KR0161553B1 - 피레트로이드계 화합물의 면역학적 검출방법, 합텐화합물, 합텐화합물 중간체, 면역원 및 항체 - Google Patents

피레트로이드계 화합물의 면역학적 검출방법, 합텐화합물, 합텐화합물 중간체, 면역원 및 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피레트로이드 화합물에 대한 제1항체를 제공하며, 이 제1항체는 제1담체와 하기 일반식(1) 또는 (2)로 표시되는 합텐화합물과 사이의 제1결합체인 면역원으로 리스펀더(responder)를 면역시켜서 얻어지며,
제1항체를 시료용액과 혼합시키고,
제2결합체는 고상담체의 표면에 코팅한 제2담체와 합텐화합물로 형성되는 것으로서, 코팅항원으로서, 미반응의 제1항체를 상기 제2결합체에 결합시켜서, 항원-항체 결합체를 얻고,
항원-항체 결합체에, 제1항체에 대한 표시효소결합된 제2항체를 반응시키는 것으로 이루어진 피레트로이드계 화합물의 검출방법에 관한 것이고, 또한 환경증의 물, 토양, 식물 또는 식품 중에 함유된 피레트로이드계 화합물의 간편하고, 경제적이고 신속한 분석을 가능하게 한다.

Description

피레트로이드계 화합물의 면역학적 검출방법, 합텐화합물, 합텐화합물 중간체, 면역원 및 항체
본 발명은 피레트로이드(pyrethroid)계 화합물과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 항체 제조용 합텐(hapten)으로 유용한 신규화합물(이하, 합텐화합물(haptenic compound)이라 한다), 합텐화합물의 합성중간체로서 유용한 신규화합물, 합텐화합물로 이루어진 면역원 및 이들의 제조방법; 및 항체를 사용하여 시료에서 하나 또는 둘 이상의 피레트로이드계 화합물을 검출하고 측정하는 방법에 관한 것이다.
피레트로이드 화합물의 면역화학적 분석방법으로서 B.D. Hammock 등이 발표한 S-바이오알레트린에 특이적인 항체에 관한 연구(Study on Antibodies specific to S-Bio allethrin) [J. Agric. Food Chem., 26, 1328-1333(1978)]와 라디오이뮤노어세이(Radiommunoassay) [Experimentia, 35, 1619-1620(1979)]가 있다. 이것들은 특이적 피레트로이드에 면역화학적 분석방법의 적용에 관한 기초연구이다.
또한 L.H. Stanker 등이 발표한 미트(meat)에서 퍼메트린(permethrin)의 면역화학적 분석방법에 관한 기초연구[J. Agric. Food Chem., 37, 834-839(1989)]가 있다. 이 연구 보고서에 따르면, 페노트린(phenothrin)의 디메틸비닐기를 오존으로 산화시켜 카르복실산 유도체로 하고, 이 유도체와 단백질을 결합시켜 합텐-단백질 결합체를 얻고, 이 결합체로 리스펀더(responder)를 면역화시킴으로써 3개의 단일클론항체를 단리하였다. 그러나 이들 항체는 단지 페노트린, 퍼메트린, 사이퍼메트린(cypermethrin) 및 델타메트린(deltamethrin)의 검출에 유용하고, 그 외의 합성 피레트로이드에 대해서는 매우 낮은 검출감도를 갖는다. 항체가 검출되는 화합물과 반응할 때, 화합물이 보다 잘 반응되도록 시료에서의 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 아세토니트릴과 같은 수용성 유기용매를 첨가하였다. 유기용매에 대한 항체의 안정성을 고려할 때, 용매의 농도는 6% 이하의 저농도로 조절되어야 하고, 수용해도가 매우 낮은 화합물은 거의 검출되지 않고, 미량분석에 따른 용매 제거 또는 농축이 다른 미량분석에 비해 절대적으로 필요한 문제를 야기시킨다.
생활환경에서의 농약잔류 문제가 사회적으로 증가되고 있으며, 특히 수입식품에서의 수확후 농약 등의 잔류문제가 증가되고 있다. 생활환경의 안전성을 확보하기 위하여 환경과 식품의 많은 시료에 잔류하는 농약의 양을 정확하고 신속하게 측정할 필요가 있다.
이전에는 잔류농약을 주로 가스 크로마토그라피 또는 HPLC에 의해 측정해 왔었다. 그러나 이들 방법은 분석용 시료 제조에 상당한 노력과 시간이 요구되며, 또한 측정기구, 시약 등이 고가인 문제점이 있다. 따라서 신규하고, 간편하고, 경제적이고, 신속한 측정방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명에 따른 분석의 대상이 되는 피레트로이드계 화합물은 곡물, 과일, 야채, 목화, 커피, 차, 동물, 수목 및 가정의 위생 해충 구제에 널리 사용되고 있는 광범위한 스펙트럼(spectrum)을 갖는 범용 살충제이다. 피레트로이드계 화합물은 다른 많은 살충제에 비해서 포유동물에 대한 독성이 낮고, 저항성 해충의 방제에 효과가 크기 때문에 적용분야가 확대되고 있다. 피레트로이드계 화합물은 각각 대부분의 식품중에서의 잔류량의 상한이 법적으로 정해져 있다. 또한, 대부분의 피레트로이드계 화합물은 수서동물에 대해 강한 독성을 갖고 있기 때문에 환경에의 영향이 우려되고 있다.
금후 환경 및 식품의 잔류농약의 분석을 필요로 하는 시료가 점차적으로 증가되고 있다. 따라서 본 발명의 목적은 그러한 시료중의 하나 또는 둘 이상의 피레트로이드계 화합물을 간편하고 경제적이고, 신속하게 분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 종래방법에 의해 수입농산물의 잔류농약의 분석은, 금후 규제 대상 농약의 증가에 따라 시료의 수가 증대되므로 경비, 노력의 관점에서 더이상 실행할 수 없는 것이 현상황이다. 따라서 본 발명은 그러한 상황에 큰 기여를 하는 것이다. 본 발명의 방법을 이용하므로써, 잔류농약의 성분분석을 실시하기 전에, 시료중 각각의 농약이 타입과 잔류정도를 검사하는 것도 가능하다. 또한 본 발명은 통상적으로 제조된 항체의 결점 즉, 유기용매에 대한 불안정성을 극복하고, 그것에 의해 ELISA법으로 검출할 수 있는 피레트로이드계 화합물의 수가 증가하고, 수입농산물의 분석에 관계하는 제문제를 포함하는 전술한 많은 문제를 해결하고자 한 것이다.
