CN116298239A - 甲醛检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用 - Google Patents

甲醛检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用。检测甲醛的免疫分析方法，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工抗原2。苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛转化为苯并咪唑；应用本发明的抗体构建间接检测食品中甲醛的酶联免疫分析，对甲醛检测限为20.91ng/mL，半抑制浓度为137.38ng/mL，对邻苯二胺以及其他甲醛结构类似物交叉反应很低，均小于0.2％，可有效的排除其类似物的干扰，该方法具有检测灵敏度高，特异性高、检测通量高等优势，具有广阔的应用前景。

Description

甲醛检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用。
背景技术
甲醛是一种无色、易挥发具有刺激性气味的物质，具有较高的毒性，易溶于水，其水溶液俗称“福尔马林”，常用作防腐剂和消毒剂。日常生活当中能接触到的甲醛最主要的来源于工业生产排放、建筑物室内装修以及家具材料所释放、人们日常生活当中燃烧矿物质所排放以及人为添加了甲醛或者被甲醛污染的食品。
甲醛已经被世界卫生组织确认为致畸、致癌物质，存在潜在的导致基因突变性，长期接触将极大的威胁人类健康，尤其是对儿童、孕妇造成的影响更大，过量的甲醛则会损伤中枢神经系统，引发过敏性肺炎、心血管疾病和癌症等疾病。因此准确测定生物体内甲醛的含量，防止其过量摄入或集聚，对人体健康具有重要意义。
甲醛为国家明文规定的禁止在食品中使用的添加剂，在食品中不得检出，对人体会产生较大的危害，同时也是一种致癌物质。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，将甲醛放在一类致癌物列表中。2019年7月23日，我国生态环境部将甲醛列入有毒有害水污染物名录(第一批)。
目前，甲醛的检测方法较多，主要有分光光度法、比色法、气相色谱法、液相色谱法、荧光探针法等。这些方法的检出限主要在0.06～1.2mg/kg之间，但这些方法都有着各自的优缺点，分光光度法通常选择性差，灵敏度低，比色法虽分析速度快但缺乏特异性，而色谱法样品处理相对复杂，这些方法都不适宜进行大批量的快速筛选，因此，需发明一种针对甲醛的快速、简便的检测方法。
基于抗原抗体特异性结合的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。国际权威学术刊物将其列为近年来首位优先发展的新分析技术。但是由于甲醛分子太小，抗原特征表位不明显，目前尚无可用于检测甲醛的半抗原、抗原和抗体及免疫检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中甲醛检测技术的缺陷和不足，提供一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用，苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛完全反应。通过检测苯并咪唑可以间接检测甲醛的含量。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
第一方面，一种检测甲醛的免疫分析方法，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；其中，
所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工抗原2；式IV如下：
Figure BDA0003976364910000021
式V如下：
Figure BDA0003976364910000022
优选地，所述免疫分析方法以人工抗原2为包被原，以人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
一种检测甲醛的免疫分析方法，将甲醛与邻苯二胺充分反应转化为苯并咪唑，以人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体，通过标准加入校准曲线法对样品中的甲醛进行定量测定。
优选地，以人工抗原2为包被原，以人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
作为上述方法的具体实施方式，包括如下步骤：
(1)利用人工抗原2免疫动物制备单克隆抗体；
(2)将人工抗原2作为包被原包被在微孔板上，然后将步骤(1)制备得到多克隆抗体加入微孔板中；
(3)加入甲醛充分衍生后的苯并咪唑待测样品，采用竞争ELISA测定苯并咪唑的含量，从而间接测定甲醛的含量，苯并咪唑与甲醛的摩尔比为1：1。
优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)。
优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。
优选地，偶联鸡卵清白蛋白的人工抗原2包被浓度为1μg/mL，甲醛抗体稀释倍数为4000倍。
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫分析、免疫传感、免疫胶体金等。
第二方面，5-氨基苯并咪唑和/或5-羧基苯并咪唑作为半抗原在制备甲醛人工抗原和/或甲醛抗体中的应用。
已知，5-氨基苯并咪唑和5-羧基苯并咪唑结构式分别如式(II)和式(III)所示，本发明研究表明可利用5-氨基苯并咪唑和/或5-羧基苯并咪唑作为半抗原制备甲醛的人工抗原和/或甲醛抗体，并间接检测甲醛；
Figure BDA0003976364910000031
第三方面，一种甲醛人工抗原，为人工抗原1或人工抗原2，人工抗原1结构式如式(IV)所示，
Figure BDA0003976364910000032
人工抗原2结构式如式(V)所示，
Figure BDA0003976364910000041
优选地，所述甲醛人工抗原偶联的载体蛋白(protein)为乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
所述甲醛人工抗原在制备甲醛抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。
