CN114591916B

CN114591916B - 一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株、其单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114591916B
Application number: CN202210290949.4A
Authority: CN
Inventors: 钟艺煊; 刘学忠; 王彦红; 杨成根
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114591916A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株、其单克隆抗体及其应用，该细胞株为杂交瘤细胞株G1,于2022年1月12日在中国典型培养物保藏中心注册保藏，保藏编号为CCTCC NO:C202211，本发明提供了一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与抗原亲和力强的优势，基于此建立的吡虫啉间接竞争ELISA检测方法具有较好的灵敏度和特异性，用作吡虫啉残留检测的应用。同时，为吡虫啉ELISA检测试剂盒的制备和吡虫啉胶体金试纸条的制备提供便利。

Description

一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株、其单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于兽药残留检测技术领域，具体涉及到一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株、其单克隆抗体及其应用。

背景技术

吡虫啉为系统性的杀虫剂，属于新烟碱类化合物。其作用于昆虫的中枢神经系统，工作原理是干扰昆虫神经系统中刺激的传递，吡虫啉与昆虫神经元受体的结合比与哺乳动物神经元受体的结合强得多，故对昆虫的毒性大于对哺乳动物的毒性。

目前，针对吡虫啉的检测方法主要以常规仪器检测法为主，这些检测方法操作复杂、样品前处理繁琐，并且依赖专业人员和专业仪器设备，检测过程耗时长、成本高，不利于实际生产应用。

因此，建立一种灵敏度高且操作简便的检测方法对于吡虫啉残留检测意义重大。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，该细胞株为杂交瘤细胞株，于2022年1月12日在中国典型培养物保藏中心注册保藏，保藏编号为CCTCC NO:C202211。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗吡虫啉单克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗吡虫啉单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株G1的细胞株或其传代细胞株分泌产生，所述抗吡虫啉单克隆抗体效价高、特异性好、与抗原亲和力强。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗吡虫啉单克隆抗体在制备检测吡虫啉残留的ELISA检测试剂盒中的应用。

本发明有益效果：

本发明提供了一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与抗原亲和力强的优势，基于此建立的吡虫啉间接竞争ELISA检测方法具有较好的灵敏度和特异性，用作吡虫啉残留检测的应用。同时，为吡虫啉Ci-ELISA检测试剂盒的制备和吡虫啉胶体金试纸条的制备提供便利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例中完全抗原薄层层析色谱法检测图；

图2为本发明实施例中完全抗原SDS-PAGE凝胶电泳结果图；

图3为本发明实施例中完全抗原红外光谱结果图；

图4为本发明实施例中完全抗原紫外光谱结果图；

图5为本发明实施例中完全抗原蛋白浓度测定图；

图6为本发明实施例中小鼠血清抗体效价测定结果图；

图7为本发明实施例中细胞融合结果图；

图8为本发明实施例中腹水蛋白浓度测定结果图；

图9为为本发明实施例中腹水抗体效价测定结果图

图10为本发明实施例中单克隆抗体亚型鉴定结果图；

图11为本发明实施例中最佳封闭液效果图；

图12为本发明实施例中吡虫啉标准竞争曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明提供一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，该细胞株为杂交瘤细胞株G1,于2022年1月12日在中国典型培养物保藏中心注册保藏，保藏编号为CCTCC NO:C202211。

实施例1

本实施例提供一种抗吡虫啉单克隆抗体，由保藏号CCTCC NO:C202211的细胞株或其传代细胞株分泌产生，其基本制备步骤为：

(一)完全抗原的合成

(1)吡虫啉半抗原合成

吡虫啉人工半抗原的合成为现有的方法，此方法为本试验对之前吡虫啉常规人工半抗原合成方法的优化：

称取吡虫啉1.3g于三口烧瓶中，用15mLDMSO溶解，得到A液；

称取KOH 0.45g、3-巯基丙酸0.42g，用5mLDMSO溶解，得到B液；

打开电热套，将A液缓慢升温至100℃；

通入氮气；缓慢向A液中滴加B液，边加边搅拌；100℃保温2h；撤去电热套，待反应体系冷却至室温。

取反应体系，用适量双蒸水溶解，稀盐酸调pH值至3.0；

用二氯甲烷在分液漏斗中萃取，收集下层；

下层用NaHCO₃萃取，收集上层；

上层用乙酸乙酯萃取，收集下层；

下层用稀盐酸调pH值至3.0，用乙酸乙酯萃取，收集上层，产品在上层中。

产品用双蒸水萃取，加入适量无水硫酸钠干燥，用旋转蒸发仪蒸发得到吡虫啉人工半抗原。

(2)吡虫啉免疫原的制备(吡虫啉与BSA偶联)

