CN101865923A - 快速检测甲基毒死蜱的免疫胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农药甲基毒死蜱的快速检测器具。一种甲基毒死蜱残留分析的快速检测试纸条。试纸条含有衬板(1)、样品垫(2)、金标结合垫(3)、纤维素膜(4)和吸水垫(7)，金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用兔抗鼠IgG印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合。本发明试纸条具有特异性强，检测灵敏度高、快速、简便、直观、准确的特点，并且前处理简单，不需要任何仪器设备，无需专业人员操作。

Description

快速检测甲基毒死蜱的免疫胶体金试纸条及其制备方法

一、技术领域：

本发明涉及农药残留免疫分析技术领域的一种快速检测器具，特别是涉及以纳米胶体金颗粒标记抗体的甲基毒死蜱胶体金快速检测试纸条。

二、背景技术：

甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)是一种广谱的有机磷杀虫剂，用于防治贮藏谷物中的害虫和各种叶类作物上的害虫，也用来防治蚊成虫、蝇类、水生幼虫和卫生害虫，目前仍在广泛应用。其作用机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱是神经递质，过量的乙酰胆碱过度刺激乙酰胆碱受体，导致靶生物死亡。然而，一些不是预定目标的生物也遭到了毒害，包括人、鱼等其他生物。

目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法和酶联免疫分析方法(ELISA)等。仪器分析方法包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography，GC)、薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等，这些仪器分析方法虽然可以达到较高的检测灵敏度，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足快速、在线检测的需要。ELISA方法，法所需要的检测时间较长，操作过程仍较复杂，检测成本较高，而且只能在室内进行检测等缺陷。因而ELISA方法的应用受到很大的限制。

本发明的甲基毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。

三、发明内容：

本发明的目的是：克服上述甲基毒死蜱检测技术的不足，研制出一种特异、敏感、快速、简便的甲基毒死蜱残留快速检测试纸条。

本发明的技术方案是：一种甲基毒死蜱快速检测试纸条，含有衬板和在衬板上一次衔接的样品垫、金标结合垫、纤维素膜、和吸水垫，金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用兔抗鼠IgG印制的直线式隐形对照线，两条线平行组合排列为“||”。

所述的衬板为不吸水的韧性材料。

所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成。

所述的样品垫为玻璃纤维棉，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜。

所述的样品垫用玻璃纤维棉制成。

所述的吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。

所述的纤维素膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜。

所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5厘米处。

所述的甲基毒死蜱金标抗体为胶体金标记的甲基毒死蜱单克隆抗体，所述的偶联甲基毒死蜱半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA，或为人血清白蛋白HAS。

本发明的快速检测试纸条具有以下优点：

1.特异性强，敏感性高。本胶体金试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中的胶体金颗粒与抗体分子之间无共价键，两者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金的标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，而且有较高的标记率。因此，试纸条很好的保留了单克隆抗体的特性，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到600ppb。

2.简便、快速。在使用本胶体金试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在10分钟内即可判定检测结果。

3.结果显示形象、直观、准确。胶体金试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原一金标抗体复合物，并且继续上移，遇T线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体继续上移，遇T线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。C线颜色的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。

4.节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。

四、附图说明：

图1、甲基毒死蜱快速检测试纸条俯瞰结构示意图。

图2、甲基毒死蜱快速检测试纸条剖面结构示意图。

图中，1：衬板，2：样品垫，3：金标物结合垫，4：纤维素膜，5：检测线，6：对照线，7：吸水垫，8-1：样品浸入端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：标识线。

图3、甲基毒死蜱快速检测试纸条结果判定示意图

图中，A为阴性样品检测结果，B为弱阳性样品检测结果，C为强阳性样品检测结果，D和E为试纸条失效。

五、具体实施方式：

要制备甲基毒死蜱快速检测试纸条，首先要制备偶联甲基毒死蜱半抗原的载体蛋白，用于印制检测线，进而制备甲基毒死蜱的金标抗体，用于制备金标抗体纤维棉，其次需要制备兔抗鼠IgG抗体，用于制备对照线。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一：(制备实施例)