第四方面，所述人工抗原1的制备方法，以5-氨基苯并咪唑为半抗原，通过重氮化法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
先将半抗原5-氨基苯并三唑溶解于冰盐酸中，然后加入NaNO2溶液冰浴避光搅拌反应，反应结束后将反应液在冰浴搅拌下缓慢加入载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；偶联混合物在低温下透析数天，得到所述人工抗原1。
优选地，所述人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS缓冲液中；
(2)将5-氨基苯并咪唑半抗原溶解于1M冰盐酸溶液中；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1；
(3)将NaNO2加入到步骤(2)的半抗原溶解液中，4℃避光反应形成重氮盐；所述NaNO2与半抗原的摩尔比为1～2：1。
(4)将重氮盐滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原1。
进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白的摩尔比为100：1；
进一步优选地，所述半抗原与鸡卵清蛋白的摩尔比为300：1；
进一步优选地，所述NaNO2与半抗原的摩尔比为1.2：1。
第五方面，所述人工抗原2的制备方法，以5-羧基苯并咪唑为半抗原，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
将5-羧基苯并咪唑溶于0.1M MES水溶液中，加入EDC和NHS室温避光搅拌，反应结束后转移至冰浴，将载体蛋白溶解后加入，搅拌均匀，室温偶联过夜；偶联混合物低温下PBS透析数天，得到所述人工抗原2。
优选地，所述的人工抗原2的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS缓冲液中；
(2)将5-羧基苯并咪唑半抗原溶解于0.1M MES溶液中；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1。
(3)将EDC和NHS加入步骤(2)的半抗原溶解液中，室温避光反应4h形成活泼酯；EDC：NHS：5-羧基苯并三唑摩尔比＝1～2：1～2：1；
(4)将活泼酯滴加入步骤(1)的载体蛋白溶液中，室温避光偶联过夜；
(5)反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS透析3天，得到人工抗原2。
进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白的摩尔比为100：1；
进一步优选地，所述半抗原与鸡卵清蛋白的摩尔比为300：1；
进一步优选地，EDC：NHS：5-羧基苯并咪唑摩尔比＝1.5：1.5：1。
第六方面，一种甲醛人工抗原组合，包括甲醛人工抗原中的两种。
优选地，所述甲醛人工抗原组合包括人工抗原1和人工抗原2。
优选地，所述甲醛人工抗原组合包括以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原1和以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原1。
进一步优选地，所述甲醛人工抗原组合包括作为免疫原的以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2和作为包被原的以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2。
第七方面，所述甲醛人工抗原组合在制备甲醛抗体和/或检测甲醛中的应用也在本发明的保护范围之内。
第八方面，一种甲醛抗体，利用甲醛人工抗原免疫动物制备得到。
优选地，所述甲醛抗体是利用人工抗原2免疫动物制备得到。
进一步优选地，所述甲醛抗体是利用以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原2免疫动物制备得到。
优选地，所述抗体为单克隆抗体。
第九方面，一种甲醛抗体的制备方法，利用甲醛人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对甲醛的抗体，所述抗体是能与甲醛发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。
优选地，利用人工抗原2免疫实验动物。
进一步优选地，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2免疫实验动物。
作为上述方法的一个具体实施方式，甲醛单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)利用人工抗原配合弗式佐剂免疫实验动物；
(2)首次免疫时，人工抗原用等体积的弗式完全佐剂乳化后免疫6-7周龄的Balb/c小鼠，乳化后每只小鼠的免疫剂量为0.1mL/只；
(3)加强免疫时，用相同剂量的人工抗原与等体积的弗式不完全佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠；
(4)加强免疫四次后，心脏取血分离获得血清即鼠源多克隆抗体。
(5)使用PEG对脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合进行细胞融合。
(6)在HAT培养基中培养7天后，使用ICELISA筛选杂交瘤的上清液，通过有限稀释法将阳性孔中的每个杂交瘤亚克隆到完全培养基中。
(8)七天后，通过ICELISA进行阳性和抑制性测定的筛查。经过四次有限稀释后，将阳性杂交瘤的一部分冷冻保存，并将另一部分注射到小鼠腹腔中以产生腹水。
(9)七天后收集腹水，使用蛋白质G免疫亲和度柱纯化腹水，即单克隆抗体。
甲醛抗体在检测甲醛中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用是在检测甲醛的试剂盒或检测甲醛的免疫分析方法中的应用。
第十方面，一种检测甲醛的试剂盒，包含作为包被原的人工抗原和以人工抗原免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述检测甲醛的试剂盒还含有衍生试剂邻苯二胺。
优选地，所述试剂盒包括作为包被原的人工抗原2和以人工抗原2免疫动物制备得到的甲醛抗体。
