CN102507931A - 一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，其特征在于由如下部分组成：用于附着膜材料的PVC底板，滴加样品检测液的样品垫，附着胶体金标记抗体的胶体金垫，用于显示结果的测试线和控制线，用于承载测试线和控制线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；胶体金垫上平铺有菊酯类金标抗体，在检测线和控制线上分别固定有包被抗原和羊抗鼠二抗。经测试标明该胶体金免疫层析试纸条在针对检测拟除虫菊酯类农药中具有非常优异的灵敏度、特异性和稳定性。具有便捷、快速、准确和无污染等特点，可被广泛应用医学检测和临床诊断，成为快速诊断方法。

Description

一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及拟除虫菊酯类农药检测领域，具体涉及一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法。

背景技术

拟除虫菊酯类农药因其具有杀虫谱广、活性高、用量少、残留量低等特点而在农业、林业、卫生业等领域被广泛应用。近年来，随着一批高毒农药的禁用，菊酯类农药在中国的使用量越来越大，其在农产品中的残留也越来越引起人们的重视。

目前拟除虫菊酯农药残留量检测的常规方法有气相色谱法和高效液相色谱法等。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但样品前处理复杂、仪器昂贵、操作技术要求高，对于中国农产品安全监控中要求的大批量样品快速初筛工作无法胜任。

免疫分析是一种快速、灵敏的用于痕量检测的方法，近十年来研究应用发展迅速，据文献报道约有60 多种农药可用于酶免疫分析。由于免疫方法特异性强，多残留分析就需要采用不同的农药抗体进行多次检测分析，这就增加了检测成本和工作量，将单种药剂的检测研究发展为对多种类似化合物通用检测筛选法，测定每类农药的总残留量，是较为适用的现场筛选检测方法。

Paulk和Taylor首次将胶体金引入了免疫化学，建立以胶体金标记抗原(或抗体)检测相应抗体(或抗原)的免疫学新方法，为研制特异、敏感、快速(5～10 min出结果)和便捷的免疫学检测技术和临床诊断方法奠定了基础。经过几十年的发展，作为一门成熟的技术被广泛应用于生物医学等领域。

有鉴于此，本发明人在总结前人工作的基础上并根据大量实验测试，研发出一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，该试纸条对多种菊酯农药均有识别力，可用于多种菊酯农药的残留检测，适合于菊酯农药的初筛，本案由此产生。

发明内容

针对现有技术中对于大批量菊酯农药检测样品的残留难以快速检测初筛的问题，本发明提供了一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，可用于菊酯农药检测样品的快速检测和初筛。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，由如下部分组成：用于附着膜材料的PVC底板，滴加样品检测液的样品垫，附着胶体金标记抗体的胶体金垫，用于显示结果的测试线和控制线，用于承载测试线和控制线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；胶体金垫上平铺有菊酯类金标抗体，在检测线和控制线上分别固定有包被抗原和二抗。

上述二抗为羊抗鼠二抗。

本发明还提供一种如权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

先将菊酯类金标抗体喷涂于胶体金垫上，冷冻干燥；再将包被抗原喷涂于硝酸纤维素膜上的测试线位置，在37℃下烘干；最后将二抗喷涂于硝酸纤维素膜上的控制线位置，在37℃下烘干后组装成条。

本发明另外提供一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的使用方法：

滴加待测样品后，样品溶液在毛细作用下沿着样品垫向上迁移，移动到胶体金垫时，金标抗体将被样品溶液溶解；当样品中含有待测物时，待测物将和结合释放垫上的金标抗体结合并一同向上迁移，到达固定有包被抗原的检测线位置时，判断试纸检测结果的标准如下：

样品中含有拟除虫菊酯类农药：只在对照线上出现一条红色线；

样品中不含拟除虫菊酯类农药：在检测线和对照线上均显现一条红色线；

试纸无效：检测线和对照线上均不出现红色线。

本发明的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条快速检测拟除虫菊酯类农药的原理如下：

胶体金垫上平铺有一定量的金标抗体，在检测线和控制线上分别固定有一定量的包被抗原和二抗。滴加样品后，在各种膜的毛细作用下，样品溶液将沿着样品垫向上迁移，移动到胶体金垫时，金标抗体将被样品溶液溶解。当样品中含有待测物时，待测物将和结合释放垫上的金标抗体结合并一同向上迁移，到达固定有包被抗原的检测线位置时，包被抗原将和待测物竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点，样品中待测物含量越高，其竞争力越强，检测线上的包被抗原和金标抗体结合将越少。当包被抗原所结合的金标抗体少于一定的数量时，检测线处将不会有红色线条出现。无论样品是否含有待测物，过量的金标抗体或金标抗体与待测物的结合物均将和二抗结合并被滞留显色，所以不含待测物(阴性)时为两条红线，含有一定量待测物(阳性)时只出现一条红线，而没有红线出现则表明试纸条失效。