1.甲基毒死蜱半抗原(O-甲基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯)的合成

①O-甲基-O-(3，5，6三氯吡啶基)硫代磷酰氯的合成。称取3，5，6-三氯-2-吡啶醇4.21g(约21.1mmol)用乙腈溶解；常温下，将溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83g(约23.2mmol)、粉状K₂CO₃ 8.7g(约63mmol)混合溶液，滴完后，继续反应1小时。反应完毕后真空过滤，蒸去溶剂，得黄色油状物。柱层析，用石油醚/二氯甲烷(8∶1，体积比)洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体6.88g(产率为72.6％)。

②O-甲基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成。称取4-氨基丁酸0.54g(约5.2mmol)、KOH 0.78g(约11.4mmol)，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于6mL甲醇溶液的(1)1.38g(约4.2mmol)，保温反应2小时。反应完毕后，用石油醚/乙醚(7∶1，体积比)洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物O-甲基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯1.28g(产率为78％)。

2.甲基毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联

利用活泼酯法(Active Ester method，简称AE法)将具有羧基末端(-COOH)的半抗原偶联到大分子的蛋白质上。分别称取0.1mmol半抗原与0.1mmol NHS，用600μl DMF溶解于反应装置中；称取0.1mmol DCC，用400μl DMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到5ml 15mg/ml的BSA蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02mol/LpH6.8的PB缓冲液中4℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的液体取出，经4℃12000rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20℃冰箱中。

同法，用OVA或HAS代替BSA制备人工抗原HAPTEN-OVA或HAPTEN-HAS。

3.抗甲基毒死蜱单克隆抗体的制备

以50μg～100μg每只的抗原量免疫6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠。每次间隔时间为2～3周，最后一次超强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时，用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次优先稀释克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。将特异性的细胞株移入高密度细胞培养器(CELLINE 350)中培养，收集细胞培养液并用Protein A进行抗体纯化，之后用超滤离心管去盐，冷冻抽干获得干粉状抗体，并于-20℃冻存备用。

4、金标抗体和金标结合物垫的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回流条件下，把100ml 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1ml 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。胶体金在与抗体标记前以0.2mol的K₂CO₃溶液调到pH为8.2左右，采用经典NaCl滴定法确定交易金溶液与甲基毒死蜱抗体的最佳标记量为5μg/ml。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％BSA(使最终BSA浓度为1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。再用和所用胶体金溶液同体积的2％BSA溶液重悬后4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的TB溶液(含3％BSA、3％蔗糖、0.01mol/L硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，4℃保存。用XYZ-3000三维喷膜仪把4％的BSA溶液以8μl/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以7μl/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。

5、兔抗鼠IgG抗体的制备

将纯化得到的IgG按50～100μg/kg体重经皮下和肌肉注射家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1∶2000以上时，心脏采血，分离收集高免血清。以饱和硫酸铵法提取兔抗鼠IgG抗体，用于胶体金层析检测试纸条对照线的制备。

6、偶联抗原和兔抗鼠包被纤维素膜

用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1.29mg/ml的偶联抗原以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为0.6mg/mL的兔抗鼠IgG以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔5mm。

7、快速试纸条的组装

把纤维素膜粘贴在衬板中间部位上，吸水垫粘贴在纤维素膜上侧和纤维素膜重叠1mm。金标结合物垫粘贴在NC膜下方重叠1mm。样品垫粘贴在进标结合物垫下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成4.08mm宽的试纸条。

8、快速检测试纸条检测反应原理

当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇检测线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜上的对照线(兔抗鼠IgG)结合，使对照线显红色。对照线颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效。

实施例二：(应用实施例)

1、检测样品液的制备

1)水检测样品溶液的预处理

取水样离心(4000rpm，5min)或用滤纸过滤后，用1M的NaOH调pH至9.0，NaCl调盐离子强度至0.4M，并加入10％的甲醇，取150μl用于进行检测。

2)苹果样品液的制备

取待测样品去皮，用搅拌机匀浆。称取10.0g样品加入10.0ml石油醚，漩涡振荡2分钟，加入1.0gNaCl、4.0g MgSO4，剧烈震荡2分钟，4000rpm离心10分钟，吸取上清液2.0ml，温和氮气吹干。用1ml 0.02M的硼酸钠缓冲液(含0.4M NaCl、10％甲醇)定容，用漩涡振荡器振荡2分钟，取1.0ml液体12000rpm离心10分钟，再从上清中取出50μl用于检测。

