−7(1978) ]、NS−1[Eur. J. Immunol., 6;511−519(1976) ]、MPC−11[Cell,8;405−415(1976) ]、SP2/0[Nature, 276;269−270(1978) ]、FO[J. Immunol. Meth., 35;1−21(1980)]、×63.6.55.3[J.Immunol., 123;1548−1550(1979) ]、S194[J. Exp. Med., 148;313−323(1978) ]、又はラットにおけるR210[Nature, 277; 131−133(1979)]などを使用することができる。
【0011】
細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融合促進剤(ポリエチレングリコールなど)及び場合により補助剤(ジメチルスルホキシドなど)を用いて行うことができ、使用比率も常法と同様に、例えば、脾臓細胞に対してミエローマ細胞を約1〜10倍程度の量で用いる。融合用培地としては、例えば、40%(w/v)ポリエチレングリコールを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって行う。
【0012】
続いて、選別用培地(例えば、HAT培地)を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体(即ち、オカダ酸と7−O−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−1とジノフィシストキシン−3とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体)産生の有無を、例えばELISA法によって検出・測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。特に、有機溶媒に対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する場合には、各種濃度で前記有機溶媒を含む有機水性溶液ないし無水有機溶媒中に抗体を入れた後、下痢性貝毒を添加し、抗原抗体反応が正常に進行することを確認することによって、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。
【0013】
こうして得られた、目的のモノクローナル抗体を分泌する本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素等の中で容易に長期間保存することができる。ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地を用いることができ、好適にはDMEMにウシ胎児血清、L−グルタミン、L−ピルビン酸及び抗生物質(ペニシリンGとストレプトマイシン)を含む培地が用いられる。ハイブリドーマの培養は、イン・ビトロの場合には例えば培地中で5%二酸化炭素濃度及び37℃で約3日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合には約14日間程度実施するのが好ましい。
【0014】
前記のハイブリドーマを常法によって培養した培養液から、あるいはハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物(例えばマウス又はラット)の腹水から、目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製することが可能である。培養液又はマウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインA又はプロテインG結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥の方法等がある。
【0015】
本発明による下痢性貝毒検出方法は、前記の本発明のモノクローナル抗体(即ち、オカダ酸と7−O−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−1とジノフィシストキシン−3とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体)を用いて実施するので、下痢性貝毒を漏れなく検出することができる。また、本発明検出方法の好ましい態様では、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を用いるので、検査対象の下痢性貝毒を充分に溶解することのできる量の有機溶媒を含有する有機水性系(又は無水有機系)中で正確な抗原抗体反応を進行させることができる。
【0016】
本発明方法は、オカダ酸と7−O−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−1とジノフィシストキシン−3とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体を用いること、そして好ましくは有機溶媒耐性抗体を用いること(従って、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施すること)を除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的検出方法にそのまま適用することができる。従って、本発明方法は、具体的には例えば、