본 발명에 따르면 환경중의 물 또는 토양, 식물 또는 식품중에 잔류하는 하나 또는 둘 이상의 피레트로이드계 화합물의 양을 간편하고, 신속하게 측정할 수 있다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 피레트로이드계 화합물의 면역화학적 분석법을 검토하여, 환경과 식품 시료에 함유된 피레트로이드계 화합물의 간편하고 신속한 검출방법으로서 간저경합 ELISA법이 유효한 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제1태양은 하기와 같은, 시료용액에 함유된 피레트로이드계 화합물의 검출방법을 제공하는 것이다;
즉, 제1담체와 하기 일반식(1) 또는 (2)로 표시되는 합텐화합물과의 제1결합체를 면역원으로하여 리스펀더(responder)에 면역시키는 것에 의해 얻어진 항체를 피레트로이드계 화합물에 대한 제1항체로 제공하고,
여기서, R1은 수소원자, 할로겐원자, C1-5알킬기, C1-5할로알킬기, C1-5알콕시기, C1-5할로알콕시기, C1-5알킬티오기, C1-5할로알킬티오기, C2-5알케닐기, C2-5할로알케닐티오기, C2-5알키닐기, C2-5할로알키닐기, 저급알콕시 저급알킬기, 저급알콕시 저급알콕시기, C2-5할로알케닐옥시기, C2-5알키닐옥시기, C1-5알콕시카보닐기, C1-5할로알콕시카보닐기, C3-6시클로알킬기, C3-6시클로알콕시기, 페닐기, 페녹시기 또는 시아노기를 나타내고;
R2는 C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고;
R3는 수소원자, C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고;
R2와 R3는 C3-6시클로알킬기 또는 C3-6시클로할로알킬기를 형성하기 위해 서로 결합될 수 있고;
R4와 R5는 각각 수소원자, 할로겐원자, 알킬기 또는 알콕시기를 나타내고;
A는 탄소원자 또는 실리콘원자를 나타내고;
B는 -CH2-, NR6-, -O- 또는 -S-를 나타내고;
R6는 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고;
Z는 -Y-(CH2)m-COOH 또는 -Y(CH2)n-NH2를 나타내고;
Y는 -H2C-, -NR7-, -O- 또는 -S-를 나타내고;
R7은 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고;
m과 n은 각각 1 ∼ 5를 나타낸다;
상기 제1항체를 시료용액에 혼합하고,
미반응의 제1항체를, 코팅항원으로서의 고상 담체의 표면에 코팅한 제2담체와 합텐화합물의 결합체인 제2결합체에 결합시켜 항원-항체 결합체를 얻고;
상기 항원-항체 결합체에 표지효소(labelled enzyme)를 결합시킨, 제1항체에 대한 제2항체를 반응시키는 것으로 이루어진 피레트로이드계 화합물의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2태양은 상기 일반식(1)과 (2)로 표시되는 합텐화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3태양은 일반식(1)과 (2)의 합텐화합물을 제조하기 위한 하기 일반식(3)과 (4)로 표시되는 중간체를 제공하기 위한 것이다.;
여기서, R1은 수소원자, 할로겐원자, C1-5알킬기, C1-5할로알킬기, C1-5알콕시기, C1-5할로알콕시기, C1-5알콕시기, C1-5할로알킬기, C1-5알킬티오기, C1-5할로알킬티오기, C2-5알케닐기, C2-5할로알케닐티오기, C2-5알키닐기, C2-5할로알키닐기, 저급알콕시 저급알킬기, 저급알콕시 저급알콕시기, C2-5할로알케닐옥시기, C2-5알키닐옥시기, C1-5알콕시카보닐기, C1-5할로알콕시카보닐기, C3-6시클로알킬기, C3-6시클로알콕시기, 페닐기, 페녹시기 또는 시아노기를 나타내고;
시클로알콕시기, 페닐기, 페녹시기 또는 시아노기를 나타내고;
R2는 C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고;
R3는 수소원자, C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고;
R2와 R3는 C3-6시클로알킬기 또는 C3-6시클로할로알킬기를 형성하기 위해 서로 결합될 수 있고;
R4와 R5는 각각 수소원자, 할로겐원자, 알킬기 또는 알콕시기를 나타내고;
A는 탄소원자 또는 실리콘원자를 나타내고;
B는 -CH2-, NR6-, -O- 또는 -S-를 나타내고;
R6는 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고;
Z'는 -Y'-(CH2)m-COOR'7또는 -Y'(CH2)n-NHR8를 나타내고;
Y는 -CH2O-, -NR9-, -O- 또는 -S-를 나타내고;
R7'은 C1-5알킬기, 저급알콕시 저급알킬기, 저급알콕시 저급알킬기, 저급알킬티오 저급알킬기, 테트라히드로피라닐기, 테트라히드로프라닐기, 페닐기, 페녹시 저급알킬기, 펜아실기, 디아실메틸기, N-프탈이미도메틸기, 벤질기 또는 실릴기를 나타내고;
m은 각각 1 ∼ 5를 나타내고;
R8은 포르밀기, 아세틸기, 할로아세틸기, 프로피오닐기, 페닐아세틸기, 알콕시카보닐기, 할로알콕시카보닐기, 플루오렌메틸카보닐기, 페닐옥시카보닐기, 페닐티오카보닐기, 피페리디닐옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기를 나타내고;
R9는 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고;
n은 1 ∼ 5를 나타낸다.
