CN107356748A - 联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝基纤维素膜及吸水垫，所述样品垫、金标垫、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在PVC底板的上方，所述样品垫设置在PVC底板一侧的边缘，金标垫与样品垫部分重叠设置；所述金标垫上包被有胶体金标记的联苯菊酯抗体；所述硝基纤维素膜位于PVC底板的中部并且其两端分别与金标垫及吸水垫部分重叠；硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端喷涂有检测线，所述检测线包被联苯菊酯半抗原与载体蛋白的偶联物；硝基纤维素膜上靠近吸水垫的一端喷涂有控制线。该试纸条可对联苯菊酯进行检测，灵敏度高，稳定性好，可用于蔬菜和水果等产品中联苯菊酯的快速检测和初筛。

Description

联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及对联苯菊酯的检测领域，具体涉及一种联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法。

背景技术

联苯菊酯是第三代合成拟除虫菊酯农药的一种，杀虫活性很高，主要为触杀和胃毒作用，无内吸和熏蒸活性，其作用迅速，持效期长，杀虫谱广。近年来，其被广泛应用于茶树、果树、蔬菜等农业害虫及白蚁等卫生害虫的防治。

联苯菊酯的广泛使用容易导致较大残留，其长期被摄入人体后，会有累积作用，对人体的健康有着潜在的风险，如：它具有神经毒害作用，通过影响动物的神经系统和离子通道活性，干扰神经系统的正常功能。因而，长期低剂量食用含有联苯菊酯残留的农产品会对人们的健康造成严重危害。

目前联苯菊酯的残留分析方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法等。仪器检测方法样品前处理繁琐，仪器昂贵庞大，需要经过专业培训、有丰富经验的人员操作，并且检测费用高，不适合批量样品的快速检测与现场检测。

免疫检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、操作简单、成本低廉，无需借助昂贵的设备等优点，特别是胶体金免疫层析试纸条的出现，更加适合基层部门和普通消费者使用。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测技术存在的缺陷，提供一种可检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条，可用于蔬菜和水果等产品中联苯菊酯的快速检测和初筛。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝基纤维素膜及吸水垫，所述样品垫、金标垫、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在PVC底板的上方，所述样品垫设置在PVC底板一侧的边缘，金标垫与样品垫部分重叠设置；所述样品垫和金标垫为玻璃纤维膜，金标垫上包被有胶体金标记的联苯菊酯抗体；所述硝基纤维素膜位于PVC底板的中部并且其两端分别与金标垫及吸水垫部分重叠；硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端喷涂有检测线，所述检测线包被联苯菊酯半抗原与载体蛋白的偶联物；硝基纤维素膜上靠近吸水垫的一端喷涂有控制线；所述控制线上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体；所述吸水垫为滤纸；所述联苯菊酯半抗原如式Ⅰ所示。

本发明所述检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1.制备联苯菊酯半抗原-载体蛋白偶联物：将联苯菊酯半抗原通过琥珀酸酐法、六溴己酸乙酯法或一氯醋酸钠法引入羧基，然后通过碳二亚胺法、混合酸酐法或活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)进行偶联，制备联苯菊酯半抗原-BSA偶联物与联苯菊酯半抗原-OVA偶联物；

2.制备联苯菊酯抗体：将联苯菊酯半抗原-BSA偶联物多次免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外进行融合，制备杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以体外细胞培养的收集上清液的方式制备联苯菊酯抗体；

3.制备胶体金：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金颗粒直径在20～ 40nm之间；

4.胶体金标记抗体：将胶体金溶液与联苯菊酯抗体按1μg/mL～20μg/mL 的比例混匀，通过离心纯化、浓缩，制备成胶体金标记的联苯菊酯抗体；

5.将胶体金标记的联苯菊酯抗体喷涂并固定在金标垫上，将联苯菊酯半抗原-OVA偶联物包被在检测线上，将兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体包被在控制线上，并充分干燥；

6.将硝基纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫依次粘合在PVC底板上，切成条状，即制成检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条。

本发明所述的检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条的使用方法如下：

样品经前处理后，用提取溶剂提取，提取溶剂为一定浓度的乙醇水溶液或磷酸盐缓冲液或两者混合物,，得到样品溶液，将适量样品溶液滴加到样品垫上，样品溶液将会向吸水垫端移动；待一段时间后，根据检测线和控制线的显色情况，判断样品中是否含有联苯菊酯，判断方法如下：

