CN116425650A - 苯海拉明半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苯海拉明半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。本发明提供了两种苯海拉明半抗原，并制备得到苯海拉明的抗体，效价高，特异性强，亲和力高，为建立特异性苯海拉明的免疫检测方法提供了核心原材料。本发明还建立了特异性和灵敏度更高的苯海拉明的免疫分析方法，最低检测限LOD为0.099ng/mL，半抑制浓度IC50为1.77ng/mL，定量检测范围为0.29ng/mL～10.93ng/mL，对苯海拉明的类似物均无交叉反应，可对样品中的苯海拉明进行快速的定性和定量检测，操作简便，检测结果准确可靠。

Description

苯海拉明半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体地，涉及苯海拉明半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
苯海拉明(Diphenhydramine)又称苯那君、可那敏苯那坐尔，白色结晶性粉末，无臭、味苦，熔点167～171℃。极易溶于水，在乙醇、氯仿中易溶，在丙酮中略溶，在乙醚、苯中极微溶解。苯海拉明是一种抗组胺药，被广泛应用于医药领域，对皮肤瘙痒、过敏性鼻炎、荨麻疹和接触性皮炎等过敏反应有良好效果，但也有一定副作用，如中枢神经抑制、恶心、食欲不振、胸闷、过敏性休克、痉挛等。因此为了加强对苯海拉明药物的监管，有必要建立一种准确、便捷的苯海拉明的快速检测方法。
目前苯海拉明的检测主要集中在化妆品、药品、食品等样品中。分析方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法等。国家市场监督官总局2017年第160号公告发布《饮料、茶叶及相关制品中对乙酰氨基酚等59种化合物的测定BJS201713》中规定食品中苯海拉明的定量限为0.1mg/kg，所用方法为液相色谱-串联质谱法，存在设备昂贵、需要专业操作人员、无法用于现场检测等缺点。
免疫检测技术具有高灵敏、特异性强、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。现有技术(CN113151188A)虽然已经公开了用于苯海拉明检测的半抗原、抗原和抗体，但是该现有技术用琥珀酸酐在苯海拉明类似物的氨基处连入手臂做免疫原和包被原，存在着苯海拉明半抗原结构单一、抗体检测限相对较高等技术问题。所以，目前仍缺少特异性好且灵敏度高的苯海拉明快速检测方法。
发明内容
为了解决现有技术中缺少快速、灵敏且简便的免疫检测方法的问题，本发明提供了一种苯海拉明半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供2种苯海拉明半抗原。
本发明的第二个目的是提供上述苯海拉明半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述苯海拉明半抗原在制备苯海拉明人工抗原中的应用。
本发明的第四个目的是提供2种苯海拉明人工抗原。
本发明的第五个目的是提供上述苯海拉明人工抗原在制备苯海拉明抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种苯海拉明人工抗原组合。
本发明的第七个目的是提供上述苯海拉明人工抗原组合在制备检测苯海拉明的试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
在半抗原目标表位和载体蛋白之间连接具有一定长度的间隔臂，从而使靶标分子的特征结构远离载体蛋白，最大限度地使半抗原暴露于免疫系统中。半抗原的间隔臂较短可能导致载体蛋白将分析物的特征结构掩蔽，从而导致抗体反应不佳。间隔臂较长可能导致半抗原分子的构象折叠，从而被载体蛋白掩蔽，容易产生针对间隔臂的抗体。因此选择合适长度的间隔臂应使靶标分子暴露于免疫系统，同时尽量避免识别间隔臂。本发明合成了三种具有不同长度间隔臂的半抗原，偶联蛋白后均可以使半抗原充分暴露出来又可尽量避免识别间隔臂，可产生更优的抗体识别苯海拉明。本发明简化了半抗原的合成步骤，降低抗体的检测限，提高苯海拉明抗体的特异性和灵敏度。
一种苯海拉明半抗原，即苯海拉明半抗原DPH-NC，其结构式如式(Ⅳ)所示，
Figure BDA0004180744620000021
其中，n＝1、3或5。
所述n＝1，苯海拉明半抗原即为DPH-2C，其结构式如式(Ⅰ)所示，
Figure BDA0004180744620000031
苯海拉明半抗原DPH-2C用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)乙酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)acetic acid。
所述n＝3，苯海拉明半抗原即为DPH-4C，其结构式如式(Ⅱ)所示，
Figure BDA0004180744620000032
苯海拉明半抗原DPH-4C用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)丁酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)butanoic acid。
所述n＝5，苯海拉明半抗原即为DPH-6C，其结构式(Ⅲ)所示，
Figure BDA0004180744620000033
苯海拉明半抗原DPH-6C采用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)己酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)hexanoic acid。
另一种，苯海拉明半抗原，即苯海拉明半抗原DPH-OH，其结构式如式(Ⅴ)所示，
Figure BDA0004180744620000041
苯海拉明半抗原DPH-OH采用系统命名法命名为：2-((2-(二苯基甲氧基)乙基)(甲基)氨基)乙醇；即2-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)ethanol。
结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC的制备方法，包括以下步骤：除盐后的2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于乙腈后，与溴代脂肪酸酯类化合物和碳酸钾充分反应，所得反应物在碱性条件下充分水解，之后将pH调节至酸性，即得；
Figure BDA0004180744620000042
其中，n＝1、3或5。
优选地，所述2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐、溴代脂肪酸酯类化合物和碳酸钾的摩尔比为1：(1～3)：(4～6)。
更优选地，所述2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐、溴代脂肪酸酯类化合物和碳酸钾的摩尔比为1：2：6。
优选地，所述溴代脂肪酸酯类化合物为溴乙酸乙酯，则如式(Ⅳ)所示的化合物的结构式中n＝1，该化合物即为苯海拉明半抗原DPH-2C。