본 발명의 제4태양은 일반식(1) 또는 (2)의 합텐화합물을 함유하는 합텐-담체 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제5태양은 상기 결합체를 면역원으로하여 리스펀더(responder)를 면역화시켜 얻어지는, 피레트로이드계 화합물에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제6태양은 상기 항체가 제1항체로 사용되는 피레트로이드계 화합물의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제7태양은 상기 항체를 피레트로이드계 화합물과 반응시키는 피레트로이드계 화합물의 측정방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
먼저, 합텐-담체(예를 들면, 담체로서 단백질) 결합체로 리스펀더(responder)를 면역시켜 얻어진 피레트로이드계 화합물에 대한 항체를 제1항원으로 한다. 소정량의 제1항체와 피레트로이드계 화합물을 함유하는 시료용액을 혼합하고, 이를 반응시킨다. 이 반응 혼합물에 잔류되어 있는 미반응의 제1항체를 고상 담체 표면에 코팅된 코팅항원에 결합시킨 다음, 고상담체에 결합한 항원-항체 결합체를 표지효소 결합된 제2항원과 반응시킨다. 표지효소의 효소반응에 의해 발생하는 발색시약을 함유하는 완충용액을 반응 혼합물에 첨가하여 발색시킨 후, 흡광도를 측정한다. 검량선을 이용하여 측정된 흡광도로부터 피레트로이드계 화합물의 농도를 계산한다.
상기 방법에서 사용된 제1항원은 단백질과 같은 담체와 본 발명의 합텐화합물의 결합체를 면역원으로 사용하여 얻어진다.
본 발명에서 합텐화합물로 사용할 수 있는 화합물의 예로는 일반식(1)에서의 각종 치환기의 다양한 조합에 의한 많은 화합물이 있다. 바람직한 예로는 A는 탄소원자, B는 산소원자인 것이다. 보다 바람직한 예로는 A는 탄소원자, B는 산소원자, R2와 R3는 메틸기, Z에서의 Y는 산소원자인 것이다. 가장 바람직한 예로는 Z는 히드록시카보닐메틸옥시기, R2와 R3는 메틸기, A는 탄소원자, B는 산소원자, R4와 R5는 수소원자인 화합물이다.
일반식(2) 화합물에 있어서 유사한 예가 많이 있다. 바람직하게는 A는 탄소원자, B는 산소원자, Z에서의 Y는 산소원자인 화합물이다. 가장 바람직하게는 R1은 알콕시기 또는 할로알콕시기, R2와 R3는 메틸기, R4와 R5는 수소원자, A는 탄소원자, B는 산소원자, Z는 4-히드록시카보닐메틸옥시기인 화합물이다.
상기와 같은 합텐화합물은 전술한 일반식(3) 또는 (4) 화합물로부터 제조될 수 있다. 일반식(1)과 (2) 화합물은 일반식(3) 또는 (4) 화합물을 염기 또는 산의 존재하에서 환원 또는 가수분해하여 얻을 수 있다. 일반식(3) 또는 (4)로 표시되는 화합물의 각종 치환기의 조합에 따라 많은 화합물을 예시할 수 있다. 가장 바람직하게는 Z'가 메틸옥시카보닐메틸옥시기, R2와 R3는 메틸기, A는 탄소원자, B는 산소원자, R4와 R5는 수소원자인 화합물이다.
이들 중간체(3)과 (4)는 공지된 화합물로부터 제조할 수 있다.
일반식(3) 화합물은 하기 일반식(5)로 표시되는 화합물과 일반식(6)으로 표시되는 화합물을 염기 존재하에서 축합시켜 제조할 수가 있다.
여기서, A, B, Y, R2∼R5는 전술한 바와 같다.
여기서, X는 할로겐원자,
m과 R'7은 전술한 바와 같다.
또한, 일반식(3) 화합물은 일반식(5) 화합물과 일반식(7) 화합물을 염기 존재하에서 축합시켜 제조할 수가 있다.
여기서, X는 할로겐 원자,
n과 R8은 전술한 바와 같다.
한편, 일반식(4) 화합물은 일반식(8) 화합물과 일반식(6) 또는 (7) 화합물을 염기존재하에서 축합시켜 제조할 수 있다.
여기서, R1∼R5, A, B, Y'는 전술한 바와 같다.
중간체 제조시의 원료로 사용될 수 있는 일반식(5) 화합물중에서 A가 탄소원자이고, B가 산소원자인 화합물은 일본특개소 58-32840 또는 58-77836에 기재된 공지화합물 또는 이들 화합물이 공지된 제조방법에서 용이하게 얻을 수 있다.
또한, A와 B가 탄소원자인 일반식(5) 화합물은 일본특개소 62-201835에 기재된 공지 화합물의 공지반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 일반식(9) 화합물을 극성 유기용매중에서 염기(예를 들면, 포타슘 tert-부톡시드와 같은 강염기)와 반응시켜 상당하는 페놀유도체를 제조할 수 있다.
또한, A가 실리콘 원자인 일반식(5) 화합물은 일본특개소 61-263988과 62-106032에 기재된 공지의 유기실리콘 화합물에서 공지반응으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 일반식(10) 화합물을 극성용매중에서 염기(예를 들면, 포타슘 tert-부톡시드와 같은 강염기)와 반응시켜 상당하는 페놀유도체를 제조할 수 있다.
다른 중간체 제조시의 원료로 사용될 수 있는 일반식(8) 화합물 중에서 A가 탄소원자이고, B가 산소원자인 화합물은 일본특개소 58-32840과 58-77836에 기재된 공지화합물 또는 이들 화합물의 제조방법에 따라 용이하게 얻을 수 있다.
또한, A가 B가 탄소원자인 일반식(8) 화합물은 일본특개소 62-201835에 기재된 공지 화합물의 공지반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 일반식(11) 화합물의 메톡시메톡시기를 산으로 처리하여 상당하는 페놀유도체를 제조할 수 있다. 일반식(11) 화합물은 일반식(12)와 (13) 화합물을 축합하고 접촉 환원함으로서 제조할 수 있다.
A가 실리콘원자인 화합물은 특개소 61-263988과 62-106032에 기재된 공지의 유기실리콘 화합물을 사용하는 공지반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 일반식(14) 화합물의 메톡시메톡시기를 산으로 처리하여 상당하는 페놀유도체를 제조할 수 있다.
일반식(14) 화합물은 일반식(15)와 (16)의 화합물을 염기존재하에서 축합시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다.