(1)試料を有機溶媒(例えば、水混和性有機溶媒)で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、
(2)下痢性貝毒に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体と、前記有機溶媒抽出液を接触させる工程、
(3)標識を有する既知量の下痢性貝毒を前記工程(2)と同時又は前記工程(2)の終了後に前記抗体と接触させる工程、
(4)前記抗体と結合した標識化下痢性貝毒と、前記抗体と結合していない標識化貝毒とを分離する工程、
(5)前記工程(4)で分離したいずれか一方の標識化下痢性貝毒が有する標識からの信号を検出又は測定する工程を含む、試料中の下痢性貝毒の検出方法(競合法及び非競合法)からなる。
【0017】
更に、本発明方法の具体的態様としては、例えば
(1)試料を有機溶媒(例えば、水混和性有機溶媒)で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、
(2)下痢性貝毒に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する第1抗体を、不溶性担体に固定させる工程、
(3)下痢性貝毒を含む有機溶媒抽出液を、前記工程(2)の固定化第1抗体に接触させる工程、
(4)前記下痢性貝毒に対して、前記第1抗体とは異なる部位で結合すると共に標識を有する第2抗体を過剰量添加する工程、
(5)第1抗体と下痢性貝毒との複合体上の標識の信号を検出する工程を含む、試料中の下痢性貝毒の検出方法(サンドイッチ法)も含む。本発明は、その他公知の免疫反応検出方法に広く応用することができる。
【0018】
本発明で用いる有機溶媒は、アルコール類、ケトン類、エーテル類又はベンゼンであって、検査対象の試料から下痢性貝毒を抽出、希釈又は保存する際に用いる溶媒である。水混和性の有機溶媒を用いると、有機水性溶媒で抽出工程を行ったり、場合により有機溶媒抽出液を水で適当に希釈してから、抗原抗体反応を有機水性溶媒中で実施することができ、あるいは有機溶媒抽出液をそのまま用いて、無水有機溶媒中あるいは有機水性溶媒中で抗原抗体反応をさせることができるので好ましい。有機溶媒としては、例えば、アルコール化合物(例えば、炭素原子1〜3個の低級アルコール、特には、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール)、ケトン化合物(例えば、炭素原子1〜3個の低級脂肪族ケトン、特には、メチルエチルケトン、アセトン)、エーテル化合物(例えば、炭素原子1〜3個の低級脂肪族エーテル、特には、メチルエーテル、エチルエーテル、m−プロピルエーテル)及びベンゼン、あるいはこれらの混合物を挙げることができる。
【0019】
本発明の検出方法を具体的に実施する際には、最初に食用二枚貝の中腸腺検体を前記の有機溶媒で抽出する。得られた抽出液をそのまま又は水で希釈して次の接触工程に用いる。次に、例えばマウスから得た本発明のモノクローナル抗体であって、有機溶媒に対し耐性を有する抗体を、前記の方法で予め調製しておく。この抗体(サンドイッチ法では第1抗体)と前記有機溶媒抽出液とを接触させると、その有機溶媒抽出液に下痢性貝毒(抗原)が存在する場合には、有機溶媒存在下で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、有機溶媒存在下で実施することを除けば、通常の抗原抗体反応と同様に行うことができる。例えば、抗体を適当な不溶性支持体(ウエル又はラテックス粒子)上に担持させ、有機溶媒抽出液中の抗原と特異的に反応させる。
【0020】
本発明方法を競合法又は非競合法で実施する場合には、既知量の標識化抗原を用いて下痢性貝毒の存在の確認又は定量を行うことができる。また、サンドイッチ法を用いる場合には、過剰量の標識化第2抗体を用いる。貝毒の標識には、公知の標識体、例えば、放射性同位体(例えば、 32 P、 35 S、 3 H)、酵素(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ)、ビタミン(例えば、ビオチン)、蛍光物質(例えば、FITC)、化学発光物質(例えば、アクリジニウム)を用いることができる。
【0021】
標識化抗原は、前記抗体と有機溶媒抽出液との接触工程が終了してから(即ち、前記抗体と有機溶媒抽出液中の抗原との抗原抗体反応が終了してから)(非競合法)、あるいは前記抗体と有機溶媒抽出液との接触工程と同時に(即ち、前記抗体と有機溶媒抽出液中の抗原との抗原抗体反応と同時に)(競合法)、反応系に加えることができる。非競合法では、有機溶媒抽出液中の下痢性貝毒と結合していない抗体が標識化抗原と結合する。一方、競合法では、既知量の標識化抗原と前記有機溶媒抽出液中の未知量の抗原とが拮抗的に抗体と結合する。サンドイッチ法では、第1抗体を前記有機溶媒抽出液と接触させた後、非競合抗原を洗浄除去してから標識化第2抗体を加えると、第1抗体と抗原との複合体に対して標識化第2抗体が結合する。
