JP2000191698A - イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、イミダクロプリドのハプテン化合
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、イミダクロ
プリド又はその部分にスペーサーアーム及び結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１−（６−クロロ
−３−ピリジルメチル）−Ｎ−ニトロイミダゾリジン−
２−イリデンアミン（以下、本明細書中「イミダクロプ
リド」と言う）およびその類似化合物のハプテン化合
物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】イミダクロプリドは、以下の式（３）：

【化３】 で表される構造を有する、クロロニコチニル系の殺虫剤
である。速攻的な殺虫活性を示す。より詳しくは、イミ
ダクロプリドはシナプス後膜のニコチン性アセチルコリ
ン受容体に作用し、神経伝達を遮断すると考えられてい
る。本剤に曝露された害虫は従来の有機リン剤やカーバ
メート剤の異常興奮とは異なり、麻痺、弛緩症状を起こ
して死に至る。致死濃度以下でも害虫の摂食、交尾、産
卵、飛翔、歩行などの活動を抑える（農薬ハンドブック
第１１６頁−第１１８頁及び第５３８頁、１９９４年
版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」 第
３５５頁−第３５７頁、農薬残留分析法研究班編集 中
央法規出版）。

【０００４】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。イミダクロプリドについては、環境庁長官個別設定
の農薬登録保留基準値が、例えば、米（０．２ｐｐ
ｍ）、果実（１ｐｐｍ）、野菜、いも類（０．５ｐｐ
ｍ）、茶（５ｐｐｍ）、ピーマン（５ｐｐｍ）と定めら
れている（「最新農薬の残留分析法」 同上）。よっ
て、環境や食品に関する安全確保のためには、農作物、
特に米に含有される、イミダクロプリドの量を迅速かつ
正確に測定することが必要である。

【０００５】従来、例えば農作物中のイミダクロプリド
は、米、果実、野菜、いも類等から抽出し、精製した
後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分
析されてきた。即ち、試料をアセトニトリルで抽出し、
多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣで測定
する方法が採用されている。この方法は、試料の調製が
煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要す
ること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要
とする等の問題点がある。イミダクロプリドの測定は短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。

【０００６】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【０００７】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載
されている。

【０００８】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、イミダクロプリドのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。

【０００９】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１０】このように、イミダクロプリドについて
は、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体
のみならず、抗体を得るために必要なハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イミダクロ
プリドに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１２】本発明はその一態様において、イミダクロ
プリドに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。

【００１３】本発明は、また、イミダクロプリドに反応
性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成する
ハプテン化合物を提供することを目的とする。

【００１４】本発明は、さらに、イミダクロプリドハプ
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。

【００１５】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記イミダクロプリドハプテン
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、イミ
ダクロプリドの免疫学的測定方法を提供することを目的
とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、イミダクロプリド又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、イミダクロプリドの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００１８】本発明の対象となるイミダクロプリドは、
以下の式（３）：

【化４】 で表される構造を有する化合物である。

【００１９】また、本発明の抗体は、式（３）のイミダ
クロプリドにおいて、塩素原子が他のハロゲン原子で置
換されているイミダクロプリド類似化合物を認識するも
のも含む。即ち、本発明の抗体は、以下の式（２）：

【化５】 ［式（２）中、Ｌ¹は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる
グループから選択されるハロゲン原子である］で表され
る構造を有する化合物に反応性を示す抗体である。本明
細書において、「イミダクロプリド」は、文脈により、
式（３）で表されるイミダクロプリドおよび／または式
（２）で表されるイミダクロプリド類似化合物を意味す
る。

【００２０】本発明の抗体は、例えば、イミダクロプリ
ドの部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能
基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合
物と結合させたものを抗原として用いることによって得
ることができる。例えば、以下の式（１）：

【化６】 ［式（１）中、Ａは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂およびＮＨからな
るグループから選択される基であり、；そしてｎは、１
ないし１０の整数である］で表される構造を有する化合
物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。