取18mg吡虫啉半抗原溶解在1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；

加入10.3mg的二环己基碳二亚胺(DCC)和5.8mg的N-羟基琥珀先亚胺(NHS)；

加入9mg4-二甲胺基吡啶(DAMP)；

室温下搅拌反应过夜；

反应结束后将反应液4000r/min离心10min后吸取上清液400μL，缓慢滴加到4mL20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲液(0.05moL/L，pH 9.0)；搅拌反应6h。

采用薄层层析色谱法对完全抗原合成过程进行检测，结果见图1。其中，A:反应物+BSA；B:DCC；C:NHS；D:产品+DMSO，结果显示：加入BSA之后，反应物迁移率改变，且在相同展开剂中与DCC、NHS迁移率不同，说明有新物质生成。

将处理好的透析袋用双蒸水清洗3遍后排空袋内的空气和水分；装入反应液，约为透析袋的1/3。将2L烧杯中加入大转子和提前预冷好的PBS，放入4℃冰箱透析3d(6-8h更换一次透析液)。透析结束后，得到吡虫啉完全抗原(IMI-BSA)，分装保存于-20℃冰箱中。

(3)吡虫啉包被原的制备(吡虫啉与OVA偶联)

为了避免载体蛋白之间发生交叉反应，在合成IMI-BSA的同时，合成IMI-OVA作为包被抗原用于后续Ci-ELISA试验中检测IMI-BSA的免疫情况。

除了将BSA更换为OVA外，其余步骤与制备IMI-BSA相同。

(4)完全抗原的鉴定

采用薄层析色谱法、SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色法、红外光谱法和紫外光谱法，鉴定IMI-BSA抗原是否合成成功，结果见图2～图4。图2中M:Marker；1:完全抗原；2:载体蛋白，结果显示：高温还原后因抗体二硫键断裂，会出现两个条带，一条为重链，约为50kDa；一条为轻链，约为25kDa，表明抗体纯化成功。

图3为本发明实施例中完全抗原红外光谱结果图，其中，(a)为BSA，(b)为IMI-BSA，结果显示：BSA与IMI-BSA拥有相似峰，但是，偶联产物的特征吸收峰发生了明显的红移，初步判定人工抗原合成成功；

图4为本发明实施例中完全抗原紫外光谱结果图，结果显示：吡虫啉半抗原的最大吸收波长为268nm，BSA与半抗原偶联后，两者的峰叠加并位移至274nm，说明吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联成功。

(5)完全抗原蛋白浓度的测定

采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测完全抗原蛋白浓度，结果见图5，其中，(a)为BSA，(b)为IMI-BSA。结果显示：根据标准曲线，将测得的待测样品值OD₅₆₂nm代入公式，计算出IMI-BSA的蛋白浓度为34.09mg/mL。

(二)免疫小鼠

选用健康状况良好的7周龄雌性BALB/c小鼠按照设定免疫程序免疫(具体见表1)，每只小鼠免疫100μg免疫原，用一定体积的生理盐水稀释免疫原，取等体积弗氏佐剂与之混匀，充分乳化后，腹腔、背部3点注射。免疫原选用优化方法得到的吡虫啉人工抗原和常规方法得到的吡虫啉人工抗原进行对比。

首次免疫采取弗氏完全佐剂，加强免疫采用弗氏不完全佐剂，冲击免疫仅采用生理盐水稀释，首免后21d进行二免，加强免疫间隔14d、免疫4次。第三次免疫后7d，断尾采血，采集小鼠血清，通过Ci-ELISA法检测小鼠血清效价，检测结果见图6。第五次免疫后7d同法检测小鼠血清效价，结果见图6。

结果显示：使用常规方法合成的吡虫啉半抗原进行免疫的小鼠，血清抗体效价在三免后仅达到1:800，五免后达到1:12800；而使用优化方法合成的吡虫啉半抗原进行免疫的小鼠，血清抗体效价在三免后均可达到1:12800，五免后可达到1:51200。