具体地，苯海拉明半抗原DPH-2C的制备方法，包括以下步骤：将1mol 2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于10mL重蒸水，加入200μL 1M氢氧化钠溶液除盐，搅拌1h后旋干除去水分，用5mL乙腈复溶，后加入2mol溴乙酸乙酯和6mol碳酸钾，常温25℃下搅拌过夜12h，得到反应物；以硅胶粉为固定相，以体积比为乙酸乙酯：甲醇＝15：1的混合溶液为流动相，通过柱层析分离纯化反应物，将20mg所得纯化产物溶解于2mL甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为苯海拉明半抗原DPH-2C。
优选地，所述溴代脂肪酸酯类化合物为溴丁酸乙酯，则如式(Ⅳ)所示的化合物的结构式中n＝3，该化合物即为苯海拉明半抗原DPH-4C。
具体地，苯海拉明半抗原DPH-4C的制备方法，包括以下步骤：将1mol 2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于10mL重蒸水，加入200μL 1M氢氧化钠溶液除盐，搅拌1h后旋干除去水分，用5mL乙腈复溶，后加入2mol溴丁酸乙酯和6mol碳酸钾，常温25℃下搅拌过夜12h，得到反应物；以硅胶粉为固定相，以体积比为乙酸乙酯：甲醇＝15：1的混合溶液为流动相，通过柱层析分离纯化反应物，将20mg所得纯化产物溶解于2mL甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为苯海拉明半抗原DPH-4C。
优选地，所述溴代脂肪酸酯类化合物为溴己酸乙酯，则如式(Ⅳ)所示的化合物的结构式中n＝5，该化合物即为苯海拉明半抗原DPH-6C。
具体地，苯海拉明半抗原DPH-6C的制备方法，包括以下步骤：将1mol 2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于10mL重蒸水，加入200μL 1M氢氧化钠溶液除盐，搅拌1h后旋干除去水分，用5mL乙腈复溶，后加入2mol溴己酸乙酯和6mol碳酸钾，常温25℃下搅拌过夜12h，得到反应物；以硅胶粉为固定相，以体积比为乙酸乙酯：甲醇＝15：1的混合溶液为流动相，通过柱层析分离纯化反应物，将20mg所得纯化产物溶解于2mL甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为苯海拉明半抗原DPH-6C。
结构式如式(Ⅴ)所示的苯海拉明半抗原半抗原DPH-OH的制备方法，将二苯基溴甲烷、氯苯和N-甲基二乙醇胺充分反应，即得；
Figure BDA0004180744620000051
优选地，所述二苯基溴甲烷、氯苯和N-甲基二乙醇胺的摩尔比为1:(4～6):(1～2)。
更优选地，所述二苯基溴甲烷、氯苯和N-甲基二乙醇胺的摩尔比为1:5:2。
具体地，将1mol二苯基溴甲烷溶于5mol氯苯，加热至温度达到110℃，再加入2molN-甲基二乙醇胺混合均匀，110℃下在溶剂氯苯中回流反应6h，以硅胶粉为固定相，以体积比为乙酸乙酯：甲醇：氨水＝30：5：1的混合溶液为流动相，通过柱层析分离纯化所得反应物，再旋蒸干燥，即得。
任一上述苯海拉明半抗原在制备苯海拉明人工抗原中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种苯海拉明人工抗原，由结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅵ)所示，
Figure BDA0004180744620000061
其中，n＝1、3或5，P为载体蛋白。
所述n＝1，结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原即为DPH-2C；n＝3，结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原即为DPH-4C；n＝5，结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原即为DPH-6C。
优选地，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白。
更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
优选地，所述n＝1。
更优选地，所述n＝1，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白。
最优选地，所述n＝1，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
一种苯海拉明人工抗原，由结构式如式(Ⅴ)所示的苯海拉明半抗原DPH-OH偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅶ)所示，
Figure BDA0004180744620000071
其中，P为载体蛋白。
优选地，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。
任一上述苯海拉明人工抗原在制备苯海拉明抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。
任一上述苯海拉明人工抗原在检测苯海拉明中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
一种制备苯海拉明人工抗原的方法，将任一上述苯海拉明半抗原通过活泼酯法或羰基二咪唑法偶联载体蛋白。
优选地，所述结构式如式(Ⅵ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC通过活泼酯法偶联载体蛋白。
更优选地，所述活泼酯法包括以下步骤：
S1.将所述苯海拉明半抗原DPH-NC、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二甲基甲酰胺充分反应，得到溶液A；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液B；
S2.溶液A与溶液B充分反应后，经过透析，即得到苯海拉明抗原。
进一步优选地，步骤S1中，苯海拉明半抗原DPH-NC、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(0.5～1.5)：(1～3)。
更进一步优选地，步骤S1中，苯海拉明半抗原DPH-NC、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1mol：0.8mol：1.9mol。
进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为(8mg～12mg)：(1mL～2mL)。
更进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg：1mL。
进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白。
更进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
进一步优选地，步骤S1中，将苯海拉明半抗原DPH-NC、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺，25℃下避光搅拌2～4h。
更进一步优选地，步骤S1中，将1mol苯海拉明半抗原DPH-NC、0.8mol N-羟基丁二酰亚胺和1.9mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下避光搅拌4h，
进一步优选地，步骤S2中，溶液A和溶液B的体积比为(1～3)：(1～5)。
更进一步优选地，步骤S2中，溶液A和溶液B的体积比为1：5。