进一步优选地，所述试剂盒包括作为包被原的以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2和以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2免疫动物制备得到的甲醛抗体。
优选地，所述试剂盒包括包被人工抗原的酶标板、甲醛标准品、甲醛抗体工作液、酶标二抗工作液、显色液、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
进一步优选地，试剂盒的包被原为以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2；抗体为以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2免疫动物制备得到的甲醛抗体。
作为上述试剂盒的一个具体实施方式，用于检测甲醛时通过以下步骤实施：
(1)样品预处理，对样品中的甲醛进行提取、浓缩，并加入过量邻苯二胺使甲醛衍生转化为苯并咪唑。
(2)然后将样品衍生液和甲醛抗体分别加入已包被好以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2的包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应。利用酶标仪测试吸光值，定量分析样品中甲醛含量。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
(1)本发明并以5-氨基苯并咪唑和5-羧基苯并咪唑作为甲醛半抗原，应用甲醛半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原1和人工抗原2，应用人工抗原2(5-羧基苯并咪唑-LF)制备得到用于间接检测甲醛的特异性抗体，应用人工抗原2(5-羧基苯并咪唑-OVA)作为人工包被原，该抗体对甲醛的衍生物苯并咪唑具有良好的灵敏度和很高的特异性。苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛转化为苯并咪唑；应用本发明的抗体构建间接检测食品中甲醛的酶联免疫分析(ELISA)，对甲醛检测限为20.91ng/mL，半抑制浓度为137.38ng/mL，对邻苯二胺以及其他甲醛结构类似物交叉反应很低，均小于0.2％，可有效的排除其类似物的干扰，该方法具有检测灵敏度高(检测限可达ppb水平)，特异性高、检测通量高等优势，具有广阔的应用前景。苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛完全反应；本发明的抗体可用于间接检测食品中甲醛的含量；为甲醛快速、准确的检测建立了免疫检测方法。
(2)本发明以5-氨基苯并咪唑和5-羧基苯并咪唑为半抗原，该结构中引入氨基或羧基结构同时保留了甲醛衍生物苯并咪唑的特征结构，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；5-氨基苯并咪唑中的氨基为芳香族氨基具强的反应活性，可在盐酸存在条件下转变为较稳定的重氮盐，能直接偶联到载体蛋白酪氨酸羟基的邻位上制备人工抗原；5-羧基苯并咪唑中的羧基基团能够与载体蛋白的氨基缩合形成稳定酰胺键，使半抗原高效偶联到载体蛋白，从而得到另一种半抗原。
附图说明
图1为甲醛衍生物苯并咪唑的质谱鉴定图；
图2为甲醛人工抗原1及其半抗原、鸡卵清蛋白、乳铁蛋白紫外扫描图；
图3为甲醛人工抗原2及其半抗原、鸡卵清蛋白、乳铁蛋白紫外扫描图；
图4为以甲醛人工抗原2所制备的抗体对甲醛的抑制曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明阐述，但实施例只用于解释本发明，并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1甲醛的衍生与鉴定
1、甲醛与邻苯二胺衍生物的鉴定
取甲醛溶液用1mL 0.4M PBS稀释，将10mg邻苯二胺溶于1mL DMF中并取其10μL加入到甲醛溶液中，混匀后70℃下反应1h，即得到甲醛衍生溶液，其衍生物为苯并咪唑。苯并咪唑的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003976364910000081
ESI-MS鉴定结果如图1所示，与苯并咪唑分子量：118相符。
实施例2人工抗原1的合成和鉴定
1、人工抗原1的合成
人工抗原1的合成方法，包括以下步骤：
将购买(上海源叶生物科技有限公司)的5-氨基苯并咪唑作为半抗原，通过重氮化法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清蛋白(OVA)；所述乳铁蛋白为免疫抗原的载体蛋白，鸡卵清蛋白为包被抗原的载体蛋白。
取17.6mg的半抗原5-氨基苯并咪唑溶解于400μL冰的1M盐酸溶液中，冰浴下避光滴加1100μL 1％ NaNO2，4℃避光搅拌反应；反应过程中用淀粉碘化钾试纸监测，当试纸呈现蓝黑色后继续反应15min形成重氮盐；取20mg乳铁蛋白(LF)和20mg鸡卵清蛋白(OVA)分别溶解于5mL的pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液(CBS；Na2CO31.69g、NaHCO32.95g用一级水定容至1L)中后，冰浴中搅拌分别加入重氮盐(LF中加入550μL，OVA中加入950μL)，搅拌均匀后，4℃避光偶联2h；偶联混合物于4℃下用0.01M PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得人工抗原1(人工抗原1(LF)、人工抗原1(OVA))。人工抗原1以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、人工抗原1的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、5-氨基苯并咪唑以及人工抗原1(LF)、人工抗原1(OVA)进行紫外扫描测定(190～400nm)，结果如图2所示，人工抗原1(5-氨基苯并咪唑-LF、5-氨基苯并咪唑-OVA)的紫外吸收峰与5-氨基苯并咪唑的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原1同时具备5-氨基苯并咪唑和LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原1偶联成功。