【0022】
前記の抗体と有機溶媒抽出液との接触工程、及び標識化抗原又は標識化第2抗体の添加工程では、下痢性貝毒の溶解度と標識の不活性化とを考慮して有機溶媒の濃度を選択する。なお、非競合法においては抗原抗体反応を実施する条件と異なる条件下(例えば、水を添加して有機溶媒濃度を低下させるか、あるいは水系に完全に置き換える)で、前記標識化抗原を加えることもできる。一方、競合法では標識化抗原を前記抗原抗体反応と同時に行うので、その反応系に存在する有機溶媒によって標識が不活性化しないようにする必要がある。
【0023】
競合法及び非競合法では、標識化抗原と抗体との反応が終了した後で、抗体と結合した標識化抗原と、抗体と結合しなかった標識化抗原とを分離する。分離は、例えば、濾過、遠心処理又は緩衝液による洗浄によって行うことができる。サンドイッチ法では、第1抗体結合抗原と標識化第2抗体との反応が終了した後で、第1抗体結合抗原と結合しなかった標識化第2抗体を除去し、続いて、第1抗体結合抗原と結合した標識化第2抗体の標識からの信号を検出又は測定する。
【0024】
こうして分離した標識抗原に由来する信号(競合法又は非競合法)、あるいは、第1抗体結合抗原と結合した標識化第2抗体の標識に由来する信号(サンドイッチ法)を検出又は測定する。信号を検出又は測定する際には、標識化抗原を含む反応系を信号検出又は信号測定に好ましい条件に変えるのが好ましい。例えば、ビオチン−標識化アビジンの系を用いた場合には、反応系を水系に変えてから基質を加え、酵素活性を検出又は測定する。また、標識として蛍光又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を検出又は測定する。
【0025】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1:モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成
下痢性貝毒の一種であるオカダ酸(和光純薬)(以下、OAと称す)2mg、N−ヒドロキシサクシニミド0.31mg及びN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド0.57mgをジメチルホルムアミド(以下、DMFと称す)120μlに溶かし、室温で2時間反応させた。得られた反応液を2分割し、一方の反応液39μlにヒトIgG1.5mgを加えて溶解し、他方の反応液81μlにはウシ血清アルブミン(以下、BSAと称す)1.9mgを加えて溶解し、各々を室温で更に2時間反応させた。最後に、得られた反応液のゲル濾過を、リン酸含有生理食塩水(pH7.4)(以下、PBSと称す)で平衡させたセファデックスG−25カラムによって行った。得られたOA−ヒトIgG及びOA−BSAをそれぞれ0.826mg/ml及び1.04mg/mlの濃度で生理食塩水に溶かし、OA−ヒトIgGを免疫原、OA−BSAを分析用抗原として用いた。
OA−IgG溶液300μlに同量のフロインド完全アジュバントを加え、良く混合して均質のゾルを調製した。このゾル200μlを雌マウス(4週令;A/J)の腹腔内に投与した。2ケ月後に、同様に調製した抗原ゾルを同じ量で腹腔内に投与した。
【0026】
血清中の抗OA抗体の力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、5%ウシ胎児血清を含んだT−2培地によりシャーレ内で摘出脾臓を3回洗浄した後、注射針で傷を付けてから、絞り出すようにして単細胞の懸濁液を調製した。単細胞懸濁液をメッシュで濾過して大きな固形物を除いた。得られた濾液に、マウスのミエローマ細胞P3X−63−Ag8−6.5.3を細胞数の比で5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるように混ぜ、遠心(300×g,4分)して細胞を集めた。次に、血清を含まないT−3培地に前記の沈殿細胞を再懸濁し、同じ条件で遠心し、遠心管を指で弾いて沈渣を攪拌してから、37℃に暖めておいた50%ポリエチレングリコール(分子量1,500 )溶液1mlを、遠心管を回転させながら、60秒かけてゆっくり加えた。細胞融合の停止は、細胞融合が進行している遠心管に、血清を含まないT−3培地を3回に分けて添加する(最初は前記培地3ml、次に前記培地9ml、そして最後に前記培地38mlをそれぞれ30秒かけて添加する)ことにより行った。前記培地の添加が終了した後、37℃で2分間、及び室温で8分間保持してから遠心し、得られた細胞を細胞数が1×10 6 /mlになるようにT−2培地に懸濁した。この細胞懸濁液を96穴のプラスチックプレートに100μl/ウエルの量で分注して、37℃にて5%二酸化炭素−95%空気の気相で培養した。24時間後に、T−4培地を100μl/ウエルの量で添加して、更に10日間から14日間、同じ条件で培養を続けた。培養液中の抗OA抗体の活性を調べ、目的とする抗体を産生しているウエルの細胞について、24穴のプラスチックプレートで、HT培地を用い、限外希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行った。クローニングした結果、抗OA抗体を産生しているハイブリドーマ(細胞融合)20株を得た。