【００２１】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、イミダクロプリドに
反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化
合物又は該抗体を用いるイミダクロプリドの免疫学的測
定方法に関する。

【００２２】イミダクロプリドハプテンの作製 式（１）で表されるイミダクロプリドハプテンは、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２３】まず、以下の式（Ｘ１）：

【化７】 ［式（Ｘ１）中、Ｌ²はＣｌ、Ｂｒ、およびＩからなる
グループから選択されるハロゲン原子である］で表され
る構造を有する化合物に、有機溶媒中、塩基の存在下、
以下の式（Ｘ２）：

【化８】 ［式（Ｘ２）中、Ｐは、カルボキシル基の保護基であ
り；そしてＡおよびｎは先に定義した通りである］で表
される構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｘ
３）：

【化９】 ［式（Ｘ３）中、Ａ、Ｐおよびｎは先に定義した通りで
ある］で表される構造を有する化合物を得る。

【００２４】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチ
ル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシ
ベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロ
ロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。

【００２５】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは１０℃から１００℃で、５分から１０時間、好ま
しくは３０分から２時間行う。

【００２６】式（Ｘ３）の化合物の合成のための溶媒と
しては、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、
トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、
四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニ
トリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド及び水等を用いることができる。塩基とし
ては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウ
ムエチラート等が挙げられる。

【００２７】次に、式（Ｘ３）の化合物を還元すること
により、以下の式（Ｘ４）：

【化１０】 ［式（Ｘ４）中、Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物を得る。

【００２８】還元反応は、公知の方法を用いて行うこと
ができる。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、酢酸及び水等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、
水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて行う。
反応は、マイナス８０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは
３０分から５時間撹拌して行う。

【００２９】次に、式（Ｘ４）の化合物を、クロロホル
ム、ジクロロメタン等の有機溶媒中、または、ハロゲン
化剤を溶媒としても使用し、塩化チオニル等のハロゲン
化剤と反応させて、以下の式（Ｘ５）：

【化１１】 ［式（Ｘ５）中、Ｌ³は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからな
るグループから選択されるハロゲン原子であり；そして
Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通りである］で表され
る構造を有する化合物を得る。

【００３０】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好まし
くは３０分から３時間行う。

【００３１】次に、式（Ｘ５）の化合物に、有機溶媒
中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ６）：

【化１２】 で表される構造を有する２−ニトロイミノイミダゾリジ
ンを反応させて、以下の式（Ｘ７）：

【化１３】 ［式（Ｘ７）中、Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物を得る。

【００３２】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好まし
くは３０分から３時間行う。

【００３３】式（Ｘ７）の化合物の合成のための溶媒お
よび塩基は、式（Ｘ３）の化合物の合成に用いることが
できるものと、同様のものを用いることができる。

【００３４】さらに、式（Ｘ７）の化合物からＰで表さ
れるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式
（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の
保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公
知の方法で行うことができる。

【００３５】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ
７）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジ
クロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に
溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエ
ーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃か
ら溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５
分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応
させることにより式（１）の化合物を得ることができ
る。

【００３６】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ
７）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、
テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒
に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の
沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１０
時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させること
により式（１）の化合物を得ることができる。

【００３７】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。

【００３８】更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場
合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリ
ド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生
させる試薬によっても行うことができる。

【００３９】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００４０】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４１】イミダクロプリドハプテンと高分子化合物
との結合体の作製 上述のように合成されたイミダクロプリドハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使
用する。

【００４２】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００４３】イミダクロプリドハプテンと高分子化合物
との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡ
ＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅ
ｍ．42 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法
（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954））等の公知の方
法によって行うことができる。

【００４４】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００４５】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは
１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反
応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０
℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５
分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好
ましくは１時間から４時間である。反応温度は各々の融
点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４６】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イミダクロ
プリドハプテンと高分子化合物との結合体を得ることが
できる。