因此，本发明的胶体金免疫层析试纸条具有便捷、快速、准确和无污染等特点，可被广泛应用医学检测和临床诊断，成为快速诊断方法。

具体实施方式

实施例1：

拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条由如下部分组成：用于附着膜材料的PVC底板，滴加样品检测液的样品垫，附着胶体金标记抗体的胶体金垫，用于显示结果的测试线（T线）和控制线（C线），用于承载测试线和控制线（T/C线）的硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水滤纸；胶体金垫上平铺有菊酯类金标抗体，在检测线和控制线上分别固定有包被抗原和二抗。

将菊酯类金标抗体喷涂于金标垫上，冷冻干燥后组装成条。将包被抗原以不同喷量分别喷涂于NC膜上T线位置，37℃烘干，组装成条后进行检测。将羊抗鼠二抗喷涂于NC膜上C线位置，37℃烘干，组装成条后进行检测。

 实施例2：

拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的灵敏度测试；

按照实施例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条。分别测试该胶体金免疫层析试纸条对溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯等4种菊酯类农药的检测灵敏度。分别将这4种菊酯类农药标准品稀释到一定浓度，能够检测出阳性结果的最低浓度，即为试纸条对该种农药的检测灵敏度。

在测试的菊酯农药中4种菊酯农药检出结果为阳性，检出限见表1；对10 mg／kg溴氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯的检出阳性率低于5％，视检测结果为阴性。表明该试纸条对多种菊酯农药均有识别力，可用于多种菊酯农药的残留检测，适合于菊酯农药的初筛。

表1 部分菊酯农药农药检出限(mg／kg)。

农药名称	检出限
		溴氰菊酯	0.030
甲氰菊酯	0.20
		氯氰菊酯	1.0
氰戊菊酯	0.15

 实施例3：

拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的特异性测试；

按照实施例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条。将滴滴涕、六六六等有机氯农药及毒死蜱、马拉硫磷等农药磷农药分别稀释至一定浓度，用试纸条进行检测。

根据检测结果，该试纸条对浓度为10 mg／ml的有机氯、有机磷农药样品的阳性检出率均低于5‰即测试交叉反应率低于5％，表明该试纸条对菊酯类农药具有检测特异性，适用于对菊酯类农药的特异性残留检测。

 实施例4：

拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的稳定性测试(加速老化试验)；

按照实施例1中的方法制备拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条。将制作好的试纸条放入密封袋内，内置干燥剂片，置于45℃烘箱内，分别于第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天取出，测试试纸条的稳定性。

分别对3个批次的试纸条进行批内和批间差异的测试。结果表明，批内差均小于5％，即试纸条制作过程中，T／C线包被均匀，各种材料处理均匀，金标抗体质量较好；通过不同批次间试纸条检测结果的比较，发现3个批次的产品，显色程度一致性高，检测结果重复性好，表明试纸条测试的重复性好，可满足重复性生产要求。

通过加速老化试验发现，45℃保存7天、14天、21天、28天，检测结果均无明显改变。45℃保存35天，检测发现，金标垫上金标记抗体的复溶效果明显下降，T／C线颜色整体变浅，灵敏度下降。45℃保存35天，相当于常温下保存一年。

可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范畴。

Claims (4)

1.一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，其特征在于由如下部分组成：用于附着膜材料的PVC底板，滴加样品检测液的样品垫，附着胶体金标记抗体的胶体金垫，用于显示结果的测试线和控制线，用于承载测试线和控制线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；胶体金垫上平铺有菊酯类金标抗体，在检测线和控制线上分别固定有包被抗原和二抗。

2.根据权利要求1所述的一种拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述二抗为羊抗鼠二抗。

3.一种如权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

先将菊酯类金标抗体喷涂于胶体金垫上，冷冻干燥；再将包被抗原喷涂于硝酸纤维素膜上的测试线位置，在37℃下烘干；最后将二抗喷涂于硝酸纤维素膜上的控制线位置，在37℃下烘干后组装成条。

4.一种如权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药胶体金免疫层析试纸条的使用方法，其特征在于：

滴加待测样品后，样品溶液在毛细作用下沿着样品垫向上迁移，移动到胶体金垫时，金标抗体将被样品溶液溶解；当样品中含有待测物时，待测物将和结合释放垫上的金标抗体结合并一同向上迁移，到达固定有包被抗原的检测线位置时，按照如下标准判断试纸的检测结果：

样品中含有拟除虫菊酯类农药：只在对照线上出现一条红色线；

样品中不含拟除虫菊酯类农药：在检测线和对照线上均显现一条红色线；

试纸无效：检测线和对照线上均不出现红色线。