进一步优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，3℃～5℃反应10h～14h。
更进一步优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，4℃反应12h。
进一步优选地，步骤S2中，所述透析的方法为溶液A与溶液B反应结束后，用磷酸盐缓冲液透析所得反应液。
更进一步优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析2天～4天，每天更换2次～4次磷酸盐缓冲液。
最优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3天，每天更换3次磷酸盐缓冲液。
优选地，所述结构式如式(Ⅴ)所示的苯海拉明半抗原DPH-OH通过羰基二咪唑法偶联载体蛋白。
更优选地，所述羰基二咪唑法包括以下步骤：
S1.将所述苯海拉明半抗原DPH-OH、羰基二咪唑和N,N-二甲基甲酰胺充分反应，得到溶液C；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液D；
S2.溶液C与溶液D充分反应后，经过透析，即得到苯海拉明抗原。
进一步优选地，步骤S1中，所述苯海拉明半抗原DPH-OH和羰基二咪唑的摩尔比为1：(1～3)。
更进一步优选地，步骤S1中，所述苯海拉明半抗原DPH-OH和羰基二咪唑的摩尔比为1：2。
进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为(8mg～12mg)：(1mL～2mL)。
更进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg：1mL。
进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。
进一步优选地，步骤S1中，将苯海拉明半抗原DPH-OH和羰基二咪唑和溶解于N,N-二甲基甲酰胺，25℃下避光搅拌2h～4h。
更进一步优选地，步骤S1中，将1mol苯海拉明半抗原DPH-OH与2mol羰基二咪唑溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下避光搅拌4h，
进一步优选地，步骤S2中，所述溶液C和溶液D的体积比为(1～3)：(1～5)。
更进一步优选地，步骤S2中，所述溶液C和溶液D的体积比为1：5。
进一步优选地，步骤S2中，将溶液C逐滴加到溶液D中，3℃～5℃反应10h～14h。
更进一步优选地，步骤S2中，将溶液C逐滴加到溶液D中，4℃反应12h。
进一步优选地，步骤S2中，所述透析的方法为溶液C与溶液D反应结束后，用磷酸盐缓冲液透析所得反应液。
更进一步优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析2天～4天，每天更换2次～4次磷酸盐缓冲液。
最优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3天，每天更换3次磷酸盐缓冲液。
上述任一方法制备得到的苯海拉明人工抗原也应在本发明的保护范围之内。
任一上述苯海拉明人工抗原在检测苯海拉明中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
任一上述苯海拉明人工抗原在制备苯海拉明抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种苯海拉明抗体，由任一上述苯海拉明人工抗原免疫动物制备得到。
优选地，所述苯海拉明人工抗原由结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC偶联载体蛋白得到。
更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，即苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA。
进一步优选地，所述苯海拉明人工抗原中的n＝1，即所述苯海拉明人工抗原由苯海拉明半抗原DPH-2C偶联牛血清白蛋白得到，即苯海拉明人工抗原DPH-2C-BSA。
优选地，所述苯海拉明抗体为单克隆抗体，则由任一上述苯海拉明人工抗原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得到苯海拉明单克隆抗体。
更优选地，所述苯海拉明抗体为单克隆抗体，则由所述苯海拉明人工DPH-NC-BSA免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得到苯海拉明单克隆抗体。
进一步优选地，所述苯海拉明抗体为单克隆抗体，则由所述苯海拉明人工抗原DPH-2C-BSA免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得到苯海拉明单克隆抗体。
优选地，所述苯海拉明抗体为多克隆抗体，则由任一上述苯海拉明人工抗原免疫动物，收集血清，得到多克隆抗体。
更优选地，所述苯海拉明抗体为多克隆抗体，则由所述苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA免疫动物，收集血清，得到多克隆抗体。
进一步优选地，所述苯海拉明抗体为多克隆抗体，则由所述苯海拉明人工抗原DPH-2C-BSA免疫动物，收集血清，得到多克隆抗体。
任一上述苯海拉明抗体在检测苯海拉明中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
任一上述苯海拉明抗体在制备检测苯海拉明的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种苯海拉明人工抗原组合，包含免疫原和包被原，所述免疫原由结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由结构式如式(Ⅳ)所示的苯海拉明半抗原DPH-NC偶联鸡卵白蛋白得到或由结构式如式(Ⅴ)所示的苯海拉明半抗原DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到；
Figure BDA0004180744620000111
式(Ⅳ)，其中，n＝1、3或5；
Figure BDA0004180744620000112
优选地，所述免疫原由苯海拉明半抗原DPH-2C偶联牛血清白蛋白得到。
优选地，所述包被原由苯海拉明半抗原DPH-2C、DPH-4C或DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到，即包被原为苯海拉明人工抗原DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA、或DPH-OH-OVA。
更优选地，所述包被原由苯海拉明半抗原DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到，即为苯海拉明人工抗原DPH-OH-OVA。
任一上述苯海拉明人工抗原组合在检测苯海拉明中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
一种检测苯海拉明的免疫分析方法，使用任一上述苯海拉明人工抗原组合进行检测，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
优选地，所述苯海拉明人工抗原组合中，免疫原由苯海拉明人工抗原DPH-2C偶联牛血清白蛋白得到。