【００４７】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロゲン蟻酸エステルと
の反応により得られ、これを高分子化合物と反応させる
ことにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が
製造される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミ
ン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチル
ホルマリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｄ
ＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナト
リウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マ
イナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃
において行われ、反応時間は５分から１０時間、好まし
くは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高
分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０
℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応
時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間で
ある。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒
としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶
媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチル
エーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等の
エーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸
エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００４８】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をイミダクロプリドハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。

【００４９】ポリクローナル抗体の作製 イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、イミダクロ
プリドハプテン−ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。

【００５０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５１】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、イミダクロプリドと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。

【００５２】本発明においてイミダクロプリドハプテン
と高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた
抗血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におい
て、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でイミダクロプ
リドと反応できる（実施例４、表１）。

【００５３】モノクローナル抗体の作製 イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。

【００５４】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５５】（ａ）免疫用抗原として使用するイミダク
ロプリドハプテンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５６】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラト
リーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二
ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載
されている。

【００５７】以下、本発明のイミダクロプリドに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５８】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５９】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６０】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５,
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５
３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来
の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎ
ａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））
等を使用できる。

【００６１】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００６２】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９
８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的
に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細
胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別
の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法
を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学
５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜
採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の
方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細
胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６３】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６４】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、イミダクロプリドに対する抗体活性
を測定する。

【００６５】さらに、測定によりイミダクロプリドに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００６６】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗イミダクロプリド
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００６７】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６８】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗イミダクロプリドモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗イミダクロプリドモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。

【００６９】以上のようにして得られた抗イミダクロプ
リドモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。

【００７０】抗体によるイミダクロプリドの測定 本発明で使用する抗体によるイミダクロプリドの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７１】イミダクロプリドの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以
下のような手順により行うことができる。

【００７２】（ａ）まず、抗原であるイミダクロプリド
ハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化す
る。

【００７３】（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。

【００７４】（ｃ）これに各種濃度のイミダクロプリド
を含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及
びイミダクロプリドに競合的に反応させて、固相化抗原
−抗体複合体及び、イミダクロプリド−抗体複合体を生
成させる。

【００７５】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のイミ
ダクロプリドの量を決定することができる。

【００７６】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７７】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の
抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１
μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．
０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌが適している。ま
た、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレート
を使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で５０μ
ｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更
に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、
通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。

【００７８】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したイミダクロプリドハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）で表されている化合物でＡまたは
ｎが抗体作製用と相違する抗原を固相化用として用いる
こともできる。さらに、式（１）に含まれない他のイミ
ダクロプリド類似化合物も、固相化抗原として使用する
ことも可能である。

【００７９】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イミ
ダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、イミダクロプリドハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング
剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）］を適量加え、約４℃、室温で、１時間から５時間
インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することによ
り行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例え
ば、ＰＢＳを用いることができる。

【００８０】次いで（ｃ）工程において、イミダクロプ
リドを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びイミダクロプリドと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びイミダクロプリド−抗
体複合体が生成する。

【００８１】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のイミダクロプリドに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【００８２】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液
としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。

【００８３】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光
度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるよう
に希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上
の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、
標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体
は不要である。

【００８４】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からイミダクロプリ
ドの量を算出することができる。

【００８５】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００８６】イミダクロプリドを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のイミダクロプリドを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のイミダク
ロプリドの濃度を算出できる。

【００８７】あるいはイミダクロプリドの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００８８】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。

【００８９】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキ
ングする。

【００９０】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のイミ
ダクロプリドを含む試料に、イミダクロプリドハプテン
と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を
調製する。

【００９１】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。

【００９２】（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検
量線から試料中のイミダクロプリドの量を決定する。

【００９３】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のイミダクロ
プリド並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【００９５】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、イミダクロプリドハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、イミダクロ
プリドを含む試料と混合する。