제1항체를 생산하기 위한 면역원은 일반식(1) 또는 (2)의 합텐화합물과 담체(예를 들면, 알부민, 글로블린, 헤모시아닌과 같은 혈청단백질, 아조페닐아세트산, 글루타민-아데닌-티로신 공중합체 등)를 결합시약존재하에서 축합시켜 제조할 수 있다. 특히, 합텐화합물이 카복실산 유도체인 경우, B.F. Erlanger 등에 의해 제안된 혼합산무수물법[J. Biol. Chem., 234, 1090-1094(1959)]에 따라 합텐화합물과 단백질을 결합시키는 것이 일반적이다.
ELISA법에 있어서 통상 사용되는 고상담체는 본 발명의 검출방법에 사용될 수 있고, 여러가지 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 튜브, 웰 플레이트, 마이크로 플레이트, 엘롱게이티드 스틱(elongated stick), 틴 스트립(thin strip) 및 비드(beads)등이 있다. 이러한 고상의 표면을 형성하는 재료로서는 폴리스티렌 또는 다른 적당한 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴 디플루오리드, 글래스 및 실리카 등이 있다. 고상담체가 특별히 한정되지는 않지만 폴리스티렌으로 된 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 사용이 바람직하다.
본 발명에 따른 측정방법에서, 코팅항원의 고상담체 표면에의 코팅은, 합텐화합물과 제1항체를 생산하는 결합체인 리스펀더(responder)의 혈청알부민 결합체를, 코팅완충용액으로 희석하고, 이 희석용액을 고상담체에 첨가한 후 인규베이션(Incubation)함으로써 행해진다. 코팅완충용액으로는 10mM 인산왕충용액(pH7.5, 100mL NaCl)을 사용하는 것이 바람직하지만, 코팅을 방해하는 계면활성제 등을 함유하지 않는다면 이것에만 한정되는 것은 아니다.
또한 제2결합체에 사용되는 단백질로서 면역원으로 이용되는 것 이외의 단백질이 사용될 수도 있다. 면역원의 제조시에도 상기와 같은 방법으로 제조될 수 있다. 항원은 하기 조건하에서 고상담체에 코팅된다;
항원의 농도는 0.01∼0.1㎍/mL이 적당하다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트가 사용될 경우에는 항원의 양이 0.1mg/웰 정도가 바람직하다. 인큐베이션은 4℃에서 하룻밤 동안 수행하는 것이 바람직하다.
고상담체에 항원을 흡착시킨 후 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 항원 이외의 단백질로 항원이 흡착되지 않은 부분을 블록킹(blocking)하는 것이 필요하다. 이 블록킹(blocking)은 3% 스킴밀크(skim milk) 용액을 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한다. 인큐베이션 후, 세정완충액으로 세정한다. 세정완충액으로는 10mM 인산완충용액(pH7.2, 0.8% NaCl,0.02% KCI 및 0.02% 트윈 20)이 바람직하다.
본 발명에 따른 측정방법의 한 형태는, 피레트로이드계 화합물과 제1항체 사이의 반응이, 고농도 유기용매를 반응계에 첨가함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 일반적으로 피레트로이드계 화합물의 물에 대한 용해도는 매우 낮아서 통상 조건하에서 제1항체와 효과적으로 반응할 수 없다.
다양한 조건을 검토한 결과, 특정 그룹의 유기용매를 반응계에 첨가함으로써 항체와 피레트로이드계 화합물의 반응을 증진시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 첨가하는 유기용매로는 메탄올, 에탄올 등의 알코올류, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 헥시-메틸포스포아미드, N,N-디메틸이미다졸리디논, 아세토니트릴, 아세톤 등의 수용성 유기용매가 있다.
제1항체의 유기용매에 대한 안정성 측면에서 볼때 메탄올이 바람직하고, 그의 농도는 20∼50%가 바람직하지만, 이것에만 한정되는 것은 아니다. 제1항체는 희석 완충액 [10mM 인산완충(pH7.2), 0.8% NaCl, 0.02% KC1]으로 반응혼합물중의 항체 농도를 1/20,000-1/80,000로 희석하여 제조한다. 논의 물과 수도물 등의 자연환경 중의 물이 시료로 사용될 경우에는 제1항체 용액과 유기용매를 일정 농도가 되도록 시료에 직접 첨가하여 반응혼합물을 제조한다. 한편 식품, 식물 또는 토양이 시료로 사용될 경우에는, 유기용매로 시료에서 피레트로이드계 화합물을 추출하고, 생성 추출용액에 항체용액을 첨가하여 반응 혼합물을 제조할 수 있다. 이 반응 혼합물은 25℃에서 1시간 인큐베이션 시킨다. 상기 반응 혼합물 중의 미반응의 제1항체는 담체에 반응 혼합물을 첨가하고, 생성 담체를 25℃에서 1시간 인큐베이션 시킴으로써 고상 담체에 코팅된 항원과 반응시킨다. 반응 후 담체를 세정완충액으로 세정하고, 제2항체와의 반응에 제공한다.
본 발명의 측정방법에 사용하는 제2항체로는 제1항체에 대한 효소결합 항체를 포함한다. 제1항체로서 토끼 항혈청이 사용되는 경우에는 페록시다제-표지 항-토끼 IgG 염소 IgG 분획을 사용하는 것이 바람직하다.
담체에 결합한 제1항체와 5,000 - 10,000배, 바람직하게는 최종 흡광도가 1.0-1.5가 되도록 희석한 제2항체를 반응시키는 것이 바람직하다. 세정 완충액이 제2항체의 희석에 사용된다. 이 반응은 25℃에서 1시간 동안 수행되고, 반응후 세정완충액으로 담체를 세정한다. 아비딘-비오틴 반응을 이용하여 제2항체로서, 제1항체에 대한 비오틴-결합 항체와 효소-표지 아비딘을 조합하여 사용할 수 있다. 담체에 결합한 제1항체에 2,000배 정도로 희석한 비오틴-결합 항-토끼 IgG 당나귀 IgG 분획을 반응시킨 후 담체를 세정하고, 1,000배 정도로 희석한 알카리 포스파타제-표지 아비딘을 가하여 이들을 반응시키는 것이 바람직하다. 또한 제2항체를 생산하는 리스펀더(responder) 또는 효소가 사용될 수 있다. 세정용 완충액은 희석용으로 이용될 수 있다. 상기 반응들중의 어느 반응도 25℃에서 1시간 동안 실시된다. 반응후에, 담체를 세정용 완충액으로 세정하고, 이는 효소반응을 위해 제공된다.