实施例3人工抗原2的合成和鉴定
1、人工抗原2的合成
人工抗原2的合成方法，包括以下步骤：
将购买(上海麦克林生化科技有限公司)的5-羧基苯并咪唑作为半抗原，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清蛋白(OVA)；所述乳铁蛋白为免疫抗原的载体蛋白，鸡卵清蛋白为包被抗原的载体蛋白。
取21.4mg的半抗原5-羧基苯并咪唑溶解于600μL 0.1M MES溶液中，搅拌加入390μL100mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和460μL 100mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光搅拌反应4h；取20mg鸡卵清白蛋白(OVA)和20mg乳铁蛋白(LF)分别溶解于5mL PH 9.6的CBS缓冲溶液(Na2CO3 1.69g、NaHCO3 2.95g用一级水定容至1L)中后，冰浴中搅拌加入半抗原活化液(LF中加入290μL，OVA中加入1160μL)，搅拌均匀后，4℃避光偶联2h；偶联混合物于4℃下用0.01M PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得人工抗原32(人工抗原2(LF)、人工抗原2(OVA))。人工抗原2以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、人工抗原2的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、5-羧基苯并咪唑以及人工抗原2(LF)、人工抗原2(OVA)进行紫外扫描测定(190～400nm)，结果如图3所示，人工抗原2的紫外吸收峰与5-羧基苯并咪唑的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原2同时具备5-羧基苯并咪唑和LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原2偶联成功。
实施例4抗体的制备及鉴定
1、抗体的制备
将实施例2、3制备好的载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原分别与等量的免疫佐剂(第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫小鼠。将6～7周大的Balb/C小鼠分别采用背部皮下、各部位皮下、腹腔和脚部多种注射方式免疫，2周后第二次免疫，以后每间隔2周加强免疫一次。第四次加强免疫后1周小鼠尾部取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用腹腔注射加强免疫。3天后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000离心15min，取上清即为抗血清，即为多克隆抗体。
使用PEG对脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合进行细胞融合,经过亚克隆和四次有限稀释后，将阳性杂交瘤的一部分冷冻保存，并将另一部分注射到小鼠腹腔中以产生腹水。七天后收集腹水，使用蛋白质G免疫亲和度柱纯化腹水，即为单克隆抗体。
2、抗体的鉴定
分别用实施例2、3制备的人工抗原1(OVA)和人工抗原2(OVA)作为人工包被原，经ELISA检测人工抗原免疫Balb/C小鼠所获得的抗血清效价和抑制率。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为抗血清和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将包被原稀释成1μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将抗血清分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，1μg/mL甲醛溶液与过量的邻苯二胺做衍生化反应。将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，在酶标仪上读取数据。间接竞争ELISA测定结果如表1所示。
选择在450nm波长处，吸光值(OD)为1～1.5的抗血清稀释倍数为抗血清的效价，抑制率通过公式1进行计算。
抑制率＝100-(OD抑制/OD效价)*100 (公式1)
表1间接竞争ELISA测定结果
Figure BDA0003976364910000101
综合抗血清的效价及抑制率选择效果最优的人工抗原组合，由表1结果可知，抗体效价最高为64000，但其对应的抑制仅为24.36％，抑制较低；因此，选择抑制率为80.59％，效价为4000的组合，即以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原2作为免疫原，以载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2作为包被原进行免疫检测。
实施例5包被浓度与抗体稀释倍数
使用棋盘检测法检测实施例3载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2(人工抗原2(OVA))包被浓度与实施例3以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原2(人工抗原2(LF))为免疫原得到的甲醛多克隆抗体浓度对甲醛检测的影响。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为多克隆抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原2分别稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将甲醛多克隆抗体分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，1μg/mL甲醛溶液与过量的邻苯二胺做衍生化反应；将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
选择在450nm波长处，吸光值为1～1.5时的包被浓度及抗体稀释倍数计算抑制率，检测结果如表2所示。
表2棋盘检测法测定结果
OD值 包被浓度 抗体稀释倍数 抑制率