任一上述苯海拉明人工抗原组合在制备检测苯海拉明的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种检测苯海拉明的试剂盒，包含苯海拉明人工抗原组合，所述苯海拉明人工抗原组合包含免疫原和包被原，所述免疫原由所述苯海拉明半抗原DPH-2C偶联牛血清白蛋白得到，即为苯海拉明人工抗原DPH-2C-BSA；所述包被原由所述苯海拉明半抗原DPH-NC或DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到，即包被原为苯海拉明人工抗原DPH-NC-OVA或DPH-OH-OVA。
优选地，所述试剂盒包含抗体，所述抗体由所述免疫原免疫动物得到。
更优选地，所述抗体为多克隆抗体，则由偶联牛血清白蛋白的所述苯海拉明半抗原DPH-2C免疫兔子，收集血清，即得。
更优选地，所述抗体为单克隆抗体，则由偶联牛血清白蛋白的所述苯海拉明半抗原DPH-2C免疫小鼠，细胞融合筛选后，进行小鼠腹腔注射，收集腹水，即得。
后续可采用辛酸-硫酸铵法进一步纯化得到血清或腹水中的抗体。
优选地，所述试剂盒还包含酶标板、苯海拉明标准品和底物显色液。
更优选地，所述酶标板上包被有所述包被原。
进一步优选地，所述酶标板上包被有由所述苯海拉明半抗原DPH-2C、DPH-4C或DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到的包被原，即包被原为苯海拉明人工抗原DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA或DPH-OH-OVA。
最优选地，所述酶标板上包被有由所述苯海拉明半抗原DPH-OH偶联鸡卵白蛋白得到的包被原，即包被原为苯海拉明人工抗原DPH-OH-OVA。
更优选地，所述底物显色液包含过氧化脲和四甲基联苯胺。
更优选地，所述试剂盒还包含终止液、洗涤液、封闭液、酶结合物浓缩液和稀释液。
进一步优选地，所述终止液体积分数为8％～12％ H2SO4。
最优选地，所述终止液体积分数为10％ H2SO4。
进一步优选地，所述洗涤液为含有体积分数为0.5％～1.0％吐温-20、质量分数为0.01％～0.03％叠氮化钠防腐剂、0.1mol/L～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2～7.6。
最优选地，所述洗涤液为含有体积分数为0.8％吐温-20、质量分数为0.02％叠氮化钠防腐剂、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
进一步优选地，所述封闭液为含有质量分数为1％～3％酪蛋白、0.1mol/L～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.1～7.5。
最优选地，所述封闭液为含有质量分数为2％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.3。
进一步优选地，所述酶结合物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体。
进一步优选地，所述稀释液为0.1mol/L～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。
最优选地，所述稀释液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液。
一种检测苯海拉明的胶体金试纸条，包括PVC底板和依次排列在PVC底板上的样品垫、纤维素膜和吸水垫，所述纤维素膜上设有检测线和控制线，所述检测线包被苯海拉明人工抗原DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA或DPH-OH-OVA，所述控制线包被羊抗兔IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体。
优选地，所述检测线包被苯海拉明人工抗原DPH-OH-OVA。
所述胶体金试纸条的使用方法如下：
将待测样品用磷酸盐缓冲液稀释后，加入胶体金标记的上述的多克隆抗体或单克隆抗体，吹打混匀，充分孵育后，滴加至胶体金试纸条的样品垫，静置直至待测样品充分渗入吸水垫，进行结果判定；
具体判定方法为：
控制线不显色，则检测效果无效，需重新检测；控制线显示红色，则检测效果有效，进一步判读检测线：检测线不显色或者显色很弱，即表示待测样品中含有苯海拉明，判读结果为阳性或者弱阳性；检测线显示红色，即表示待测样品中不含苯海拉明，判读结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了两种苯海拉明半抗原，并制备得到苯海拉明的抗体，效价高，特异性强，亲和力高，为建立特异性苯海拉明的免疫检测方法提供了核心原材料。本发明还建立了特异性和灵敏度更高的苯海拉明的免疫分析方法，最低检测限LOD为0.099ng/mL，半抑制浓度IC50为1.77ng/mL，定量检测范围为0.29ng/mL～10.93ng/mL，对苯海拉明的类似物均无交叉反应，可对样品中的苯海拉明进行快速的定性和定量检测，操作简便，检测结果准确可靠。
附图说明
图1为苯海拉明半抗原DPH-NC的合成路线图，a～c依次对应DPH-2C、DPH-4C和DPH-6C的合成路线。
图2为苯海拉明半抗原DPH-OH的合成路线图。
图3为苯海拉明半抗原DPH-NC-BSA和DPH-NC-OVA的紫外扫描鉴定结果图，a～f依次对应DPH-2C-BSA、DPH-4C-BSA、DPH-6C-BSA、DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA和DPH-6C-OVA的鉴定结果。
图4为苯海拉明半抗原DPH-OH、OVA和DPH-OH-OVA的紫外扫描图。
图5为苯海拉明苯海拉明的单克隆抗体间接竞争ELISA标准曲线。
图6为本申请实施例8的苯海拉明胶体金快速检测试纸条的结构示意图；其中包括：PVC塑料底板、样品垫、NC膜、吸水垫、测试线和控制线。
图7为本申请实施例8的苯海拉明胶体金快速检测试纸条的结果判定图；其中：A为有效的阴性检测结果，B为有效的阳性检测结果，C和D为无效的检测结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1苯海拉明半抗原的合成与鉴定
一、苯海拉明半抗原DPH-NC(即DPH-2C、DPH-4C和DPH-6C)的合成与鉴定
1、苯海拉明半抗原DPH-2C的合成与鉴定
(1)苯海拉明半抗原DPH-2C的合成
苯海拉明半抗原的合成路线如图1中的a所示，具体步骤如下：
将1mol 2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于10mL重蒸水，加入200μL 1M氢氧化钠溶液除盐，搅拌1h后旋干除去水分，用5mL乙腈复溶，后加入2mol溴乙酸乙酯和6mol碳酸钾，常温(25℃)下搅拌过夜(12h)，得到反应物；柱层析(固定相为硅胶粉，流动相为乙酸乙酯：甲醇＝15：1)分离纯化反应物，将20mg所得纯化产物溶解于2mL甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，旋干除去溶剂所得沉淀即得半抗原DPH-2C。
(2)苯海拉明半抗原DPH-2C的鉴定
苯海拉明半抗原DPH-2C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.56-7.09(m,10H),5.52(s,1H),3.93–3.70(m,4H),3.50(t,J＝4.9Hz,2H),2.94(s,3H)。
