CN107796947A - 一种检测β‑兴奋剂类药物的试纸条及其应用 - Google Patents

一种检测β‑兴奋剂类药物的试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测β‑兴奋剂类药物的试纸条及其应用，它涉及生物技术领域。它的制备方法为：制备喷涂有β‑兴奋剂类药物单克隆抗体‑胶体金标记物的结合物释放垫，制备具有包被有β‑兴奋剂类药物半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；将上述步骤制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。本发明操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制，实现对大批量样品进行快速检测和现场监控。

Description

一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及的是生物技术领域，具体涉及一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条及其应用。
背景技术
β-兴奋剂(β-agonist)全称β-肾上腺素受体激动剂(β-adrenoceptor agonist)，又叫β-激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物，常见的β-兴奋剂有克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、非诺特罗、特布他林等。β-兴奋剂能选择性地与细胞膜上的β-肾上腺素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。20世纪80年代有研究表明，β-兴奋剂影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率。β-兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，由于这类化合物具有口服活性，如果违法超量使用将会对人与动物的肝、肾等内脏器官产生毒副作用，因此世界各国已将这类物质列为禁止用于食品动物的化学物质。
目前国内外关于β-兴奋剂类药物残留的主要检测方法是色谱法，如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GC-MS)、液质联用法(LC-MS)等，这类方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条及其应用，操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制，实现对大批量样品进行快速检测和现场监控，实用可靠，易于推广使用。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，底板上依次粘贴有样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，所述结合物释放垫的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下，结合物释放垫上喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜上具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线。
作为优选，所述的样品吸收垫为吸滤纸或滤油纸；结合物释放垫为玻璃棉或聚酯材料；反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸水垫为吸水纸；底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料板。
作为优选，所述的β-兴奋剂类药物单克隆抗体是以β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；所述β-兴奋剂类药物半抗原是由4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应得到；所述的羊抗鼠抗抗体体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的制备方法，其步骤为：(1)制备喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
(2)制备具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
(3)将步骤(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
作为优选，试纸条的具体制备步骤包括：
①将4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应，制备β-兴奋剂类药物半抗原；
②将β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物；
③用β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌β-兴奋剂类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
④提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
⑤分别将β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线和质控线上；
⑥用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
⑦将制备的β-兴奋剂类药物单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
⑧将β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
⑨将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(质量分数)、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
⑩在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。
一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的应用，其用于检测样品中β-兴奋剂类药物的方法包括如下步骤：
(1)对样品进行前处理；
(2)用试纸条进行检测：样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当β-兴奋剂类药物在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线和质控线处各出现一条红色条带；如果β-兴奋剂类药物在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与β-兴奋剂类药物全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带；
(3)分析检测结果：
①阴性：当质控线显示出红色条带，检测线同时也显示出红色条带，样品中β-兴奋剂类药物浓度低于检测限，判为阴性；
②阳性：当质控线显示出红色条带，而检测线不显色，样品中β-兴奋剂类药物浓度等于或高于检测限，判为阳性；
③无效：当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
作为优选，所述β-兴奋剂类药物为盐酸氯丙那林、班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺、特布特林中的一种或两种及两种以上的组合。
本发明的有益效果：本试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，且可以同时检测盐酸氯丙那林、班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺、特布特林13种β-兴奋剂类药物，检测方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用，实现对大批量样品进行快速检测和现场监控。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；
图1为本发明试纸条剖面结构示意图；
图2为本发明试纸条检测结果判定图；
图3为本发明β-兴奋剂类药物半抗原合成图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
参照图1-3，本具体实施方式采用以下技术方案：一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条，包括样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板5，底板5上依次粘贴有样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4，所述结合物释放垫2的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫1下，结合物释放垫2上喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜3上具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线T和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线C。
值得注意的是，所述的样品吸收垫1为吸滤纸或滤油纸；结合物释放垫2为玻璃棉或聚酯材料；反应膜3为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸水垫4为吸水纸；底板5为PVC底板或其他硬质不吸水的材料板。