【００９６】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したイミダクロ
プリドハプテン自体のみならず、式（１）で表される他
のハプテンを用いることもできる。例えば、式（１）で
表される化合物でＡまたはｎが抗体作製用と相違する化
合物を標識競合用として用いることもできる。さらに、
式（１）に含まれない他のイミダクロプリド類似化合物
も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。

【００９７】（ｄ）工程においてイミダクロプリドを含
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、イミダクロプリドと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化担体との複合体が生成す
る。イミダクロプリドを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用するこ
とができる。

【００９８】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からイミダクロプリドの量を算出することが
できる。

【００９９】本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１
−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．３ｎ
ｇ／ｍｌないし５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｎｇ
／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの範囲でイミダクロプリド
を測定できる（実施例７、図１）。

【０１００】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【０１０１】例えば、３３Ｃ３−１−１は上述した間接
競合ＥＬＩＳＡ法においてイミダクロプリドに高い特異
性を示し、類縁化合物にはほとんど反応性を示さない
（実施例６、表２）。

【０１０２】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０３】

【実施例】実施例１ イミダクロプリドハプテンの合成

【化１４】

【０１０４】３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）
プロピオン酸エチル（１）の合成 エタノール２０ｍｌに２−クロロ−５−ホルミルピリジ
ン１.４ｇ（１０ｍｍｏｌ）、チオグリコール酸エチル
１.５ｇ（１１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム１.６ｇ
（１１．５ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に１
時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの
水を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸
エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃
縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し１.７ｇ（収率
７１％）の（１）を得た。

【０１０５】３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジ
ルチオ）プロピオン酸エチル（２）の合成 ３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸
エチル２.０ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を１、４−ジオキサ
ン２０ｍｌに溶解した溶液に、水３ｍｌに溶かした水素
化ホウ素ナトリウム０.３２ｇ（８．４ｍｍｏｌ）の溶
液を１０−１５℃で加え、室温で３０分間撹拌した。反
応混合物を濃縮し、残渣に水４０ｍｌを加え、７０ｍｌ
の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝２：１、次いで酢酸エチル：メタノール １：１）で
精製し、１.４ｇ（収率７０％）の（２）を得た。

【０１０６】３−（５−クロロメチル−２−ピリジルチ
オ）プロピオン酸エチル（３）の合成 ３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジルチオ）プロ
ピオン酸エチル（２）２.２ｇ（９.０ｍｍｏｌ）をクロ
ロホルム５ｍｌに溶解し、この溶液に、塩化チオニル
１.３ｇ（１１ｍｍｏｌ）を１０−１５℃で加え、室温
で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に５％炭
酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌを加え、７０ｍｌの酢
酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水
硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
２：１）で精製し２.３ｇ（収率６４％）の（３）を得
た。

【０１０７】３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリ
ジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオ
ン酸エチル（４）の合成 アセトニトリル１０ｍｌに２−ニトロイミノイミダゾリ
ジン０.８ｇ（６.２ｍｍｏｌ）、３−（５−クロロメチ
ル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（３）１.
６ｇ（６.２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム０.９４ｇ
（６.８ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に２時
間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水
を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エ
チル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮
した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エ
チル）で精製し１.５ｇ（収率６８％）の（４）を得
た。

【０１０８】３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリ
ジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオ
ン酸（５）の合成 エタノール４０ｍｌ中に３−［５−（２−ニトロイミノ
イミダゾリン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］
プロピオン酸エチル（４）１.３ｇ（３.７ｍｍｏｌ）を
含む懸濁液に、水３０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム
０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌
した。減圧下にエタノールを留去し、残渣に水２０ｍｌ
とエーテル３０ｍｌを加え、分配後、水層を希塩酸でｐ
Ｈ５にし、酢酸エチル７０ｍｌで２回抽出した。酢酸エ
チル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エ
チル：メタノール＝１：１）で精製し０.６ｇ（収率５
０％）の（５）を得た。