苯海拉明半抗原DPH-2C的质谱结果为：MS：C18H21NO3：299.37，ESI-[M-H]+：300.2。
由质谱核磁结果可以看出，质谱结果可对应上DPH-2C分子量且核磁的氢谱数可对应DPH-2C结构上的氢谱数，说明成功制备得到了苯海拉明半抗原DPH-2C，其结构式如式(Ⅰ)所示，
Figure BDA0004180744620000151
苯海拉明半抗原DPH-2C采用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)乙酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)acetic acid。
2、苯海拉明半抗原DPH-4C的合成与鉴定
(1)苯海拉明半抗原DPH-4C的合成
苯海拉明半抗原的合成路线如图1中的b所示，具体步骤与本实施例中苯海拉明半抗原DPH-2C的合成步骤基本相同，区别仅在于用溴丁酸乙酯代替溴乙酸乙酯。
(2)苯海拉明半抗原DPH-4C的鉴定
苯海拉明半抗原DPH-4C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.52–6.99(m,10H),5.53(s,1H),3.84–3.74(m,2H),3.49–3.17(m,4H),2.39(t,J＝6.9Hz,2H),2.14–1.80(m,3H),1.44–1.08(m,2H)。
苯海拉明半抗原DPH-4C的质谱结果为：MS：C20H25NO3：327.42，ESI-[M-H]+：329.0。
由质谱核磁结果可以看出，质谱结果可对应上DPH-4C分子量且核磁的氢谱数可对应DPH-4C结构上的氢谱数，说明成功制备得到了苯海拉明半抗原DPH-4C，其结构式如式(Ⅱ)所示，
Figure BDA0004180744620000161
苯海拉明半抗原DPH-4C采用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)丁酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)butanoic acid。
3、苯海拉明半抗原DPH-6C的合成与鉴定
(1)苯海拉明半抗原DPH-6C的合成
苯海拉明半抗原的合成路线如图1中的c所示，具体步骤与本实施例中苯海拉明半抗原DPH-2C的合成步骤基本相同，区别仅在于用溴己酸乙酯代替溴乙酸乙酯。
(2)苯海拉明半抗原DPH-6C的鉴定
苯海拉明半抗原DPH-6C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.33–7.05(m,10H),5.38(s,1H),3.65(dd,J＝5.7,4.3Hz,2H),3.22(d,J＝5.0Hz,2H),2.99–2.89(m,2H),3.69(s,3H),2.07(t,J＝7.3Hz,2H),1.65–1.42(m,4H)：。
苯海拉明半抗原DPH-6C的质谱结果为：MS：C22H29NO3：355.48，ESI-[M-H]+：356.6。
由质谱核磁结果可以看出，质谱结果可对应上DPH-6C分子量且核磁的氢谱数可对应DPH-6C结构上的氢谱数，说明成功制备得到了苯海拉明半抗原DPH-6C，其结构式如式(Ⅲ)所示，
Figure BDA0004180744620000162
苯海拉明半抗原DPH-6C采用系统命名法命名为：4-((2-二苯基甲氧基)乙基(甲基)氨基)己酸，即4-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)hexanoic acid。
4、苯海拉明半抗原DPH-NC
苯海拉明半抗原DPH-NC的结构通式如式(Ⅳ)所示，
Figure BDA0004180744620000171
其中，n＝1、3或5。
当n＝1时，苯海拉明半抗原DPH-NC即为DPH-2C；当n＝3时，苯海拉明半抗原DPH-NC即为DPH-4C；当n＝5时，苯海拉明半抗原DPH-NC即为DPH-6C。
二、苯海拉明半抗原DPH-OH的合成与鉴定
1、苯海拉明半抗原DPH-OH的合成
苯海拉明半抗原DPH-OH的合成路线如图2所示，具体步骤如下：
将1mol二苯基溴甲烷溶于5mol氯苯，加热至温度达到110℃，再加入2mol N-甲基二乙醇胺混合均匀，110℃下在溶剂氯苯中回流反应6h，通过柱层析(硅胶粉作为固定相，用体积比为乙酸乙酯：甲醇：氨水＝30：5：1的混合溶液作为流动相)法分离纯化后，旋蒸干燥直至去除全部溶剂，即得。
2、苯海拉明半抗原DPH-OH的鉴定
苯海拉明半抗原DPH-OH的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.42–6.90(m,10H),5.38(s,1H),3.71–3.60(m,2H),3.28–3.14(m,2H),1.69–1.40(m,4H),1.31–1.11(m,3H)。
苯海拉明半抗原DPH-OH的质谱结果为：MS：C18H23NO2：285.39，ESI-[M-H]+：286.9。
由质谱核磁结果可以看出，质谱结果可对应上DPH-OH分子量且核磁的氢谱数可对应DPH-OH结构上的氢谱数，说明成功制备得到了苯海拉明半抗原DPH-OH，其结构式如式(Ⅴ)所示，
Figure BDA0004180744620000181
苯海拉明半抗原DPH-OH采用系统命名法命名为：2-((2-(二苯基甲氧基)乙基)(甲基)氨基)乙醇；即2-((2-(benzhydryloxy)ethyl)(methyl)amino)ethanol。
实施例2苯海拉明人工抗原的合成与鉴定
一、苯海拉明半抗原DPH-NC人工抗原的合成与鉴定
1、苯海拉明半抗原DPH-NC人工抗原的合成
将实施例1制备的苯海拉明半抗原DPH-NC(即DPH-2C、DPH-4C和DPH-6C)通过活泼酯法偶联牛血清白蛋白(BSA)，具体步骤如下：
取1mol苯海拉明半抗原DPH-2C、0.8mol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.9mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温(25℃)下避光搅拌3h，得到半抗原DPH-NC活化液，记为A液；将10mg BSA溶于1mL PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)，得到BSA溶液，记为B液；将200μL A液缓慢逐滴加入1mL B液中，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得到苯海拉明人工抗原DPH-2C-BSA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
按照上述方法，区别仅在于，分别用DPH-4C和DPH-6C代替DPH-2C，制备得到苯海拉明人工抗原DPH-4C-BSA和DPH-6C-BSA，另用鸡卵白蛋白(OVA)代替BSA，制备得到苯海拉明人工抗原DPH-NC-OVA(即DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA和DPH-6C-OVA)。
2、苯海拉明半抗原DPH-NC人工抗原的鉴定
取上述BSA、DPH-NC(即DPH-2C、DPH-4C和DPH-6C)、DPH-NC-BSA(即DPH-2C-BSA、DPH-4C-BSA和DPH-6C-BSA)和DPH-NC-OVA(即DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA和DPH-6C-OVA)，分别用紫外全波长法(200～350nm)进行扫描鉴定。