所述的β-兴奋剂类药物单克隆抗体是以β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；所述β-兴奋剂类药物半抗原是由4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应得到；所述的羊抗鼠抗抗体体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的制备方法，其步骤为：(1)制备喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
(2)制备具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
(3)将步骤(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
具体地，其制备步骤包括：
①将4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应，制备β-兴奋剂类药物半抗原；
②将β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物；
③用β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌β-兴奋剂类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
④提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
⑤分别将β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线T和质控线C上；
⑥用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
⑦将制备的β-兴奋剂类药物单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
⑧将β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
⑨将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(质量分数)、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
⑩在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。
一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的应用，其用于检测样品中β-兴奋剂类药物的方法包括如下步骤：
(1)对样品进行前处理；
(2)用试纸条进行检测；
(3)分析检测结果。
值得注意的是，所述β-兴奋剂类药物为盐酸氯丙那林、班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺、特布特林中的一种或两种及两种以上的组合。
本具体实施方式检测β-兴奋剂类药物的试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的β-兴奋剂类药物在流动过程中，与结合物释放垫上的β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成β-兴奋剂类药物-抗体-胶体金标记物。样本中的β-兴奋剂类药物与反应膜检测线上的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无来判断待测样品液中是否含有β-兴奋剂类药物残留。
检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当β-兴奋剂类药物在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线T和质控线C处各出现一条红色条带；如果β-兴奋剂类药物在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与β-兴奋剂类药物全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。
试纸检测结果分析如下：
①阴性：当质控线C显示出红色条带，检测线T同时也显示出红色条带，样品中β-兴奋剂类药物浓度低于检测限，判为阴性；
②阳性：当质控线C显示出红色条带，而检测线T不显色，样品中β-兴奋剂类药物浓度等于或高于检测限，判为阳性；
③无效：当质控线C不显示出红色条带，则无论检测线T显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
本具体实施方式克服现有的检测β-兴奋剂类药物的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，检测方法简便快速、直观准确，试纸条灵敏度高，不受检测设备限制，保质期长，有效实现对大批量样品进行快速检测和现场监控，具有广阔的市场应用前景。
实施例1：一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：
1、制备喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2、制备具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3、将上述步骤制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。
上述分步详细叙述如下：
(1)β-兴奋剂类药物半抗原的制备
取4-羟基苯乙酰溴1.0g，加二氯甲烷30mL溶解，加叔丁胺1.0g，室温搅拌2h，停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加水，乙酸乙酯，萃取，浓缩，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(V/V，10/1)洗脱，分离，得到化合物Ⅰ0.9g，收率93.75%；
取化合物Ⅰ0.9g，加乙醇30mL溶解，0～5℃搅拌30min，加硼氢化钠0.32g，继续搅拌2h，停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水，二氯甲烷萃取，浓缩，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(V/V，5/1)，洗脱，分离，得到中间体化合物Ⅱ0.81g，收率90%；
取化合物Ⅱ0.81g，加二甲基亚砜溶解，加KOH 0.26g，加氯乙酸钠0.73g，60℃搅拌4h，停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，浓缩，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇(V/V，10/1)洗脱，分离，得到化合物Ⅲ 0.84g，即为β-兴奋剂类药物半抗原，收率81.55%。
(2)免疫原的制备
取β-兴奋剂类药物半抗原8mg，加0.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加碳化二亚胺(EDC)12mg，搅拌30min，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7mg，继续搅拌1h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1mol/L CB缓冲液溶解，得到B液；将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌4h，0.02mol/L PB透析纯化3天，每天换液三次，得到免疫原，分装，-20℃保存备用。
(3)包被原的制备
取β-兴奋剂类药物半抗原5mg，加0.4mL DMF溶解，加三乙胺10μL，搅拌，加氯甲酸异丁酯5μL，搅拌1h，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白(OVA)50mg，加0.1mol/L CB溶解，得到B液；将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌4h，0.02mol/L PB透析纯化3天，每天换液三次，得到包被原，分装，-20℃保存备用。
(4)β-兴奋剂类药物单克隆抗体的制备
①动物免疫
将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
②细胞融合和克隆化
取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
③细胞冻存和复苏
取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
④单克隆抗体的制备与纯化
采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。
(5)羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
(6)β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备
①胶体金的制备
用双蒸去离子水将质量分数为1%的氯金酸溶液稀释成0.01%，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备良好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。
②β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调节胶体金的pH至7.2(不同抗体的pH标记范围在7～8之间，可以变化)，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述β-兴奋剂类药物单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10% BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1%，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1%～0.3%、吐温-80的质量分数为0.05%～0.2%、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