注：检测最终结果应除以倍数2

3)包菜样品液的制备

取待测样品洗净，晾干，用搅拌机匀浆。称取10.0g样品加入10.0ml石油醚，漩涡振荡2分钟，加入1.0gNaCl、4.0g MgSO₄，剧烈震荡2分钟，4000rpm离心10分钟，吸取上清液2.0ml，温和氮气吹干。用1ml 0.02M的硼酸钠缓冲液(含0.4M NaCl、10％甲醇)定容，用漩涡振荡器振荡2分钟，取1.0ml液体12000rpm离心10分钟，再从上清中取出50μl用于检测。

注：检测最终结果应除以倍数2

2、检测及结果判断

如图所示：将甲基毒死蜱试纸条样品端插入以上预处理的各待检测样品中，插入深度不超过标记线9，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫端。在扩散过程中，如果样品中有待测物浓度大于5ppm时，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使检测线不显色即表示检测样品为阳性(如图3C)；如果样品中待测物在0.6～5ppm时，阻止部分金标抗体与纤维素膜上检测线的结合，使检测线显示很弱的红色即表示检测样品为弱阳性(如图3B)；如果样品中待测物浓度小于0.6ppm时，不能阻止金标抗体与纤维素膜上检测线的结合，使检测线显示一条清晰红线即表示检测样品为阴性(如图3A)。同样，金标抗体也与纤维素膜上的对照线(兔抗鼠IgG)结合，使对照线显红色，对照线颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效(如图3A、B、C为有效D、E为无效)。5～10分钟判定检测结果。

是实例三：(应用实施例)

1.特异性试验

按实施例二所述的方法进行试验，将与甲基毒死蜱结构相似的五种农药(毒死蜱、杀螟硫磷、甲基对硫磷、甲基立枯磷、倍硫磷)的标准品配成40ppm，用本发明试纸条进行检测，纤维素膜上检测线与对照线呈“||”排列，即甲基毒死蜱试纸条与毒死蜱、杀螟硫磷、甲基对硫磷、甲基立枯磷、倍硫磷这五种农药没有交叉反应。从而可以断定此试纸条特异性很好，在进行检测时不会受到其他样品的干扰。

2.敏感性和均一性试验

按实施例二所述的方法进行试验，用本发明试纸条进行检测0ppm、0.3ppm、0.6ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的甲基毒死蜱标准品，重复10次，其中5ppm、10ppm的甲基毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜上的对照线呈一条红色线，即为阳性；0.6ppm、1.25ppm、2.5ppm的甲基毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜上的对照线呈一条红色线，检测线呈一条很弱的红色线，即为弱阳性；0ppm、0.3ppm的甲基毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜上的检测线和对照线呈两条红色线。因此本发明检测试纸条的灵敏度为0.6ppm。此10检测显色深度均一，检测结果显示一致。

3.稳定性试验

将试纸条放入铝铂袋中真空包装，并且室温保存，6个月后各项指标均符合上1-2项指标，即检测其他相似农药无交叉反应，灵敏度达0.6ppm，检测显色深度均一，反应结果一致。

Claims (9)

1.一种甲基毒死蜱残留分析的快速检测试纸条，含有衬板和在衬板上一次衔接的样品垫、金标结合垫、纤维素膜、和吸水垫，在试纸条两端粘贴有保护膜，其特征是：金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用兔抗鼠IgG印制的直线式隐形对照线，两条线平行组合排列为“||”。

2.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料。

3.根据权利要求2中所述的试纸条，其特征是：所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成。

4.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的样品垫为玻璃纤维棉，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜。

5.根据权利要求4中所述的试纸条，其特征是：所述的样品垫用玻璃纤维棉制成。

6.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。

7.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的纤维素膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜。

8.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5厘米处。

9.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的甲基毒死蜱金标抗体为胶体金标记的甲基毒死蜱单克隆抗体，所述的偶联甲基毒死蜱半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA，或为人血清白蛋白HAS。

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