如图3中的a～c所示，通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现DPH-NC-BSA的吸收曲线与载体蛋白BSA明显不同，DPH-NC在260nm以上吸收峰较强，而偶联BSA后，DPH-NC-BSA的吸收峰在230nm处明显比BSA高而在280nm处明显比BSA低，且相对半抗原DPH-NC的曲线发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，说明反应产物是载体蛋白BSA与DPH-NC的复合物。
如图3中的d～f所示，通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现DPH-NC-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，DPH-NC在260nm以上吸收峰较强，而偶联OVA后，DPH-NC-OVA的吸收峰虽然在230nm处与OVA的吸收峰基本吻合，但在240nm处DPH-NC-OVA明显比OVA多了一个特征峰，且在280nm处DPH-NC-OVA的吸收峰明显比OVA高，此外，相对半抗原DPH-NC的曲线发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，说明反应产物是载体蛋白OVA与DPH-NC的复合物。
以上结果表明，本发明成功制备得到了苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA和DPH-NC-OVA，其结构式如式(Ⅵ)所示，
Figure BDA0004180744620000191
其中，n＝1、3或5，P为载体蛋白BSA或OVA。
二、苯海拉明半抗原DPH-OH人工抗原的合成与鉴定
1、苯海拉明半抗原DPH-OH人工抗原的合成
将实施例1制备的苯海拉明半抗原DPH-OH通过羰基二咪唑法偶联鸡卵白蛋白(OVA)，具体步骤如下：
取1mol苯海拉明半抗原DPH-OH和2mol羰基二咪唑(CDI)，溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温(25℃)下避光搅拌3h，得到半抗原DPH-OH活化液，记为C液；将10mgOVA溶于1mL PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)，得到OVA溶液，记为D液；将200μL C液缓慢逐滴加入1mL D液中，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得苯海拉明人工抗原DPH-OH-OVA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
2、苯海拉明半抗原DPH-OH人工抗原的鉴定
取上述OVA、DPH-OH和DPH-OH-OVA，分别用紫外全波长法(200～350nm)进行扫描鉴定。
紫外全波长扫描鉴定结果如图4所示，通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现DPH-OH-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，半抗原DPH-OH在270nm有一个特征峰，而偶联OVA后，DPH-OH-OVA的吸收峰在280nm处明显比OVA高，且相对半抗原DPH-OH的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，说明反应产物是载体蛋白OVA与半抗原DPH-OH的复合物。本发明成功制备得到了苯海拉明人工抗原DPH-OH-OVA，其结构式如式(Ⅶ)所示，
Figure BDA0004180744620000201
其中，P为载体蛋白OVA。
实施例3用于检测苯海拉明的抗体的制备
1、多克隆抗体的制备
将实施例2制备的苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA(即DPH-2C-BSA、DPH-4C-BSA和DPH-6C-BSA)作为免疫原，与免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫体重为2.5～3kg新西兰大白兔。采用颈部和背部皮下多点注射对大白兔进行免疫，4周后进行第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉注射对大白兔进行加强免疫。一周后对大白兔进行心脏采血，收集到的血液在37℃下温浴0.5h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，5000rpm离心10min，取上清，即得到抗血清。采用硫酸铵沉淀法纯化抗血清即得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2、单克隆抗体的制备
利用实施例2制备的苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA(即DPH-2C-BSA、DPH-4C-BSA和DPH-6C-BSA)免疫雌性Balb/c小鼠。取人工抗原DPH-NC-BSA与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀后，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，尾部取血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次免疫，3天后取小鼠脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，将筛选到的阳性杂交瘤细胞对进行小鼠腹腔注射，收集腹水，得到单克隆抗体。
实施例4免疫原和包被原的组合
一、实验方法
以实施例2制得的DPH-OH-OVA和DPH-NC-OVA(即DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA和DPH-6C-OVA)作为包被原，利用实施例3制得的多克隆抗体，经ELISA检测免疫新西兰大白兔所获得抗血清的效价和抑制率。具体操作步骤如下：
1、用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释包被原至浓度为250ng/mL，按照100μL/孔的添加量包被96孔酶标板，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；
2、每孔加入120μL封闭液(含1wt％鱼皮胶原蛋白的PBST)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
3、将实施例3制得的多克隆抗体用PBST稀释为1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000和1:256000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；用PBST将1mg/mL苯海拉明标准品稀释1000倍至浓度为1μg/mL；
4、效价列设置：先每孔加50μL PBST，再每孔加50μL不同稀释比例的多克隆抗体，最后一个孔加50μL PBST代替抗体；
5、抑制列设置：先每孔加50μL苯海拉明稀释液，再每孔加50μL不同稀释比例的多克隆抗体，最后一个孔加50μL PBST代替抗体；
6、在37℃下温育40min，洗涤5次，拍板；