【0027】
実施例2:モノクローナル抗体の調製
実施例1で選抜したハイブリドーマ20株の各々を、ペニシリン及びストレプトマイシンをそれぞれ2.5μg/mlずつ含む組織培養用無血清培地セルグロッサーH(ハイブリドーマ用)(住友製薬)で培養した。得られた細胞を同じ培地に懸濁し、抗OA抗体を産生させる目的でミリポアダイナセルカルチャーシステム(ミリポア社)を用いて5%二酸化炭素−95%空気の気相の下で、37℃にて培養した。培養終了後、培養液を硫安分画し、得られたモノクローナル抗体を0.9%NaCl含有5mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶かして透析した。
【0028】
実施例3:モノクローナル抗体の選定
20株のハイブリドーマが産生した各抗OAモノクローナル抗体を用いてELISA用プレートを作成した。即ち、実施例2で調製した抗OAモノクローナル抗体を10μg/mlになるように、0.083M硼酸含有生理食塩水(pH8.0)(以下、BBSと称す)に溶かし、96穴プレートに100μl/ウエルの量で洗浄した後、BBSに溶かしたゼラチン溶液(10mg/ml)250μlを各ウエルに分注し、室温で1時間放置してブロッキングを行った。
一方、水中のメチルアルコール濃度を0%(水)から100%(無水アルコール)まで10%ずつ徐々に変化させて調製したメチルアルコール水溶液のシリーズを調製した。
【0029】
前記の各ELISA用プレートに、前記のアルコール性水溶液100μlを各ウエルに加え、室温に放置した。一時間後に各ウエルをBBS250μlで3回洗浄した。次に、パーオキシダーゼで標識したOA(以下、OA−PODと称す)25〜100ng/mlを含む溶液(1.0%ゼラチンを含むBBS)100μlを各ウエルに加え、室温で一時間放置した。続いて、BBS250μlで5回洗浄してから、基質溶液[3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン100mgをDMF10mlに溶かした溶液100μlを0.1M酢酸ナトリウム溶液(pH5.5)9.9mlで希釈した後、3%過酸化水素水溶液15μlを加えて調製した;以下、TMBZ溶液と称す]100μlを各ウエルに分注し、室温で5〜40分間反応させ、1N硫酸100μlを加えて反応を止めた。反応液の吸光度を450nm又は415nmにて分光光度計(日立分光光度計U−1100)で測定し、検量線を作成した。
【0030】
その結果、ハイブリドーマOA958−2株(FERM P−13404)が産生する抗OAモノクローナル抗体(以下、OA958−2抗体と称す)が100%メチルアルコール中でも正しく抗原を認識して、正常な抗原抗体反応を行うことがわかった。更に、ハイブリドーマOA8−2株(FERM P−13401)が産生する抗OAモノクローナル抗体(以下、OA8−2抗体と称す)、ハイブリドーマOA10−8株(FERM P−13402)が産生する抗OAモノクローナル抗体(以下、OA10−8抗体と称す)、ハイブリドーマOA22−22株(FERM P−13403)が産生する抗OAモノクローナル抗体(以下、OA22−22抗体と称す)が産生する各抗OAモノクローナル抗体についても、50%メチルアルコール中でも正しく抗原を認識して、正常な抗原抗体反応を行うことがわかった。前記4種類の抗OA抗体の免疫グロブリンクラスをマウスIgGサブクラス識別用ビオチン標識抗体(Ig、IgM、IgG1 、IgG2a、IgG2b、IgG3 、IgA、λ型L鎖、κ型L鎖)を用いてELISA法で調べたところ、OA958−2抗体はIgG 1κ、OA8−2抗体はIgG2aκ、OA10−8抗体はIgG 1κ、そしてOA22−22抗体はIgG2aκであった。
【0031】
実施例4:非競合法による下痢性貝毒の測定
非競合法により、OA、7−O−パルミトイル−オカダ酸(以下、7−OAと称す)、ジノフィシストキシン−1(以下、DTX1と称す)及びジノフィシストキシン−3(7−O−パルミトイル−DTX1)(以下、DTX3と称す)の標準品を測定した。使用したELISA用プレートはそれぞれOA958−2抗体、OA8−2抗体、OA10−8抗体、そしてOA22−22抗体を用いて、実施例3に記載した条件下に調製した。標準試料溶液は、実検体からの抽出操作を考慮し、下痢性貝毒の100%メチルアルコール溶液を一度乾固させた後、各々の濃度のメチルアルコールを含むBBSに再溶解する方法で調製して用いた。
【0032】
前記OA958−2抗体を担持したELISA用プレートを用いて、実施例3に記載した非競合法によりOA、7−OA、DTX1及びDTX3の標準品を測定した。メチルアルコール濃度を20%刻みで0%から100%までの6段階について調べ、検量線を作成し、結果を図1〜図4に示した。メチルアルコールに換えてアセトンを用いて、アセトン濃度を20%刻みで0%から70%までの5段階について調べ、検量線を作成し、結果を図5〜図8に示した。
また、前記OA8−2抗体、OA10−8抗体及びOA22−22抗体をそれぞれ担持したELISA用プレートを用いて、実施例3に記載した非競合法によりOA、7−OA、DTX1及びDTX3の標準品を測定した。メチルアルコール濃度30%における検量線を作成し、結果を図9〜図11に示した。