【０１０９】上記イミダクロプリドハプテン（５）の¹
Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以
下に示す。¹ Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−Ｄ₆ , ４００ ＭＨｚ) δ ２．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）, ３．２９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）, ３．４７（２Ｈ，ｍ，２Ｈ₂）, ３．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）, ４．４２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂）, ７．３１（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）, ７．５８（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ ）,８．４３（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）, ８．９５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ ）, １２（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ ）

【０１１０】実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニン
グ用抗原の作製 免疫原およびスクリーニング用抗原としてイミダクロプ
リドハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を
用いて作製した。

【０１１１】実施例１で作製したイミダクロプリドハプ
テン０.２ｍｍｏｌをＤＭＳＯ１.０ｍＬに溶解し、Ｎ−
ヒドロキシこはく酸イミド０.３ｍｍｏｌ及び１−エチ
ル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
０.３ｍｍｏｌを加え、室温で３.５時間撹拌した。反応
後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に
分離した。

【０１１２】一方、ＢＳＡ５０ｍｇを１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ−０.０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２：以下「ＰＢ
Ｓ」と言う)５.０ｍＬに溶解し、ＤＭＳＯ １.０５ｍＬ
を加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記の上清
０.２５ｍＬを加え、室温にて１６時間反応させた。反
応後、蒸留水にて４℃で透析し、イミダクロプリドハプ
テンとＢＳＡとの結合体（以下、「イミダクロプリドハ
プテン−ＢＳＡ結合体」と言う）を調製し、以降免疫用
抗原として使用した。

【０１１３】また、同様の方法を用いて、イミダクロプ
リドハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「イミダクロ
プリドハプテン−ＲＳＡ結合体」と言う）、および、イ
ミダクロプリドハプテンとＨＲＰとの結合体（以下、
「イミダクロプリドハプテン−ＨＲＰ結合体」と言う）
も作製した。

【０１１４】実施例３ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製
したイミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体１００μ
ｇをＰＢＳ ５０μＬに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に
接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュ
バンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加
免疫した。また、６週間目に１８０μＬのＰＢＳに溶解
した免疫用抗原３０μｇをマウス尾静脈より追加免疫し
た。

【０１１５】実施例４ 抗血清によるイミダクロプリド
の反応性 実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述するように間接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法にてイミダクロプリドを測定し、抗血
清を評価した。

【０１１６】実施例２で調製したイミダクロプリドハプ
テン−ＲＳＡ結合体溶液(０.５μｇ／ｍＬ)を５０μＬ
／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートにコーティ
ングし(２５ｎｇ /５０μｌ/ウェル)、４倍希釈したブ
ロックエース (「ＢｌｏｃｋＡｃｅ」、雪印乳業社製、
コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ)でブロッキングしてアッセイ
用プレートを作製した。これに抗血清１００００倍希釈
液と、各種濃度のイミダクロプリドを含む２０%メタノ
ール溶液とを等量混合し、その５０μＬを各ウェルに入
れ、室温で１時間反応させた。

【０１１７】ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈の
ブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 (Ｔａｇｏ社製)
を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応さ
せた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰ
Ｄ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−
リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間反応させて発色させた。

【０１１８】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を表１に示す。

【０１１９】

【表１】

【０１２０】表１より、イミダクロプリド１０ｎｇ／ｍ
Ｌにおいて阻害反応が認められたことから、用いた抗血
清はイミダクロプリドに対して反応性があることが確認
された。

【０１２１】実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例３に続いて、血清中の抗イミダクロプリド抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(Ｓ
ｐ２/０−Ａｇ１４)とを山下修二らの方法(組織細胞化
学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年)に
従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養し
た。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッキ
ングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清液
をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時
間反応させた。

【０１２２】ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希釈のブ
ロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Ｔａｇｏ社製)を５
０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させ
た。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ
及び０.０２%の過酸化水素を含む０.１Ｍ クエン酸−
リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間発色させた。