(1)检测线显红色，控制线显红色——阴性结果，样品中不含联苯菊酯；

(2)检测线不显红色，控制线显红色——阳性结果，样品中含有联苯菊酯；

(3)无论检测线显不显红色，控制线不显红色——试纸条失效。

本发明所述的检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条的检测原理如下：

滴加待测样品溶液后，样品溶液在各种膜的毛细作用下，沿着样品垫向吸水垫端移动，移动到金标垫时，样品溶液溶解胶体金标记的抗体。当样品中含有待测物时，将与胶体金标记的抗体结合并一起向吸水垫端移动，到达固定有包被抗原的检测线时，包被抗原将和待测物竞争结合胶体金标记抗体，样品中待测物含量越高，竞争越明显，检测线上的包被抗原与胶体金标记抗体结合越少。当包被抗原所结合的胶体金标记抗体少于一定数量时，检测线将不显红色。无论样品中含不含有待测物，过量的胶体金标记抗体或其与待测物结合物都会与控制线的兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体结合，形成一条红色线，若控制线不显红色，则说明试纸条失效，需要重新更换试纸条进行检测。

附图说明

图1为本发明联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

在本发明中，SA为琥珀酸酐，DMSO为二甲基亚砜，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，PBS为磷酸缓冲盐溶液；BSA为牛血清白蛋白。

如图1所示：一种联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板1、样品垫2、金标垫3、硝基纤维素膜6及吸水垫7，所述样品垫2、金标垫 3、硝基纤维素膜6、吸水垫7均设置在PVC底板1的上方，所述样品垫2设置在PVC底板1一侧的边缘，金标垫3与样品垫2部分重叠设置；所述样品垫2 和金标垫3为玻璃纤维膜，金标垫3上包被有胶体金标记的联苯菊酯抗体；所述硝基纤维素膜6位于PVC底板1的中部并且其两端分别与金标垫3及吸水垫 7部分重叠；硝基纤维素膜6上靠近金标垫3的一端喷涂有检测线4，所述检测线4包被联苯菊酯半抗原与载体蛋白的偶联物；硝基纤维素膜6上靠近吸水垫 7的一端喷涂有控制线5；所述控制线5上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体；所述吸水垫7为滤纸；所述联苯菊酯半抗原如式Ⅰ所示。

本发明的具体实施例如下：

实施例1：联苯菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的制备；

以联苯菊酯半抗原-BSA偶联物的制备为例：本发明所采用的联苯菊酯半抗原中含有羟基基团，采用琥珀酸酐法，羟基与琥珀酸酐反应得到一个琥珀酸半酯(含一个羧基)，再经碳二亚胺法将羧基与BSA上的氨基结合，即得联苯菊酯半抗原-BSA偶联物。具体操作如下：将10.0mg联苯菊酯半抗原溶于0.5mL 无水吡啶中，加入20.0mg SA，室温下混匀过夜(8-10个小时)，在40℃下氮气吹干反应物，加入3mL纯乙酸乙酯和1mL 0.1mol/L HCl分配，蒸馏水洗涤3 次；取乙酸乙酯层离心，保留有机层，室温下氮气吹干；加入1mL无水吡啶溶解残留物，加入10mg NHS，静置5min，再加入10mg EDC，静置5min，将溶液缓慢滴入到10mL 25mg/mLBSA溶液中，其中，BSA用1mmol/L乙酸钠溶解，约10min滴加完毕，边滴加边振摇；在4℃下旋转混匀4h，在1L生理盐水中透析，每12h换1次水，透析2d，取出液体离心，上清液进行-20℃条件下冷冻干燥，即得联苯菊酯半抗原-载体蛋白偶联物。

实施例2：联苯菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的应用实施例；

在市场上取蔬菜叶片，剪取适量，磨碎，加入5％乙醇水溶液振荡提取，放置分层，吸取上清液，滴加到联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条样品垫上，反应 5～10min，观察检测线和控制线的显色情况，若检测线和控制线均显红色，则结果为阴性，表明样品中不含联苯菊酯；若检测线不显红色，控制线显红色，则结果为阳性，表明样品中含有联苯菊酯；若控制线不显红色，说明试纸条失效，需使用新的试纸条进行检测。