(7)结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含0.5% BSA(质量分数)、pH 7.2的0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20%)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20%)中保存备用。
(8)反应膜的制备
将β-兴奋剂类药物半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用磷酸缓冲液将β-兴奋剂类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
(9)样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(质量分数)、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h备用。
(10)试纸条的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(T)和质控线(C)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
实施例2：一种应用试纸条检测样品中β-兴奋剂类药物的方法：
(1)样品的前处理：
取尿液样品直接检测，如样品浑浊，需3000r/min以上离心5min后再检测。
(2)用试纸条进行检测：
用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴于加样孔中，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果。
(3)分析检测结果：
阴性(-)：T线和C线都显色，表示样品中β-兴奋剂类药物浓度低于检测限，如图2a。
阳性(+)：T线无显色C线显色，表示样品中β-兴奋剂类药物浓度等于或高于检测限，如图2b。
无效 ：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2c，在此情况下，应用新的试纸条重新测试。
实施例3：样品检测实例
(1)检测限试验
取空白猪尿、牛尿、羊尿样品，在其中分别添加盐酸氯丙那林至浓度为4μg/L、8μg/L、16μg/L，班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺至浓度为1.5μg/L、3μg/L、6μg/L，特布他林至浓度为2.5μg/L、5μg/L、10μg/L，取试纸条进行检测，每个样品重复测定三次。
用试纸条检测猪尿、牛尿、羊尿样品时，当其中盐酸氯丙那林添加浓度为4μg/L，班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺添加浓度为1.5μg/L，特布他林添加浓度为2.5μg/L时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中盐酸氯丙那林添加浓度为8μg/L、16μg/L，班布特罗、克仑特罗、西布特罗、溴布特罗、马布特罗、溴氯布特罗、西马特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、克伦丙罗、莱克多巴胺添加浓度为3μg/L、6μg/L，特布他林添加浓度为5μg/L、10μg/L时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性。表明本试纸条对猪尿、牛尿、羊尿等动物尿液中β-兴奋剂类药物的检测限为：盐酸氯丙那林8μg/L，班布特罗3μg/L，克仑特罗3μg/L，西布特罗3μg/L，溴布特罗3μg/L，马布特罗3μg/L，溴氯布特罗3μg/L，西马特罗3μg/L，沙丁胺醇3μg/L，妥布特罗3μg/L，克伦丙罗3μg/L，莱克多巴胺3μg/L，特布他林5μg/L。
(2)假阳性率、假阴性率试验
取空白猪尿、牛尿、羊尿样品各20份，并向其中分别添加13种β-兴奋剂类药物至检测限浓度，制成阳性猪尿、牛尿、羊尿样品，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样品时，结果全为阳性，可知阳性样品符合率为100%，假阴性率为0；检测阴性样品时，结果全为阴性，可知阴性样品符合率为100%，假阳性率为0。说明本发明的检测β-兴奋剂类药物的试纸条可以对猪尿、牛尿、羊尿等动物尿液中的β-兴奋剂类药物进行快速检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条，其特征在于，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(5)，底板(5)上依次粘贴有样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)，所述结合物释放垫(2)的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫(1)下，结合物释放垫(2)上喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜(3)上具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(T)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(C)。
2.根据权利要求1所述的一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条，其特征在于，所述的样品吸收垫(1)为吸滤纸或滤油纸；结合物释放垫(2)为玻璃棉或聚酯材料；反应膜(3)为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸水垫(4)为吸水纸；底板(5)为PVC底板或其他硬质不吸水的材料板。
3.根据权利要求1所述的一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条，其特征在于，所述的β-兴奋剂类药物单克隆抗体是以β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；所述β-兴奋剂类药物半抗原是由4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应得到；所述的羊抗鼠抗抗体体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。
4.一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的制备方法，其特征在于，其步骤为：(1)制备喷涂有β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
(2)制备具有包被有β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
(3)将步骤(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
5.根据权利要求4所述的一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的制备方法，其特征在于，所述试纸条的具体制备步骤包括：
①将4-羟基苯乙酰溴与叔丁胺反应后，经硼氢化钠还原，再与氯乙酸钠反应，制备β-兴奋剂类药物半抗原；
②将β-兴奋剂类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物；
③用β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌β-兴奋剂类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
④提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
⑤分别将β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)上；
⑥用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
⑦将制备的β-兴奋剂类药物单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
⑧将β-兴奋剂类药物单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
⑨将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(质量分数)、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
⑩在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。
6.一种检测β-兴奋剂类药物的试纸条的应用，其特征在于，其用于检测样品中β-兴奋剂类药物的方法包括如下步骤：
(1)对样品进行前处理；
(2)用试纸条进行检测：样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当β-兴奋剂类药物在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)处各出现一条红色条带；如果β-兴奋剂类药物在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与β-兴奋剂类药物全部结合，从而在(T)线处因为竞争反应不会与β-兴奋剂类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带；
(3)分析检测结果：
①阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)同时也显示出红色条带，样品中β-兴奋剂类药物浓度低于检测限，判为阴性；
②阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)不显色，样品中β-兴奋剂类药物浓度等于或高于检测限，判为阳性；
③无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
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