筛选效价高的小鼠于细胞融合前三天腹腔冲击免疫，准备进行细胞融合。

表1吡虫啉完全抗原免疫小鼠的免疫程序

(三)细胞融合与细胞株建立

通过聚乙二醇(50％PEG)诱导融合，使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按照1：10的比例融合，融合后细胞用HAT培养基培养，融合后第五天，用HAT培养基对细胞板进行半换液，具体方法如下：

1)将1×10⁸脾细胞，与5×10⁷骨髓瘤细胞混合于一支50mL融合管中，补加不完全培养基至30mL。

2)1000r/min，离心5-10min，收集上清。

3)手掌搓热，在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀。

4)置于40℃水浴中预热45s。

5)在90s内加预热至40℃的50％PEG 1mL，边加边轻轻搅拌，先慢后快。

6)37℃水浴90s；

7)每隔2min分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL不完全培养基。

8)1000r/min，5min，弃去上清

9)加入5mL HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其重悬浮并混匀。

10)分装96孔细胞培养板，每孔200μL，然后将培养板置37℃、6％CO₂培养箱内培养。

11)7d后用HAT培养基换出1/2培养基。

12)10d后用HT培养基换出HAT培养基。

13)第14d用普通完全培养基。

14)经常观察杂交瘤细胞生长情况。

融合后第14d，观察到生长状态良好明显的细胞团，吸取上清液进行检测，利用间接竞争ELISA方法检测细胞孔抑制效果，筛选后利用有限稀释法进行三次亚克隆，最终筛选到效价高抑制效果好的抗吡虫啉单克隆细胞株(于2022年1月12日在中国典型培养物保藏中心注册保藏，保藏编号为CCTCC NO:C202211)，结果见图7，其为不同天数细胞融合电镜结果(a)融合后3d；(b)融合后7d；(c)融合后14d(100×)，结果显示：融合3d后细胞呈散状生长，细胞透亮、圆润；融合7d后细胞呈团块状生长；融合14d后，细胞呈对数生长，细胞生长状态良好。

(四)小鼠腹水的制备

本试验采用体内诱生法，在生产过后的BALB/c雌性小鼠体内制备腹水，并采用Hitrap ProteinG免疫亲和层析柱进行纯化。

(五)细胞株性质鉴定

将纯化后的腹水，采用小鼠抗体亚型测定试剂盒检测抗体亚型；腹水抗体效价、交叉反应试验采用间接ELISA法，结果见图8-图10、表2。图8结果显示：根据标准曲线，纯化后腹水蛋白浓度为27.1mg/mL，图8结果显示：腹水的抗体效价高于1：12800，表明制备的抗体质量高。

结果显示：吡虫啉与啶虫脒、噻虫胺和烯腚虫胺均无交叉反应，表明抗体特异性良好。

表2为单克隆抗体与其他药物的交叉反应率结果

图10结果显示：单抗株分泌的抗体类型为IgG2b型，轻链为κ链。

实施例2

Ci-ELISA检测方法的初步建立

(1)最佳封闭液的筛选

将不同浓度的脱脂乳、BSA、明胶进行最佳封闭液的筛选，选出阳性孔与阴性孔的P/N比值最大并且抑制效果最好的组，作为最佳封闭液，结果见表3、图11，结果显示：5％的牛乳为最佳封闭液。

表3最佳封闭液效果比较表

1)取干净96孔板，将IMI-OVA用CBS(pH 9.6)缓冲液稀释，100μL/孔加到96孔酶标板中。

2)4℃湿盒中孵育过夜。

3)用5％PBST洗涤5遍，每次间隔3min，拍干。

4)在96孔酶标板中分别加入：10％明胶、5％明胶、2％明胶；10％牛乳、5％牛乳、2％牛乳；10％BSA、5％BSA、2％BSA，并设阴性对照孔和空白孔，200μL/孔。37℃孵育封闭2h。用5％PBST洗涤5遍，每次间隔3min，拍干。

