CN109946454B - 一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用，本发明的有益效果为特异性强，敏感性高，简便快速，结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广；制得的毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。

Description

一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及农产品检测领域，具体涉及一种毒死蜱单克隆抗体。

背景技术

毒死蜱(Chlorpyrifos)又名氯吡硫磷，属于硫代磷酸酯类杀虫剂，通过抑制乙酰胆碱酯酶AChE或胆碱酯酶ChE的活性而破坏了正常的神经冲动传导，引起一系列中毒症状：异常兴奋、痉挛、麻痹、死亡。主要用于防治稻飞虱、稻纵卷叶螟、绵蚜、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾、蚜虫、根蛆等农业害虫。

目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括高效液相色谱法(Highperformance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography，GC)、薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。

与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在毒死蜱的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。但是，目前已报道的毒死蜱胶体金试纸条的灵敏度通常很难实现对复杂基质样品的快速检测。

发明内容

本发明目的是：提供一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用。

本发明的技术方案是：一种毒死蜱单克隆抗体，其抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALI SRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGS GSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。

本发明还提供了一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：毒死蜱半抗原的合成；

步骤(2)：毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联；

步骤(3)：抗毒死蜱单克隆抗体的制备；

步骤(4)：抗体可变区氨基酸序列的测定。

进一步的：所述步骤(2)中毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联的载体蛋白是利用活泼酯法将3,5,6-三氯-2-吡啶氧乙酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联的产物。

进一步的：所述步骤(4)包括以下步骤：将步骤(3)中所制得的毒死蜱单克隆抗体免疫小鼠；无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合与培养，培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时进行亚克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用Protein A进行抗体纯化，之后去盐并冷冻抽干获得干粉状抗体，冻存备用。

进一步的：所述小鼠为6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠，毒死蜱单克隆抗体免疫健康的雌性BALB/c小鼠的每次间隔时间为2～3周，最后一次超强免疫后3天。

进一步的：小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以10：1的细胞数量用PEG介导的方法融合，融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，所述亚克隆次数大于或等于3，且每次亚克隆均采用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆。

进一步的：冻存的温度为-20℃。

进一步的：所述毒死蜱半抗原的合成包括以下步骤：

步骤a：O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯的合成：将O-乙基硫代磷酰氯和K2CO3溶于乙腈中制得混合溶液，将3,5,6-三氯-2-羟基吡啶溶液于常温下逐滴加入所述混合溶液中，反应1h，获得反应液，将反应液真空过滤，蒸去溶剂，得到C1；对C1进行柱层析，用石油醚/二氯甲烷洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体；

步骤b:O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成:称取4-氨基丁酸与KOH溶解于甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于甲醇溶液的O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯，保温反应2h；反应完毕后，用石油醚/乙醚洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物。

进一步的：所述步骤a中石油醚/二氯甲烷的体积比为8:1，所述步骤b中石油醚/乙醚的体积比为7:1。

本发明还提供了一种毒死蜱单克隆抗体的应用，包括以下步骤：

1)毒死蜱金标抗体的制备；

2)金标结合物垫的制备；

3)毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；

4)毒死蜱胶体金试纸条。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1)特异性强，敏感性高。本胶体金试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ng/mL。

2)简便、快速。在使用本胶体金试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在3至5分钟内即可判定检测结果。

3)结果显示形象、直观、准确。胶体金试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原－金标抗体复合物，并且继续上移，遇隐形检测线T线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体继续上移，遇隐形检测线T线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。隐形对照线C线颜色的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。

4)节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。

本发明的毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为毒死蜱胶体金检测试纸条俯瞰结构示意图；

图2为毒死蜱胶体金测试纸条剖面结构示意图；

图3为毒死蜱胶体金检测试纸条结果判定示意图；

其中：1：衬板；2：样品垫；3：金标结合物垫；4：纤维素膜；5：检测线；6：对照线；7：吸水垫；8-1：样品浸入端保护膜；8-2：手柄端保护膜；9：标识线；A、阴性样品检测结果；B、弱阳性样品检测结果；C、强阳性样品检测结果；D、试纸条失效结果；E、试纸条失效结果。

具体实施方式

实施例：一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1、毒死蜱半抗原的合成

合成O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯。称取3,5,6-三氯-2-羟基吡啶4.26g，溶于乙腈。常温下，将溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-乙基硫代磷酰氯3.83g、粉状K₂CO₃8.7g混合溶液，反应1h。反应完毕后，真空过滤，蒸去溶剂，得黄色油状物。柱层析，用石油醚/二氯甲烷(8:1，体积比)洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体6.35g(产率为87％)。

合成O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯。称取4-氨基丁酸0.54g、KOH0.78g，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于6mL甲醇溶液的O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯(1.45g)，保温反应2h。反应完毕后，用石油醚/乙醚(体积比7:1)洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物1.37g(产率为83％)。

2、毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联

利用活泼酯法(Active Ester method，简称AE法)制备免疫抗原。分别称取0.1mmol半抗原O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯与0.1mmol NHS，用600μL DMF溶解于反应装置中；称取0.1mmol DCC，用400μL DMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到5mL 15mg/mL的KLH蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02mol/LpH7.4的PBS缓冲液中4℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的液体取出，经4℃12000rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20℃冰箱中。

利用活泼酯法制备包被抗原。方法与免疫抗原相同，用3,5,6-三氯-2-吡啶氧乙酸代替O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯；用BSA代替KLH。

3、抗毒死蜱单克隆抗体的制备

以100μg每只的抗原量免疫8周龄健康的雌性BALB/c小鼠。每次间隔时间为3周，最后一次超强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以10：1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养至细胞长满培养孔1/2时，用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次亚克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。使用特异性的细胞株制备腹水并用ProteinA进行抗体纯化，之后用超滤离心管去盐，冷冻抽干获得干粉状抗体，并于-20℃冻存备用。