更に、OA958−2抗体を担持したELISA用プレートを用いて、実施例3に記載した非競合法により、無水有機溶媒系でOA標準品を測定した。メチルアルコール中のエチルアルコール濃度を0%及び70から100%までの5段階、メチルアルコール中のアセトン、エチルエーテル、ベンゼンの濃度を各々0から50%までの5段階について調べ、検量線を作成し、結果を図12〜図15に示した。
【0033】
OA958−2抗体を用いた非競合法によるメチルアルコール中での測定結果によれば、メチルアルコール濃度が高くなるに従い抗体活性は徐々に低下するものの、100%メチルアルコール中でも、OA、7−OA、DTX1及びDTX3のすべてについて十分に測定可能であった。各々の測定感度は、20%メチルアルコールではOAが0.1ng/ml、7−OAが1.0ng/ml、DTX1が0.3ng/ml、DTX3が1.0ng/mlであった。また100%メチルアルコールではOAが10ng/ml、7−OAが30ng/ml、DTX1が30ng/ml、DTX3が30ng/mlであった。また、OA、7−OA、DTX1及びDTX3に対するOA958−2抗体の反応性の比は、60%メチルアルコールでは1:0.3:1:0.2であり、80%メチルアルコールでは1:0.3:0.6:0.3であるが、100%メチルアルコールでは1:0.8:2:1.4となり、メチルアルコール濃度が増すにつれ反応性の差は少なくなった(図1〜図4)。
【0034】
OA958−2抗体を用いた非競合法によるアセトン中での測定結果によれば、メチルアルコールと同様にアセトン濃度が高くなるに従い抗体活性は徐々に低下し、70%アセトン中ではDTX3が多少の影響を受けるものの、測定は可能であった。その他のOA、7−OA及びDTX1は共に十分測定可能であった。アセトン濃度が70%を越えるとELISA用プレートの材質が変化するため測定不可能であった。各々の測定感度は、10%アセトンではOAが0.3ng/ml、7−OAが1.0ng/ml、DTX1が1.0ng/ml、DTX3が3.0ng/mlであった。また70%アセトンではOAが10ng/ml、7−OAが30ng/ml、DTX1が100ng/ml、DTX3が30ng/mlであった。また、OA、7−OA、DTX1及びDTX3に対するOA958−2抗体の反応性の比は、アセトン濃度による差は余りなく、50%アセトンでは1:0.2:0.5:0.1となり、DTX1及びDTX3に対する反応性が低下する傾向が見られた(図5〜図8)。
【0035】
OA8−2抗体を用いた非競合法による30%メチルアルコール中での測定結果によれば、OAに対する反応性が最も高く、測定感度は3.0ng/mlであった。また7−OA、DTX1及びDTX3に対する反応性は等しく、測定感度は10ng/mlであった(図9)。
OA10−8抗体を用いた非競合法による30%メチルアルコール中での測定結果によれば、DTX1及びDTX3に対する反応性が、OA及び7−OAに対する反応性よりも高かった。測定感度はOAが3.0ng/ml、7−OAが30ng/ml、DTX1が1.0ng/ml、そしてDTX3が1.0ng/mlであった(図10)。
OA22−22抗体を用いた非競合法による30%メチルアルコール中での測定結果は、OA8−2抗体の場合と類似しており、OAに対する反応性が最も高く、他の7−OA、DTX1及びDTX3に対する反応性は、ほぼ等しかった。測定感度はOAが0.3ng/ml、7−OAが3.0ng/ml、DTX1が10ng/ml、そしてDTX3が3.0ng/mlであった(図11)。
【0036】
OA958−2抗体を用いた非競合法によるエチルアルコールとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、エチルアルコール濃度が70%及び80%では、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化が無かった。エチルアルコール濃度が90%及び100%になっても抗体の反応性の低下は僅かであった(図12)。
OA958−2抗体を用いた非競合法によるアセトンとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、アセトン濃度が高くなるに従い、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化は無かった。アセトン濃度が50%を越えるとELISA用プレートの材質が変化するため測定不可能であった(図13)。
OA958−2抗体を用いた非競合法によるエチルエーテルとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、エチルエーテル濃度が高くなるに従い、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化は無かった。エチルエーテル濃度が50%を越えるとELISA用プレートの材質が変化するため測定不可能であった(図14)。