7、加入羊抗兔二抗-HRP(用PBST稀释5000倍)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；
8、加入显色液，在37℃下温育显色10min；
9、加入10％v/v H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值；统计效价和抑制率，效价是OD450为1.0左右所对应的抗体稀释倍数，抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值×100％。
二、实验结果
不同免疫原和包被原的组合ELISA检测结果如表1所示。
表1免疫原和包被原的ELISA检测结果
Figure BDA0004180744620000221
从表1中可以看出，苯海拉明人工抗原DPH-NC-BSA(即DPH-2C-BSA、DPH-4C-BSA和DPH-6C-BSA)作为免疫免疫原的新西兰大白兔，产生的抗血清均有一定的效价，所得抗血清对目标分析物苯海拉明均有不同程度的抑制效果。
编号1、编号2和编号4的免疫原和包被原的组合，抗血清效价均高于1：128000且抑制率均高于90％，均可用于特异性识别目标分析物苯海拉明，而且抗体灵敏度好。其中，编号4的免疫原和包被原的组合，抗血清效价最高且抑制率最高为最佳组合。
实施例5苯海拉明间接竞争ELISA检测方法的建立
一、一种苯海拉明的间接竞争ELISA检测方法，包括以下步骤：
1、将实施例2制备的苯海拉明人工抗原DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA或DPH-OH-OVA作为包被原，用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)分别稀释至浓度为62.5ng/mL；以100μL/孔包被96孔酶标板，37℃孵育过夜(12h)；
2、弃包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％v/v Tween-20)洗2次，拍干；
3、每孔加入120μL封闭液(含1wt％鱼皮胶原蛋白的PBST)，37℃封闭3h；
4、弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
5、将实施例3制得的单克隆抗体用PBST按照体积比1:4000进行稀释，并将苯海拉明标准品稀释至浓度为10000ng/mL、1000ng/mL、125ng/mL、15.63ng/mL、1.95ng/mL、0.24ng/mL、0.031ng/mL、0.0038ng/mL和0.00048ng/mL；
6、加入50μL/孔不同浓度的苯海拉明标准品(三组平行)，再加入50μL/孔稀释后的单克隆抗体，37℃孵育40min，洗涤五次，拍干；
7、加入100μL/孔，羊抗鼠二抗-HRP(用PBST稀释5000倍)，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
8、加入100μL/孔显色液，显色10min；
9、加入50μL体积分数为10％的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
10、ELISA标准曲线绘制：以B/B0作为纵坐标(B为不同浓度苯海拉明的标准品的吸光值OD450，B0为空白对照孔的吸光值OD450)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。
2.检测结果
用于检测苯海拉明的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，可以看出用于检测苯海拉明的抗体半抑制浓度(IC50)为1.77ng/mL，最低检测限(LOD)为0.099ng/mL，定量检测范围为0.29ng/mL～10.93ng/mL；说明本发明制备得到的用于检测苯海拉明的抗体可以满足检测要求，本发明建立的一种苯海拉明的间接竞争ELISA检测方法对苯海拉明的识别能力高，灵敏度高。
实施例6用于检测苯海拉明的抗体的特异性
1、实验方法
异苯海拉明、甲苯海明和氯苯那敏均为苯海拉明的类似物，过交叉反应实验来确定本发明制备的抗体对检测苯海拉明的特异性。
按照实施例5的方法，区别仅在于将苯海拉明标准品替换为异苯海拉明、甲苯海明和氯苯那敏的标准品，以同样的稀释倍数进行检测，得到各结构类似物的IC50值。按照以下公式计算苯海拉明交叉反应率(CR)：CR(％)＝IC50(苯海拉明)/IC50(结构类似物)×100％，交叉反应率越小，则表示特异性越强。
2、实验结果
表2苯海拉明单克隆抗体与苯海拉明及其类似物的交叉反应结果
Figure BDA0004180744620000231
注：NR表示无反应，无反应即抗体不识别该类似物。
从表2可知，用于检测苯海拉明的单克隆抗体对苯海拉明的交叉反应率为100％，IC50为1.77ng/mL，对苯海拉明类似物异苯海拉明、甲苯海明和氯苯那敏均无交叉；说明用于检测苯海拉明的抗体对苯海拉明的识别能力高，特异性强，可以有效地排除苯海拉明类似物异苯海拉明、甲苯海明和氯苯那敏检测的干扰，能够专门用于对苯海拉明的检测。
实施例7一种检测苯海拉明的ELISA试剂盒
1、组成
(1)包被有包被原的酶标板，由如下方法制备得到：
将实施例2制备的苯海拉明人工抗原DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA或DPH-OH-OVA作为包被原，用包被原液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至62.5ng/mL，按照100μL/孔的添加量包被96孔酶标板，37℃避光孵育过夜；倾去孔中液体，用本试剂盒中的洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干；然后按照200μL/孔加入本试剂盒的封闭液，25℃避光孵育2h；倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；
(2)标准品：8个不同浓度的苯海拉明标准品，分别为1000ng/mL、125ng/mL、15.63ng/mL、1.95ng/mL、0.24ng/mL、0.031ng/mL、0.0038ng/mL和0.00048μg/L；
(3)抗体：实施例3制备的用于检测苯海拉明的多克隆抗体或单克隆抗体；
(4)酶结合物：辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗或辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗；
(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液：2mol/L H2SO4；
(7)洗涤液：pH值为7.4，含有体积分数为0.8％吐温-20、质量分数为0.02％叠氮化钠防腐剂、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；使用前用水将洗涤液稀释20倍(即1份洗涤液加入19份水，现配现用)，即得到洗涤液工作液；
(8)稀释液：0.2mol/L磷酸盐缓冲液；使用前用水将稀释液稀释20倍(即1份稀释液加入19份水，现配现用)，即得到稀释液工作液；
(9)封闭液：pH值为7.3，含有质量分数为2％酪蛋白的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。
2、使用方法
(1)样品检测