담체에 결합한 제2항체의 효소와 기질의 반응에 의하여 발색·시약을 담체에 첨가한 후에 흡광도를 측정했다. 한가지 이상의 피레트로이드계 화합물의 양은 검량선을 이용하여, 측정된 흡광도로 부터 계산 가능하다. 페록시다제가 제2항체를 위하여 사용시에는, 과산화수소와 O-페닐렌 디아민이 각각 기질과 발색시약으로 사용될 수 있다.
발색용액을 담체에 첨가한 후에, 이들을 25℃에서 10분간 반응시킨다. 반응후에 바로, 4N황산을 첨가하여 효소반응을 중지시킨다. O-페닐렌 디아민을 사용시에는, 흡광도는 492nm과 630nm에서 측정될 수 있다.
반면에, 알카리 인산염을 사용시에는, 발색은 기질로서 p-니트로페닐포스포릭애시드로 실행될 수 있다. 효소반응을 중지시키기 위하여 2N NaOH를 첨가해주는 것이 적당하며, 흡광도는 415nm과 630nm에서 측정될 수 있다.
피레트로이드계 화합물을 첨가하지 않은 반응 용액의 흡광도로부터, 일정량의 피레트로이드계 화합물을 첨가한 후 항체와 반응시킨 용액의 흡광도의 감소율을 저해율로서 산출한다. 시료중의 피레트로이드 화합물의 농도는 검량선(calibration curve)을 이용하여 공지된 농도의 피레트로이드계 화합물이 첨가된 반응혼합물의 저해율로 부터 계산될 수가 있다.
본 발명에 따르는 제1항체들은 반응성의 정도에는 차이가 있을 수 있지만, 이들은 합텐화합물의 구조에도 불구하도 다른 피레트로이드계 화합물들과의 교차반응성을 보여주며, 이는 피레트로이드 화합물의 일반적 검출을 위하여 효과적으로 사용될 수가 있다.
본 발명의 검출가능한 피레트로이드계 화합물의 예는, 레스메트린, 케데트린, 시할로트린, 비펜트린, 펜프로파트린, 알레트린과 트랄로메트린과 같은 시클로 프로판 카르복실산 에스테르; 펜바레레이트,플루시트리네이트, 플루발리네이트와 시클로프로트린과 같은 방향족-치환된 알칸카르복실산 에스테르; 와
에토펜프록스, 할로펜프록스,(MTI-732), 1-(3-페녹시-페닐)-4-(4-에톡시페닐)-4-메틸펜탄(MTI-790), 1-(3-페녹시-4-플루오로페닐)-4-(4-에톡시페닐)-4-메틸펜탄(MTI-800, 디메틸-4-(4-에톡시페닐)-)3-(페녹시벤질옥시)실란(SSI-116), 실라플루오펜, pp-682와 같은 비에스테르 화합물들을 포함한다.
분석시료중에 있는 여러가지이 피레트로이드계 화합물의 전체 잔류량은 양 항체들을 이용하는 ELISA 방법으로 검출할 수 있다.
사용되거나 또는 스프레이된 분석시료가 단 한가지의 피레트로이드계 화합물만을 포함한다면, 측정결과는 상당하는 화합물의 잔류량과 일치한다.
몇가지의 피레트로이드계 화합물을 포함하는 분석시료의 경우에서도, 액체크로마토그래피와 같은 현행의 기술을 이용하고 시료를 자동조작으로 처리하여 이들 각각의 잔류량을 측정할 수 있다.
검출될 피레트로이드계 화합물로서 사용되는, 에토펜프록스에 대한 항체의 제조법과 항체를 이용하는 피레트로이드 화합물의 검출방법은 후술하는 실시예에서 상세히 설명한다. 이 실시예들은 단지 예시만을 위한 것이며, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
[실시예 1]
[합텐화합물(I) 중간체의 합성]
3-페녹시벤질 2-(4-히드록시페닐)-2-메틸-프로필에테르 3.0g, 소듐하이드라이드 0.36g 아세토니트릴 20ml를 약 20분간 가열환류한 후, 실온에서 메틸브로모아세테이트 2ml를 적하했다. 여기서 얻은 혼합물을 20분동안 60℃에서 교반했다. 반응혼합물을 농축한 후에, 에틸아세테이트 약 50ml를 농축액에 첨가하고, 이어서 물로 세정하고, 건조, 농축했다. 결과로 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여, 3-페녹시벤질 2-(4-(메톡시카보닐-메틸옥시)페닐)-2-메틸프로필 에테르 3.0g을 얻었다.
[실시예 2]
[합텐화합물(I)의 합성]
2.5시간동안, 실시예 1에서 얻어진 3-페녹시벤질 2-(4-메톡시카보닐 메틸옥시)페닐)-2-메틸프로필에테르 2.2g, 수산화나트륨 2.5g, 물 7.5g과 에틸렌글리콜 10ml를 가열환류했다. 묽은 염산을 반응혼합물에 첨가하여 산성으로 만들고, 이어서 에틸아세테이트로 추출했다. 추출물을 물로 세정하고, 건조후 농축했다. 여기서 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리정제하여, 3-페녹시벤질 2-[4-(히드록시 카보닐 메틸옥시)-페닐)-2-메틸프로필에테르 0.9g을 얻었다.
[실시예 3]
[합텐화합물(II) 중간체의 합성]
3-(4-히드록시페녹시)벤질 2-(4-에톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 1.1g, 소듐하이드라이드0.17g, 아세토니트릴 10ml을 약 20분간 60℃로 교반하고, 이어서 실온에서 에틸 브로모아세테이트 1ml를 적하했다. 여기서 얻은 혼합물을 50℃에서 30분동안 교반했다. 반응혼합물을 여과하고, 그 후에 여액을 농축했다. 여기서 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리정제하여, 3-(4-에톡시카보닐메틸-옥시)벤질 2-(4-에톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 1.2g을 얻었다.