5)100μL/孔一抗，37℃避光反应1h。用5％PBST洗涤5遍，每次间隔3min，拍干。

6)100μL/孔二抗，37℃避光反应1h。用5％PBST洗涤5遍，每次间隔3min，拍干。

7)100μL/孔加入TMB显色液，37℃避光反应20min。

8)50μL/孔加入终止液终止反应。

9)在450nm波长下检测各孔吸光度。选出阳性孔与阴性孔的P/N比值最大并且抑制效果最好的孔，该孔对应的封闭液是最佳封闭液。

(2)抗原最佳工作浓度确定

以IMI-OVA为包被原，将包被原和G-1单克隆抗体做梯度稀释进行方阵实验，选择OD值接近1且抑制率最高的孔，结果见表4。

表4为抗原、抗体最佳工作液确定表

结果显示：IMI-OVA的最佳工作浓度为1:1600，单克隆抗体最佳工作浓度为1:3200。

1)取干净96孔板，将包被原IMI-OVA用CBS(pH 9.6)缓冲液进行系列梯度稀释：1:100、200、400、800、1600，按100μL/孔依次加入96孔酶标板中。

2)将96孔酶标板置于4℃湿盒中孵育过夜。

3)用5％PBST缓冲液洗板5次，每次间隔3min，拍干酶标板。

4)200μL/孔加入5％的牛乳，37℃培养箱中孵育反应2h进行封闭。用5％PBST缓冲液洗板5次，每次间隔3min，拍干酶标板。

5)将纯化后的腹水作梯度稀释，按浓度由高到低加入到96孔酶标板中，每孔100μL。37℃避光反应1h。用5％PBST洗涤5遍，每次间隔3min，拍干。

7)100μL/孔加入TMB显色液，37℃避光反应20min。

8)50μL/孔加入终止液终止反应。

9)在450nm波长下检测各孔吸光度。选择OD值在1.0左右且抑制效果好的孔，作为抗原抗体的最佳工作浓度。

(3)CiELISA标准工作曲线及参数确定

1)根据筛选出的最佳封闭液浓度和抗原抗体最佳工作浓度进行Ci-ELISA试验。将吡虫啉标准品做系列稀释，分别为0、1、5、10、20、50、100、200、400、800ng/mL。

2)将系列稀释的吡虫啉溶液作为竞争物，与稀释成最佳工作浓度的腹水稀释液按1:1比例混合后加入96孔酶标板，并做阳性孔和阴性对照孔。

3)将阳性孔所测得的OD值用B₀表示，其他各抑制孔所测得的OD值用B表示，以竞争物的浓度加1的对数(Lg(1+CIMI))为横坐标，以抑制率(1-B/B₀)为纵坐标，绘制出标准工作曲线，并计算出曲线方程及相关参数，结果见表5、图12。

表5单克隆抗体腹水ELISA相关参数表

结果显示：浓度在20～1000ng/mL时，标准曲线线性关系良好。

其中IC₅₀为0.57ng/mL，LOD为0.08ng/mL，LOQ为0.56ng/mL。

本发明提供了一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株及其应用。本发明的细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与抗原亲和力强的优势，基于此建立的吡虫啉间接竞争ELISA检测方法具有较好的灵敏度和特异性，用作吡虫啉残留检测的应用。

发明人前期用常规的方法制备免疫原免疫小鼠，效价也可以达到融合要求，但是出现了融合率高、阳性率低的问题，没有拿到单抗株；换了本发明制备的免疫原，小鼠效价提升，融合时阳性率也一直稳定在40％左右，也成功拿到了单抗株。再者，并非用同样方法都可以获得单抗株，存在“运气”成分，而本发明提供一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与抗原亲和力强的优势，为吡虫啉Ci-ELISA检测试剂盒的制备和吡虫啉胶体金试纸条的制备提供便利。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株，该细胞株为杂交瘤细胞株G1,于2022年1月12日在中国典型培养物保藏中心注册保藏，保藏编号为CCTCC NO: C202211。

2.一种抗吡虫啉单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株G1的细胞株或其传代细胞株分泌产生。

3.如权利要求2所述抗吡虫啉单克隆抗体，其特征在于：所述抗吡虫啉单克隆抗体效价高、特异性好、与抗原亲和力强。

4.如权利要求2所述的抗吡虫啉单克隆抗体在制备检测吡虫啉残留的Ci-ELISA检测试剂盒中的应用。