将样品和本试剂盒的标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将抗体用稀释液工作液按1：40体积比进行稀释(即1份抗体加入40份稀释液工作液，现配现用)，得到抗体工作液。根据需要量将酶结合物浓缩液用稀释液工作液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份稀释液工作液，现配现用)，得到酶结合物工作液。
加入标准品或样品50μL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50μL到相应的微孔中，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，弃掉板孔内洗涤液工作液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可使用未使用过的枪头戳破)。
加入酶结合物工作液100μL/孔到对应的微孔中,轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，弃掉板孔内洗涤液工作液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可使用未使用过的枪头戳破)。
加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。
加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
(2)标准曲线的绘制
根据上述最优条件绘制ELISA标准曲线，以B/B0作为纵坐标(B为添加标准品时的吸光值OD450，B0为不添加标准品时的吸光值OD450)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。
(3)样品浓度的计算
将样品的测定的吸光值OD450值代入上述计算公式，计算得到样品的百分吸光率；将样品的百分吸光率代入上述标准曲线的公式，得到样品的浓度，再乘以其对应的稀释倍数即得到检测样本中苯海拉明的实际浓度。
实施例8一种检测苯海拉明的胶体金试纸条
1、胶体金快速检测试纸条的组装
如图6所示，胶体金快速检测试纸条是由NC膜(硝酸纤维素膜)、样品垫、吸水垫和PVC塑料底板叠加而成。用XYZ三维喷点划膜仪将包被原(DPH-2C-OVA、DPH-4C-OVA或DPH-OH-OVA)以0.8μL/cm的喷量喷涂在NC膜上，作为测试线(T线)；以相同的方法和剂量将羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG喷涂在NC膜上，作为控制线(C线)；测试线(T线)和控制线(C线)位于NC膜的中间并且彼此间隔6mm；37℃下干燥12h后，把纤维素膜粘贴在衬板中间部位上，样品垫与NC膜T线端重叠1mm，吸水垫粘贴在纤维素上侧和纤维素膜3重叠1mm，组装好的试纸板用斩切机切成3.5mm宽的试纸条。
2、金标抗体的制备
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备平均直径在30nm的胶体金悬浮液，具体方法如下：取1mL胶体金溶液，加入0.2mol/L的K2CO3溶液调节pH到8.0左右，加入10μg实施例3制备的多克隆抗体或单克隆抗体孵育30min，再加入10％wt BSA溶液孵育30min，在4℃10000rpm离心20min，并去上清，用200μL 0.2mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含0.5％v/v/吐温-20、0.5％wt BSA、5％wt蔗糖、0.3％wt聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.03％v/vprocline-300)重悬，4℃保存。
3、检测样品液的制备
将待测样品与PBST按照体积比为1:900混合均匀，得到样品液。
4、检测步骤
取120μL样品液与5μL金标抗体反复吸打混合均匀，室温孵育5min，随后将试纸条插入样品液中反应3min，随后取出试纸条去除样品垫，3～5分钟后进行结果判定。
5、检测结果判定
如图7所示，如果样品中不含有待测物苯海拉明，则金标抗体与快速检测是纸条上T线(测试线)上的包被原结合，使测试线显示一条清晰的红色线即表示检测样品为阴性(如图7中的A)；如果样品中含有待测物苯海拉明，则苯海拉明与金标抗体进行结合而不能被快速检测试纸条上的测试线捕获，进而测试线不显色即表示为阳性(如图7中的B)；同样，金标抗体也与纤维素膜上的C线(控制线)上的羊抗鼠IgG结合，使控制线显红色，控制线有颜色即表示此试纸条的检测结果有效(如图7中的A和B)，控制线没有颜色即表示此试纸条的检测结果无效(如图7中的C和D)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苯海拉明半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅳ)所示，
Figure FDA0004180744610000011
其中，n＝1、3或5。
2.一种苯海拉明半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅴ)所示，
Figure FDA0004180744610000012
3.结构式如式(Ⅳ)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
除盐后的2-(二苯基甲氧基)-N-甲基乙胺盐酸盐溶于乙腈后，与溴代脂肪酸酯类化合物和碳酸钾充分反应，所得反应物在碱性条件下充分水解，之后将pH调节至酸性，即得；
Figure FDA0004180744610000013
Figure FDA0004180744610000021
其中，n＝1、3或5。
4.结构式如式(Ⅴ)所示化合物的制备方法，其特征在于，将二苯基溴甲烷、氯苯和N-甲基二乙醇胺充分反应，即得；
Figure FDA0004180744610000022
5.权利要求1和/或权利要求2所述苯海拉明半抗原在制备苯海拉明人工抗原中的应用。
6.一种苯海拉明人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述苯海拉明半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅵ)所示，
Figure FDA0004180744610000023
其中，n＝1、3或5，P为载体蛋白。
7.一种苯海拉明人工抗原，其特征在于，由权利要求2所述苯海拉明半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅶ)所示，
Figure FDA0004180744610000024
Figure FDA0004180744610000031
其中，P为载体蛋白。
8.权利要求6和/或权利要求7所述苯海拉明人工抗原在制备苯海拉明的抗体中的应用。
9.一种苯海拉明人工抗原组合，其特征在于，包含免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求6所述苯海拉明人工抗原偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由权利要求6或7所述苯海拉明人工抗原偶联鸡卵白蛋白得到。
10.权利要求9所述苯海拉明人工抗原组合在制备检测苯海拉明的试剂盒中的应用。
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