对制得的毒死蜱单克隆抗体可变区氨基酸序列进行测定：

步骤1：提取mRNA

(1)收集细胞瓶里的杂交瘤细胞，弃上清，加TRIZOL试剂1ml，立即吹打。(观察：液体变粘稠，细胞脱壁)。

(2)将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5ml EP管中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇20秒。

(3)室温静置5分钟后，12000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清无色水相到EP管(DEPC处理过)，加等体积新开的异丙醇，颠倒离心管数次，混匀后室温下静置10分钟。

(4)12000rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75％乙醇1.0ml洗涤(用DEPC水新配制)后，7500rpm，5min，4℃离心，重复两次洗涤。

(5)去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀9分钟，DEPC处理水30ul加入，中枪打匀，58℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。

(6)1.2％琼脂糖电泳,155，30min。

步骤2：反转录

用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录得到cDNA，-20℃冻存。

步骤3：DNA片段扩增及测序

用Trans-Tap酶试剂盒(北京全式金生物有限公司)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的DNA片段，进行测序(北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司)。

PCR条件：

轻链：95℃，5min---94℃，30s---49℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止

重链：95℃，5min---94℃，30s---60℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止

步骤4：抗体可变区氨基酸序列的确定

经过翻译序列为：

(1)抗体重链可变区氨基酸序列为：

QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYH SALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；

(2)抗体轻链可变区氨基酸序列为：

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSR FSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。

一种毒死蜱单克隆抗体的应用，包括以下步骤：

1)按上述步骤进行毒死蜱金标抗体的制备；

2)、金标抗体和金标结合物垫3的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回流条件下，把100ml 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1ml 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。胶体金在与抗体标记前以0.2mol的K₂CO₃溶液调到pH为8.2，采用经典NaCl滴定法确定30μg抗体标记1mL胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％BSA(使最终BSA浓度为1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。加入胶体金溶液同体积的2％BSA溶液重悬，4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的TB溶液(含3％BSA、3％蔗糖、0.01mol/L硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，4℃保存。用XYZ-3000三维喷膜仪把4％的BSA溶液以8μL/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以6μL/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。

3)、偶联抗原和兔抗鼠包被纤维素膜4

用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/mL的包被抗原以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜4的偏下侧，作为检测线5。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/L的兔抗鼠IgG以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜4的偏上侧，作为对照线6，两线间隔5mm。

4)、快速毒死蜱胶体金试纸条

把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成4.08mm宽的试纸条。

快速检测试纸条检测反应原理：当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的对照线6(兔抗鼠IgG)结合，使对照线6显红色。对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效。

应用：对蔬菜和水果样品溶液的预处理。称取10g样品，匀浆后移入50mL离心管中，加入20mL含有40％甲醇的PBS溶液，涡旋3min，超声提取10min，4000rpm离心5min，取1mL上清液用工作缓冲液(PBS)稀释一定倍数后测定溶液中毒死蜱含量。

检测及结果判断

如图3所示：将胶体金检测试纸条样品端插入以上预处理的待检测样品中，插入深度不超过标记线9，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物浓度大于100ng/mL时，阻止金标抗体与纤维素膜4上检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使检测线5不显色即表示检测样品为阳性(如图3C)；如果样品中待测物在5～100ng/mL时，阻止部分金标抗体与纤维素膜4上检测线5的结合，使检测线5显示很弱的红色即表示检测样品为弱阳性(如图3B)；如果样品中待测物浓度小于5ng/mL时，不能阻止金标抗体与纤维素膜4上检测线5的结合，使检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品为阴性(如图3A)。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的对照线6(兔抗鼠IgG)结合，使对照线6显红色，对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效(如图3A、B、C为有效D、E为无效)。5分钟判定检测结果。

特异性试验

将与毒死蜱结构相似的有机磷农药(甲基毒死蜱、甲基对硫磷、对硫磷、杀螟硫磷、三唑磷、甲基立枯磷、乙基溴硫磷、EPN和二嗪农)的标准品配成1000ng/mL，用本发明试纸条进行检测。除甲级毒死蜱外，纤维素膜4上检测线5与对照线6呈“||”排列，即毒死蜱试纸条与甲基对硫磷、对硫磷、杀螟硫磷、三唑磷、甲基立枯磷、乙基溴硫磷、EPN和二嗪农等有机磷农药没有交叉反应，与甲级毒死蜱的交叉反应为10％。从而可以断定此试纸条特异性很好，在进行检测时不会受到其他样品的干扰。

敏感性和均一性试验

用本发明试纸条进行检测200、100、50、20、10、5、2.5、1、0ng/mL的毒死蜱溶液，重复10次，其中200和100ng/mL的毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜4上的对照线6呈一条红色线，即为阳性；50、20、10和5ng/mL的毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜4上的对照线6呈一条红色线，检测线5呈一条很弱的红色线，即为弱阳性；2.5、1和0ng/mL的毒死蜱标准品检测的检测结果为纤维素膜4上的检测线5和对照线6呈两条红色线。因此本发明检测试纸条的灵敏度为5ng/mL。检测显色深度均一，检测结果显示一致。

稳定性试验

将试纸条放入铝铂袋中真空包装，并且室温保存，3个月后各项指标均符合上1-2项指标，即检测其他相似农药无交叉反应，灵敏度达5ng/mL，检测显色深度均一，反应结果一致。

当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种毒死蜱单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。

2.一种根据权利要求1所述的毒死蜱单克隆抗体的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)毒死蜱金标抗体的制备；

2)金标结合物垫的制备；

3)毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；

4)毒死蜱胶体金试纸条。

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