实施例3：灵敏度测试；

用本发明的试纸条对不同浓度的联苯菊酯进行检测。结果显示，联苯菊酯的最低检测限为0.1mg/kg。如表1所示。

表1联苯菊酯试纸条灵敏度测试结果

浓度(mg/kg)	检测结果
		0.5	阳性
0.2	阳性
		0.1	阳性
0.05	阴性
		0.01	阴性

实施例4：特异性测试；

用本发明的试纸条对10种有机磷农药、5种氨基甲酸酯类农药及5种拟除虫菊酯类农药(不含联苯菊酯)进行检测，结果显示，对硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷、乐果、氧化乐果、敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、久效磷等10 种有机磷农药，克百威、甲萘威、丁硫克百威、涕灭威、猛杀威等5种氨基甲酸酯类农药以及氯氰菊酯、醚菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯等5种拟除虫菊酯类农药的检测结果均为阴性。说明本发明的试纸条可对联苯菊酯进行特异性检测，而对其它成分无特异性反应。

实施例5：稳定性测试；

将用本发明方法制作好的试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，置于45℃烘箱内保存，分别于7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天取出，检测试纸条的稳定性。结果显示，45℃保存7天、14天、21天、28天、35天、 42天，检测结果均无明显变化。45℃保存49天，金标垫上胶体金标记的抗体出现复溶现象，检测线和控制线的颜色变浅，灵敏度下降。45℃保存到56天，检测限颜色已经很微弱。45℃保存49天，相当于常温保存18个月。

Claims (8)

1.一种联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝基纤维素膜及吸水垫，所述样品垫、金标垫、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在PVC底板的上方，所述样品垫设置在PVC底板一侧的边缘，金标垫与样品垫部分重叠设置；所述金标垫上包被有胶体金标记的联苯菊酯抗体；所述硝基纤维素膜位于PVC底板的中部并且其两端分别与金标垫及吸水垫部分重叠；硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端喷涂有检测线，所述检测线包被联苯菊酯半抗原与载体蛋白的偶联物；硝基纤维素膜上靠近吸水垫的一端喷涂有控制线，所述联苯菊酯半抗原如式Ⅰ所示。

2.根据权利要求1所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述控制线上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体。

3.根据权利要求1所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述吸水垫为滤纸。

4.根据权利要求1所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫和金标垫为玻璃纤维膜。

5.一种如权利要求1-4任意一项所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1).制备联苯菊酯半抗原-载体蛋白偶联物：将联苯菊酯半抗原通过琥珀酸酐法、六溴己酸乙酯法或一氯醋酸钠法引入羧基，然后通过碳二亚胺法、混合酸酐法或活泼酯法与牛血清白蛋白或卵清白蛋白进行偶联，制备联苯菊酯半抗原-BSA偶联物与联苯菊酯半抗原-OVA偶联物；

(2).制备联苯菊酯抗体：将联苯菊酯半抗原-BSA偶联物多次免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外进行融合，制备杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以体外细胞培养的收集上清液的方式制备联苯菊酯抗体；

(3).制备胶体金：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

(4).胶体金标记抗体：将胶体金溶液与联苯菊酯抗体按1μg/mL～20μg/mL的比例混匀，通过离心纯化、浓缩，制备成胶体金标记的联苯菊酯抗体；

(5).将胶体金标记的联苯菊酯抗体喷涂并固定在金标垫上，将联苯菊酯半抗原-OVA偶联物包被在检测线上，将兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体包被在控制线上，并充分干燥；

(6).将硝基纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫依次粘合在PVC底板上，切成条状，即制成检测联苯菊酯的胶体金免疫层析试纸条。

6.根据权利要求5所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(3)中胶体金颗粒直径控制在20～40nm之间。

7.一种如权利要求1-4任意一项所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条的使用方法，其特征在于：

样品经前处理后，用提取溶剂提取，得到样品溶液，将适量样品溶液滴加到样品垫上，样品溶液将会向吸水垫端移动，待一段时间后，根据检测线和控制线的显色情况，判断样品中是否含有联苯菊酯，判断方法如下：

(1)检测线显红色，控制线显红色——阴性结果，样品中不含联苯菊酯；

(2)检测线不显红色，控制线显红色——阳性结果，样品中含有联苯菊酯；

(3)无论检测线显不显红色，控制线不显红色——试纸条失效。

8.根据权利要求7所述的联苯菊酯胶体金免疫层析试纸条的使用方法，其特征在于：所述提取溶剂为一定浓度的乙醇水溶液或磷酸盐缓冲液或两者混合物。