[실시예 4]
[합텐화합물(II)의 합성]
1.5시간동안, 실시예 3에서 얻어진 3-(4-(에톡시카보닐-메틸옥시)페녹시벤질 2-(4-에톡시페닐)-2-메틸-프로필에테르 1.2g, 수산화나트륨 0,9g, 물 3.0g과 에틸알코올 12ml를 가열환류했다. 묽은 염산을 반응혼합물에 첨가하여 산성으로 한 후에, 에틸아세테이트로 추출했다. 추출물을 수세, 건조한 후 농축했다. 여기서 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리정제하여, 3-(4-(히드록시카보닐메틸옥시)페녹시)벤질 2-(4-에톡시페닐)-2-메틸프로필에테르 0.75g을 얻었다.
[실시예 5]
[합텐화합물(III) 중간체의 합성]
4시간동안, 3-(4-(메톡시메틸옥시)-페닐옥시)벤질 클로라이드 0.9g, 2-(4-(브로모-디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필 알코올 0.9g, 트리에틸벤질 암모늄 클로라이드 0.1g, 수산화나트륨 3.5g과 물4.0g을 40-50℃에서 교반했다. 반응혼합물에 물을 첨가하고, 이어서 에틸아세테이트로 추출했다. 추출물을 물로 세정하고, 건조한 후에 농축했다. 여기서 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리정제하여, 3-(4-(메톡시메틸옥시)-페닐옥시)벤질 2-(4-(브로모디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 1.2g을 얻었다.
2시간동안, 3-(4-(메톡시메틸옥시)-페닐옥시)벤질 2-(4-브로모디플루오로메톡시)페닐-2-메틸프로필에테르 1.2g, p-토루엔 설폰산 0.05g과 아세톤 10mg을 가열환류했다. 반응혼합물을 농축하여, 3-(4-히드록시페닐옥시)벤질 2-(4-브로모디플루오로메톡시)페닐-2-메틸프로필에테르 1.2g을 오일로 얻었다.
3-(4-히드록시페닐옥시)벤질 2-(4-(브로모디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르(1.2g), 소듐하이드라이드 0.13g과 아세토니트릴 10ml를 60℃에서 약 20분 동안 교반하고, 이어서 실온에서 에틸브로모아세테이트 1ml를 적하했다. 여기서 얻은 혼합물을 50℃에서 30분간 교반했다. 반응혼합물을 여과하고, 여액을 농축했다. 농축액을 실리카겔 컴럼크로마토그래피로 분리정제하여, 3-(4-(에톡시-카보닐메틸옥시)페녹시)벤질 2-(4-(브로모디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 1.0 g을 얻었다.
[실시예 6]
[합텐화합물(III)의 합성]
1.5시간동안, 실시예 5에서 얻어진 3-(4-(에톡시카보닐-메틸옥시)페녹시)벤질 2-(4-(브로모디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 1.0g, 수산화나트륨 0.9g, 물 4.0g, 에틸알코올 20ml을 60℃에서 교반했다.
반응혼합물에 물을 첨가하고, 이어서 헥산으로 세정했다. 묽은 염산을 반응혼합물에 첨가시켜 산성으로 만든후, 에틸아세테이트로 추출했다. 추출물을 물로 세정하고, 건조후 농축했다. 여기서 얻은 농축액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리정제하여, 3-(4-히드록시카보닐메틸옥시)페녹시)벤질 2-(4-(브로모-디플루오로메톡시)페닐)-2-메틸프로필에테르 0.72g을 얻었다.
[실시예 7]
면역원으로서, 소혈청알부민(BSA)과 실시예 2 및 실시예 4에서 얻은 두가지의 카르복실산 유도체 사이의 결합체들은 혼합산무수물법에 의하여 제조되었다.
각각의 결합체들은 후술하는 방법에 따라서 제조되었다. 실시예 2에서 얻어진 3-페녹시 벤질 2-(4-(히드록시카보닐메틸옥시)페닐)-2-메틸프로필에테르(이하, 합텐화합물(I)로 칭함)과 실시예 4에서 얻어진, 3.4-(히드록시카보닐메틸옥시)페녹시)벤질 2-(4-에톡시페닐)-2-메틸프로필에테르(이하, 합텐화합물(II)로 칭함)25mg을 무수디옥산 2ml에 용해했다. 여기서 얻은 용액에 N-메틸모르폴린 0.05ml 첨가하고, 이어서 20분동 10℃로 교반했다. 반응혼합물에 이소부틸 클로로카보네이트 0.02ml를 첨가한 후에, 15분동안 교반했다. 따라서, 합텐화합물 용액이 산 무수물의 형태로서 제조되었다.
반면에, BSA 80mg을 증류수 4.3ml에 용해했다. 여기서 생긴 용액을 1N NaOH 용액으로서 pH 9.0이 되게 조절해주고, 이어서 무수 디옥산 2.6ml를 부분적으로 첨가했다. 위에서 제조된 산 무수물 형태인 합텐화합물 용액을 BSA 용액에 부분적으로 첨가하고, 반면에 여기서 얻은 용액을 1N NaOH 용액으로서 pH9가 되게 유지해주고, 이어서 반응액을 4℃에서 4시간동안 교반했다.
이렇게 얻은 반응생성물을 세파덱스 G-25(상표명)를 이용하여 컬럼상에서 크로마토그래피로 정제하고, 24시간동안 증류수로 투석한 후, 면역원으로서 사용하기 위하여 동결건조했다.
더욱이, 합텐화합물(I) 및 (II)와 토끼 혈청 알부민의 결합체들도 동일한 방법에 따라서 항원으로서 제조되었다.
위에서 제조된 각각의 면역원을 생리적 인산완충액 [PBS : 10mM 인산염 완충용액(pH7.2), 0.9% NaCl]에 용해시켜서 용액농도 20㎍/ml되게 했다. 여기서 얻은 용액을 프로인트의 완전 아쥬번트와 동량으로 혼합시켜서 유중수(watei-in-oil) 타입의에멀션을 얻었다. 이렇게 얻는 에멀션 1ml을 토끼[NZW, 암컷, 13주령]에 피하 투여했다.