【０１２３】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で
加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞(ハイブリドーマ)を選抜した。次に、
各ウェルのイミダクロプリドとの反応性を実施例４に記
載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を
産生している細胞について限界希釈法によりクローニン
グを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗イミ
ダクロプリド抗体を産生する細胞としてクローン化され
た。そのうちの３３Ｃ３−１−１を平成１０年１２月１
７日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で、工業技
術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨
城県つくば市１丁目１番３号）に寄託した。

【０１２４】実施例６ モノクローナル抗体の交差反応
性の評価 実施例５で得られたハイブリドーマ細胞３３Ｃ３−１−
１が産生するモノクローナル抗体を精製し、抗イミダク
ロプリド抗体３３Ｃ３−１−１を得た。（以降、モノク
ローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマと同一
の名称を用いる。）

【０１２５】モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１につ
いて、実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を
用いて、２種類のイミダクロプリド類縁化合物に対する
反応性を検討した。この結果を表２に示す。

【０１２６】

【表２】

【０１２７】表２中、ＩＣ₅₀（ｎｍｏｌ/Ｌ）は、イミ
ダクロプリド等の化合物を添加しない反応溶液の吸光度
に対して吸光度を５０％減少させる反応溶液中の対象化
合物の濃度を示す。また、交差反応率（％）は、（イミ
ダクロプリドのＩＣ₅₀／対象化合物のＩＣ₅₀）×１００
で定義される。イミダクロプリドと類縁化合物の交差反
応率の数値が乖離している程、イミダクロプリドと特異
的に反応する抗体であることを示す。

【０１２８】表２に示したように、モノクローナル抗体
３３Ｃ３−１−１はイミダクロプリドに対しては高い反
応性を示したが、類縁化合物に対しては、ほとんど反応
性を示さなかった。従って、モノクローナル抗体３３Ｃ
−１−１は、イミダクロプリドに対して特異的に反応す
る抗体である。

【０１２９】実施例７ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るイミダクロプリドの測定 実施例５で得られたハイブリドーマ３３Ｃ３−１−１を
マウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られ
た腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーに
よりモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１を精製した。
この３３Ｃ３−１−１抗体を用いて直接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法により、イミダクロプリドの量を測定した。

【０１３０】上記の３３Ｃ３−１−１抗体溶液(１０μ
ｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイク
ロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティング
し、さらに４倍希釈のブロックエース(雪印乳業社製)で
ブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各濃度のイミダクロプリドを含む２０％メタノール
溶液及び実施例２で作製したイミダクロプリドハプテン
−ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μ
Ｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１.５時間反応させ
た。

【０１３１】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ
／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含むクエン
酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬずつ各ウェル
に入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。

【０１３２】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体３３
Ｃ３−１−１は、イミダクロプリドを０.３ｎｇ／ｍＬ
ないし５０ｎｇ/ｍＬの範囲で測定することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３
−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイミダクロ
プリドの測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 鎌田 良雄 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 BA53 DA02 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X AA99Y AB05 BA08 CA25 CA46 4C063 AA01 BB03 CC23 DD12 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA51 DA76 DA86 EA50 FA41 FA72

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ａは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂およびＮＨからなるグループから
   選択される基であり、；そしてｎは、１ないし１０の整
   数である］で表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】ＡがＳであり、そして、ｎが２である、請
   求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載された化合物と高分
   子化合物又は標識物質との結合体。
4. 【請求項４】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
   合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
   用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 ［式（２）中、Ｌ¹は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる
   グループから選択されるハロゲン原子である］で表され
   る構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造するこ
   とを特徴とする、式（２）で表される構造を有する化合
   物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製造方
   法。
5. 【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
   載の抗体又はフラグメント。
7. 【請求項７】モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１であ
   る、請求項５又は６に記載の抗体又はフラグメント。
8. 【請求項８】請求項５ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
9. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で寄託
   されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項５ないし７のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、請求項１もしくは２に記載の化
    合物又は請求項３に記載の結合体を用いることを含む、
    請求項１０に記載の免疫学的測定方法。