1.430 2μg/mL 1：8000 79.94％
1.293 1μg/mL 1：4000 80.59％
1.411 0.5μg/mL 1：1000 80.3％
由表2可知，最优的偶联鸡卵清白蛋白的人工抗原2包被浓度为1μg/mL，甲醛多克隆抗体稀释倍数为4000倍。
实施例6抗体的灵敏度
依据实施例5最优的包被浓度，使用实施例3人工抗原2(LF)制备的单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF))绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线。以实施例3载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2(人工抗原2(OVA))为包被原；以实施例3载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原2(人工抗原2(LF))制备单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF))。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为单克隆抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原2稀释成1μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将甲醛标准品分别配制成浓度为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL的溶液，与邻苯二胺做衍生化反应后与甲醛单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF))按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin8.5软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。以甲醛为标准品建立ELISA的标准曲线，结果如图4，相关标准曲线参数见表3。
表3单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF))对甲醛的检测参数
Figure BDA0003976364910000121
结合图4和表3可知，以甲醛标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好，IC50为137.38ng/mL，最低检测限为20.91ng/mL。
实施例7抗体的特异性
使用实施例3人工抗原2(LF)制备的单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF)，对甲醛本身及其衍生剂和常见添加剂进行酶联免疫分析(ELISA)，通过拟合得到其相应的IC50并计算交叉反应率，结果如表4。
表4单克隆抗体对其衍生物和常见添加剂的交叉反应率
竞争药物 IC50(μg/mL) 交叉反应率
甲醛 0.137 100％
邻苯二胺 1200 0.011％
山梨酸钾 无 ＜0.01％
亚硫酸钠 无 ＜0.01％
亚硝酸钠 无 ＜0.01％
乙醛 无 ＜0.01％
丙醛 100 0.14％
从表4可知，所得的甲醛单克隆抗体对其衍生剂-邻苯二胺和甲醛类似物及常见添加剂交叉反应率小于0.2％；说明本发明制备得到的单克隆抗体用于甲醛检测具有很强的特异性。
实施例8检测甲醛的试剂盒
一种检测甲醛的试剂盒，包括包被有实施例3载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原2包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板、甲醛标准品衍生物、实施例3人工抗原2(LF)制备的单克隆抗体(Ab-人工抗原2(LF))、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液、10％浓硫酸终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
提取、浓缩样品中的甲醛制备样品待测液。向待测液(或不同浓度的甲醛标准品溶液)中加入过量邻苯二胺使甲醛充分衍生成苯并咪唑，然后将样品衍生液、和甲醛抗体加入已包被好包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应。利用酶标仪测试吸光值。通过对比样品待测液及甲醛标准品的吸光值大小，定量分析样品中的甲醛的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测甲醛的免疫分析方法，其特征在于，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；其中，
所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工抗原2；
式IV如下：
Figure FDA0003976364900000011
式V如下：
Figure FDA0003976364900000012
2.一种甲醛人工抗原，其特征在于，为人工抗原1或人工抗原2，其中，人工抗原1结构式如式(IV)所示，
Figure FDA0003976364900000013
人工抗原2，结构式如式(V)所示，
Figure FDA0003976364900000021
3.权利要求2所述甲醛人工抗原在制备甲醛抗体中的应用。
4.一种甲醛人工抗原组合，其特征在于，包括权利要求2所述人工抗原中的两种。
5.权利要求4所述甲醛人工抗原组合在制备甲醛抗体和/或检测甲醛的应用。
6.一种甲醛抗体，其特征在于利用权利要求2所述人工抗原免疫动物制备得到。
7.一种检测甲醛的免疫分析试剂盒，其特征在于，包含作为包被原的权利要求2所述人工抗原和权利要求6所述甲醛抗体。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于检测甲醛的试剂盒还含有衍生试剂邻苯二胺。
9.一种检测甲醛的免疫分析试剂盒，其特征在于，将甲醛与邻苯二胺充分反应生成苯并咪唑，以权利要求1所述免疫分析方法检测。
10.5-氨基苯并咪唑和/或5-羧基苯并咪唑作为半抗原在制备甲醛人工抗原或甲醛人工抗体中的应用。
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