투여한 후 2주일 간격으로, 토끼를 프로인트의 불완전 아쥬번트와 동일한 면역원의 혼합된 에멀션으로서 비슷한 방법으로 추가 면역했다.
면역처리한 후에, 각각의 토끼로부터 채혈한 혈액샘플을 원심분리처리하여 혈청을 얻었다. 혈청을 33% 황산암모늄으로 염석시켜서 제1항체를 얻었다. 합텐화합물(I)과 BSA 사이의 결합체로 면역시켜 얻어진 항체를 항-에토펜프록스항체 I(이하, E항체 I이라 한다)로 하고, 합텐화합물(II)와 BSA 사이의 결합체로 면역시켜 얻어진 항체를 항-에토펜프록스항체 II(이하, E-항체 II라 함)로 한다.
[실시예 8]
에토펜프록스 E-항체 I을 이용하여 ELISA법으로 측정했다.
1. 96-웰 폴리스틸렌 마이크로타이퍼 플레이트에, 0.03㎕/웰이 되도록 코팅 완충용액 [10mM 인산염 완충용액(pH 7.5), 100mM NaCl] 중에 용해된 합텐화합물(I)과 토끼 혈청알부민(RSA) 사이의 결합체 용액을 0.1ml/웰의 비율로서 항원으로 첨가한 후에 4℃로 하룻밤 인큐베이터하여, 항원을 플레이트에 흡착시켰다. 여분의 용액을 제거한 후, 스킴밀크 3% 용액을 0.3ml/웰의 비율로 첨가하고, 이어서 25℃에서 1시간동안 배양했다. 플레이트를 세정용 완충액 [10mM 인산염 완충용액(pH 7.2), 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02% 트윈 20]으로 3회 세정하여 항원-코팅플레이트를 얻었다.
2. E-항체 I를 희석용 완충액 [10mM 인산염 완충액(pH 7.5)], 0.8% NaCl, 0.02% KCl]으로 20,000배로 희석한 후, 1:1의 비율로 메탄올 중에서 에토펜프록스 용액과 함께 혼합시켜서, 최종용액중의 항체농도와 메탄올농도가 각각 1/40,000과 50%가 되게 했다. 용액을 25℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 반응혼합물을 0.1ml/웰의 비율로 항원-코팅된 플레이트에 첨가한 후에, 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그후 플레이트를 세정용 완충액으로 3회 세정했다.
3. 호세라디쉬(horseradish) 퍼옥시다제와 항-토끼 IgG 염소 IgG(제2항체) 사이의 결합체를 세정용 완충액으로 10,000배로 희석시켰다.
희석된 결합체를 0.1ml/웰의 비율로 항원-코팅 플레이트에 첨가하고, 이어서 25℃에서 1시간동안 인큐베이션 했다. 플레이트를 세정용 완충액으로 3회 세정했다.
4. 항원-코팅 플레이트에, 0-페닐렌디아민 [0.2%(V/V) 0-페닐렌디아민과 100mM 인산염-구연산염 완충용액(pH 5.0, 0.003%(V/V) 과산화수소]의 발색용액을 0.2ml/웰의 양으로 첨가하고, 이어서 25℃에서 10분동안 배양했다. 그 후에 효소반응은 4N 황산을 0.05ml/웰의 비율로 플레이트에 첨가하므로써 종결되었다. 그 후에 492nm과 630nm에서 흡광도를 각기 측정했다. 이 방법에 따라서, 10ng/ml 내지 10,000ng/ml에 이르는 범위의 에토펜프록스농도를 성공적으로 측정했다.
반면에, E-항체 II를 이용하는 ELISA법은 다음에 설명될 것이다. 항원으로서, 합텐화합물(II)과 RSA 사이의 결합체 용액 0.01㎍/ml이 사용되었다. 64,000배로 희석된 E-항체 II용액과 에토펜프록스의 메탄올용액을 4:1의 비율로 혼합하여, 최종용액중의 항체농도와 메탄올농도가 각기 1/80,000과 20%가 되게 했다.
그 후에 여기서 얻은 용액을 반응시켰다. 제2항체로서는, 5,000배로 희석된 형태의 항-토끼 IgG 염소 IgG가 사용되었다.
상술한 ELISA 방법과 유사한 방법으로,3ng/ml 내지 1,000ng/ml에 이르는 범위를 갖는 에토펜프록스농도를 성공적으로 측정했다.
[실시예 9]
실시예 8에 설명된 방법에 따라서, 논의 토양, 농작물(곡식, 야채 또는 과일 등)과 수도물에 포함된 에토펜프록수의 농도를 측정했다.
40∼40,000ng/ml의 농도로 에토펜프록스를 포함하는 토양시료 각각 5g에, 물5ml와 메탄올 15ml를 첨가하고, 이어서 30분동안 진탕하면서 추출했다. 추출액을 10,000배로 희석된 E-항체 I와 함께 3:1의 비율로 혼합했다. 에토펜프록스는 실시예 8에 유사한 방법인 ESLISA법으로 측정되었다.
이와 유사하게, 물 10ml와 메탄올 30ml를 40∼4,000ng/ml의 농도로 에토펜프록스를 포함하는 농작물시료 각기 10g에 첨가하고, 이어서 30분동안 진탕하면서 추출했다. 10,000배로 희석된 추출액과 항체를 3:1의 비율로 혼합하고, 에토펜프록스의 농도를 실시예 8에 유사한 방법인 ELISA법에 의하여 성공적으로 측정했다.
반면에, 30∼3,000ng/ml 농도로 에토펜프록수를 포함하는 수도물 시료 80ml, 40,000배로 희석된 E-항체 II용액 200ml와 메탄올 80ml를 혼합하고, 25℃에서 1시간동안 반응시켜서, 반응혼합물내에서 항체농도와 메탄올농도가 각기, 1/80,000과 20%가 되게 했다. 에토펜프록스농도는 ELISA법에 의하여 성공적으로 측정되었다.