OA958−2抗体を用いた非競合法によるベンゼンとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、ベンゼン濃度が10%以下では、抗体の反応性に変化は無かった。ベンゼン濃度が20%になると抗体の反応性は約2/3、ベンゼン濃度が30%では抗体の反応性は約1/3になり、ベンゼン濃度が50%になると反応性はほぼ完全に失われた。また、ベンゼン濃度が50%になるとELISA用プレートの材質が変化するため測定が非常に困難となった(図15)。
【0037】
【発明の効果】
従来の致死活性測定法には、動物の管理、検出感度や精度及び特異性に問題があり、従来の競合酵素免疫学的測定法にも、下痢性貝毒のうちの7−O−アシル−オカダ酸及びDTX3を検出・測定することができないという問題点があったのに対し、本発明によれば、OA、7−OA、DTX1及びDTX3の4種の下痢性貝毒の全てに特異性を有するモノクローナル抗体が提供されるので、従来の欠点を解消することができる。また、前記モノクローナル抗体が有機溶媒耐性を有する場合には、試料からの有機溶媒抽出液をそのまま又は単に希釈するだけで検出又は測定工程に用いることができるので、検出又は測定工程が簡便になるだけで無く、高精度及び高感度を達成することができる。従って、食品衛生等に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】メチルアルコール濃度0〜100%の溶液中にてOAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図2】メチルアルコール濃度0〜100%の溶液中にて7−OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図3】メチルアルコール濃度0〜100%の溶液中にてDTX1を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図4】メチルアルコール濃度0〜100%の溶液中にてDTX3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図5】アセトン濃度0〜70%の溶液中にてOAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図6】アセトン濃度0〜70%の溶液中にて7−OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図7】アセトン濃度0〜70%の溶液中にてDTX1を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図8】アセトン濃度0〜70%の溶液中にてDTX3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図9】OA8−2抗体を用いてメチルアルコール濃度30%の溶液中で、OA、7−OA、DTX1及びDTX3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図10】OA10−8抗体を用いてメチルアルコール濃度30%の溶液中で、OA、7−OA、DTX1及びDTX3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図11】OA22−22抗体を用いてメチルアルコール濃度30%の溶液中で、OA、7−OA、DTX1及びDTX3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図12】OA958−2抗体を用いてメチルアルコール中エチルアルコールの濃度が0%及び70〜100%の溶液中で、OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図13】OA958−2抗体を用いてメチルアルコール中アセトンの濃度が0〜50%の溶液中で、OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図14】OA958−2抗体を用いてメチルアルコール中エチルエーテルの濃度が0〜50%の溶液中で、OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図15】OA958−2抗体を用いてメチルアルコール中ベンゼンの濃度が0〜50%の溶液中で、OAを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
Claims (5)
- オカダ酸、7−O−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−1及びジノフィシストキシン−3に特異的に反応し、メチルアルコール中ベンゼンの濃度が20%の溶液に耐性を示すことを特徴とする、モノクローナル抗体。
- メチルアルコール中ベンゼンの濃度が30%の溶液に耐性を示す、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号がFERM P−13401、FERM P−13402、FERM P−13403、又はFERM P−13404であるハイブリドーマにより産生される、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、下痢性貝毒の免疫学的検出方法。
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