상술한 방법에 따라서, 토양과 농작물 중의 에토펜프록스의 농도는 40∼4,000ng/ml범위내에서 측정될 수 있으며, 수도물 중의 에토펜프록스의 농도는 30∼3,000ng/ml 범위내에서 측정가능했다.
[실시예 10]
실시예 8과 유사한 방법으로, 합텐화합물 I 또는 II와 RSA(토끼 혈청알부민)의 접합체를 96-웰마이크로타이터 플레이트 상에서 항원으로 코팅한 후에, 시료중에서 에토펜프록스로 미리 반응시킨 E-항체 I 또는 E-항체 II를 항원으로 반응시켰다. 에토펜프록수는 다음의 방법에 따라서 성공적으로 검출되었다.
즉, 항-토끼 IgG 당나귀 IgG와 비오틴의 결합체를 세정용 완충액으로 2,000배로 희석했다. 희석용액을 0.1ml/웰의 비율로 플레이트에 첨가하고, 이어서 25℃에서 1시간동안 인큐베이션 했다. 그 후 플레이트를 세정용 완충액으로 3회 세정했다. 아비딘과 알카리 인산염과의 결합체를 세정용 완충액으로 1,000배 희석하고, 이어서 0.1ml/웰의 비율로 플레이트에 첨가시키고 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후에 플레이트를 세정용 완충액으로 3회 세정했다.
플레이트에 알카리인산염 [0.1% P-니트로페닐 포르포릭산, 9,7% 디에탄올아민-하이드로클로라이드 완충용액(pH 9.8), 0.005% 염화마그네슘]의 발색용액을 0.2ml/웰의 비율로 첨가하고, 이어서 25℃에서 30분 동안 배양시키면, 발색을 야기했다. 그 후에 반응은 50㎕/웰의 비율로 플레이트에 2N NaOH을 첨가시키면 정지되며 415nm와 630nm에서 흡광도를 측정했다. 상술한 아비딘-비오틴 방법에 따라서, 10ng/ml 이상의 에토펜프록스를 성공적으로 측정했다.
[실시예 11]
E항체 I과 E항체 II를 따로 이용하여, 여러가지 피레트로이드계 화합물에 대한 교차 반응성은 실시예 8에 설명된 방법으로 측정되었다.
메탄올 중의 여러가지 피레트로이드계 화합물 각각의 용액(2∼20,000ng/ml의 농도)을, 희석용 완충액으로 미리 20,000배로 희석시킨 E항체 I의 용액과 1:1의 비율로 혼합시킨 후에 25℃에서 1시간동안 배양했다.
반응혼합물을 사용하여, 실시예 8에 설명된 ELISA법에 의하여 측정을 행했다.
어떠한 피레트로이드계 화합물의 첨가없이 얻는 반응혼합물의 흡광도는 100%로 나타낸다.
흡광도의 50%를 저해하는 에토펜프록스의 농도를 IC50농도로 표시한다.
IC50농도에서 에토펜프록스의 저해율이 100%로 나타낼 경우, 다른 피레트로이드계 화합물의 저해율은 표 1에 교차반응성으로 설명된다.
더욱이, 메탄올 중의 여러가지 피레트로이드 화합물 각각의 용액(농도 : 5∼50,000ng/ml)과 64,000배로 미리 희석된 E-항체 II용액을 1:4의 비율로 혼합하고, 이어서 25℃에서 1시간동안 배양했다. 반응혼합물을 실시예 8에 설명된 바에 따라서 처리하고 이의 교차반응성을 얻었다.
IC50농도에서 에토펜프록스의 저해율이 100%일 경우, 다른 피레트로이드계 화합물의 저해율도 표 1에 교차반응성으로 나타냈다.

Claims (2)

  1. 하기와 같은 시료용액에 함유된 피레트로이드계 화합물의 검출방법; 제1담체와 하기 일반식(1) 또는 (2)로 표시되는 합텐화합물과의 제1결합체를 면역원으로 하여 리스펀더(responder)를 면역시켜 얻어진 항체를 피레트로이드계 화합물에 대한 제1항체로 제공하고;
    여기서, R1은 수소원자, 할로겐원자, C1-5알킬기, C1-5할로알킬기, C1-5알콕시기, C1-5할로알콕시기, C1-5알킬티오기, C1-5할로알킬티오기, C2-5알케닐기, C2-5할로알케닐티오기, C2-5알키닐기, C2-5할로알키닐기, 저급알콕시 저급알킬기, 저급알콕시 저급알콕시기, C2-5할로알케닐옥시기, C2-5알키닐옥시기, C1-5알콕시카보닐기, C1-5할로알콕시카보닐기, C3-6시클로알킬기, C3-6시클로알콕시기, 페닐기, 페녹시기 또는 시아노기를 나타내고;
    R2는 C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고; R3는 수소원자, C1-5알킬기 또는 C1-5할로알킬기를 나타내고; R2와 R3는 C3-6시클로알킬기 또는 C3-6시클로할로알킬기를 형성하기 위해서도 결합될 수 있고; R4와 R5는 각각 수소원자, 할로겐원자, 알킬기 또는 알콕시기를 나타내고; A는 탄소원자 또는 실리콘원자를 나타내고; B는 -CH2-, NR6-, -O- 또는 -S-를 나타내고; R6는 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고; Z는 -Y-(CH2)m-COOH 또는 -Y(CH2)n-NH2를 나타내고; Y는 -H2C-, -NR7-, -O- 또는 -S-를 나타내고; R7은 수소원자 또는 저급알킬기를 나타내고; m과 n은 각각 1 ∼ 5를 나타낸다; 상기 제1항체를 20∼50% 유기용매의 존재하에 시료용액에 혼합하고; 미반응의 제1항체를, 제2담체와 상기 합텐화합물과의 제2결합체를 고상담체의 표면에 코팅하여 된 코팅항원에 결합시켜 항원-항체 결합체를 얻고; 상기 항원-항체 결합체에, 표지효소(labelled enzyme)를 결합시킨, 제1항체에 대한 제2항체를 반응시킨다.
  2. 제1항에 있어서, 제1결합체와 제2결합체가 동일한 것인 검출방법.
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